CC BY
35
УДК 618.3:616.523 М.Т.Луценко
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ГЕРПЕСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА КЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ВО ВРЕМЯ БЕРЕМЕННОСТИ
Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН
РЕЗЮМЕ
Исследование посвящено изучению новых методов оценки влияния персистирующей инфекции на клеточный метаболизм. Изучали периферическую кровь и плаценту беременных, перенесших острую герпесную инфекцию. Герпесная инфекция на конформационном уровне изменяет взаимодействие ДНК с гистонами, усиливая связь последних с информационной системой клетки, что приводит к нарушению синтеза РНК. Герпесная инфекция усиливает синтез ганглиозидов в клеточных мембранах лейкоцитов, что приводит к агрегации и образованию «герпесных телец» -надежных маркеров острой герпесвирусной инфекции.
SUMMARY
M.T.Lutsenko
METHODS USED TO EVALUATE HERPES INFECTION EFFECT ON CELLULAR METABOLISM IN PATIENTS DURING GESTATION PERIOD
The purpose of the investigation was to study new methods for assessing persistent infection effect on cellular metabolism. Peripheral blood and placenta of pregnant women with herpes infection have been studied. At conformation level herpes infection modifies DNA interaction with histones, thus strengthening their link with cell information system. This results in RNA synthesis disturbance. Herpes infection increases gan-glioside synthesis in leukocyte membranes, which leads to formation and aggregation of ‘herpes bodies’ - reliable markers of acute herpes infection.
Последнее десятилетие характеризуется усилением внимания ученых-биологов и медиков к феномену персистенции вирусов в организме человека. Убедительными опытами было показано, что персисти-рующий бактериофаг существует в бактериях в виде неинфекционного профага, активация которого вызывает лизис бактерий [3].
Установлено, что латентные вирусные инфекции
проявляют себя периодическими обострениями или без них. В промежутках между ними вирус не обнаруживается. Иногда это состояние вирусоноситель-ства проявляется длительным многолетним периодом. Персистенция вирусов зависит во многом от степени резистентности организма к данному вирусу. Чем менее восприимчив организм к тому или иному вирусу, тем более скрытые формы течения он проявляет. Устойчивость организма к вирусам обусловлена генетическими и иммунологическими факторами. Особая роль принадлежит при этом степени выраженности иммунной толерантности и проявлению иммунодепрессивного действия вирусов, а также процессу образования иммунных комплексов, в которых антитела нейтрализуют активность вируса, уничтожению с поверхности зараженных клеток вирусных детерминант под влиянием антител. В этом плане большая роль отводится характеру обмена ганглиозидов в клеточных мембранах и их взаимодействию с антигенами и другими токсическими веществами.
Одним из механизмов персистенции вирусов является интеграция вирусного гистона с клеточным ДНК в единую генетическую структуру. Это происходит вследствие рекомбинации ДНК-клеток хозяина с вирусами такого типа как аденовирусы или вирусы обычного герпеса.
В.М. Жданов предположил, что одним из возможных механизмов длительной персистенции в клетках неонкогенных РНК-содержащих вирусов является образование ДНК-транскриптов с помощью реверта-зы - обратной транскриптазы этого вируса [1].
Активация персистирующего вируса происходит в результате воздействия на организм различных факторов или складывающихся метаболических ситуаций: лучистая энергия, температурные воздействия, химические метаболиты, вторичная инфекция, создание иммунологического конфликта и т.д. Присутствие персистирующей вирусной инфекции часто не убивает клетку-хозяина, и даже не вызывает бурного иммунного ответа. Такая ситуация может существовать в организме длительное время, в течение которого складывается некий постоянный эффект. Нередко это оказывает выраженное влияние на ряд специализированных функций: уровень секреции гормонов, синтез и функционирование гемоглобина в
Рис. 1. Плацента при окраске амидочерным 10Б по АНеп, веБсИ-шМ.
а - беременность 5 недель - контроль (вирус герпеса не выявлен у матери);
б - беременность 5 недель - в крови у матери вирус герпеса 1:3200;
в - беременность 9 недель - в крови у матери вирус герпеса 1:1600;
г - беременность 9 недель - в крови у матери вирус герпеса 1: 12800.
Увеличение х 1350.
элементах эритроидного ряда; синтез фосфолипидов (особенно ганглиозидов) клеточных мембран, уровень ферментативной активности лейкоцитов периферической крови.
В клетках нейробластомы, зараженных вирусом лимфоцитарного хориоменингита, развивались процессы нарушения синтеза и деградации ацетилхоли-на. При этом клетки продолжали нормально расти, производя нормальное количество ДНК, РНК, белков и жизненно важных ферментов. И даже на ультра-микроскопическом уровне клетка ничем не отличалась от нормальных.
В этих случаях происходит избирательное нарушение транскрипции м-РНК с ДНК, касающееся того или иного признака метаболизма клетки (это каса-
лось гормона роста, но не затрагивало функцию щитовидной железы).
Проведенные опыты показали, что персисти-рующий вирус, введенный животным, у которых иммунная система изначально была интактной, является мутантным, способным подавлять направленный на него иммунный ответ. Таким образом, вирус мог реплицироваться в клетках, и при этом возникли мутанты, способные подавлять активность Т-киллеров, специфичных данному вирусу. Только 2% хелперов содержат вирусные гены, а из них только 2% были инфицированными, то есть вирус в них реплицировался. Следовательно, для подавления иммунного ответа вирусу нужно вывести из строя совсем немного лимфоцитов.
Рис. 2. Периферическая кровь беременной.
а - в мембране эритроцитов определяют ганглиозиды по Бюкнеру. Беременность 16 недель. Титр антител к вирусу герпеса 1:1600;
б - периферическая кровь. Лейкоциты периферической крови. Титр антител к вирусу герпеса 1:12800. Ганглиозиды в мембранах лейкоцитов по Бюкнеру.
Увеличение х 900.
в
Рис. 2. Периферическая кровь беременной с герпесной инфекцией (16 недель беременности). Титр антител к вирусу герпеса - 1:12800. Этапы формирования «герпесных телец».
Таким образом, измененные формы вируса реплицируются в лимфоцитах и прекращают размножение именно тех Т-киллеров, которые уничтожают клетки, зараженные данным вирусом. Мутация обеспечивает переход инфекции в персистентное состояние, вследствие чего вирусные РНК и белки накапливаются в крови и тканях зараженного организма. Такие события развиваются при инфицировании человека вирусами гепатита В, С, цитомегаловиру-сом, вирусом иммунодефицита. Если в условиях эксперимента с персистентной инфекцией добавить специфичные к этому вирусу Т-киллеры, выделенные из селезенки здоровых животных с соответствующим типом МНС - в результате этой процедуры больные животные полностью избавлялись от инфекции.
Внедрение и рекомбинация ДНК и вируса - это только внешняя начальная сторона процесса, перерастающая в сложные процессы, затрагивающие весь метаболизм клеточных систем, захваченных в этот процесс. Огромная роль в управлении метаболизмом клеток, особенно фетоплацентарной системы, принадлежит функциональному состоянию их генетического аппарата.
Неоценимая роль в регуляции генов принадлежит гистонам. По крайней мере, гистоны одного типа способствуют активации генов: они стимулируют инициацию транскрипции. Подавляющая же масса гистонов угнетает транскрипцию информационной РНК, которая служит матрицей для синтеза специфически присущего клеточному виду белка.
В генах эукариотических клеток имеется минимум три функциональных сегмента: а) кодирующий, б) определяющий аминокислотную последовательность белка, в) участки, от которых зависит начало и интенсивность транскрипции данной кодирующей области. ДНК почти в два оборота обматывается вокруг гистонового октамера, который состоит из восьми белковых молекул: по две Н4, Н3, Н2А и Н2В. Уплотнению ДНК помогает еще один вид гистона - Н1, который связывается с наружной поверхностью цепи ДНК, намотанной на гистоновый октамер. Вскоре было установлено, что гистоны играют огромную роль в генной активности и подавляют транскрипцию в ядре [3]. Препятствием к репрессии транскрипции являются гистоны Н1. Ликвидация репрессии является необходимым этапом активации эукариотического гена. Нужно знать, каким образом ослабляются связи между гистоновым октамером и блоком транскрипции (ТАТА-блок).
Этот процесс выполняется белками-
активаторами, которые как бы вытесняют гистоны из комплекса с ТАТА-блоком. Во время присоединения белков-активаторов со специфическим местом в хвостовой части гистона Н4 происходит изменение его конформационного состояния, что и приводит к временному отделению Н2А и Н2В от нуклеосомы. ДНК становится доступной для базальных факторов. После того как РНК-полимераза пройдет свой путь по ДНК, димеры Н2А - Н2В могут вновь свя-
заться с тетрамером Н3-Н4, восстановив структуру нуклосомы. Факторы, приводящие к таким изменениям, возможно и заложены в длительном присутствии в клетках вирусной ДНК.
Материал и методы исследования
Материал собирался от пациентов, находящихся на лечении в отделении патологии дыхательной системы беременных Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН.
Было проанализировано состояние 120 беременных, обратившихся с диагнозом острого респираторного заболевания. В результате уточнения диагноза при поступлении было установлено методом иммунно-ферментного анализа (ИФА), что 86% лиц имели положительный титр антител к вирусу герпеса. Острая фаза заболевания была зарегистрирована у 15% пациентов, остальные были отнесены к хронической форме герпесвирусной инфекции. У 20 пациентов обращение в клинику завершилось прерыванием беременности на сроках 7-8 недель. От 30 беременных был получен плацентарный материал во время родов, завершившихся в срок. В 3 случаях беременность на 24-26 неделях закончилась гибелью плода. У них методом ИФА был поставлен в начале беременности диагноз цитомегаловирусемия. В последних случаях был взят не только плацентарный материал, но и внутренние органы плода: легкие, тимус, надпочечники, слюнные железы. Материал фиксировался в спирт-формалине, жидкости Карнуа. Замороженные в криостате срезы, изучались различными гистохимическими методами.
В данной работе анализируется материал плаценты и легких плодов. До и после удаления ДНК с помощью ДНК-азы или 5% трихлоруксусной кислотой срезы окрашивались галлоцианином, прочным зеленым и амидочерным 10Б на выявление гистонов. Одновременно у женщин с установленным методом ИФА диагнозом герпесвирусная инфекция в лейкоцитах периферической крови определяли гистохимическим методом содержание ганглиозидов и взаимоотношение их друг по отношению к другу.
Результаты исследования
В плаценте, полученной после прерывания беременности на 7-8 неделе по случаю острой герпесвирусной инфекции (ВПГ-1) после удаления ДНК и РНК с помощью трихлоруксусной кислоты и окраски амидочерным и прочным зеленым 62±2,3% ядер хориального симпласта четко окрашивались тем и другим красителем; в контроле (беременность без осложнений) их было 11±0,9%. У плодов на 24 неделе беременности с установленным диагнозом цитомега-ловирусемия (пациентки отказывались на 7-8 неделе от прерывания беременности) в легких, эпителии формирующихся бронхов и альвеол обнаруживаются крупные клетки с гигантскими ядрами диаметром от 15 до 25 мкм, интенсивно окрашиваясь амидочерным.
В хориальном симпласте ворсинок встречается до 10% крупных ядер (от 15 до 20 мкм), интенсивно окрашивающихся амидочерным. Полученные данные свидетельствуют, что при герпесной инфекции отмечается блокирование ДНК гистонами, приводящее к нарушению репликации белка, что естественно приводит к нарушению функции фетоплацентарного барьера. Мы полагаем, что эти процессы одновременно происходят в лимфоцитах периферической крови и заселяющих плаценту, а также в децидуальных клетках плаценты. У этих пациентов отмечается снижение супрессорной функции плаценты, что подтверждается уменьшением числа лимфоцитов - супрессоров (на 25%), выявленных иммунофермент-ным методом с помощью пероксидазы. Резко увеличивается накопление в тканях ворсинок и крови, омывающей ворсинки, Т-киллеров.
Одновременно биохимическими методами установлено резкое увеличение в плазме периферической крови содержания серотонина. Это следует расценивать как активизацию биогенноаминообразующей функции нервными центрами и ганглиями в результате активизации герпесвирусной инфекции.
Клетки периферической крови вследствие активизации герпесвирусной инфекции усиливают выработку ганглиозидов на уровне клеточных мембран лимфоцитов и гранулоцитов. Гистохимическими
методами в мембранах лейкоцитов периферической крови мы обнаружили до 40% клеток с интенсивной реакцией на ганглиозиды. Модифицируя окраску мазков периферической крови методами, позволяющими не нарушать ионный состав и зарядность поверхности клеточных мембран, мы получили интересный эффект. У лиц имеющих высокий титр анти-
тел - 1:6400-1:12800 - в периферической крови обнаруживаются специфические образования - «герпесвирусные тельца», сформировавшиеся вследствие электростатического сближения клеток с высоким содержанием ганглиозидов в клеточных мембранах.
Выводы
Вирусная инфекция в организме человека зачастую приобретает персистирующее течение. Как показывают современные иммунногенетические исследования персистирующая инфекция вступает в рекомбинантные связи с ДНК, оказывая существенное влияние на конформационную структуру ДНК, путем укрепления связи гистонов с ДНК. Нарушается цитоплазматический метаболизм клеток, приводящий к выключению из нормального ритма отдельные ферментативные процессы.
При острой герпесной инфекции усиливается контакт гистонов с ДНК, выключающих информационную систему и синтетические процессы внутриклеточного белка. При этом состоянии усиливается синтез ганглиозидов в мембранах клеток периферической крови, что приводит к образованию клеточных комплексов - «герпесвирусных телец», которые можно рассматривать как надежный диагностический тест при острой герпесвирусной инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гаврилов В.И., Семенов Б.Ф., Жданов В.М. Хронические вирусные инфекции и их моделирова-ние.-М., 1974.
2. Granstein M. Histon as regulatore system of gens//Scienftic Атепсап.-1992.-Уо1. 267.-P.3.
3. Lwoff A., Gutmann A. Recherches sur un Bacillus megtheriun 1ysogene//Ann. Ins. Pastеur.-1950.-Vo1.78.-P.711.
□ □□
