CC BY
38
Вестник ДВО РАН. 2004. № 3
М.Т.ЛУЦЕНКО
Морфофункциональная характеристика фетоплацентарного барьера при герпес-вирусной инфекции
На ультрамикроскопическом, люминесцентном и гистохимическом уровне изучали взаимоотношение нуклеиновых кислот, гистонов и кислых белков в ядрах симпласта в плаценте беременных на высоте обострения герпес—вирусной инфекции. Причиной фетоплацентарной недостаточности, развивающейся при герпес—вирусной инфекции, является внедрение в цитоплазму симпласта хор-иона вирусов герпеса, провоцирующих высокий синтез серотонина и перекисное окисление липидов, нарушение связи ДНК с гистонами и усиливающееся метилирование дезоксирибонуклеиновой кислоты. В цитоплазме хориального симпласта снижается синтез РНК.
The morphofunctional description of the fetoplacental barrier under the herpes-viral infection.
M.T.LUTSENKO (Far Eastern Scientific Center of Respiratory Pathology and Physiology, SB RAMS, Blagoveshchensk).
The ultramicroscopic, luminescent, and histochemical methods have been used to study the relationships of nucleic acids, histones, and acid proteins in the symplast nuclei in the pregnant women placentas under acute herpes infection. The fetoplacental insufficiency can be attributed to the herpes virus penetration into cytoplasm of the chorion symplast. This virus provokes the increase of the serotonin synthesis, lipid peroxidation, disturbance of link between histones and DNA, and increase of the desoxyribonucleic acid methylation. Synthesis of RNA decreases in the chorion symplast.
Исследования выполнялись на плацентарном материале от 30 беременных женщин, перенесших герпес-вирусную инфекцию (острый период). Контрольная группа — плаценты от 15 беременных, у которых не было никаких заболеваний.
Материал фиксировался в спирт-формалине и заливался в парафин. Одновременно материал фиксировался в 2,5 %-ном глютаральдегиде на 0,1 М какодилат-ном буфере с постфиксацией в 2 %-ном растворе четырехокиси осмия для ультра-микроскопического исследования на электронном микроскопе Tesla BS-540. Содержание серотонина изучали с помощью люминесцентного анализа с использованием для фиксации 2 %-ного раствора глиоксалевой кислоты.
Гистоны окрашивались в 0,125 %-ном растворе амидочерного Б при рН 8,2 в течение 20 мин при температуре 25 °С. Окрашивание ДНК проводилось гал-лоцианином при рН 1,64 в течение 48 ч. Как дополнительный был использован
ЛУЦЕНКО Михаил Тимофеевич — доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН (Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН, Благовещенск).
метод окрашивания хроматина сафранином. Разрыхление хроматина ядер проводилось 4 М раствором мочевины при 60 °С в течение 60 мин. Удаление гис-тонов, богатых лизином, проводили 0,6 М раствором NaCl при температуре 60 °С в течение 60 мин, гистонов, богатых аргинином, — 1,5 М NaCl при 60 °С в течение 60 мин.
Метильные группы окрашивали 0,1 %-ным раствором азура А при рН 6,2 и 37 °С в течение 20 мин. Деметилирование проводили в 1 %-ном растворе КОН на 70 %-ном спирте в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим окрашиванием в растворе азура А при рН 6,2 в течение 20 мин. Препараты подвергались цитофотометрическому анализу на цитофотомере фирмы «Mecos».
Механизмы метилирования ДНК
Во всех клетках в ДНК есть метилированные основания двух классов. К одному из них относится тимин, участвующий непосредственно в синтезе ДНК. Другой класс — 5-метилцитозин и 6-метил-аденин, которые метилируются уже в составе построенного полидезоксирибонуклеотида [3].
5-Метилцитозин и 6-метиладенин содержатся в ДНК бактериофагов Т2, Т4, Т7, Р1. До настоящего времени никто из исследователей никакого метилирования ДНК на уровне полинуклеотидов у вирусов папилломы и простого герпеса I не обнаружил.
Реакцию метилирования ДНК можно себе представить следующими образом: ДНК+8-аденозилметионин^-ДНК-метилаза^-метил-ДНК+8-аденозилгомоцис-теин. Эта реакция необратима: после добавления в реакционную среду S-адено-зил-гомоцистеина обратного переноса СН3-групп с ДНК не наблюдается. Скорость реакции пропорциональна концентрации фермента. S-Аденозилгомоцисте-ин ингибирует реакцию метилирования.
Сильное увеличение ДНК-метилазной активности наблюдается в клетках, зараженных разными фагами, что, по-видимому, можно объяснить появлением специфических фаговых метилаз, относящихся к так называемым ранним белкам. Через 2 мин после заражения фагом Т2 активность ДНК-метилазы в клеточных экстрактах увеличивается в 16 раз, а через 15 мин — в 220 раз по сравнению с неза-раженными клетками Е. соИ [2].
Вероятно, что ДНК-метилаза, появляющаяся после заражения фагами и вирусами, является вновь образовавшимся белком, структура которого закодирована в фаговой ДНК. Специфичность этого фермента такая же, как у ДНК-метилазы хозяина [5]. Однако, по мнению других исследователей, образующаяся метилаза более стабильна и отличается от метилазы клетки-хозяина.
Метилирование аденина в Ni-положении снижает упорядоченность конформации молекул поли-А, лишает ее матричной активности и способности образовывать комплексы с поли-V. Метилирование углерода пиримидинов в 5-м положении способствует возникновению упорядоченной конформации у одноцепочечных полимеров и значительно стабилизирует двутяжные полинуклеотиды. Замещение даже одного атома водорода в ^-положении СНз-группой является серьезным препятствием для образования нормальных водородных связей и комплементарных взаимодействий полинуклеотидов.
Необходимо оценить, как влияет метилирование на считывание информации с ДНК. Метилированные основания в ДНК могут иметь значение определенных точек начала и конца считывания информации с ДНК [2]. Считывание информации
в широком смысле может зависеть от степени модификации ДНК вследствие ее метилирования. Не исключено, что такая модификация ДНК может иметь регуляторное значение при избирательном запуске или, наоборот, прекращении считывания информации с определенных генов. Такая ситуация имеет место при клеточной дифференцировке. У низших организмов метилирование обычно происходит непосредственно при репликации ДНК. У них перед репликацией ДНК должна быть прометилирована. У высших позвоночных синтез высокой организации и дифференцировка клеток возможны на базе неметилированной ДНК.
Плотность ДНК при развитии зародыша не отличается от плотности ДНК гамет вплоть до стадии бластулы, и только на стадии поздней бластулы она немного изменяется, становясь более выраженной уже в период гаструляции, приближаясь по своей плотности к ДНК диплоидных клеток взрослого организма.
В это же время отмечаются и изменения в метилировании ДНК. Возможно, что эти изменения в эмбриогенезе являются следствием метилирования или действия других энзиматических модификаций ДНК с участием метилаз. Напрашивается гипотеза о химической основе клеточной дифференцировки как следствии последовательной энзиматической модификации ДНК. Последовательности, выполняющие функции стартовых точек для считывания ряда сцепленных генов, могут одновременно быть специфическими местами метилирования цитозина и последующего дезаминирования 5-МЦ. Дезаминирование 5-МЦ под влиянием 5-МЦ-ами-ногидролазы может привести к возникновению тимина. (Так, видимо, синтезируется минорная его часть, в основном же он появляется в цепи ДНК обычным путем.) В результате этих изменений в цепи ДНК вместо цитозина окажется тимин и возникнет некомплентарная пара оснований Т—Г. Такое нарушение спаривания оснований и может послужить началом считывания информации с ДНК. При репликации одна из цепей такой измененной ДНК дает нормальную дочернюю молекулу с парой Г—Ц, а другая образует отличную ДНК с парой А—Т в том же месте. Немодифицированная молекула при репликации будет сохранять информацию зародышевой линии, а измененная молекула ДНК несет информацию дифференцирующихся клеток.
Вероятно, эта гипотеза объясняет, как программа дифференцировки может быть закодирована в самой ДНК и реализуется при спонтанном синтезе модифицирующих ДНК ферментов.
Нарушения в считывании информации ДНК могут играть не последнюю роль в процессе старения [2]. Искажения в метилировании ДНК вносят ошибки при считывании информации, что приводит к преждевременному старению организма в целом [14]. Метилирование локусов, связанных в 5'-промоторных регионах Срв-островков, коррелирует с молчанием экспрессии эстрогеновых рецепторов, что приводит к дисгормональным явлениям, создающим предпосылки к злокачественному росту клеток молочной железы [16].
Таким образом, метилирование, удаление или трансформация «минорных» оснований ДНК имеют весомое значение в процессах клеточной дифференцировки, мутагенеза и канцерогенеза. Некоторые алкилирующие агенты: диметилнитроза-мин, метилметансульфонат, М-метил-М-нитрозуретан и другие — увеличивают частоту мутаций и являются сильными канцерогенами. Их действие в направлении вызывания канцерогенеза связывают с метилированием различных оснований в нуклеиновых кислотах. В ДНК они метилируют в основном гуанин и образуют М-метилгуанин [9, 11—13, 20, 22].
Предполагается, что метилазы нуклеиновых кислот могут играть роль своеобразных естественных канцерогенов. Это может осуществляться ферментами, кото-
рые вносятся в клетки одноклеточными вирусами или же при генетической рекомбинации.
Исследования генетического материала клетки показывают, что мутация в определенном локусе во многом зависит не только от генетических, но и от эпигенетических факторов — наследственных и ненаследственных изменений в экспрессии конкретного гена без каких-либо соответствующих структурных изменений в его нуклеотидном коде.
В настоящее время большое внимание уделяется процессам метилирования ДНК, которые приводят к нарушению клеточной дифференцировки, инактивации Х-хромосомы и изменяют процесс репликации ДНК.
Большая роль в этом отводится Срв-островкам в промоторных районах, которые в таких условиях аномально метилируются и подвергаются полной инактивации. Даже без изменения нуклеотидной последовательности ген теряет свою активность, что можно назвать функциональной делецией [4].
В процессе метилирования меняется только одно основание ДНК — цитозин с помощью ДНК-метилтрансфераз, которые переносят метильную группу 8-адено-зилметионина. Метилцитозин в свою очередь удаляется из ДНК гликозилазой или ДНК-деметилазой. В этом процессе осуществляется деметилирование без нарушения целостности ДНК.
Метилирование способствует инактивации экспрессии генов, так как метиль-ные группы, внедряясь в ДНК, препятствуют связыванию специфических элементов транскрипции. Точнее, метильные группы связывают транскрипционный ре-прессор МеСР2, который содержит корепрессор и диацетилазу гистонов.
Деацетилирование гистонов приводит к более плотной упаковке нуклеосом и вызывает инактивацию гена. Таким образом, метилирование ДНК и деацетилиро-вание гистоновых белков являются взаимодополняющими процессами, участвующими в изменении структуры хроматина и приводящими соответственно к отсутствию экспрессии генов без их структурных нарушений.
Метилирование ДНК — основной эпигенетический механизм, обеспечивающий передачу распределения генной активности между клетками в ходе развития
Согласно современным сведениям [6], у высших организмов важным эпигенетическим процессом может быть химическая модификация ДНК. В управлении генетическим переключением в развивающихся клетках может участвовать присоединение метильной группы к цитозиду. По-видимому, от одного поколения клеток к другому передаются без изменений не какие-либо белки, а метильные группы в составе ДНК. Наличие или отсутствие метиль-ных групп служит сигналом для регуляторных белков. Эти белки в последующем взаимодействуют с ДНК в дочерних клетках так же, как в родительской клетке. Метилированный цитозин становится неактивным и блокирует присоединение к ДНК активаторов транскрипции или же содействует связыванию репрессоров.
В организме группы клеток подвергаются координированным изменениям в ответ на внеклеточные сигналы, называемые индукторами. Сигналы воспринимаются клеточной мембраной и передаются в ядро, где они влияют на транскрипцию генов. Экспериментальные исследования показали, что присутствие метильных групп связано не просто со снижением уровня генной экспрессии, но почти всегда с полной инактивацией. Изменения же нуклеотидной последовательности в про-
моторных участках, где инициируется транскрипция, часто имеют модулирующий эффект, это тоже указывает на то, что сигнал в виде метильной группы — более специфичный регулятор гена [7—10, 15, 17, 21].
Значимость метилирования цитозина для происходящих в клетке процессов подтверждается тем, что оно наблюдается у многих видов животных. Однако при этом нельзя не учитывать, что этот процесс протекает в комплексе с другими явлениями клеточного метаболизма, в числе которых нужно учитывать и взаимодействие ДНК с белками, передачу сигнала с клеточной мембраны на хромосомы, межклеточные взаимодействия.
Подходя к вопросу регуляции процессов развития зародыша и плода у высших млекопитающих, прежде всего привлекает внимание состояние чрезвычайно важной структуры, условно разделяющей организм матери и плода и одновременно постоянно обеспечивающей единство фетоплацентарной системы — фетоплацентарного барьера.
Особо построенная морфологическая структура — хориальный симпласт — обеспечивает, с одной стороны, удаление ненужных продуктов метаболизма от развивающегося плода, с другой — постоянное поступление жизненно важных продуктов для построения и регуляции роста плода. Благополучие этого гомеостаза будет зависеть от морфофункционального состояния ДНКП ядерного аппарата симпласта и отвечающей этим условиям работы цитоплазматической системы. Очень часто возникающие сбои в формировании зародыша на ранних стадиях развития, безусловно, происходят в основном от функционально-генетического неблагополучия фетоплацентарного барьера. Нарушения энзиматического статуса в хориальном симпласте, вызываемые эпигенетическими факторами, к числу которых прежде всего следует отнести появляющиеся нейрогормо-нальные или метаболические нарушения в организме беременной, резко меняют условия дифференцировки и роста зародыша. Как мы излагали выше, эпигенетические воздействия на ДНК вызывают перестройку локусов генетического аппарата ядер симпласта, выражающуюся в перераспределении процентного содержания цитозиновых нуклеотидных метильных групп.
Избыточное метилирование ДНК в данной ситуации — крайне тревожное явление, так как оно влечет за собой изменения в транскрипции белков, обеспечивающих нормальное функционирование фетоплацентарного барьера [19].
Еще более грозным осложнением для фетоплацентарной системы становится активизация постоянно присутствующих в нашем организме персистирующих вирусов. Нам известно, что основные нервные центры и ядра человека изобилуют возбудителями герпесной инфекции (8 серологических групп), склонной к активизации в начальный период беременности.
Очень важно представлять себе, каковы пути распространения герпесной инфекции не только в организме хозяина, но и как она пересекает фетоплацентарный барьер в сторону развивающегося плода.
При переходе фетоплацентарного барьера вирусами герпеса либо развивается «мирный» вариант, при котором не задевается генетический аппарат ядер симпласта, либо происходят повреждение и мутация генного аппарата ядерных элементов хориона, что приведет к репликации ДНК вирусов на ядрах симпласта.
Нами обнаружено на электронно-микроскопическом уровне внедрение возбудителя в цитоплазму хориального симпласта, изменение ее нормальной структуры, что выражается в разрушении митохондрий и появлении мелкопузырчатых образований. Вирусные частицы вступают в контакт с оболочкой ядер (рис. 1, 2).
Рис. 1. Фетоплацентарный барьер ворсинки хориона из плаценты беременной, перенесшей на 24-й неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. Участок с частицами возбудителя, тесно контактирующими с ядерной оболочкой. Увеличение х 40 000
Рис. 2. Фетоплацентарный барьер. Ворсинки хориона плаценты беременной, перенесшей на 24-й неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. В цитоплазме симпласта многочисленные вакуоли с частицами возбудителя. Увеличение х 40 000
В цитоплазме симпласта вырабатывается большое количество серотонина (рис. 3). В симпласте хориона отмечается интенсивная реакция на гистамин (рис. 4) и перекисное окисление липидов (рис. 5).
Белки хроматина
В составе хроматина большая часть приходится на гистоны, они вступают через ионные связи во взаимодействие с ДНК. Катионные группы гистонов нейтрализуют фосфатные группы ДНК. Для того чтобы в ДНК кислотные группы были полностью связаны с основными белками, между ними должно быть соотношение 1,35 : 1. Группы гистонов отличаются друг от друга по аминокислотному составу: первая группа гистонов богата лизином и бедна аргинином, вторая фракция содержит эти аминокислоты в равных количествах, третья и четвертая группы отличаются бедным содержанием лизина и богаты аргинином.
Используя растворы различной ионной силы, можно последовательно извлекать из ДНК различные гистоны. Так, 0,6 M раствором NaCl можно извлекать только гистоны первой фракции, 0,8—1,5 М раствором — гистоны второй фракции. И, наконец, гистоны III и IV фракций экстрагируют более высокими концентрациями солей. Это позволяет оценивать роль различных фракций гистонов в работе ДНКП.
Матричная активность ДНК в составе хроматина зависит от количества связанного с ней гистона. Простая экстракция гистона из хроматина приводила к повышению синтеза ДНК в ядре (рис. 6). Синтез ДНК прямо пропорционален ее коли-
Рис. 3. Участок плаценты беременной, перенесшей на 24-й неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. В цитоплазме симпласта — накопление серотонина. Люминесцентная микроскопия. Увеличение 15 х 20
Рис. 4. Фетоплацентарный барьер. Ворсинки хориона плаценты беременной, перенесшей на 24—й неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. В цитоплазме симпласта — накопление гистамина. Реакция по Шампи. Увеличение 40 х 15
честву, не связанному с гистоном. Следовательно, гистоны являются репрессора-ми матричной активности ДНК в составе хроматина. Мы провели гидролиз ядер симпласта хориона раствором 5 н HCl в два этапа в течение 5 мин (1-я группа) и в течение 30 мин (2-я группа).
В плаценте, взятой после родов от женщин, не имевших признаков инфицирования организма герпес-вирусной инфекцией, освобождение ДНК от белковых элементов (МН2-групп и гистонов) происходило очень медленно. Цитофотометри-рование препаратов, окрашенных с помощью Шифф-реактива, показало, что количество хроматина на единицу площади ядра через 5 мин гидролиза составило 70,9±9,0 усл. ед., а через 30 мин — 20,5±2,0 усл. ед.
В то же время, т. е. через 5 мин после гидролиза раствором 5 н НС1, количество окрашиваемого на единицу площади ядерного вещества в симпласте хориона на фоне герпес-вирусной инфекции составляло 50,76±4,5 усл. ед., а к 30-й минуте гидролиза — 10,22±0,8 усл. ед.
Для полного удаления белков, связанных с ДНК, рекомендуется инкубационный раствор для гидролиза применять на фоне 20 %-ного полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000.
При таких обстоятельствах у практически здоровых беременных количество ДНК на единицу площади ядра через 30 мин гидролиза определялось в количестве 11,8±0,15 усл. ед., а при герпес-вирусной инфекции — 2,21±0,01 усл. ед.
Таким образом, присутствие вирусов герпеса в симпласте хориона резко нарушает его ядерный гомеостаз. Связь ДНК с белками (ЫН2-группы и гистоны) нарушается, ДНК быстро, по сравнению с контролем, освобождается от гистоновой связи, становясь доступной для репликации вирусного информационного матери-
ала, что, несомненно, приводит к увеличению массы хроматина ядра и нарушению метаболизма в фетоплацентарном барьере. Было обнаружено, что в зоне гистонов содержится РНК, в количестве от 0,01 до 0,05 % массы ДНК, отличная от других известных типов РНК. Эта хромосомная РНК, по-видимому, связана с белком, так как устойчива к действию РНКазы. Хромосомная РНК отделяется от ДНК хроматина нагреванием растворов, что может свидетельствовать о ее комплементарной связи с ДНК.
Хромосомная РНК комплементарно связана с белком, который с помощью водородных связей комплексируется с гистонами. Специфичность репрессирующего действия гистонов определяется специфичностью отдельных молекул хромосомной РНК, которая связывается с определенными местами на ДНК. К такому комплексу затем присоединяется гистон. Чтобы вызвать полную диссоциацию ДНК и гистонов, нужно на них подействовать 2 М №С1.
Гистоны действительно могут закрывать ДНК в хроматине и прекращать ее работу в качестве матрицы для синтеза РНК, но этот эффект неспецифичен. Но нужно учесть, что и другие негистоновые белки ответственны за обнажение специфических последовательностей на ДНК [18].
Вероятно, ацетилирование гистонов — более сильный фактор, регулирующий синтез новых РНК на ранее репрессированных генных локусах. Другой признак активного хроматина — фосфорилирование серина в ядерных белках, в т. ч. в ги-стонах. Фосфорилирование связанных с хромосомами белков влияет на взаимодействие ДНК с гистонами, выводя ее из компактного неактивного состояния в диффузное активное. Дефосфорилирование может снова вызвать плотное скручивание комплекса ДНК-гистон.
Гистоны, связываясь с ДНК, вызывают агрегацию хроматина в условиях растворов с ионной силой, близкой к физиологическим растворам (0,05—0,2 М №С1). Это свойство гистонов может отражать их структурную функцию. Удаление части гистонов с помощью 0,6 М №С1 приводит к растворению осадка хроматина. Обработка хромосом трипсином приводит к их набуханию и диспергированию [1]. Все приведенные выше факты свидетельствуют, что гистоны поддерживают и определяют структуру хроматина и хромосом, а точнее, они, взаимодействуя с ДНК, функционируют не только как репрессоры, но и как факторы структуризации хроматина. Гистоны могут образовывать мостики между молекулами ДНК, что может приводить к скручиванию ДНК в составе хроматина и хромосом. Структуризация ДНП и репрессия матричной активности связаны между собой. Обработка ДНП 4 М раствором мочевины приводит к растворению ДНП без потери его белковых компонентов. При этом нити ДНП утончаются. Вероятно, мочевина нарушает слабые взаимодействия типа водородных связей и, возможно, гидрофобные взаимодействия, ответственные за образование сшивок между разными участками молекулы ДНП или между молекулами ДНП.
Гистоны играют большую роль в структуризации хроматина не только на уровне макромолекул. Известно, что ядра многих клеток обладают двумя формами хроматина: компактным — плотным и диффузным — рыхлым. В ядрах лимфоцитов образование компактных масс хроматина связано с высоким содержанием в них лизинового гистона. Зоны плотного хроматина, как правило, неактивны в отношении синтеза, в то время как диффузные зоны хроматина — предшественники РНК.
Если экстрагировать гистоны, богатые лизином, то хромосомы разрыхляются и под электронным микроскопом имеют вид сетчато-фибриллярных структур. Добавление к хромосомам гистонов, богатых аргинином, не приводит к восстановле-
Рис. 5. Ворсинки хориона плаценты беременной, перенесшей на 24-й неделе вспышку гер-пес-вирусной инфекции. Реакция на перекиси жирных кислот в симпласте хориона. Реакция по Винклеру. Увеличение 15 х 40
Рис. 6. Фетоплацентарный барьер. Ворсинка хориона плаценты беременной, перенесшей на 8-й неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. В симпласте хориона — интенсивный синтез ДНК в ядрах симпласта. Окраска амидочерным. Увеличение 40 х 15
нию структуры хромосом. Считают, что гистоны, богатые лизином, образуют поперечные сшивки между фибриллами ДНП.
У беременных женщин без признаков герпесной инфекции во время гестации в симпласте хориона определялось до 25 % ядер, содержавших 62,8±1,3 усл. ед. ДНК. После проведенной реакции деметилирования и подсчета ДНК на условную единицу ядерного вещества содержание ее составило 172,2±3,4 усл. ед. Число таких ядер определялось в пределах 70—75 %. Окраска проводилась двумя методами: сафранином и галлоцианином. Применяя деметилирование, мы освобождаем хроматин ядра от метильных групп и определяем истинное содержание ДНК, которое избирательно окрашивается данными красителями.
У беременных, перенесших вспышку герпесной инфекции на 24-й неделе, в среднем на единицу хроматина ядра до этапа деметилирования приходилось до 54,6—55,0±1,8 усл. ед. ДНК. После проведенного деметилирования содержание ДНК определялось до 141,0±3,9 усл. ед. Таким образом, до метилирования плотность хроматина в ядрах симпласта хориона была в 2 раза выше, чем в ядрах симпласта контрольных исследований. Соотношение плотности ядер неметелирован-ных и деметилированных в симпласте в контрольной группе составило 62,8 усл. ед./54,6 усл. ед.=1,15. При герпесной инфекции этот показатель был практически тот же: 172 усл. ед. /141 усл. ед.=1,2.
Таким образом, истинное содержание ДНК в ядрах симпласта практически было одно и то же, речь шла только о присоединении к ДНК большого количества метильных (блокирующих) групп при обострении герпес-вирусной инфекции.
Метилирование ДНК в ядрах влияет на связь ДНК с гистонами. Как показывают наши исследования, при вспышке герпесной инфекции в симпласте фетоплацентарного барьера число гистоновоокрашенных ядер увеличивалось до
Рис. 7. Фетоплацентарный барьер. Ворсинки хориона плаценты беременной без признаков герпес-вирусной инфекции. Активность аде-нилатциклазы — интенсивная. Увеличение 40 х 15
Рис. 8. Фетоплацентарный барьер. Ворсинки хориона плаценты беременной при вспышке герпесной инфекции на 24-й неделе. Активность аденилатциклазы резко подавлена. Увеличение 40 х 15
й1
Рис. 9. Фетоплацентарный барьер. Ворсинки хориона плаценты беременной при вспышке герпесной инфекции на 24-й неделе. Реакция на гуанилатциклазу активная. Увеличение 40 х 15
« • «
Рис. 10. Фетоплацентарный барьер. Ворсинка хориона плаценты беременной без признаков инфицирования вирусом герпеса. Реакция на гу-анилатциклазу слабо выражена. Увеличение 40 х 15
85,0±2,8 %. При контрольных исследованиях число амидоокрашенных ядер не превышало 10,0±0,7 %. Эти показатели совпадали и при окрашивании препаратов плаценты азуром I.
Наконец, мы применили реакции, показывающие уровень синтеза РНК в симпласте хориона. Для этой цели в контрольных исследованиях и при герпес-вирусной инфекции мы обрабатывали препараты плаценты в течение 60 мин 0,6 М раствором №С1. После такой обработке в контрольной группе беременных на единицу площади симпласта приходилось 137 усл. ед. РНК. У лиц, перенесших герпесную инфекцию, количество РНК на единицу площади симпласта определялось в пределах 115—120 усл. ед. Содержание РНК в ядре определяли до и после обработки препаратов последовательно вначале в 4 М мочевине в течение 1 ч, а затем в 0,6 М №С1 в течение 60 мин.
Мочевина применялась с целью разрыхления белков, связанных с ДНК. До воздействия мочевины и №С1 плотность ядра на единицу площади составила в контроле 230 усл. ед., после экстракции белков с помощью 0,6 М №С1 — 119 усл. ед. Коэффициент элюции составил 1,9. При герпес-вирусной инфекции плотность ядерного вещества симпласта до элюции составила 165 усл. ед., после — 150 усл. ед., коэффициент элюции — 1,1.
Обращает на себя внимание, что еще до экстракции белков из ядра их содержание в хроматине ядер симпласта хориона при герпесной инфекции было на 30 % меньше по сравнению с контролем, а после экстракции в контроле удалялось до 50 % белков. При герпес-вирусной инфекции белков в ядре оставалось меньше, поэтому процент экстракции составил не более 9—10 %. Таким образом, синтез РНК в ядре при герпесной инфекции в ядре снижен, по-видимому, почти в 4 раза.
Исследуя функциональную активность фетоплацентарного барьера в условиях проникновения в него вирусов герпеса (рис. 1), мы обнаруживаем не только структурные изменения в его цитоплазме (рис. 2), приводящие к вакуолизации протоплазмы и разрушению митохондрий, но и проявления глубоких ферментативных перестроек. В цитоплазме симпласта увеличивается накопление серотонина (рис. 3) и гистамина (рис. 4), приводящих к усилению процессов перекисного окисления липидов мембран (рис. 5) и активизации НАДФН-синтазы, усиливающей деструктивные процессы в фетоплацентарном барьере. Нарушается проницаемость наружной мембраны симпласта и изменяется функция ведущих клеточных трансмиттеров: аденилатциклазы и гуанилатциклазы (рис. 7—10). Ядра симпласта становятся разнокачественными, выявляя в 10 % случаев повышенный синтез ДНК (рис. 6).
Заключение
Фетоплацентарый барьер при вспышке герпес-вирусной инфекции в период беременности подвергается атаке со стороны возбудителя инфекции. В симпласте хориона при электронно-микроскопическом анализе отчетливо обнаруживаются вирусные тельца. Это приводит к ряду глубоких ферментативных и структурных изменений. Прежде всего следует обратить внимание на следующие перестройки в симпласте хориона:
1. Активизация синтеза серотонина.
2. Увеличение содержания НАДФН-синтазы.
3. Накопление в цитоплазме симпласта гистамина.
4. В ядрах симпласта нарушается взаимодействие ДНК с гистонами, делая ее открытой для синтеза ДНК возбудителя.
5. Подавляется синтез РНК в цитоплазме симпласта.
6. Увеличивается количество метильных групп на молекулах ДНК, блокируя ее участие в метаболических процессах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Буш Г. Гистоны и другие ядерные белки. М.: Мир, 1967. 285 с.
2. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и его биологическое значение // Успехи соврем. биологии. М.: Наука, 1989. Т. 65, вып. 2. С. 163—185.
3. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1976. 412 с.
4. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Бочков Н.П. Метилирование ДНК как этиологический фактор канцерогенеза // Иммунология. 2002. Т. 19. С. 6—11.
5. Хесин Р.Б., Богданова Е.С. Биохимия. М.: Наука, 1999. 405 с.
6. Холлидей Р. Эпигенетическая наследственность // В мире науки. М.: Мир, 1989. № 8. С. 30—38.
7. Crooks P., Triber M., Pinney R. Inhibition of bacterial DNA cytosine-5-methyltransferase by S-adenosyl-L-homocysteine and some related compounds // J. Pharm. Pharmacol. 1984. Vol. 36, N 2. P. 85—89.
8. Goorha R., Granoff A., Willis D., Murti K. The role of DNA methylation in virus replication: inhibition of frog virus 3 replication by 5-azaoytidine // Virology. 1984. Vol. 138, N 1. P. 94—102.
9. Goto K., Numata M., Komura J. et al. Expression of DNA methyltransferase gene in mature and immature neuron as well as proliferating cells in mice // Differentiation. Tohoku Univ., Japan. 1994. Vol. 56, N 1—2. P. 39—44.
10. Harris L.G., Remack J.S., Brenet T. In vitro methylation of the human 0-6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter reduces transcription // Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1217, N 2. P 141—146.
11. Hoffman R. Altered methionine metabolism, DNA methylation and oncogene expression in carci-no-genesis. A review and synthesis // Biochim. Biophys. Acta. 1984. Vol. 738. P. 49—87.
12. Laird P., Jaenisch R. DNA methylation and cancer // Hum. Nol. Genet. 1994. N 3. P. 1487—1494.
13. Leteurtre F., Kohlhagen G., Fesen M., Tanizawa A. Effects of DNA methylation on topoisomerase I and II cleavage activities // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 296, N 11. P 7893—7900.
14. Mazin A. Enzymatic DNA methylation as an aging mechanism // Mol. Biol. 1994. Vol. 28, N 1. P 21—51.
15. Monpellier C., Burgeois C., Rokalj V. Detection of methylcytosine rich in heterochromatin on banded chromosomes. Application to with cells various status of DNA methylation // Cancer Genet. Cytogenet. 1994. Vol. 78, N 1. P. 87—93.
16. Ottaviano V.L., Issa J.P, Pazl F., Smith H. Methylation of the estrogen receptor gene CpG island marks loss of estrogen receptor expression in human breast cancer cells // Cancer Res. 1974. Vol. 54, N 10. P. 2552—2555.
17. Parker M., Judge K., Gevers W. Loss of type I procollagen gene expression in SV40-transformed human fibroblasts is accompanied by hypermethylation of these genes // Nucleic Acids Res. 1982. Vol. 10, N 19. P. 5879—5891.
18. Paul J. General theory of chromosome structure and gene activation in eukaryotes // Nature. 1972. Vol. 238. P. 444—446.
19. Rhodes K., Rippe R., Umezava A., Nehls M. DNA methylation represses the murine alpha 1-collagen promoter by an indirect mechanism // Mol. Cell. Biol. 1994. Vol. 14, N 9. P. 5950—5960.
20. Rideout W., Eversole C., Spruck C., Hustad C. Progressive increases in the methylation status and he-terochromatinization of the myo D CpG island during oncogenic transformation // Mol. Cell Biol. 1994. Vol. 14, N 9. P. 6143—6152.
21. Szyf M., Avraham-Haetzni K., Reifman A. DNA methylation pattern is determined by the intracellular level of the methylase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81, N 11. P. 3278—3282.
22. Weitzman S., Turk B., Milkowski D., Kozlowski K. Free radical adducts induce alteration in DNA cytosine methylation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91, N 4. P. 1261—1264.
