CC BY
76
664(075.8)
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ДРЕЙССЕНЫ И ТЕХНОЛОГИЯ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
О.А. СУДНИК, АС. ЛЫСОВА, О.Я МЕЗЕНОВА
Калининградский государственный технический университет,
236000, г. Калининград, Советский пр., 1; электронная почта: [email protected]
Исследована активность протеолитических ферментов из двустворчатого моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas). Установлено, что дрейссена содержит комплекс протеолитических ферментов, активность которых зависит от температуры, рН среды и физиологического состояния моллюска. Разработана технология получения протеолитиче-ских ферментов из дрейссены.
Ключевые слова: дрейссена, протеолитические ферменты, рН среды, температура.
Протеолитические ферменты (ПФ) эффективно используют в различных отраслях пищевой промышленности. В мясной промышленности ПФ применяют для ускорения созревания мяса и повышения выхода мяса 1-го сорта. В кулинарии применение пептид-гидролаз для обработки мяса перед его приготовлением резво улучшает качество мясных блюд. В молочной промышленности использование протеаз ускоряет созревание сыров вдвое и снижает их себестоимость на 10%. В пивоваренной промышленности применение ферментов позволяет экономить солод, заменяя его несоложеным сырьем. Применение коллагеназы облегчает удаление кожи с плавников ската, кальмаров, темной пленки с брюшной полости у некоторых рыб, снятие чешуи, очистку креветок от панциря и др. Мышечная ткань ряда объектов промысла (пеламида, судак, хек, путассу), которые могли бы составить сырьевую базу для производства слабосоленой деликатесной продукции, имеет низкий уровень активности собственных протеиназ, что не способствует созреванию без дополнительного внесения протеолитических ферментных препаратов, интенсифицирующих процесс протеолиза и созревания [1]. В связи с этим одной из актуальных проблем инженерной энзимологии является поиск новых доступных крупномасштабных сырьевых источников для промышленного получения ферментных препаратов, в первую очередь протеолитического действия.
Цель работы - изучение активности ПФ двустворчатого моллюска дрейссены и разработка технологии получения из нее ферментного препарата протеолитического действия.
Объектом исследования служил двустворчатый моллюск дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas), снятый с грунта Форелевого озера, расположенного в Калининградской области.
Дрейссена широко распространена в озерах Калининградской области, Вислинском и Куршском заливах. В нашей стране она обитает в Каспийском, Азовском и Балтийском морях, а также в многочисленных озерах, лиманах, реках. Широко распространена в Учинском, Рыбинском, Саратовском и Кременчугском водохранилищах; в бассейне рек Невы, Северной Двины и отчасти в бассейне Печоры (р. Ижма), реках Кольского полуострова и Карелии. За пределами нашей страны дрейссена известна в заливе Сагино озера Гурон, реке Ридо озера Онтарио (США и Канада) [2, 3].
Для выделения ПФ использовали свежезамороженного моллюска, хранившегося при температуре -20°С.
Ранее нами были проведены исследования по влиянию сроков холодильного хранения на активность протеолитических ферментов (АПФ) моллюска дрейссе-ны. Установлено, что хранение при температуре (-20 ± 2)°С не приводит к снижению активности ПФ моллюска в течение 5 мес и этот режим позволяет осуществлять заготовку и хранение дрейссены как ферментсодержащего сырья [4].
Известно, что одним из основных свойств ПФ является их способность проявлять максимальную активность при определенном значении рН среды. Представляется возможным, используя влияние рН среды на активность протеолитического комплекса ферментов, определить пути использования максимальной активности пептидгидролаз для технологических целей.
Для определения рН оптимума активности комплекса пептидгидролаз использовали гомогенат мускула дрейссены. Универсальным буфером создавали рН от 1,0 до 11,0. Для предотвращения развития микрофлоры в процессе инкубирования гомогенатов в них добавляли 2% хлороформа.
Зависимость ПФ дрейссены от рН среды оценивали по формольно-титруемому азоту (ФТА), который определяли по методике Шиффа-Зеренсена в модификации [5]. Определение ФТА (азота аминных групп аминокислот и пептидов) основано на способности формалина вступать во взаимодействие, связывать МН2-груп-пы. При этом продукты распада белка из нейтральных соединений переходят в сильные метиленаминокисло-ты, которые оттитровывают щелочью.
На рис. 1 отражено влияние рН среды на активность ферментов дрейссены. Установлено, что автопротео-лиз протекает со значительной скоростью в широком диапазоне рН от 4,5 до 10,5. В этом интервале рН возможно проведение промышленного ферментирования сырья. При этом обнаруживается два ясно выраженных оптимума - 1-й на участке рН 4,0-5,0, который можно принять за пепсиновый, 2-й оптимум - на участке рН 9,0-10,0, этот комплекс протеаз может быть принят за трипсиновый.
Для изучения сезонных изменений протеолитиче-ской активности ферментов дрейссены АПФ определяли также по накоплению концевых аминогрупп методом формольного титрования.
Полученные результаты свидетельствуют (рис. 2), что максимальная активность - 7,5 мг% в час - была в весенние месяцы - апрель-май. В этот период в дрейс-сене интенсивно протекают процессы синтеза белка, и
Е
в С
Рис. 1
8
7
6
о
з- 5
2 4 в
5 3
~I-----1-----1-----1-----1-----1------1-----------1-1--1------г
Янв Март Май Июль Сен Ноя
Рис. 2
он характеризуется как подготовительный период к размножению. Этот период также совпадает по времени с пробуждением моллюсков от зимнего покоя, с повышением температуры воды и увеличением темпа их роста [6]. В осенний посленерестовый период в связи с ослаблением обменных процессов в теле дрейссены отмечена АПФ от 0,78 до 1,5 мг% в час.
Оптимальные значения технологических параметров получения протеолитического ферментного препарата (процесс проведения автопротеолиза мягкого тела дрейссены) установлены путем реализации математического планирования эксперимента с использованием ортогонального центрального композиционного плана второго порядка для двух факторов. При этом параметрами оптимизации математической модели была выбрана совокупная безразмерная характеристика у, состоящая из двух частных откликов: удельной активности комплекса протеолитических ферментов (ПА) и выхода ферментного препарата (к массе сырья без створок).
Активность полученного ПФ определяли по модифицированному методу Ансона (ГОСТ 20264.2-88). Метод основан на гидролизе казеината натрия исследуемым ферментным препаратом до пептидов и аминокислот с последующим их спектрофотометрическим определением. Активность фермента оценивали по количеству тирозина, содержащегося в продуктах протеолиза, не осаждаемых трихлоруксусной кисло-
той. Тирозин определяли по интенсивности окраски, которую эта аминокислота дает с фенольным реактивом Фолина [7]. Активность считали на 1 мг белка в ферментном препарате и выражали как мкг тирози-на/(мг белка • мин), далее по тексту - ед./мг белка.
Расчет оптимальных значений факторов показал, что рациональны следующие: продолжительность ферментации (автолиза) мягкого тела дрейссены - 40 ч при температуре 47°С. План эксперимента и результаты его реализации по моделированию и оптимизации технологии получения протеолитического ферментного препарата представлены в таблице.
На основе полученных данных по характеристике ПФ дрейссены была разработана технология получения ферментного препарата протеолитического действия из моллюска. Для облегчения трудоемкого процесса отделения мягкого тела дрейссены от створок проводили предварительное 2-часовое ферментирование не-разделанного размороженного моллюска, что достаточно для автолиза мускула-замыкателя и раскрытия створок. Отделяли мягкое тело моллюска от створок, массу гомогенизировали и осуществляли автопротео-лиз в течение 40 ч при температуре 47°С, применяя расчетные оптимальные значения процесса. Автолиз вели при естественном для тканей моллюска рН 6,8, что соответствует диапазону рН, при котором автолиз дрейссены протекает со значительной скоростью. Это позволяет исключить дополнительное внесение хими-
Таблица
План эксперимента Частные отклики Обобщенный
Номер Продолжительность ферментации, ч Температура ферментации, °С ПА, ед./мг Выход ферментного параметр
по матрице Х1 натурально т по матрице Х2 натурально Т белка препарата, % оптимизации у
1 + 1 48 +1 60 0,11 47 0,93
2 24 +1 60 0,53 33 0,79
3 + 1 48 -1 40 1,09 53 0,41
4 24 -1 40 0,28 33 0,93
5 + 1 48 0 50 0,34 47 0,79
6 24 0 50 1,30 47 0,32
7 0 36 +1 60 0,26 47 0,84
8 0 36 -1 40 0,61 53 0,64
9 0 36 0 50 1,01 47 0,44
ческих реагентов и обеспечивает высокий экологический уровень технологии получения ферментного препарата. В качестве консерванта, для подавления микробиологического процесса при автолизе тканей моллюска, использовали этиловый спирт в дозировке 7% к массе мягкого тела. Надежность консервирования оценивали по показателю отношения азота летучих оснований к ФТА в процентах. После проведения автолиза смесь направляли на центрифугирование для отделения жидкой фракции (автолизата) от твердого остатка -створок дрейссены вместе с непрогидролизованной частью мускульной ткани. Полученный автолизат сепарировали для удаления липидной фракции, которая из-за высокой способности к окислению ухудшает стойкость ферментного препарата при хранении. Автолизат после сепарирования направляли на сушку, которую проводили под вакуумом при температуре <30°С до массовой доли влаги в готовом продукте 5-8%. Выход сухого ферментного препарата составляет 13-15% к массе автолизата.
Предлагаемая технология при заявленных параметрах позволяет получить протеолитический ферментный препарат активностью не ниже 1,5 ед./мг белка из моллюска дрейссены, значительно расширить сырьевую базу для получения ферментных препаратов про-теолитического действия. Дрейссена образует значительные скопления на небольшой площади, что откры-
вает широкие возможности для ее промысла и практического использования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Биотехнология гидробионтов / О.Я. Мезенова, Л.С. Бай -далинова, В.И. Киселев и др.; Под ред. О.Я. Мезеновой и В.П. Тере -щенко. - Калининград: КГТУ, 2004. - 481 с.
2. Лакомкина Д.О. Сезонная динамика численности личи -нок Dreissena Polymorpha в карьере Прибрежный (Калининградская область) в 2002 г // Эволюция морских экосистем под влиянием все -ленцев и искусственной смерти фауны: Тез. докл. Межцунар. конф. -Ростов н/Д, 2003. - С. 100-102.
3. Старобогатов Я.И. Систематика и палеонтология // Дрейссена Dreissena polymorpha (Pall.) (Bivalvia, Dreissenidae)^^-тематика, экология, практическое значение. - М.: Наука, 1994. -С. 18-46.
4. Судник О.А., Лысова А.СКомпанией; И.В., Шмаров
В.А. Обоснование режимов хранения дрейссены-сырца // Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы: Материалы на -уч.-практ. конф.: Калининград, 4-5 июля 2006 г. / Под. ред. Р.Г. Ва-силова. - М.: МАКС Пресс, 2006. - С. 113-114.
5. Черногорцев А.П. Переработка мелкой рыбы на основе ферментирования сырья. - М.: Пищевая пром-сть, 1973. - 151 с.
6. Ляшенко А.В., Харченко Т.А. Годовая динамика энергетического обмена у дрейссены // Гидробиол. журн. - 1989. - 25. -№ 3. - С. 31-39.
7. ГОСТ 20264.1-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности. - М., 1988.
Поступила 15.06.09 г.
PROTEOLYTIC ENZYMES OF DREISSENA AND TECHNOLOGY THEIR PRODUCTION
O.A. SUDNIK, AS. LYSOVA, O.YA. MEZENOVA
Kaliningrad State Technical University,
1, Sovietsky pr., Kaliningrad, 236000; e-mail: [email protected]
Proteolytic activity of bivalve mollusc Dreissena polymorpha Pallas was investigated. It’s found that dreissena contains proteolytic enzymes complex, activity which depends on temperature, pH, and physiological state of bivalve. Technology of proteolytic production from dreissena was developed.
Key words: dreissena, proteolytic enzymes, pH, temperature.
[641:66.095.91]:613.26
ИНСТАНТ-ПРОДУКТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЕЛЕКТИВНО ИЗМЕЛЬЧЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
С.Д. РУДНЕВ, А.М. ПОПОВ, Е.Е. ПЕТУШКОВА, А.В. СУХОРУКОВ
Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, бЗ00Зб, г. Кемерово, б-р Строителей, 47; тел. : (384-2) 73-40-40, тел/факс: (384-2) 73-40-07, электронная почта: [email protected]
Описана технология приготовления быстрорастворимых гранулированных продуктов - киселя - на основе селективно измельченного нативного плодово-ягодного сырья. Показано, что предлагаемая технология измельчения растительных компонентов делает производство практически безотходным, способствует повышению качества готовых изделий и может применяться для выработки продуктов функционального питания.
Ключевые слова: инстант-продукт, селективное измельчение, растительное сырье, переработка шротов ягод, порошки ягод, кисель, гранулирование.
Богатым источником практически всех необходи- ных преимуществ перед синтетическими стимулятора-
мых организму микронутриентов является раститель- ми: мягкость действия, возможность длительного ис-
ное сырье. При этом растения имеют ряд существен- пользования, отсутствие привыкания и побочных эф-
