CC BY
14
УДК 579.83/.88:579.24.001.66
С.А. Риженко, Г.М. Кременчуцький*, М.О. Бредихта, Т. В. Дикленко, О. В. Дробот, Д. О. Степанський
Дтпропетровська обласна санiтарно-епiдемiологiчна станцiя (гол. лкар - д. мед. н. С.А. Риженко) Дтпропетровська державна медична академiя * кафедра мiкробiологii, вiрусологii, iмунологii та епiдемiологii (зав. - д. мед. н., проф. Г.М. Кременчуцький)
ПРИНЦИПИ КОНСТРУЮВАННЯ Р1ДКИХ ПРОБ1ОТИК1В 13 М1КРОАЕРОФ1Л1В
Ключовi слова: A.viridans, pidrn форма пробютика, живильне середовище, стимулятори росту Key words: A.viridans, liquid form of probiotics, medium, growth stimulators
Резюме. Изучена динамика роста культуры производственного штамма A.viridans № 167 на различных питательных средах и избрана оптимальная питательная среда для получения жидкой формы пробио-тика «А-бактерин». Экспериментально доказана возможность конструирования жидких форм пробиотиков с учетом биохимических аспектов метаболизма пробиотических культур и соблюдением принципов и требований ФАО/ВОЗ. На основании полученных данных разработана принципиальная технологическая схема производства жидкой формы пробиотика «А-бактерин».
Summary. The dynamics of growth of culture of A.viridans N167 production strain on different mediums was studied, an optimum medium was chosen for obtaining of liquid form of probiotics «A-bacterinum». Possibility of constructing of liquid forms ofprobiotics, taking into account biochemical aspects of metabolism of probiotics cultures and observance of principles and requirements of FAO/WHO, is experimentally proved. On the basis of the obtained data the basic technological scheme ofproduction of the liquid form of probiotic «A-bacterinum» is developed.
Перспективним i актуальним напрямом остан-шх роюв е виробництво рщких пробютиюв, яю мають ряд переваг перед сухими [8, 11], але вимагають розробки нових технологш 1х вироб-ництва [1, 2, 4, 5, 13, 14, 15, 16].
Загальновизнана роль, яку вдаграють у шд-тримщ здоров'я людини аерококи та iншi про-бютичш мшрооргашзми [6, 7, 19]. 1хня жит-тедiяльнiсть регулюе сшввщношення мшробю-тиюв макрооргашзму; гальмуе рют ракових кл^ин кишечника; пригшчуе актившсть гншних i патогенних бактерш; стимулюе продукування вгамшв; активiзуе iмуннi процеси; забезпечуе захист вщ кишкових шфекцш; нормалiзуе фун-кци кишечника; бере участь у засвоенш живиль-них речовин, вiтамiнiв i мiкроелементiв.
Сьогодш при лiкуваннi й профiлактицi рiзних захворювань широко використовуються пробю-тики - бактершш сухi або рщю препарати iз жи-вих мшробних культур (аерококiв, бiфiдобак-терiй i лактобактерiй), призначенi для корекци мшрофлори хазя1на та лiкування ряду захворювань. Одним iз таких препарата е «А-бактерин» фссит), що мiстить лiофiльно висушену бiомасу живих бактерiй Aerococcus viridans 167 [10, 12].
На B^MiHy вщ сухого, у рiдкому пробiотику «А-бактерин» аерококи постшно перебувають в активному сташ. Головна перевага рiдкого «А-бактерину» полягае в тому, що бактерп в ньому перебувають у бюлопчно активнiй формi. Свiй корисний вплив вони роблять негайно - вщразу шсля прийому препарату, що випдно вiдрiзняе його вiд аналопчних сухих препаратiв. Крiм живих бактерш, рщю пробiотики мiстять про-дукти життедiяльностi корисних для органiзмy людини бюлопчно активних речовин: незамшш амшокислоти, органiчнi кислоти, вiтамiни, стимулятори iмyнiтетy та вироблення iнтерферонy [16, 18].
У той же час добре вщомо, що аерококи мають ряд особливостей в енергетичному обмш, потребах у ростових факторах, що е певними труднощами у розробцi технологи виробництва рiдкого пробiотика. Аерококи, як мшроаерофши, ростуть тiльки при обмеженому достуш кисню, продукують активнi форми кисню (АФК), що е аутошпб^орами.
Конструювання живильного середовища [9], що враховуе бiохiмiчнi аспекти метаболiзмy про-бютичного мiкроорганiзмy A.viridans, дозволило
розпочати розробку технологи виробництва рщ-кого пробютика «А-бактерин».
При конструюваннi рщкого пробiотика керу-валися наступними засадами:
1. Забезпечення стабшьност властивостей пробютичного мiкроорганiзму.
2. Функцiональне структурування пробютика (мшрооргашзм, середовище вирощування, сти-мулятори, шпбгтори i стабiлiзатори).
3. Використання природних iнгредieнтiв, крiм генетично модифшованих i токсичних.
4. Стандартизацiя пробютика при збер^анш по активностi пробютичного мшрооргашзму i органолептичних властивостях.
Були врахованi вимоги i рекомендаци Про-довольчо! та сшьськогосподарсько1 оргашзаци Об'еднаних Нацiй (ФАО) i Всесв^ньо1 оргашзаци охорони здоров'я (ВООЗ) для нацюналь-них органiв вiдносно пробiотикiв [17].
Одержання бюмаси необхщно1 концентраци виробничого штаму A.viridans № 167 у рщкому живильному середовищi супроводжуеться iстот-ними труднощами.
По-перше, аерококи продукують перекис вод-ню, надлишки якого е iнгiбiторами !х власного росту, що вимагае його нейтралiзацп.
По-друге, аерококи е гетеротрофами i вима-гають присутностi в ростовому середовищi стимуляторiв росту i створення оптимальних умов вирощування.
По-трете, будучи мшроаерофшами, аерококи хоча i мають потребу в киснi для одержання енерги, однак не переносять концентраци кисню, що присутня у пов^р^ Антиоксидантний захист клiтин аерокока здшснюеться функцiонуванням глутатiонпероксидази, супероксиддисмутази, а також за допомогою хiмiчноl реакци мiж шро-виноградною кислотою i водень пероксидом [6].
Метою дослщження був вибiр оптимального середовища на базi рослинно! сировини вирощування аерокоюв за умови вмюту аерококiв у пробiотику не менш 1108 колонiетвiрних оди-ниць (КУО) у 1 мл при збер^анш до 3 мюящв.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛЩЖЕНЬ
Об'ектом дослiдження служила популящя виробничого штаму A.viridans № 167, що вирощу-валася в грибному живильному середовищi (грибний вiдвар гливи звичайно1 -Pleurotus ostre-atus) [12] при 36-370С, рН 5,0 - 8,0 протягом 24 годин.
У середовище додавався гiдролiзат рибного борошна до наявностi в середовищi 150 мг % амiнного азоту. Для нейтралiзацп активних форм кисню, насамперед перекису водню, у середовище додавалися антиоксиданти - вгтамш С и
вiтамiн Е в концентраци 10 мг на 1 л середовища. Для зменшення конвекци кисню в середовищi додавався агар-агар до 0,1%.
Для нагромадження бюмаси A.viridans 167 застосовувалися рiдкi живильш рiзного середовища складу, виготовлеш на основi бульйону грибiв гливи звичайно1: грибний бульйон; грибний бульйон iз рiвнем амiнного азоту 150 мг %; грибний бульйон iз додаванням рiзних вугле-водiв, амiнокислот i вiтамiнiв.
В експеримент використанi рiзнi сполучення й концентраций глюкоза, цисте1н солянокислий, цистин солянокислий, амошю хлорид, амонiю нiтрат, натрда сульфат, калiй водень фосфат, калш водень дiфосфат, магнiй сульфат, шкоти-нова кислота, пантотенат кальцiю, шозит, аденiн, натрiю хлорид, аскорбiнова кислота, вгамш Е, ембрiональна теляча сироватка, глютамшова кислота, глiцин, натрiю пдроселешт, агар-агар.
Бiомасу A.viridans для зааву у рiдке жи-вильне середовище накопичували у пробiрках зi скошеним м'ясо-пептонним агаром (МПА), пiсля чого проводили мшроскошчний i бiохiмiчний контроль чистоти вирощено1 культури. Контроль рiвня концентраци мiкробних клiтин здш-снювали шляхом титрування вирощено1 культури i висiву iз рiдкого живильного середовища на живильнi середовища рiзного складу (МПА, ентерокок-агар, гонокок-агар, живильний агар iз додаванням 1-3% дефiбринованоl кровi, середовище Блаурока).
Залежно вщ схеми дослiду флакони iз пос> вами залишали для шкубаци ще на 24 години у колишньому обсязi або доводили середовищем з аналопчним складом до 200 - 400 мл, шсля чого знову проводили контроль концентраци мшроб-них кттин.
Результати дослiджень обробляли iз вико-ристанням методiв варiацiйноl статистики [3] з розрахунком середшх рiвнiв (М) i помилки се-реднiх величин (т).
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
У таблиц 1 представлеш результати дослщ-жень характеру росту A.viridans на живильних середовищах iз рiзними добавками.
Як видно iз даних таблицi, найбiльш штен-сивний рiст A.viridans вiдзначаеться при вирощу-ваннi в грибному бульйош iз вмiстом амiнного азоту 150 мг %.
Проведено дослщження впливу цисте1ну солянокислого на накопичення живих клiтин A.viridans у грибному бульйош iз вмiстом амш-ного азоту 150 мг % i 1% глюкозою. Даш дослщження представлеш у табл.2.
07/ Том XII/ 2
37
Таблиця 1
Ростов! характеристики через
24 години росту при 37°С
Таблиця 2
Вплив цистеТну солянокислого на р1ст
Найменування Концентрация мшробних кл1тин при вис1в1 на МПА (КУО/мл; М±т)
середовища
без глюкози 1з 1% глюкозою
Середовище № 1 (МПБ) 5,7^107±3,5^106 3,1107±2,5106
Середовище № 2 (грибний бульйон) 2,4106±0,8105 1,2106±0,6105
Середовище № 3 (грибний бульйон 1з вмктом амiнного азоту 150 мг % ) 1,4108±0,9107 1,6108±0,5107
Середовище № 4 (МПБ з1 стимулюючою сум1шшю) 1,7107±0,5106 3,9107±1,1106
о 100 200 400
1,6107 ± 0,3106 1,4107± 0,1107 1,6107±0Д107
Прим1тки: 1. МПА - м'ясо-пептонний агар, 2. МПБ - м'ясо-пептонний бульйон, 3. Стимулююча сумш (1% глюкоза, 0,001% цистеш солянокислий, 1% альгшат натрто)
Данi, що наведет у таблиц 2, свщчать, що цисте1н солянокислий стимулюе рют аерококiв, але його концентрацiя понад 100 мг/л особливого значення не мае.
У результат проведених дослiджень була об-рана основа живильного середовища, що е не-вщ'емною частиною рщко1 форми пробютика «А-бактерин» наступно1 рецептури: грибний бульйон, амiнний азот (NH2) - 150 мг %, глюкоза - 1%, цистеш солянокислий - 100 мг/л.
Були вивчеш властивосп клгтин A.viridans, що отриманi на стандартних середовищах i про-понованому середовищi культивування, для вста-новлення аутентичносп штаму мiкроорганiзму. На рис. 1 представлена морфолопя клiтин, отри-маних при вирощуванш у казе1новому бульйош, i на рис. 2 - морфолопя кттин, отриманих у за-пропонованому середовищi.
Рис. 1. М1крофотограф1я кл1тин A.viridans 167, Рис. 2. М1крофотограф1я кл1тин A.viridans 167, що вирощеш у казеТновому бульйонi. що вирощеш у грибному бульйонi. Забарвлення
Забарвлення за Грамом. Збшьшення х 1000 за Грамом. Збшьшення х 1000
1,8106 ± 0,3105
Як видно на рисунках, морфолопчних вщ-мiнностей A.viridans не спостерiгаеться, що свщ-чить про вiдсутнiсть впливу зазначених живиль-них середовищ на одну iз ознак аерококу -
морфолопю клiтини.
Пiдтвердження вiдсутностi впливу дослщже-них живильних середовищ на бiохiмiчнi власти-востi A.viridans 167 надаш у табл.3.
Таблиця 3
Бюх1м1чш властивостi A.viridans 167, що вирощувався на р1зни\ живильних
Тест або субстрат
РеакцН
A.viridans, A.v1r1dans,
вирощений вирощений у
у казешовому грибному
бульйон1 бульйон1
Рамноза
Ксилоза
Сахароза
Матт
Крохмаль
Рафшоза
1нозит
Арабiиоза
Сорб1т
Глюкоза (газ)
Желатиноза
Мальтоза
Дульцит
Арг1и1и
Лактоза
Глюкозний
бульйон
Сольовий бульйон Н1тратний бульйон Оксидна актившсть Плазмокоагулаза
Придонний р1ст
Придонний р1ст
Примiтки: +
ферментуеться
ферментащя середовища , - - середовище не
Як видно i3 даних табл. 3, штами A.viridans 167, що вирощувалися на рiзних середовищах, щентичш за сво!ми бiохiмiчними властивостями. Перевiрка антагонiстичних властивостей двох штамiв i вiдношення ix до антибактерiальних препаратiв також не виявила вщмшностей.
ВИСНОВКИ
1. Визначено оптимальне живильне середовище для одержання рщко! форми пробютика "А-бактерин®".
2. Експериментально доведена можливють конструювання рiдкиx форм пробютиюв i3 ура-хуванням бiоxiмiчниx аспектiв метаболiзму про-бiотичниx культур та дотриманням вимог ФАО/ВООЗ.
3. Розроблена принципова технолопчна схема виробництва рщко! форми пробiотика "А-бак-терин®".
4. Встановлена iдентичнiсть культур A.viridans 167, що вирощеш на рiзниx живильних середовищах, за морфолопчними, бiоxiмiчними i антагонiстичними властивостями, а також вщно-шенням до антибактерiальниx препаратiв.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Биотехнологические аспекты конструирования питательных сред для культивирования лактоба-цилл / Р.Х. Тимербаева, Е.В. Бобкова, М.М. Туйгунов и др. // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Материалы Всерос. науч. конф.
- Томск, 2004. - С. 133-136.
2. Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Междунар. Конгресса. - М.: ЗАО "Максима", РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. -544с.
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика / Пер. с англ. - М.: Практика, 1998. - 459с.
4. Калинина Т.Э. Питательные среды для культивирования бифидобактерий (биохимические подходы к конструированию): Автореф. дис. ... канд. мед. наук.
- Ростов - На - Дону, 1995. - 23с.
5. Кигель Н.Ф. Технологии бактериальных препаратов для функциональных продуктов и биологически активных добавок: Автореф. дис. ... д-ра. тех. наук. - К., 2003. - 41с.
6. Кременчуцький Г.Н. Бюлопчш властивосп А-бактерину // Мед. перспективи. - 2001. - Т.6, №3. -С.90-97.
7. Молокеев А.В. Байбаков В.И., Карих Т.Л. Разработка жидкого концентрата бифидобактерий для применения в медицине: Отчет 1911/НСО. - Коль-цово: ГНЦ ВБ «Вектор», 1995. - 37с.
8. Новый высокопродуктивный производствен-
ный штамм бифидобактерий / Байбаков В.И., Молокеев А.В., Карих Т.Л., Никулин Л.Г. // Биотехнология. Теория и практика. - 2000. - № 3-4. - С.55-56.
9. Пат. 53270, UA, МПК7 12N102 // C12N1 / 02 (C12N1 / 02,C12R1;645). Живильне середовище для видшення та щентифшацп мiкроорганiзмiв / Г.М. Кременчуцький, О.М.Мединська. № заявки 2002043159; Заявл. 17.04.2002. Опубл. 15.10.2004. Бюл. № 10.
10. Пат. 53301, UA, МПК7 C12N1/20,C12P1/04. Споаб одержання пробютику з аерокошв / Г.М. Кременчуцький. № заявки 2002043334; Заявл. 22.04.2002. Опубл. 15.03.2005. Бюл. № 3.
11. Питательная среда для производства жидкого концентрата бифидобактерий / Андреева М.А., Молокеев А.В. и др. // Биотехнология. - 1998. - № 4. - С.76-80.
12. Риженко С.А., Черняев С.А., Кременчуцький С.Г. Змша бюлопчних властивостей усередиш популяцп Aerococcus viridans // Мед. перспективи. -2002. - Т.7, № 2. - С. 18-21.
13. Розробка живильного середовища для одержання бюмаси Staphylococcus aureus / Осолодчен-ко Т.П., Паачник Т.О., Школаенко В.М. та ш. // Анализ Мечшков. ш-ту. - 2005. - № 1. - С. 22.
14. Романов В.Е. Оценка возможности использования питательных основ и сред из непищевого сырья для микробиологических и биотехнологических целей // Биотехнология, экология, медицина: Материалы III-IV Междунар. науч. семинаров 2001-2002гг. / Под
07/ Том XII/ 2
39
ред. А.Ф.Труфанова. - М.; Киров: ЭКСПРЕСС, 2002. -С. 78-84.
15. Технология сохранения жидких концентратов бифидобактерий и лактобацилл на основе стабилизированной активированной низкоминерализованной воды в метастабильном состоянии "МИС-РТ" - 2005 г. Сборник № 37-5. [Электронный ресурс]. http: // ikar.udm.ru/sb37-5.htm.
16. Тимербаева Р.Х., Баталова Т.А. Конструирование питательных сред для производства препаратов - пробиотиков // Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и
тест-систем: Материалы III Междунар. науч.-практ. конф. - Махачкала, 2001. - С. 20-21.
17. FAO/WHO. Guidelines for the evaluation of pro-biotics in food. - 2002. [Электронный ресурс]. http: // www.who.int/foodsafety/fs_management/en/ probio-tic_guidelines.pdf.
18. Hsu C.A., Yu R.C., Chou C.C. Production of be-ta-galactosidase by Bifidobacteria as influenced by various culture conditions // Int. J. Food. Microbiol. - 2005. - Vol. 104, N 2. - P.197-206.
19. Quality assurance criteria for probiotic bacteria / Tuomola E., Crittenden R., Playne M. et al. // Am. J.Clin. Nutr. - 2001.-T.73 -S.393-398.
♦
УДК: 615.214:615.015.2
О. О. Ярош, В.Й. Мамчур
ПРОТИСУДОМНА АКТИВН1СТЬ НООТРОПНИХ ПРЕПАРАТ1В ТА IX КОМБ1НАЦ1Й
Дтпропетровська державна медична академiя кафедра фармакологи та технологи лтарських засобiв (зав. - д. мед. н., проф. В.Й. Мамчур)
Ключовi слова:
антиконвульсанти, ГАМК, мелатонгн, коразоловi судоми Key words: anticonvulsants, aminalon, melatonin, corazol convulsions
Резюме. Ноотропные средства у-ГАМК (аминолон) и мелатонин проявляют выраженные противосудорожные эффекты, которые потенцируют при совместном применении. В экспериментах на мышах совместное их применение удлиняет латентные периоды судорожного синдрома, существенно повышают выживаемость животных при отравлении судорожным ядом - коразолом. Комбинация, состоящая из аминалона и мелатонина, по противосудорожному эффекту не уступает, а по некоторым показателям существенно превышает эффекты профильных антиконвульсантов.
Summary. Nootropic drugs such as aminobutyric acid (aminalon) and melatonin manifest marked anticonvulsive effects, which potentiate in their combined using. In experiments on mice their combined use prolongs latent periods of convulsive syndrome, significantly raises survival of animals in poisoning with corazol. A combination, which includes aminobutyric acid (aminalon) and melatonin, on its anticonvulsant effect does not give in but significantly exceeds specific profile anticonvulsive drugs effects by some indicators.
Епшепия - одне з найбшьш поширених за-хворювань нервово1 системи, особливо в пед> атричнш практищ. Вщ 5 до 7 людей на 1000 населення страждають на цю хворобу, а якщо розглядати такий стан, як фебрильш судоми, то ця цифра становить близько 5 % всього дитячого населення [12]. Незважаючи на широке впро-вадження останшх досягнень в антиконвуль-сантнш терапп, близько 20 % хворих на епшеп-сда залишаються без медикаментозного контролю судомних нападiв [22]. Однак i епшепсш, i препарати-антиконвульсанти як попередшх по-
колшь (барб^урати, вальпроати), так i протису-домний арсенал нового поколшня - ламотрид-жин, тотрамат, фелбамат, т1агабш та iH., мають ютотш ro6i4Hi ефекти. Вони виражено знижують штелектуальний iндекс (IQ), послаблюють когш-тивнi процеси, зменшують об'ем пам'ятi та швидюсть вiдтворення енграм. Для зменшення тяжкост цих ускладнень у комплекснiй терапи пiслясудомних станiв можуть використовуватися ноотропш препарати.
Здатнiсть окремих препаратiв групи ноотро-пiв виявляти протисудомнi властивосп вiдома з
