CC BY
61
УДК 616-08-039.76
ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПРОЦЕССА РЕГЕНЕРАЦИИ У ЛЮДЕЙ СТАРШИХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП
А.В. Печерский 1, В.И. Печерский1, А.Б. Смолянинов2, В.Н. Вильянинов3, Ш.Ф. Адылов2, В.Ф. Семиглазов4
1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия;
2 Покровский банк стволовых клеток, Санкт-Петербург, Россия;
3 Центр крови и тканей Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия;
4 НИИ онкологии им. профессора Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург, Россия
APPLICATION OF CELLULAR TECHNOLOGIES FOR RESTORATION OF PROCESS OF REGENERATION AT PEOPLE OF THE SENIOR AGE GROUPS
A.V. Pechersky 1, V.I. Pechersky 1, A.B. Smolyaninov2, V.N. Velyaninov3, S.F. Adylov2, V.F. Semiglazov4
1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnicov, St. Petersburg, Russia;
2 Pokrovsk bank of stem cells, St. Petersburg, Russia;
3 The center of blood and fabrics of Army medical academy of S.M. Kirov, St. Petersburg, Russia;
4 N.N. Petrov Scientific-Research Institute of Oncology, St. Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2014
Статья посвящена актуальной теме - восстановлению процесса регенерации у людей старших возрастных групп. Коммитированные клетки-предшественники и дифференцированные клетки могут делиться ограниченное число раз и не в состоянии обеспечить регенерацию тканей на протяжении всего онтогенеза. Обновление тканей на протяжении такого длительного периода невозможно без участия специализированной системы, ответственной за регенерацию. Данная система представлена плюрипотентными стволовыми клетками, которые способны дифференцироваться во все типы соматических клеток и в линию половых клеток, а также обладают способностью к самообновлению на протяжении всей жизни организма. Результаты исследования позволяют считать, что численность пула плюрипотентных стволовых клеток у людей старших возрастных групп можно восстановить путём трансфузии мононуклеарной фракции периферической крови от молодых доноров 18-23 лет одних с реципиентом групп крови и пола (патент РФ № 2350340).
Ключевые слова: плюрипотентные стволовые клетки, регенерация, тестостерон.
This manuscript is devoted to the vital topic - restoration of process of the regeneration at people of the senior age groups. Cells-predecessors and differentiated cells can divide a limited number of times and are not capable of providing regeneration of tissues during all of ontogenesis. The updating of tissues during such a long period is impossible without the participation of a specialized system responsible for regeneration. The given system is submitted by stem cells which are capable of being differentiated in all types of somatic cells and in a line of genital cells, and also have ability to self-update during the whole life of an organism. Results of research allow to consider, that the number of a pool of pluripotent stem cells at people of the senior age groups can be restored by a transfusion of mononuclear fraction of peripheral blood from young donors of 18—23 years of one blood types and a floor with the recipient (The patent of the Russian Federation № 2350340).
Key words: stem cells, regeneration, testosterone.
После 40 лет у людей наблюдается снижение пула плюрипотентных стволовых клеток [1], приводящее к атрофии и фиброзным изменениям во всех тканях и органах. В частности, у мужчин отмечается атрофия яичек, проявляющаяся развитием фиброза базальной мембраны канальцев, уменьшением количества клеток
Лейдига и другими изменениями. Примерно одинаковая скорость снижения численности пула плюрипотентных стволовых клеток у людей с увеличением возраста определяет одинаковую интенсивность склерозирования у них большинства тканей, составляющую около 1% в год после 35-40 лет [2, 3]. Склерозирование тка-
ней яичек у мужчин старше 35-40 лет приводит к уменьшению численности клеток Лейдига и последующему прогрессирующему снижению продукции тестостерона примерно на 1 % в год [3]. Последнее было названо частичным возрастным андрогенным дефицитом (Partial androgen defishency of aging men / PADAM) [4, 5].
Цель исследования - восстановление процесса регенерации у людей старших возрастных групп.
Материалы и методы
Пациенту 60 лет врачами-трансфузиоло-гами Покровского банка стволовых клеток (Санкт-Петербург) проводилась регенеративная терапия в целях восстановления процесса обновления тканей (восстановления регенерации). Было проведено 7 переливаний моно-нуклеарной фракции периферической крови с промежутками в 2-3 месяца между ними. Заготовка мононуклеарной фракции периферической крови производилась от одного молодого донора 20 лет с одинаковыми с реципиентом полом (мужской пол) и антигенными системами: АВ0, Rh-фактор, фенотип Rh-фактора, Kell (патент РФ № 2350340). Заготовка мононуклеарной фракции периферической крови от донора производилась на сепараторе клеток крови Amicus с использованием специализированной одноразовой стерильной расходной системы Амикус MNC-Кит. При первом переливании с целью формирования химеризма для минимизации антигенной нагрузки производился редуцированный забор мононуклеарной фракции периферической крови - 5 циклов сепарации (ориентировочный объем интраоперационно обработанной крови донора - 1500 мл). Для последующих переливаний, осуществляемых с целью восстановления обновления тканей (восстановления регенерации), мононуклеарная фракция периферической крови получалась путём проведения 15 циклов сепарации при аппаратной обработке 4600 ± 100 мл крови донора. Перед забором мононуклеарной фракции периферической крови донор проходил стандартное обследование. В течение 5 дней до проведения операции донорского лейкоцитофереза производилась подготовка донора, включавшая подкожное введение филгастрима (фирменное название - нейпомакс) 78 млн ЕД / 30 + 48 млн ЕД (780 мкг / 300 + 480 мкг) один раз в день, ежедневно. Последнее введение филгастрима производилось в день сепарации. В конце пе-
реливания мононуклеарной фракции периферической крови пациенту внутривенно однократно вводился преднизолон в дозе 50 мг для уменьшения выраженности посттрансфузион-ных реакций. Начиная с первых часов после переливания, пациенту вводился филгастрим (нейпомакс) 78 млн ЕД / 30 + 48 млн ЕД (780 мкг / 300 + 480 мкг) один раз в день, ежедневно в течение 10 дней. Введение колониестимули-рующего фактора (филгастрима) проводилось с целью преодоления перелитыми мононукле-арными лейкоцитами точки рестрикции при их попадании в чужеродную среду крови реципиента, а также для последующей стимуляции их деления и увеличения их числа. Дополнительно с этой же целью пациенту назначался мети-лурацил 0,5 по 1 таблетке четыре раза в день в течение 1 месяца. До начала регенеративной терапии и на её фоне пациенту по поводу частичного возрастного андрогенного дефицита проводилась андроген-заместительная терапия с индивидуально подобранной дозой препарата тестостерона - 1,6 мл 1% андрогеля в сутки, который наносился однократно утром на кожу живота. После 4-го введения мононуклеар-ной фракции периферической крови (по мере восстановления обновления тканей, которое сопровождалось увеличением уровня общего тестостерона) у пациента доза 1% андрогеля была уменьшена до 0,5 мл в сутки.
Определение гемопоэтических клеток-предшественников (ГКП) CD34+ периферической крови проводилось методом проточной цитоме-трии на проточном цитометре FC500 с использованием набора Stem-Kit Reagents, Beckman Coulter Company, Франция. Чувствительность метода определения концентрации гемопо-этических клеток-предшественников (ГКП) CD34+ периферической крови составила 0,5 кл/ мкл. Коэффициент вариации составил 10,7%.
Определение общего тестостерона и общего PSA проводилось иммуноферментным способом. Венозную кровь брали утром натощак в фиксированное время (8.00 - 10.00). Определение концентрации общего тестостерона и общего PSA проводилось наборами DPC (США). Чувствительность метода и коэффициент вариации составили для общего тестостерона - 0,02 нмоль/л и 8%, для общего PSA - 0,01 нг/мл и 8%.
Результаты и их обсуждение
Через три месяца после седьмого переливания мононуклеарной фракции периферической
крови содержание гемопоэтических клеток-предшественников (ГКП) CD34+ периферической крови увеличилось в 5 раз (с 1 до 5 клеток в 1 мкл). Сравнение полученного результата с данными 117 здоровых лиц разных возрастных групп с максимальным значением CD34+ периферической крови у молодых людей - 6,5 кл/мкл и минимальным значением у лиц более старшего возраста - 0,5 кл/мкл показало, что у пациента после завершения курса переливаний мононуклеарной фракции периферической крови от 20-летнего донора содержание CD34+ периферической крови приблизилось к максимальному значению, характерному для молодых лиц. Таким образом, у 60-летнего пациента удалось восстановить процесс регенерации до уровня молодых лиц. При этом СОЭ у наблюдаемого пациента после седьмой трансфузии уменьшилась с начальных 6 мм/час до 3 мм/час (табл. 1, рис. 1, 2, 3).
Таблица 1 Изменение содержания гемопоэтических
клеток-предшественников (ГКП) в периферической крови при переливании пациенту 60 лет мононуклеарной фракции периферической крови от донора 20 лет
Показатели Переливания мононуклеарной фракции периферической крови
До переливания Через 3 мес.
после 7-го переливания
Гемопоэтические
клетки- 5
предшественники (ГКП) CD34+, кл/ 1
мкл
СОЭ, мм/час 6 3
13.1 Ожидаемые диапазоны контрольных значений
Дня иирндеинннн НИЗПВЗОНСв №РМЭЛЬНЫХ ЗНаЧиНИИ СНЧГМ )•< < :, ОбраЗЦЫ КрОРЙ ГрупПЫ "Я I испытуемы* (пи 11Г; 53 мужчин М5ЭЖ&НШИН) Данное 1»йспад0ваннвйылп выполнение независимой исследовательской центра.
ПрЗЙЫ ДЛИ ШЙОгакратнпго иссладовднкя КЯЖЛОГО образца были НРКГОТООЛОНЫ G COOTOetCTUHH с требованиями инструкцни-вкладьниа S1om-Kit Fteo^eeti Дли юлучггиин значений CD454 CD344 и С034Ч применили ручной гейтинг к анализ.
ClBTnCTimBCKHti Л№)ЛИЗ РрОВоДВН исхрря из предположения о нетауиоовском рзсп редепинни полученных ДОЧМЫХ. На ОСКОЬаНИИ :>'Л* рртулъптов ДПП ВНВЛИДа /1;|.|.|> t tj ы.п применен ■■еларамитрн^всчий (робаотный) пцп*ол. Получинь. энач&ннн CW5+. СD3H' н СЗна'Юним. рыоажанныо н пднмича* лбсолю таопз копичвст ва «летои Кл и<; CD454 а 0Г.З-'* и пропили at ойщпгп чнс.па лейкоцитов <С034иЗ) приведены р следующей таБгмце. цельная кровь здорового человека: Контрольный диалазомы значений
Ручной метод (ста- п
C04S* <кл t мкл) CD34* (кл 1 мкл} CQ341 f%)
б ильный анализ} Мин Мл кс Среди СО Мим Макс Среди СО Мин Макс Среди СО
Ручной 117 2919,5 11240.0 64692 1635.2 0,50 6,50 2.36 1,14 0.035 D.600 0.052 0.056
Рис. 1. Содержание гемопоэтических клеток-предшественников (ГКП) CD34+ в периферической крови у здоровых людей разных возрастных групп (выдержка из инструкции Stem-Kit Reagents, Beckman Coulter Company, Франция)
JS )AWD MA3LE WD LEtKS AND :03» POS AND СЭ45 DWJFS LiftS
i
(A CD^I* HPC
у
i........1323
F8
[NOT ( BEADS ) AND VIABLE AND LEUKS AND CD34 P( Region 011s'|iL Number %Totnl %Gated
ALL 1 15 0.01 100.00
CD34+ HPC 1 13 0.01 86.67
Рис. 2. Протокол определения гемопоэтических клеток-предшественников (ГКП) CD34 + в периферической крови (до переливания мононуклеарной фракции периферической крови)
Drstrlpilon Kit: Ion
!.t-u>3XUi Count :.'>: 1 LEUKS
Jci33xstc Cutitil lube 2 LEUKS
.3' j-X^rTCt .C J } I CftinU
AbHilulc ШН+ uibc 1 CDJJ-HPC
Absolute CDM+101*3 сим- ни:
Absolute ■ i i): !.:■, . <' mlrol (3)14• Hi\
Avg Ab* CdjJ+Oant ci.
RL'VIH
M.M3M 9S.9]7% 6673.000 67 I05!i 91358%
5.D00
CtUjJUL CAL
ото
ыы.о
40
6.0 0.00
Рис. 3. Протокол определения гемопоэтических клеток-предшественников (ГКП) CD34+ в периферической крови (через 3 месяца после 7-го переливания мононуклеарной фракции периферической крови)
После четвёртого переливания мононуклеар-ной фракции периферической крови у пациента наблюдалось увеличение содержания общего тестостерона, что позволило внести изменения в проводимую андроген-заместительную терапию - уменьшить дозу 1% андрогеля с 1,6 мл в сутки до 0,5 мл в сутки. После уменьшения дозы 1% андрогеля содержание общего тестостерона снизилось до прежнего достаточного уровня (табл. 2).
Значения общего PSA оставались нормальными. После седьмого переливания мононукле-арной фракции периферической крови по причине нормализации продукции тестостерона восстановленным числом собственных клеток Лейдига планируется отмена андроген-замести-тельной терапии.
У позвоночных большинство популяций дифференцированных клеток подвержены обновлению - непрерывно происходит погибель старых клеток и их замещение новыми клетками. В некоторых случаях новые дифференцированные клетки взрослого организма могут образовываться простым удвоением, при котором образуются две дочерние клетки того же типа (например, гепатоциты). В ряде тканей конечное состояние дифференцировки несовместимо с клеточным делением. Обновление клеток в таких тканях может происходить за счёт клеток камбиальной зоны (например, базальные клетки эпидермиса, сперматогонии). Камбиальные клетки представляют собой специализированные клетки-предшественницы, которые могут делиться, но уже проявляют начальные признаки дифференцировки. При делении они дают потомство, часть которого продолжает диффе-ренцировку, а часть остаётся низкодифферен-цированным [6].
Коммитированные клетки-предшественники и дифференцированные клетки, вступив на путь дифференцировки или завершив его, мо-
гут делиться ограниченное число раз [6] и не в состоянии обеспечить регенерацию ткани на протяжении всего онтогенеза. Обновление тканей на протяжении такого длительного периода невозможно без участия специализированной системы, ответственной за регенерацию. Данная система представлена плюрипотентными стволовыми клетками, которые способны дифференцироваться во все типы соматических клеток и в линию половых клеток, а также обладают способностью к самообновлению на протяжении всей жизни организма. Популяция плюри-потентных стволовых клеток неоднородна: при преимущественной локализации плюрипотент-ных стволовых клеток в костном мозге, клетки с подобными характеристиками обнаруживаются по данным ряда авторов [1, 7, 8] и в других производных мезодермы: в жировой ткани, в мышцах, в сердце и в дерме. Такая пространственная организация системы позволяет ей наиболее эффективно обеспечивать процессы регенерации тканей, а также предоставляет возможность взаимодополнения и взаимозамещения отдельных её составляющих.
Данная структура имеет характерные для системы механизмы саморегуляции. Число плю-рипотентных стволовых клеток и камбиальных клеток-предшественников, а также их соотношение с дифференцированными клетками регулируется макроорганизмом. Соотношение данных клеток определяется конкретными задачами репарации. Плюрипотентные стволовые клетки являются отдельной ветвью дифферен-цировки эмбриональных клеток [6].
Учитывая, что в эксперименте диссоциированные клетки легче агрегируются с аналогичными клетками [6], донорские плюрипотентные стволовые клетки в большей степени агрегируются с плюрипотентными стволовыми клетками костного мозга с образованием колоний в нём. Последующая дифференцировка плюрипотент-
Таблица 2
Изменение уровня общего тестостерона у пациента 60 лет при проведении переливаний мононуклеарной фракции периферической крови от донора 20 лет
Показатели
Переливания мононуклеарной фракции периферической крови
до переливания после 4 переливаний после 5 переливаний
Общий тестостерон, нмоль/л 13,5 26,6 17,6
PSA общий, нг/мл 1,27 1,60 1,16
Доза 1% андрогеля, мл 1,6 1,6 0,5
ных стволовых клеток в клетки камбиальной зоны с пополнением их состава и последующая дифференцировка последних способствует замене погибших старых клеток. Универсальность механизма регенерации, осуществляемого посредством плюрипотентных стволовых клеток, было подтверждено ранее выявленным постепенным замещением клеток реципиента клетками донора после трансплантации стволовых клеток периферической крови [3].
Формирование и регенерация тканей, осуществляемые путём миграции клеток, представляют собой более сложный механизм по сравнению с их делением [6]. У старых клеток вследствие десиалирования клеточной поверхности нарушается защита концевых углеводных остатков мембранных гликоконъюгатов - на их поверхности появляется свободная манноза. Данные клетки становятся доступными для распознавания. При контакте макрофагов со старыми клетками происходит их активация и включение первой линии иммунной защиты -реакций естественного иммунитета [9]. Некроз или апоптоз и последующий лизис клетки сопровождаются развитием демаркационного воспаления. Некротические процессы (некроз, апоптоз) происходят на протяжении всего онтогенеза как проявление нормальной жизнедеятельности организма. В организме постоянно происходят гибель и разрушение старых клеток с последующей регенерацией, что и обеспечивает нормальную его жизнедеятельность [9, 10].
Продуктами инкреции макрофагов, активированных Т-клеток, а также эпителиальных и эн-дотелиальных клеток, клеток стромы кроветворных и лимфоидных органов, образующихся при воспалении, являются клеточные факторы роста, колониестимулирующие и хемотаксические факторы, а также интерлейкины [9]. При некрозе (или апоптозе) специфическая комбинация образующихся клеточных ростовых факторов способствует пролиферации и дифференцировке клеток-предшественниц, пролиферации фибро-бластов. Образование колониестимулирующих факторов способствует пролиферации стволовых клеток для их последующего поступления в камбиальные зоны или непосредственно в места гибели клеток. Инкреция клеточных ростовых факторов и колониестимулирующих факторов продолжается до полного восстановления повреждённой ткани [9].
Направленная миграция плюрипотентных стволовых клеток невозможна без образования специфических хеморецепторов. Их появлению
должны предшествовать ряд промежуточных этапов. Первоначально необходимо связывание и доставка антигенов в лимфатические узлы или иные лимфоидные органы антиген-представ-ляющими клетками, которые активизируются в ответ на десиалирование старых и интенсивно пролиферирующих клеток с появлением на их поверхности гликопротеинов, содержащих концевую маннозу.
Активация плюрипотентных стволовых клеток с образованием у них комплементарных рецепторов осуществляется через посредничество антиген-представляющих клеток. Анти-ген-представляющие клетки во вторичных лим-фоидных органах встречаются с лимфоцитами. Лимфоциты попадают в лимфатические узлы из посткапиллярных венул, прикрепляясь к эн-дотелиальным клеткам и протискиваясь между ними. Затем они мигрируют в лимфатические сосуды, по которым поступают в лимфатические узлы [6]. Такая постоянная циркуляция позволяет обеспечить опосредованные антиген-пред-ставляющими клетками контакты Т-хелперов не только с Т-киллерами [9], но и с плюрипо-тентными стволовыми клетками с формированием у них соответствующих рецепторов [3].
Вероятность встречи Т-хелперов и плюрипо-тентных стволовых клеток (при их постоянной циркуляции через вторичные лимфоидные органы) с антиген-представляющими клетками значительно выше, по сравнению с возможностью возникновения контакта между ними самими. По аналогии с процессом активации цитоток-сических Т-клеток, следующим этапом должно быть оказание Т-хелперами (через Т-клеточный рецептор и молекулу МНС II класса с презентуемым антигеном) активирующего действия на антиген-представляющие клетки. Активированные антиген-представляющие клетки через молекулу МНС II класса с антигеном (по аналогии с взаимодействием с Т-клеточным рецептором цитотоксической Т-клетки) связываются с плюприпотентными стволовыми клетками с последующим образованием тканеспецифи-ческих рецепторов на их поверхности. Появление тканеспецифичных рецепторов определяет пути миграции лимфоцитов [9] и стволовых клеток [3] к местам воспаления, включая места гибели старых клеток.
Активирование Т-хелперами (ТЬ1) (при посредничестве антиген-представляющих клеток) цитотоксических Т-клеток сопровождается па-ракринным и аутокринным образованием ^-2. Среди прочих функций, ^-2 способен предо-
хранять активированные клетки от апоптоза. Соответственно, у активированных Т-киллеров появляется экспрессия гена Ьс1-2 и некоторых других подобных генов [9]. Аналогичным образом экспрессия гена Ьс1-2 позволяет предотвратить развитие апоптоза у мигрирующих в область регенерации после опосредованного антиген-представляющими клетками контакта с Т-хелперами стволовых клеток. Дополнительное усиление экспрессии гена Ьс1-2 у коммити-рованных стволовых клеток происходит при их миграции в межклеточное пространство между эндотелиальными клетками, продуцирующими ^-7. Экспрессия гена Ьс1-2 позволяет высокочувствительным к неблагоприятным условиям среды стволовым клеткам выжить в условиях воздействия высокоактивных продуктов (активные формы азота и кислорода, TNFa, INF-y и другие), образующихся, в частности, при гибели старых клеток и развитии сопутствующего воспаления.
Образование хемоаттрактантов (в числе которых выступают антигены МНС I класса) и формирование у плюрипотентных стволовых клеток комплементарных им рецепторов (через представление аутоантигенов молекулами МНС II класса), представляется наиболее подходящим объяснением направленной миграции плюрипотентных стволовых клеток к определённым погибшим клеткам определённых тканей [3].
Участие плюрипотентных стволовых клеток и возможное посредничество антиген-пред-ставляющих клеток, Т-хелперов/Т-супрессоров в комплексе с молекулами МНС I класса/ II класса позволяют предполагать, что именно иммунная система ответственна за регенерацию тканей организма. Значительное преобладание аутоантигенов (99%) среди пептидов, представляемых молекулами МНС II класса, а также существенное преобладание субпопуляции CD4+-лимфоцитов (хелперов) над CD8+-киллерами в крови и в лимфе показывает, что участие в процессах регенерации является важнейшей (а может быть и ведущей) функцией иммунной системы [3].
Заселение тимуса стволовыми клетками необходимо не только для последующего образования Т-клеток, но и для поддержания нормального функционального состояния эпителия тимуса - для формирования эпителиального ретикулума и кортико-медуллярной структуры тимуса в онтогенезе [9]. Эпителиальные клетки тимуса составляют микроокружение
развивающихся тимоцитов и служат источниками сигналов, генерируемых при прямых клеточных контактах. В процессе данных контактов клетки микроокружения тимуса передают Т-лимфоцитам информацию об антигенах собственных тканей, а также, по-видимому, формируют у них тип ответных реакций на презентуемые антигены [9]. Активация Т-киллеров происходит в ответ на презентацию антигенов пораженной вирусом клетки или чужеродной ткани [9]. Напротив, презентация аутоантиге-нов погибших старых клеток приводит к последующей активации плюрипотентных стволовых клеток с образованием у них тканеспецифичных рецепторов (определяющих их направленную миграцию) и восстановлению соответвующих тканей [3].
При переливании аллогенных плюрипотент-ных стволовых клеток эпителиальные клетки микроокружения тимуса будут формироваться, в том числе, и из донорских клеток. Соответственно, в процессе обучения Т-лимфоциты дополнительно начнут воспринимать в качестве «своих» антигены донора. Данная закономерность, по-видимому, определяет развитие иммунологической толерантности, развивающейся, по данным ряда авторов, при трансплантации тканей или органов после предварительного переливания крови (плюрипотентных стволовых клеток/костного мозга) от единого донора, а также после предварительной трансплантации клеток зародыша в эксперименте [6].
Переливание стволовых клеток периферической крови / костного мозга приводит к формированию химерной особи. Данная особь приобретает два типа плюрипотентных стволовых клеток с двумя различными генотипами. Последующая миграция стволовых клеток двух видов в тимус и обновление его собственных клеток микроокружения приводит к формированию Т-лимфоцитов, воспринимающих антигены собственного организма и антигены донора как «свои». Данное заключение было подтверждено ранее выполненным исследованием, выявившим отсутствие реакции отторжения у пациентов через 1 год после пересадки стволовых клеток периферической крови на клетки буккального эпителия, в 50-100% случаев имевшие генотип донора [3]. Теоретически химерному реципиенту могут быть пересажены от донора стволовых клеток любые ткани или органы без риска последующего отторжения. Закономерно в представленном клиническом случае на фоне
множественных трансфузий мононуклеарной фракции периферической крови от одного молодого донора (при соответствии группы крови и пола) у пациента не отмечалось реакции иммунной системы. В частности, у пациента не было повышения СОЭ. Напротив, СОЭ имело тенденцию к снижению, поскольку на фоне восстановления процесса обновления тканей снижалась стимуляция митогенной активности, что, соответственно, приводило к снижению реакции иммунной системы на избыточно пролиферирующие клетки. На фоне химеризма и сопутствующей ему иммунологической толерантности наблюдалось увеличение числа гемопоэтических клеток предшественников CD34+ в периферической крови реципиента. Данный эффект был обусловлен дифференцировкой CD34+ из обладающих большим пролиферативным потенциалом клеток мононуклеарной фракции молодого донора, которые образовали колонии в костном мозге реципиента (табл. 1, рис. 2, 3).
Представление о бессмертии плюрипотент-ной стволовой клетки - её способности к неограниченному числу делений - является в определённой степени условным. Пролиферативное поведение клеток на протяжении онтогенеза управляется долговременными внутриклеточными программами. Взаимоотношения между долговременными и кратковременными механизмами контроля определяются, по-видимому, программой развития, реализуемой через клеточные факторы роста, колониестимулирую-щие факторы, продукты, образованные при экспрессии протоонкогенов и другие факторы [6].
С возрастом количество клеток, которые по данным маркирования могут быть отнесены к плюрипотентным стволовым клеткам, постепенно уменьшается [1]. Для поддержания нормального состояния в организме каждую секунду должно образовываться несколько миллионов новых клеток [6]. Одновременно каждую секунду происходит некроз (или апоптоз) такого же количества старых клеток, приводящий к множеству локальных участков воспаления. У лиц старших возрастных групп некротизированные старые клетки не возмещаются адекватным количеством низкодифференцированных клеток-предшественников (или стволовых клеток), что делает невозможным завершение процесса регенерации. Учитывая, что плотность клеточной популяции обратно пропорциональна концентрации факторов роста в среде, у данной категории лиц при незавершённом процессе регенера-
ции в местах гибели старых клеток и обеднении камбиальных зон из-за сокращения численности пула стволовых клеток компенсаторно увеличивается образование клеточных ростовых факторов (для стимуляции пролиферации низ-кодифференцированных клеток камбиальных зон), а также увеличивается образование коло-ниестимулирующих факторов (для стимуляции пролиферации плюрипотентных стволовых клеток). Продукция данных факторов для оказания дополнительного стимулирующего воздействия на пролиферацию клеток усиливается. Повышенная продукция ростовых факторов у людей старших возрастных групп из-за сокращения пула стволовых клеток и обеднения камбиальных зон не приводит к образованию адекватного количества клеток-предшественников, обеспечивающих замену погибших старых клеток. Более того, с возрастом количество клеток камбиальных зон только уменьшается. Соответственно, данная стимуляция с увеличением возраста усиливается и становится постоянной. Данная избыточная стимуляция митогенной активности, наблюдаемая во всех тканях у людей старших возрастных групп, неотвратимо приводит к метаплазии, а затем к малигнизации. Последняя может наступить раньше при наличии предрасполагающих наследственных факторов и при местном действии канцерогенных факторов (как внешних, так и внутренних, образующихся, например, при хроническом воспалении), которые способны ускорить наступление злокачественной трансформации определённой ткани [3].
В условиях преобладания гибели старых клеток над процессами регенерации у лиц старших возрастных групп, по-видимому, стимулируется образование как плюрипотентных стволовых клеток костного мозга, так и образование стволовых клеток жировой и некоторых других видов тканей. Вовлечение жировой ткани в процессы компенсации приводит к увеличению её массы [3, 11].
При недостаточности количества плюрипо-тентных стволовых клеток и, соответственно, камбиальных клеток в области некроза (или апоптоза), при невозможности завершения регенерации данного участка ткани уровни клеточных ростовых факторов будут возрастать, вызывая интенсивную пролиферацию фибро-бластов. В данных условиях количество фи-бробластов будет значительно преобладать над количеством камбиальных клеток, приводя к образованию рубца. Соотношение камбиаль-
ных клеток и фибробластов определяет выраженность образования рубцовой ткани. При миграции адекватного числа стволовых клеток и формировании достаточного количества камбиальных клеток, по-видимому, участок некроза (или апоптоза) может полностью восстановиться без развития фиброзной ткани [3].
Возрастная инволюция тимуса сопровождается снижением его массы, а также замещением эпителиального компартмента соединительной тканью и производными фибробластов - ади-поцитами. После 50-60 лет отмечается снижение количества Т-клеток (в большей степени Т-хелперов). Возрастное снижение Т-хелперов может негативно отразиться на формировании тканеспецифичных рецепторов плюрипотент-ных стволовых клеток и, соответственно, на процессе регенерации. Среди популяций тимо-цитов наиболее сильно убывает численность их незрелых кортикальных форм - CD4+CD8+. Тем не менее, в тимус продолжают постоянно поступать костномозговые предшественники, из тимуса продолжают эмигрировать зрелые Т-клетки, хотя интенсивность этого процесса снижается [9]. Возрастное снижение плюрипо-тентных стволовых клеток негативно сказывается не только на заселении тимуса лимфоидными элементами, но и на поддержании нормального функционального состояния эпителия тимуса -на формировании эпителиального ретикулума и кортикомедуллярной структуры тимуса.
При частичном возрастном андрогенном дефиците нарушения развития андроген-зави-симых клеток морфологически проявляются атрофией состоящих из них тканей [12, 13, 14, 15, 16]. Как показало ранее проведённое исследование [3], стволовые клетки периферической крови у мужчин имеют андрогенные рецепторы и, соответственно, являются андроген-за-висимыми. Возрастное снижение продукции половых гормонов негативно сказывается на развитии и пролиферации зависимых от них плюрипотентных стволовых клеток, что является дополнительным негативным фактором, способствующим уменьшению их количества. Последующее нарушение регенерации тканей гонад (яичек у мужчин с уменьшением клеток Лейдига, инкретирующих тестостерон) свидетельствует о формировании порочного круга с феноменом взаимного отягощения [3].
Восстановление пула плюрипотентных стволовых клеток у лиц старших возрастных групп обеспечивает их достаточное поступление в камбиальные зоны с последующим возмещением
старых некротизированных клеток адекватным количеством молодых коммитированных клеток. За этим следует обратное развитие описанных выше патологических процессов. Для обеспечения непрерывно происходящего процесса обновления тканей у лиц старших возрастных групп требуется постоянное поддержание нормальной численности пула плюрипотентных стволовых клеток [3].
Потенциальная возможность обновления эпителиальных клеток тимуса (осуществляющих обучение Т-лимфоцитов) перелитыми аллогенными плюрипотентными стволовыми клетками с последующим восприятием их тка-неспецифичных антигенов иммунной системой реципиента как «своё» позволяет считать данный способ наиболее перспективным для нормализации численности пула плюрипотентных стволовых клеток у лиц старших возрастных групп. После переливания плюрипотентные стволовые клетки образуют свой пул, представленный их колониями в костном мозге реципиента, который принимает участие в обновлении подавляющего числа тканей организма. Индивидуум становится химерой. Ввиду распространённости химеризма в естественных условиях искусственное формирование химерной особи через переливание аллогенных плюрипотент-ных клеток может широко использоваться для восстановления регенерации у людей старших возрастных групп [3].
Эффективность восстановления регенерации при переливании аллогенных плюрипо-тентных стволовых клеток лицам старших возрастных групп будет зависеть от разницы между возрастом молодого донора и возрастом более старшего реципиента. В данном случае принципиальное значение имеет этап долгосрочной внутриклеточной программы, на котором находятся клетки донора и клетки реципиента. Наличие долгосрочных внутриклеточных программ плюрипотентных стволовых клеток, определяющих их пролиферативный потенциал (способность поддерживать необходимую численность собственного пула), существенно отличает плю-рипотентные стволовые клетки молодых лиц от аналогичных клеток лиц старших возрастных групп. Восстановление пула плюрипотентных стволовых клеток у людей старших возрастных групп может быть достигнуто переливанием мо-нонуклеарной фракции периферической крови. Первичное переливание стволовых клеток периферической крови не сопровождается ответом иммунной системы реципиента, посколь-
ку у них подавлена экспрессия всех антигенов МНС I класса, за исключением HLA-G. Аналогичный эффект у стволовых клеток пуповинной крови (в дополнение к имеющемуся гематопла-центарному барьеру) позволяет предотвратить отторжение плода [6, 17]. Учитывая развитие иммунологической толерантности, обусловленной химеризмом, переливание стволовых клеток от одного донора может быть выполнено многократно до получения нормализации численности пула плюрипотентных стволовых клеток у пациента.
Несмотря на формирование химеризма и восприятие иммунной системой реципиента клеток донора как «своих», для макрофагов (нейтро-филов и других) переливаемой донорской мо-нонуклеарной фракции периферической крови антигены реципиента остаются «чужими». Вероятно, с этим были связаны кратковременные посттрансфузионные реакции у реципиента, для уменьшения выраженности которых сразу после завершения трансфузии проводилось однократное введение преднизолона.
В представленном случае трансфузия моно-нуклеарной фракции периферической крови от 20- летнего донора позволила у 60-летнего реципиента в пять раз увеличить количество гемопо-этических клеток-предшественников (ГКП) периферической крови без реакции на донорские клетки со стороны иммунной системы реципиента. Показательным является сравнение полученного результата с ранее опубликованными данными обследования 117 здоровых лиц различных возрастных групп (табл. 1, рис. 1, 2, 3). При обследовании здоровых лиц было выявлено максимальное значение CD34+ периферической крови у молодых людей - 6,5 кл/мкл и минимальное значение - у лиц более старшего возраста - 0,5 кл/мкл. Сравнение количества CD34+ в периферической крови у наблюдавшегося пациента с данными контрольными значениями показывает, что у пациента после завершения курса из 7 переливаний мононуклеарной фракции периферической крови от 20-летнего донора содержание CD34+ периферической крови приблизилось к максимальному значению, которое характерно для молодых людей. Таким образом, переливание мононуклеарной фракции периферической крови от 20-летнего донора позволило у 60-летнего пациента восстановить процесс регенерации (табл. 1, рис. 1, 2, 3).
При существенной разнице в возрасте между молодым донором и реципиентом старших возрастных групп пролиферативный потенциал
плюрипотентных стволовых клеток донора существенно превосходит аналогичный показатель реципиента. Это приводит к доминированию пула плюрипотентных стволовых клеток донора в ответ на образование колониестимули-рующих факторов реципиента. Соответственно, обновление подавляющего числа клеток тканей реципиента осуществляется за счёт перелитых и образовавших колонии в костном мозге плю-рипотентных стволовых клеток донора. В данных условиях для уменьшения антигенной нагрузки оптимальным является использование для переливания плюрипотентных стволовых клеток от одного донора (или, что менее желательно, от ограниченного числа доноров) [3].
Участие перелитых плюрипотентных стволовых клеток в обновлении подавляющего числа тканей организма, включая ткани эндокринных органов, требует учёта целого ряда факторов. Переливание стволовых клеток периферической крови от донора одного пола реципиенту противоположного пола может оказать негативное влияние на регуляцию половых гормонов. При увеличении образования гормонов противоположного пола повышается риск развития различных сердечно-сосудистых заболеваний. Соседство клеток от индивидуумов разных полов в одной ткани, вероятно, будет сопровождаться различными реакциями несовместимости. Реакции несовместимости будут развиваться также при переливании стволовых клеток периферической крови от донора реципиенту, имеющих различные группы крови. В частности, это будет происходить из-за диф-ференцировки части перелитых плюрипотент-ных стволовых клеток в клетки эритроидного ростка кроветворения с образованием из них эритроцитов, имеющих отличные от эритроцитов реципиента антигены [3].
Различия, связанные с полом и группами крови, появились на ранних этапах эволюции. Формирование всех регуляторных систем организма человека в процессе филогенеза происходило с учётом данных факторов. Так, антигены системы АВ0 присутствуют не только на эритроцитах, но и на многих других клетках человека, а также экспрессируются большим числом микроорганизмов. Антигены системы АВ0 локализованы в углеводной части гликопро-теинов. Структура этих углеводов, как и углеводов, определяющих близкую систему групп крови - Льюис, зависит от экспрессии генов, определяющих активность ферментов, транспортирующих терминальные сахара при синте-
зе олигосахаридных молекул [17]. По этой причине переливание плюрипотентных стволовых клеток в составе стволовых клеток периферической крови или костного мозга, которые дифференцируются в том числе в клетки эритроид-ного ростка, должна осуществляться от донора реципиенту одного пола, имеющих одинаковые группы крови (патент РФ № 2350340). Благодаря соблюдению этих принципов, у представленного пациента реакций иммунной системы не наблюдалось (табл. 1).
Нарушение процесса обновления эндокринных органов приводит к развитию гормонального дисбаланса, оказывающего существенное влияние на факторы внеклеточной среды, ускоряющие клеточное старение. В частности, при возрастном снижении продукции тестостерона у мужчин наблюдается увеличение уровней таких индукторов апоптоза, как глюкокорти-коиды, фактор некороза опухоли а (TNF-а), активные формы кислорода и азота [11, 18]. Для повышения эффективности переливания - для сохранения жизнеспособности перелитых плюрипотентных стволовых клеток - пациенты нуждаются в дополнительном назначении андроген-заместительной терапии в индивидуально подобранной дозе [19] до нормализации у них пула плюрипотентных стволовых клеток и восстановления собственной продукции тестостерона. Данное положение было также реализовано у представленного пациента (табл. 1, 2).
Параллельно с переливанием людям старших возрастных групп мононуклеарной фракции периферической крови от молодых доноров с постепенным восстановлением у них пула стволовых клеток возможна дополнительная стимуляция регенерации отдельных тканей с выраженными атрофическими и фиброзными изменениями. Например, для восстановления регенерации кожи пациенты могут быть направлены к косметологу для проведения различных видов пилинга или аппаратных методов восстановления кожи. Микротравматизация кожи, наносимая при проведении данных процедур, приводит к развитию асептического воспаления, подобного тому, которое возникает при гибели старых клеток [20]. Гибель клеток вызывает миграцию в места повреждения макрофагов, являющихся одновременно антиген-представляющими клетками. Происходит существенное увеличение доставляемых макрофагами к Т-хелперам аутоантигенов клеток кожи. В ответ на увеличение поступления тка-неспецифичных аутоантигенов, не поражённых вирусами собственных клеток, Т-хелперы начи-
нают формировать соответствующие им рецепторы у большего числа стволовых клеток, мигрирующих к местам альтерации, а также к другим участкам кожи, имеющим сходные тканеспеци-фичные антигены MHC I типа. Увеличение миграции стволовых клеток к коже при проведении пилинга или аппаратных процедур восстановления кожи у людей старших возрастных групп после трансфузий им мононуклеарной фракции периферической крови от молодых доноров не будет наносить ущерба регенерации других тканей благодаря достаточности восстановленного у них пула стволовых клеток, способного покрыть все возникающие потребности. Аналогичный дополнительный эффект стимуляции регенерации определённых тканей можно получить при назначении пациентам препаратов, полученных из аналогичных ксеногенных тканей, которые содержат общие с ними тканеспецифичные антигены.
Заключение
Плюрипотентные стволовые клетки являются универсальным механизмом регенерации, сформированным в процессе эволюции. Возрастное снижение количества плюрипотент-ных стволовых клеток нарушает процессы обновления тканей, включая ткани эндокринных органов. Развивающийся гормональный дисбаланс усугубляет происходящие изменения. Взаимное отягощение развивающихся патологических процессов приводит к формированию порочного круга. Соответственно, у людей старших возрастных групп повышается риск развития онкологических заболеваний, прогрессируют атрофические и склеротические процессы в подавляющем числе тканей, нарастают деструктивные изменения соединительной ткани (с уменьшением её прочностных характеристик). Перспективным способом обратного развития данных патологических процессов может стать трансфузия аллогенных плюрипотентных стволовых клеток в составе мононуклеарной фракции периферической крови, заготовленной от молодых доноров (1823 лет) с одинаковыми полом и группами крови с реципиентами. Количество необходимых трансфузий определяется наступлением восстановления у реципиентов численности пула стволовых клеток.
Литература
1. Тепляшин, А.С. Характеристика мезен-химальных стволовых клеток человека, вы-
деленных из костного мозга и жировой ткани / А.С. Тепляшин, С.В. Коржикова, С.З. Шарифуллина, Н.И. Чупикова, М.С. Ростовская, И.П. Савченкова // Цитология. - 2005. -Т. 47, № 2. - С. 130—135.
2. Тареева, И.Е. Нефрология / И.Е. Тареева. -М.: Медицина, 1995. - Т. 1. - 496 с.
3. Печерский, А.В. Некоторые аспекты процесса регенерации, осуществляемой посредством плюрипотентных стволовых клеток / А.В. Печерский, В.И. Печерский, М.В. Асеев,
A.В. Дробленков, В.Ф. Семиглазов // Цитология. - 2008. - Т. 50, № 6. - С. 511-520.
4. Bremner, W.J. Loss of circadian rhythmicity in blood testosterone levels with aging in normal men / W.J. Bremner, M.V. Vitietto, P.N. Prinz // Clin. Endocrin. Metab. - 1983. - Vol. 56. -P. 1278-1281.
5. Gray, A. Age, disease, and changing sexhormone levels in middle-aged men : Results of the Massachusetts male aging study / A. Gray, H.A. Feldman, J.B. McKinlay, C. Longcope // Clin. Endocinol. - 1991. - Vol. 73, № 2. - P. 1016-1025.
6. Alberts, B. Molecular biology of the cell /
B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson - Moscow: Mir, 1994. - Т. 1. - 517 p., Т. 2. - 539 p., Т. 3. - 504 p.
7. Toma, J.G. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin /J.G. Toma, M. Akhavan, K.J. Fernandes, F. Barnabe-Heider, A. Sadikot, D.R. Kaplan, F.D. Miller // Nat. Cell Biol. - 2001. - Vol. 3. - P. 778-784.
8. Zuk, P.A. Human adipose tissue is source of multipotent stem cells / P.A. Zuk, M. Zhu, P. Ashjian, D.A. De Ugarte, J.I. Huang, H. Mizuno, Z.C. Alfonso, J.K. Fraser, P. Benhaim, M.H. Hedrick // Mol. Biol. Cell. - 2002. -Vol. 13. - P. 4279—4295.
9. Ярилин, А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.
10. Струков, А.И. Патологическая анатомия / А.И. Струков, В.В. Серов. - М.: Медицина, 1993. - 688 с.
11. Печерский, А.В. Влияние частичного возрастного андрогенного дефицита на развитие метаболического синдрома / А.В. Печерский,
В.Ф. Семиглазов, В.И. Мазуров, А.И. Карпи-щенко, В.И. Печерский, Н.Н. Зыбина, Н.И. Давыдова, В.Ю. Кравцов, С.Н. Прошин, М.Г. Ско-робогатых, О.Б. Лоран // Лабораторная диагностика. - 2006. - № 4. - С. 12-19.
12. Лопаткин, Н.А. Руководство по урологии / Н.А. Лопаткин. - М.: Медицина, 1998. -Т. 3. - 672 с.
13. Ryde, CM. Steroid and growth factor modulation of aromatase activity in MCF7 and T 47D breast carcinoma cell lines / C. M. Ryde, J.E. Nicholls, M. Dowsett // Cancer Res. - 1992. -Vol. 52. - P. 1411-1415.
14. Sporn, M.B. The war on cancer / M.B. Sporn // Lancet. - 1996. - Vol. 347. - P. 1377-1381.
15. Берштейн, Л.М. Гормональный канцерогенез / Л.М. Берштейн. - СПб.: Наука, 2000. -200 c.
16. Печерский, А.В. Изменение экспрессии рецепторов стероидных гормонов при развитии частичного возрастного андрогенного дефицита (PADAM) / А.В. Печерский, В.Ф. Семиглазов, Б.К. Комяков, Б.Г. Гулиев, А.И. Горелов, А.И. Новиков, В.И. Печерский, Н.Н. Симонов, А.В. Гуляев, И.А. Самусенко, М.С. Вонский,
A.Г. Миттенберг, О.Б. Лоран // Цитология. -2005. - Т. 47, № 4. - С. 311-317.
17. Roitt I. Immunology / I. Roitt, J. Brostoff, D. Male. - Moscow: Mir, 2000. - 582 p.
18. Печерский, А.В. Изменение уровня ци-токинов у пациентов с раком предстательной железы после орхиэктомии / А.В. Печерский,
B.Ф. Семиглазов, О.Б. Лоран, В.И. Мазуров, В.Ф. Карпищенко, В.Ф. Никифоров, Н.М. Калинина, Л.Б. Дрыгина, Н.И. Давыдова, М.Г. Скоробогатых // TERRA MEDICA nova, специальный выпуск «Лабораторная диагностика». - 2003. - № 2. - С. 26-30.
19. Печерский, А.В. К вопросу о диагностике и лечении частичного возрастного андрогенного дефицита / А.В. Печерский // Вестник Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования. - 2010. - Т.2, № 4. -
C. 30-37.
20. Серов, В.В. Воспаление / В.В. Серов, В.С. Пауков. - М.: Медицина, 1995. - 640 с.
А.В. Печерский
Тел.: +7-921-931-42-98
E-mail: [email protected]
