CC BY
42
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ... 61
УДК 616-006.81-08:615.371/.372 И.В. Манина, НМ. Сапрыкина, А.М. Козлов, И.Н. Михайлова, И.Н. Григорьева, Н.Н. Касаткина, АЮ. Барышников ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ЦЕЛЬНОКЛЕТОЧНОЙ GM-CSF-СЕКРЕТИРУЮЩЕЙ противоопухолевой вакцины ПУТЕМ ПРЕИНКУБАЦИИ С ЦИТОКИНАМИ
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Манина Ирина Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной терапии метастазов нИи ЭДиТО
Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)612-80-08 e-mail: [email protected]
Статья поступила 25.12.2010., подписана в печать 05.05.2011.
Резюме
На экспериментальной модели меланомы В16 F10 мышей in vivo изучена возможность повышения эффективности биотерапии с помощью цельноклеточной противоопухолевой GM-CSF-секретирующей вакцины путем преинкубации клеток вакцины в присутствии цитокинов. При культивировании клеток меланомы в присутствии INF-y резко повышается экспрессия МНС I и II классов. Вакцины, полученные на основе модифицированных геном GM-CSF-клеток, после их преинкубации в среде, содержащей INF-y в концентрации 10 нг/мл и времени экспозиции 48 ч, оказывают более выраженное профилактическое и терапевтическое действие. При сочетанном применении биотерапии на основе GM-CSF-секретирующих клеток, инкубированных в присутствии INF-y, и хирургическом удалении первичного опухолевого узла отмечен наилучший терапевтический эффект. Полученные результаты создают предпосылки для оптимизации режимов проведения вакцинотерапии в клинической практике.
Ключевые лова: меланома, биотерапия, цельноклеточная противоопухолевая GM-CSF-секретирующая вакцина, IFN-y, TNF-a.
I.V. Manina, N.S. Saprikina, A.M. Kozlov, I.N. Mikhaylova, I.N. Grigorieva, N.N. Kasatkina, A. Y. Barishnikov. THE INCREASING OF GM-CSF PRODUCED VACCINE EFFICIENCY BY INHIBITION THE CELLS WITH CYTOKINES
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow Abstract
We have studied the effect of incubation of GM-CSF-produced vaccine with different cytokines in order to increase the efficiency of antitumor response. Here we show that after cultivation of melanoma cells with INF-y the expression of MHC I and II classes considerably increases. The incubation of vaccine with INF-y at the concentration 10 ng/ml for 48 hours has more expressed preventive and therapeutic effects. The therapeutic effect was more effective if we combined the surgical resection of primary tumor with biotherapy bassed on GM-CSF-produced vaccine. The data obtained allow to optimize the regimen of vaccinotherapy in clinical practice.
Key words: melanoma, biotherapy, antitumor cell-whole GM-CSF-produced vaccine, IFN-y, TNF-a.
Введение
Опыт клинического применения GM-CSF-сек-ретирующих вакцин из транзиторно трансфицированных аутологичных опухолевых клеток пациентов подтвердил эффективность такого вида биотерапии опухолей человека [3; 6; 9; 10].
Одной из главных причин малой эффективности противоопухолевых цельноклеточных вакцин является низкая иммуногенность самих опухолевых клеток. Плохое распознавание опухолевых клеток Т-лимфоцитами происходит вследствие неадекватной презентации антигенов [1; 2]. Злокачественная трансформация меланоцитов и опухолевая прогрессия часто ассоциируется с потерей антигенов МНС 8].
Данные, свидетельствующие об увеличении экспрессии МНС под действием !№-у, известны [12; 15]. Ш№у повышает экспрессию антигенов МНС I и II классов на разных клетках и может индуцировать их экспрессию на тех клетках, которые не экспрессируют MHC конститутивно, что делает опухоль
более чувствительной к эффекторам иммунной системы [13]. Тем самым IFN-y повышает эффективность презентации антигенов и способствует их распознаванию Т-лимфоцитами [14].
Таким образом, восстановление экспрессии комплексов МНС на поверхности опухолевых клеток имеет принципиальное значение для реализации нормального противоопухолевого иммунного ответа [17]. Представляется необходимым контролировать экспрессию OAA и антигенов МНС I и II классов в опухолевых клетках для приготовления на их основе аутологичных и аллогенных вакцин, а в случае алло-генных вакцин вести отбор клеточных линий, стабильно продуцирующих соответствующие опухолеассоциированных антигены [7].
Несмотря на обилие работ, посвященных способам повышения эффективности биотерапии, данная проблема остается по-прежнему актуальной [5; 11]. В ходе настоящего исследования апробирован метод повышения иммуногенности цельноклеточных противоопухолевых вакцин in vitro с помощью преинкубации клеток с цитокинами IFN-y и TNF-a.
Материалы и методы
Исследование выполнено на мышах линии C57Bl/6, самцах массой 22-25 г. в количестве до 2000 особей (полученные из питомника лабораторных животных РАМН «Столбовая»). Для индукции развития меланомы вводили 1х105 клеток B16F10 мышей, которые по своему иммунофенотипу наиболее полно воспроизводят модель меланомы человека [16; 18]. Формирующиеся опухоли измеряли дважды в неделю, объем опухоли определяли по формуле:
V=DU х D х (D^), где
Dmax равен максимальному диаметру опухоли,
Dj - диаметру, перпендикулярному максимальному.
Для вакцинотерапии использовали облученные на источнике у-излучения Агат-Р с применением 60Co (в дозе 100 Гр) клетки меланомы B16F10, секретирующий GM-CSF клон BG. При иммунизации каждой мыши вводили подкожно 1х106 клеток. Клетки культивировали в СО2-инкубаторе в стандартных условиях в среде DMEM (ПанЭко, РФ) с добавлением 10 %-ной телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС, производство HyClone, USA), 10 мг/мл гентамицина (ПанЭко, РФ) при 37 °С и 5% СО2. Смену культуральной среды проводили каждые 48 ч. При достижении монослоя 50 % при смене культуральной среды вводили исследуемый цито-кин: рекомбинантный мышиный IFN-y (kat № 315-
05, PetroTech Inc., USA) или рекомбинантный мышиный TNF-a (kat № 315-01А, PetroTech Inc., USA). Криоконсервацию проводили в жидким азоте.
Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухоли и динамике продолжительности жизни мышей, антиметастатический - по массе и количеству метастатических колоний в легких в соответствие со стандартными методиками. Первичные опухоли (достигшие размера 700-1000 мм3) у животных удаляли хирургическим способом на фоне гексеналового наркоза (100 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно).
Оценку уровня экспрессии антигенов МНС I и МНС II проводили проточно-цитофлуориметри-ческим методом на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), укомплектованном аргоновым лазером (длина волны 488 нм), с использованием программного обеспечения CELLQuest.
Результаты и обсуждение
Жизнеспособность клеток, культивированных 12 и 24 ч в присутствии INF-y при концентрации 5 и 10 нг/ мл культуральной среды не отличалась от контроля (количество погибших клеток составило менее 5 %). Было отмечено, что присутствие INF-y в среде значительно повышает способность клеток к дифференцировке: выявлено выраженное увеличение гиперпигментированных гра-нулсодержащих клеток, снижение количества делящихся клеток. На рис. 1. (см. вклейку) представлены результаты обзорной микроскопии клеток GM-CSF-секретирующего клона BG, культивированные 48 ч в присутствии INF-y (концентрация 10 нг/мл культуральной среды), по сравнению с контролем на рис. 2. Морфологические свойства клеток, культивированных в присутствии TNF-a при концентрации 25; 50; 100 нг/мл культуральной сре-
ды по описанной ранее методике при 12-; 24- и 48часовом режимах не менялись. При культивировании в присутствии TNF-a в концентрации 100 нг/мл культуральной среды в течение l2 ч гибель клеток составила более 30 %. Данная концентрация в ходе дальнейших экспериментов не применялась в связи с выраженным цитотоксическим эффектом.
Преинкубация клеток В16 F10 клон BG в течение 48 ч в среде, содержащей INF-y в концентрации 5 нг/мл повышала экспрессию МНС II до 14 %, а в концентрации 10 нг/мл - до 16 %. Время инкубации имело принципиально важное значение: 24часовая инкубация была не эффективна. TNF-a оказывал гораздо менее выраженное влияние на экспрессию клетками В16F10 клон BG антигенов МНС II класса. При определении экспрессии МНС I класса было обнаруженное выраженное влияние INF-y. При культивировании клеток в присутствии INF-y в течение 48 ч (в концентрации 5 нг/ мл и l0 нг/мл) экспрессия МНС I достоверно увеличилась на 92 и 97 % соответственно (р<0,05). При культивировании клеток в присутствии TNF-a в концентрации 50 нг/мл в течение 48 ч выявлено увеличение экспрессии только в l0 раз по сравнению с контрольной группой. Данные представлены в виде диаграмм на рис. 3-4.
Оценку эффекта биотерапии проводили в профилактическом (вакцину вводили животным за 5-7 суток до трансплантации опухолей) и терапевтическом (вакцину вводили через 5-7 суток после трансплантации опухолей) режимах. В качестве сравнения применялась цельноклеточная противоопухолевая вакцина, приготовленная по аналогичной технологии без добавления цитокинов в среду (интактная).
В ходе проведения данных экспериментов было выявлено появление инфильтратов на месте введения вакцины. Данный процесс отражает индукцию иммунной реакции на месте введения вакцины по типу ГЗТ и степень ее выраженности, что свидетельствует об иммуногенности вакцины [4]. Динамика их появления и размеры были более выражены в группе животных, получавших INF-y -модифицированную вакцину.
Выявлено ингибирующее действие вакцины на развитие опухолей на месте трансплантации опухолевых клеток. Средняя продолжительность жизни животных группы, получавших IFN-y модифицированную in vitro цельноклеточную секретирующую GM-CSF вакцину, составила 53,1+3,0 суток, а увеличение продолжительности жизни на 78 % (95 %-ный ДИ 69,9+86,1), достоверность различий с контрольной группой р<0,05. Средняя продолжительность жизни животных группы, получавших интактную цельноклеточную секретирующую GM-CSF вакцину, составила 46,6+4,5 суток, а увеличение продолжительности жизни на 57 % (95 %-ный ДИ 47,3+66,7). Средняя продолжительность жизни животных контрольной группы составила 29,7+4,0 суток.
На 52 сутки после трансплантации опухолевых клеток и при вакцинации по заявляемому способу роста опухоли не наблюдалось у 72 % животных (95 %-ный ДИ 63,2+80,8), достоверность различий с контрольной группой р<0,05. При вакцинации с использованием интактной цельноклеточной секретирующей GM-CSF вакцины роста опухоли не выявлено у 50 % животных (95 %-ный ДИ 40,2+59,8). В контрольной группе отмечена 100 % гибель животных в связи с прогрессией опухолевого роста. С целью контроля воспроизводимости результатов проведена серия опытов по схожим схемам, в которых получены идентичные данные.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ... 63
Эффективность профилактического применения вакцин выразилась и в значительном увеличении средней продолжительности жизни вакцинированных животных по сравнению с контрольными. По этому клинически значимому критерию применение INF-y модифицированной GM-CSF-секретирующей вакцины было также наиболее эффективным.
Сравнительная оценка эффективности интакт-ной, модифицированной с помощью INF-y и модифицированной с помощью TNF-a цельноклеточной GM-CSF-секретирующей противоопухолевой вакцины, представлена в виде диаграмм на рис. б; б. Показано достоверное увеличение УПЖ (р>0,05) по сравнению с контрольной группой животных, которым не проводили профилактическую вакцинотерапию.
Терапевтическое применение интактной и модифицированной преинкубацией в среде, содержащей цитокины (TNF-a или INF-y), GM-CSF-секретирую-щей вакцины в режиме монотерапии не оказывает влияния на продолжительность жизни мышей с развившимся опухолевым процессом.
Это может быть связано с множеством факторов, в том числе развитием большой опухолевой массы. У всех животных, получавших разные виды GM-CSF-секретирующей противоопухолевой вакцины, отмечено появление выраженных инфильтратов на месте вакцинации, что свидетельствует о развитии реакции по типу ГЗТ [4].
Цель заключительного этапа состояла в попытке скомпоновать рациональную схему сочетанного применения противоопухолевой вакцины (модифицированной in vitro преинкубацией с цитокинами) и XT. В работе использованы циклофосфамид в дозе 350 мг/кг однократно и цисплатин в дозе 8 мг/кг однократно. Циторедуктивное действие высокодозной XT сопряжено с выраженной, а зачастую тотальной иммуносупрессией. Для коррекции этого побочного эффекта XT в схему включена трансплантация КМ. Данные представлены в табл. На основании полученных результатов показано, что комбинированная терапия не превысила эффективности цитостатика в режиме монотерапии по отношению к росту первичного опухолевого узла. Сочетанное применение высокодозной химиотерапии, вакцинотерапии с применением модифицированной преинкубацией in vitro в присутствии ци-токинов INF-y и TNF-a цельноклеточной противоопухолевой GM-CSF-секретирующей вакцины и биотерапии (внутривенном введении 1х10б клеток костного мозга, полученных от сингенных интактных животных) по сравнению с проведением высокодозной химиотерапии в режиме монотерапии оказывало умеренный терапевтический эффект, достоверно отличающийся от контрольной группы животных, р<0,05; от группы животных с проведенной трансплантацией костного мозга в режиме монотерапии, р<0,05. Выявлено превосходство INF-y модифицированной вакцины.
Таблица
Влияние сочетанного применения циклофосфамида и вакцинотерапии на продолжительность жизни мышей с
Воздействие СПЖ, дни УПЖ, % TPO, % на 20 сутки опыта
Контроль 22,7+3,5 - 11591,б+35б3,19111
Вакцина TNF-a 19,5+3,8 -15 б 95 % ДИ (1,3+10,7)
Вакцина INF-y 27,9+3,7 23 95 % ДИ (14,8+31,2) 10 95 % ДИ (4,1+15,9)
Циклофосфамид + КМ 34 ,б+4,2 52 , 95 % ДИ (42,2+01,8) 82 , 95% ДИ (73,3+88,7)
Циклофосфамид + КМ + вакцина INF-y 40,9+3,2 80* ** 95 % ДИ (72,2+87,8) 84*“ 95 % ДИ (7б,8+91,2)
Циклофосфамид + КМ + вакцина TNF-a 29,7+4,3 31*“ 95 % ДИ (21,9+40,1) 78*“ 95 % ДИ (б9,9+8б,1)
Циклофосфамид 42,4+б,1 87 , 95 % ДИ (80,4+93,б) 84 , 95 % ДИ (7б,8+91,2)
КМ 23,4+4,4 3 95 % ДИ (0+б,3) +21
*р<0,05 по сравнению с контрольной группой; **р<0,05 по сравнению с группой животных с проведенной трансплантацией КМ режиме монотерапии; ***для контрольной группы указан размер опухоли в мм3.
Однако применение цитостатиков в режиме высокодозной монотерапии было не достаточно эффективным в отношении процесса метастазирования опухоли в легкие. У 43 % мышей, получавших циклофосфамид, и у 57 % получавших цисплатин (р<0,05 по сравнению с контрольной группой) в режиме монотерапии развились метастазы. В то же время при оценке влияния комбинированной терапии отмечена некоторая тенденция повышения ан-тиметастатической активности.
На фоне хирургического удаления первичного опухолевого узла применение СМ-ОБР модифицированной противоопухолевой вакцины повышает эффект терапии в отношение метастазов меланомы в легкие. Эксперименты по сравнительной оценке эффективности биотерапии с использованием цельноклеточной противоопухолевой СМ-ОБР-секретирую-
щей модифицированной вакцины, преинкубирован-ной in vitro с INF-y, и интактной вакцины выявили преимущество INF-y-модифицированной вакцины. Максимально эффективным оказался режим вакцинации, предполагающий двукратное введение вакцины (за б дней до и б дней после хирургического удаления первичного опухолевого узла). Индекс TPO составил 37 % (р<0,0б по сравнению с контрольной группой) в режиме послеоперационной вакцинации и 43 % (р<0,0б по сравнению с контрольной группой) в режиме двукратной вакцинации. Однократная предоперационная вакцинация животных не приводила к достоверному снижению интенсивности метастазирования. Результаты типичного эксперимента, выполненного с целью оценки терапевтической активности модифицированной in vitro INF-y цельноклеточной GM-CSF сек-ретирующей вакцины, представлены на рис. 7.
64 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ...
Рис. 3. Изменение уровня экспрессии МНС II на клетках меланомы мышей В16 F10, модифицированных геном GM-CSF (клон BG), при разных режимах культивирования в присутствии цитокинов in vitro.
(*р<0,05 по сравнению с контрольной группой).
Рис. 4. Изменение уровня экспрессии МНС I на клетках меланомы мышей В16 F10, модифицированных геном GM-CSF (клон BG), при разных режимах культивирования в присутствии цитокинов in vitro.
(*р<0,05 по сравнению с контрольной группой).
Рис. 5. Увеличение продолжительности жизни (УПЖ, %) животных с меланомой В16F10, вакцинированных в профилактическом режиме интактной, модифицированной с помощью INF-y и модифицированной с помощью TNF-a цельноклеточной GM-CSF секретирующей противоопухолевой вакциной.
(*р<0,05 по сравнению с контрольной группой).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ... 65
Рис. 6. Частота «излечения**» животных (%) с меланомой, вакцинированных в профилактическом режиме ин-тактной, модифицированной с помощью INF-y и модифицированной с помощью TNF-a цельноклеточной GM-CSF секретирующей противоопухолевой вакциной.
*р<0,05 по сравнению с контрольной группой;
**«излечение» - отсутствие роста опухоли на месте трансплантации опухолевых клеток на фоне профилактического применения вакцины.
Рис. 7. Антиметастатическая активность цельноклеточной противоопухолевой модифицированной INF-y in vitro вакцины (при разных режимах введения) на фоне хирургического удаления первичного опухолевого узла.
66 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ...
Выводы
1. Повышение экспрессии антигенов МНС клетками противоопухолевой вакцины при их инкубации с INF-y in vitro приводит к повышению эффективности цельноклеточной противоопухолевой GM-CSF секретирующей вакцины.
2. Для повышения экспрессии МНС необходима инкубация опухолевых клеток в среде, содержащей INF-y, в течение длительного времени. Максимальный уровень экспрессии отмечен при концентрации 10 нг/мл среды в течение 48 ч. Менее продолжительная инкубация при той же концентрации не вызывает достаточного увеличения экспрессии МНС.
3. Вакцины, полученные на основе модифицированных геном GM-CSF клеток, после их преинкубации в среде, содержащей оптимальную концентрацию INF-y и достаточное время экспозиции, оказывают значительно более выраженное профилактическое и терапевтическое действие.
4. При сочетанном применении биотерапии на основе GM-CSF-секретирующих клеток, инкубированных в присутствии INF-y in vitro, и хирургическом удалении первичного опухолевого узла отмечен наилучший терапевтический эффект. Эти результаты создают предпосылки для оп-тиматизации режимов проведения вакцинотерапии в клинической практике.
Литература
1. Барышников А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - 2004. - Т. 2. - С. 59-63.
2. Барышников А.Ю., Демидов Л.В, Кадагидзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник Московского онкологического общества. - 2008. - Т. 1. - С. 6-10.
3. Бережной А.Е., Сапрыкина Н.С., Ларин С.С. и др. Изучение противоопухолевой активности вакцин на основе генетически модифицированных опухолевых клеток, секретирующих ГМ-КСФ // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2006. - Т. 5, № 4. - С. 47-53.
4. Михайлова И.Н., Иванов П.В, Петренко Н.Н. и др. Внутрикожная клеточная реакция на фоне вакцинотерапии меланомы кожи // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2010. - №1. - С. 63-7.
5. Моисеенко ВМ., Балдуева И А. Проблемы иммунологии опухолевого роста и возможности вакцинотерапии // Медицинский академический журнал. - 2007. - Т. 7, № 4. - С. 17-35.
6. Borrello I., Pardoll D. GM-CSF-based cellular vaccines: a review of the clinical experience // Cytokine Growth Factor Rev. - 2002. - 13. - P. 185-93.
7. Gambari R, Barbieri R, Piva R. et al. Regulation of the expression of class II genes of the human major histocompatibility complex in tumor cells // Ann N Y Acad Sci. - 1987. - 511. - P. 292-307.
8. Garrido C, Algarra I., Maleno I. et al. Alterations of HLA class I expression in human melanoma xenografts in immunodeficient mice occur frequently and are associated with higher tumorigenicity // Cancer Immunol Immunother. - 2010. - 59(1). - P. 13-26.
9. Hege K.M., Joss К., Pardoll. D. GM-CSF gene-modified cancer cell immunotherapies: of mice and men // Int Rev Immunol. - 2006. - 25. - P. 321-52.
10. Li B, Simmons A., Du Т. et al. Allogeneic GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapies generate potent anti-tumor responses comparable to autologous tumor cell immunotherapies // Clin Immunol. - 2009. -Nov. - 133(2). - P. 184-97.
11. Machiels J.P., Reilly R.T., Emens L.A. et al. Cyclophosphamide, doxorubicin, and paclitaxel enhance the antitumor immune response of granulocyte/macrophage-colony stimulating factor-secreting whole-cell vaccines in HER-2/neu tolerized mice // Cancer Res. - 2001. - 61. - P. 3689-97.
12. Propper D.J., chao D., braybrooke J.P. et al. low-dose ifn-gamma induces tumor mhc expression in metastatic malignant melanoma // clin cancer res. - 2003. - 9(1). - p. 84-92.
13. Rodriguez T., M6ndez R, Del Campo A. et al. Distinct mechanisms of loss of IFN-gamma mediated HLA class I inducibility in two melanoma cell lines // BMC Cancer. - 2007. - 23 Feb. - P. 7-34.
14. Rodriguez T., M6ndez R, Del Campo A. et al. Patterns of constitutive and IFN-gamma inducible expression of HLA class II molecules in human melanoma cell lines // Immunogenetics. - 2007. - 59(2). - P. 123-33.
15. Rosa F.M., Fellous M. Regulation of HLA-DR gene by IFN-gamma. Transcriptional and post-
transcriptional control // J Immunol. - 1988. - 1 Mar. - 140(5). - P. 1660-4.
16. Seliger B, Wollscheid U., Momburg F. et al. Characterization of the major histocompatibility complex class I deficiencies in B16 melanoma cells // Cancer Res. - 2001. - 61(3). - P. 1095-9.
17. Whitley E.M., Bird A.C., Zucker K.E., Wolfe L.G. Modulation by canine interferon-gamma of major histocompatibility complex and tumor-associated antigen expression in canine mammary tumor and melanoma cell lines // Anticancer Res. - 1995. - 15(3). - P. 923-9.
18. Willem W, Overwijk N., Restifo P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma// Curr Protoc Immunol. -2009. - 20(1). - P. 1-33.
