CC BY
99
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОЦЕНКА ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА... 47
УДК 616-006.81:615.371/.372:612.017.1
А.Е. Бармашов, Г.З. Чкадуа, И.Н. Михайлова, З.А. Соколова, М.В. Огородникова, Л.Ф.Морозова,
К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников
ОЦЕНКА ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА МЕТОДОМ ELISPOT У БОЛЬНЫХ, ПОЛУЧАЮЩИХ ДЕНДРИТНОКЛЕТОЧНУЮ ВАКЦИНУ
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация:
Бармашов Александр Евгеньевич, аспирант лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО
адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)324-10-65 e-mail: [email protected]
Статья поступила 23.08.2012, принята к печати 31.08.2012.
Резюме
В настоящем исследовании изучался иммунологический ответ у онкологических больных, которые получали дендритноклеточную вакцину. Оценка противоопухолевого иммунитета проводилась методом ELISPOT
- одним из основных способов определения количества цитокин-продуцирующих клеток. Лимфоциты инкубировались в присутствии фитогемагглютинина (ФГА) или опухолевого лизата. Было установлено, что в процессе вакцинотерапии число секретирующих интерферон-у клеток в двух указанных пробах увеличивается в несколько раз у 8 пациентов. У 5 больных было зафиксировано уменьшение данного показателя. У одного пациента нет изменения в количестве активированных лимфоцитов на фоне иммунизации. Была обнаружена взаимосвязь между изменением числа интерферон-у-продуцирующих клеток в двух группах. У 4 больных с повышением иммунного ответа в присутствии лизата увеличивается также и неспецифическая реакция на ФГА. У 1 пациента при уменьшении числа клеток в опытной пробе уменьшается и число клеток при инкубации с ФГА.
Ключевые слова: меланома, дендритноклеточная вакцина, ELISPOT, противоопухолевый иммунитет, интерферон-у.
А.Е. Barmashov, G.Z. Chkadua, I.N. Mikhailova, M.V. Ogorodnikova, L.F. Morozova, K.A. Baryshnikov, L.V. Demidov, A.Yu. Baryshnikov THE ESTIMATION OF ANTICANCER RESPONSE BY ELISPOT IN PATIENTS TREATED WITH DENDRITIC CELL VACCINE
FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
In this study we have examined the immune response in cancer patients treated with dendritic cell vaccine. Antitumor response was estimated by ELISPOT method, one of the basic methods determining the number of cytokine-produced cells. Lymphocytes were incubated with phytohaemagglutinin (PHA) and tumor lysate. 14 patients were enrolled in this study. It was determined that the number of interferon-y secreted cells increased few-fold in 8 patients during the vaccination, the number of interferon-y secreted cells reduced in 5 patients and there was no response in one patient. Moreover, we have observed that the increasing of immune response in 4 patients was correlated with the response to PHA and the decreasing of immune response was correlated with the decrease of immune response to PHA in one patient. Based on data obtained we conclude that the dendritic vaccine is effective.
Key words: melanoma, dendritic cell vaccine, ELISPOT, antitumor immunity, interferon-y.
Введение
Успешное лечение онкологических заболеваний является одной из центральных проблем медицины. Сейчас основными методами противоопухолевой терапии являются: хирургическое удаление опухоли, химиотерапия, лучевая терапия. Но все эти методы не позволяют полностью уничтожить опухоль и ее метастазы. Насущной проблемой медицины является разработка новых терапевтических методов борьбы с онкологическими заболеваниями. Одним из направлений этой работы является создание противоопухолевых вакцин [3; 6; 20]. К ним относятся: коктейль рекомбинантных опухолевых антигенов, рекомбинантные микроорганизмы, онколитические вирусы, анти-идиотипические антитела, ДНК, генно-инженерные конструкции, облученные цельные опухолевые клетки и клетки иммунной системы (в частности, аутологичные дендритные клетки, нагруженные опухолевыми
антигенами) [21; 23; 25; 26; 32]. Кроме того, одной из применяемых вакцин являются дендритомы, которые в опытах in vitro показали большую эффективность по сравнению с дендритоклеточной вакциной [7; 18].
В России проходили клиническое испытания вакцины на основе опухолевых клеточных линий меланомы, трансфицированных геном tag-7 и ГМ-КСФ и аутологичные дендритные клетки больных нагруженных опухолевым лизатом [9; 11-15]. Целью создания подобного рода препаратов+ является увеличение у пациентов популяции CD8+ цитоток-сических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), способных уничтожать опухолевые клетки [4; 5; 30]. Вакцины на основе дендритных клеток в настоящее время проходят I и II фазу клинических испытаний как в России, так и за рубежом [1; 16; 27]. Изучается их действие при разных нозологиях: раке мочевого пузыря, колоректальном раке, меланоме, нейроглиоме и др. [1; 8; 16; 17].
Для оценки степени выраженности Т-клеточ-ного звена иммунитета на фоне иммунизации данной вакциной используют метод ELISPOT. ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot) - твердофазная модификация метода иммуноферментного анализа. Изначально ELISPOT был разработан С. Czerkinsky et al. в 1983 г. [22] для подсчета В-лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела, а затем был адаптирован для разных задач, в особенности для идентификации и подсчета ци-токин-продуцирующих клеток с точностью вплоть до отдельных клеток. ELISPOT позволяет визуализировать вещество, продуцируемое отдельными активированными клетками, и предоставляет как качественную (тип продуцируемого вещества), так и количественную (число активированных клеток) информацию. Метод ELISPOT является удобным и надежным для оценки иммунного ответа у больных злокачественными новообразованиями, получающих иммунотерапию [2; 33].
Цель работы - оценить иммунологическую эффективность дендритноклеточной вакцины методом ELISPOT у больных меланомой.
Материалы и методы
Исследование проводилось на мононуклеа-рах 14 больных меланомой кожи. Вакцину вводили больным внтутрикожно в дозе 1х106 аутологичных дендритных клеток. Интервалы между первыми 4 инъекциями составляли 2 нед., далее иммунизация больных проводилась 1 раз в месяц [16]. Вакцинация продолжалась вплоть до развития прогрессирования. На разных этапах вакцинации проводился забор крови, условно обозначенный «точка».
Мононуклеары периферической крови получали путем разделения в градиенте плотности фи-колл-урографина (р=1,077 г/мл) по стандартной методике [31].
Клеточную линию меланомы человека mel Kor [10] культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % ТЭС, 10мМ HEpES (Sigma, США), 2мМ L-глутамина (Sigma, США), 40 нг/мл гента-мицина (ICN, США), 0,1% 1000х раствора аминокислот и 0,1% 1000х раствора витаминов (ПанЭко, Россия). Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для открепления клеток с пластика использовали раствор Версена. Для получения опухолевого лизата проводили процедуру замораживания-оттаивания клеток линии mel Kor 5 раз. Полученный лизат разливали по аликвотам и хранили при -80 °С. Клеточная линия mel Kor отличается отсутствием антигенов главного комплекса гистосовместимости I и II классов и наличием различных опухолеассоциированных антигенов [10].
При постановке ELISPOT раскапывали покровные МКА к ИФН-у на белок-связывающую мембрану 96-луночного планшета по 50 мкл на лунку и инкубировали 18 ч при 37 °С и 5 % СО2. Плато отмывали от несвязавшихся МКА стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS). Блокировали белок-связывающую мембрану средой RPMI-1640 содержащей 5 % ТЭС. Инкубировали 2 ч при комнатной температуре, после чего блокирующую среду сливали. В лунки вносили мононуклеары по 5х104 клеток на лунку в присутствии ФГА в концентрации 10 мкг/мл, или по 1х105 клеток на лунку в присутствии лизата (из расчета лизат из 10 000 опухолевых клеток на 100 000 лимфоцитов). Инкубировали 18 ч при 37 °С и 5 % СО2. После инкуба-
ции 10-кратно отмывали от клеток буферным раствором, содержащим 0,1 % Tween-20. Затем, добавляли 100 мкл на лунку биотинилированных МКА к интерферону-у, разведенных 1:1000 в PBS с 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,1% Tween-
20, инкубировали 2 ч и отмывали от несвязавшихся антител. Затем добавляли 0,01 %-ную щелочную фосфатазу по 100 мкл на лунку. Инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. Плато отмывали и добавляли субстрат к щелочной фосфа-тазе по 100 мкл на лунку. Плато инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. Для остановки реакции плато отмывали проточной дистиллированной водой в течение 2 минут. Плато высушивали при комнатной температуре в темноте. Количество пятен в лунках определяли на приборе ELISPOT-reader.
Результаты и обсуждение
Изучалась продукция ИФН-у лимфоцитами крови 14 больных меланомой, получавших аутологичную дендритноклеточную вакцину. Результаты работы представлены в табл. 1. При активации мо-нонуклеаров опухолевым лизатом у 8 пациентов наблюдалось повышение интерферон-у-продуци-рующих клеток в процессе вакцинации (Б.А.В., М.А.В., С.Н.М., С.Л.В., Т.А.В., К.Е.С., Т.О.В., Г.С.Л.; табл. 1). Отметим, что статистически достоверное увеличение числа исследуемых клеток зафиксировано у 4 из 8 пациентов (М.А.В., С.Н.М., С.Л.В., Г.С.Л.). У 5 больных число клеток, продуцирующих интерферон-у, уменьшалось в процессе вакцинации (П.А.В., С.Р.В., П.Н.А., Г.С.Д., Д.Ф.А.). Достоверное отличие имеется только у 2 из них (С.Р.В., П.Н.А.). У одного пациента нет изменения в числе активированных лимфоцитов на фоне вакцинотерапии (В.Е.В.). Полученные результаты позволяют говорить о стимуляции Т-клеточного иммунитета у большинства пациентов получающих дендритноклеточную вакцину. Кроме того, следует отметить, что у всех пациентов этой группы число интерферон-у-продуцирующих клеток увеличивается поступательно от вакцинации до вакцинации.
Помимо противоопухолевого ответа Т-лим-фоцитов на вакцинотерапию дендритными клетками, изучалась также неспецифическая активность клеток способных секретировать интерферон-у в ответ на ФГА на фоне иммунизации (табл. 2). Статистически значимое увеличение числа данных клеток имеется у 7 пациентов (М.А.В., С.Н.М., П.А.В., Д.Ф.А., Г.С.Л.). Статистически значимое уменьшение хотя бы на каком-то этапе - у 4 больных (Б.А.В., П.Н.А., Г.С.Д., Т.О.В.). Полученные результаты свидетельствуют о повышении неспецифической активности Т-лимфоцитов в процессе вакцинации у большей части пациентов.
Была также установлена прямая взаимосвязь между изменением числа интерферон-у-проду-цирующих клеток в ответ на лизат и ФГА. У 4 больных с повышением иммунного ответа в опытной пробе увеличивается также и неспецифическая реакция на ФГА (М.А.В., С.Н.М., С.Л.В., Г.С.Л.) У 1 пациента при уменьшении числа клеток в опытной пробе уменьшается и число клеток при инкубации с ФГА. Исследование по использованию дендритноклеточной вакцины для иммунизации больных меланомой проводилось в рамках I фазы клинических испытаний. На основании полученных результатов можно дать заключение об иммунологической эффективности данной вакцины.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОЦЕНКА ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА... 49
У некоторых больных число клеток, секре-тирующих интерферон-у, в процессе вакцинации увеличивается примерно в 3, а у одного в 10 раз. В местах введения вакцины у больных развивается реакция ГЗТ, что свидетельствует о наличии специфических иммунных реакций, направленных против опухоли [28].
Вакцина на основе дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом, предназначена для активации эффекторного звена иммунитета для уничтожения опухоли. Идея создания данной вакцины основана на сведениях о взаимодействии клеток иммунной системы и антиген-презентации. Дендритная клетка представляет фрагмент антигена в комплексе с молекулами ИЬЛ-ЛБС и НЬЛ-БЯ как Т-хелперам, так и Т-киллерам и запускает каскад реакций, направленных на уничтожение клеток-мишеней. Предполагается, что и презентация опухолевых пептидов в иммуногенном комплексе
будет способствовать специфической активации Т-лимфоцитов и в конечном счете ликвидации опухолевой массы [19; 24; 29].
Однако параллельное изменение уровня ин-терферон-у-продуцирующих клеток в ответ на опухолевый лизат и ФГА указывает на то, что аутологичная дендритноклеточная вакцина неспецифически активирует иммунную систему.
Вероятно, манипуляция с дендритными клетками и их активация стимулирует иммунную систему, которая реагирует на любые встретившиеся антигены.
Заключение
Полученные результаты позволяют говорить о ст муляции Т-клеточного звена иммунитета у большинства пациентов получающих дендритноклеточную вакцину.
Таблица 1
Число ИНФ-у-продуцирующих клеток больных, получающих дендритноклеточную вакцину на разных этапах вакцинации в ответ на опухолевый лизат____________________________________________________
Больные № точки Опухолевый лизат + клетки Медиана
В.Е.В. 1 3 5 4,3 ± 2,5 3,7 ± 0,6 4 ± 5,1 4 4 1
Б.А.В. 1 3 5 7,7 ± 3,8 8,3 ± 6,1 22,7 ± 12,7 6 7 18
М.А.В. 1 3 10 3 ± 1 9 ± 4,6 ** 27,7 ± 5 *** 3 8 27
С.Н.М. 1 5 10 13 ± 8 25,7 ± 2,1 41,3 ± 10,5*** 13 25 41
С.Л.В. 1 5 10 4 ± 2,6 14 ± 7 ** 42,7 ± 5,5 *** 5 14 43
П.А.В. 1 5 15 ± 1,7 12,7 ± 2,1 16 12
Т.А.В. 1 3 58,3 ± 10,7 74,7 ± 14,4 56 83
С.Р.В. 1 3 54,7 ± 6,5 24,7 ± 8,5 *** 55 25
К.Е.С. 1 3 5,7 ± 0,6 16 ± 9,5 6 11
П.Н.А. 1 3 5 86 ± 12,8 * 18 ± 3,5 ** 49,3 ± 11,5*** 89 16 49
г.с.д. 1 3 39 ± 17,6 28 ± 2,6 46 29
Т.О.В. 1 3 9 ± 5,6 21,7 ± 7,1 8 23
Д.Ф.А. 1 3 18.7 ± 5,5 11.7 ± 6,1 16 13
Г.С.Л. 1 3 3,3 ± 2,5 36 ± 7,9 *** 3 33
*статистическая достоверность между первой и последующей точкой; **статистическая достоверность между промежуточной и последней точками; ***статистическая достоверность между первой и последней точками.
Таблица 2
Число ИНФ-у-продуцирующих клеток больных, получающих дендритноклеточную вакцину на разных этапах вакцинации в ответ на ФГ А________________________________________________________________
Больные № точки ФГА + клетки Медиана
1 176,3 і 90,45 195
ВБ.В. 3 186 і 10 188
5 243 і 44,7 257
1 306,3 і 6 * 307
Б.А.В. 3 448,3 і 9,7 ** 446
5 302 і 2,7 301
1 202,7 і 21,5 201
М.А.В. 3 238,3 і 10,7** 236
10 439,7 і 13,9 *** 436
1 35,7 і 4,1 * 37
С.Н.М. 5 354 і 7,9 ** 351
10 423 і 9,6 *** 419
1 137 і 58,6 * 134
С.Л.В. 5 368 і 50,2 353
10 432 і 9,2 *** 434
1 331 і 13,7 334
5 391,7 і 28,9 *** 386
1 224,7 і 30 241
3 219,7 і 19,5 211
1 463,7 і 7,2 460
С.Р.В. 3 453 і 7,5 452
1/С л 1 215 і 33,6 212
К . E. С. 3 226,3 і 40,6 230
1 485,7 і 15 * 487
П.Н.А. 3 335 і 31,6 ** 348
5 445 і 10,8 *** 442
Г Г* Я 1 425,7 і 19,5 417
1 .С.Д. 3 224,7 і 7,8*** 217
1 418 і 19,9 429
3 305 і 16 *** 305
1 196 і 18,5 206
Д.ф.А. 3 382 і 44,8 *** 400
г р и 1 118 і 34,1 128
3 400 і 7,2 *** 402
*статистическая достоверность между первой и последующей точкой;
**статистическая достоверность между промежуточной и последней точками;
***статистическая достоверность между первой и последней точками.
Литература
1. Бажанов С.П., Олюшин В.Е., Улитин А.Ю. и др.Специфическая противоопухолевая иммунотерапия в комплексном лечении больных со злокачественными супратенториальными глиомами // Сибирский онкологический журнал. - 2009. - 6. - С. 23-7.
2. Бармашов А.Е., Никитин К.Д., Михайлова И.Н. и др. Оценка специфического противоопухолевого иммунитета методом ELISPOT у больных, получающих вакцину «Мелавак» // Российский биотера-певтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 3. - С. 37-40.
3. Барышников А.Ю. Биотерапия злокачественных новообразований: «Экспериментальная онкология на рубеже веков» / Под редакцией М.И. Давыдова, А.Ю.Барышникова. - М.: издательская группа РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003. - С. 543-9.
4. Барышников А.Ю. Вакцинотерапия: «Детская онкология (национальное руководство)» / Алиев М. Д., Поляков В.Г., Менткевич Г.Л., Маякова С.А. - М.: «Практическая медицина», 2012. - С. 251-61.
5. Барышников А.Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма // Практическая онкология. - 2003. - № 3. - С. 127-30.
6. Барышников А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака // Бюллетень СО РАМН. - 2004. - № 2. - С. 59.
7. Барышников А.Ю., Никитин К.Д.,. Никифорова А.Н, Рубцова М.В. Сравнительное исследование им-муногенности противоопухолевых вакцин на основе дендритных клеток и дендритом in vitro // Аллергология и иммунология. - 2009. - № 3. - С. 361-3.
8. Лукашина М.И., Алиев В.А., Смирнова А.В. Вакцинация больных колоректальным раком аутологичными дендритными клетками// Сборник тезисов. Дом ученых «Биотехнология и онкология», Санкт-Петербург 29-31 мая 2005. - С. 115.
9. Манина И.В., Перетолчина Н.М., Сапрыкина Н.С. и др. Доклинические исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 3. - С. 14-9.
10. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф. и др. Патент на изобретение «клеточной линии Mel Kor». № 2287578. Российский патент, июнь 2006.
11. Михайлова И.Н., Барышников К.А., Бурова О.С. и др. Первая фаза клинических испытаний противоопухолевой геномодифицированой вакцины. Оценка иммунного статуса // Российский биотерапев-тический журнал. - 2006. - Т. 5, № 3. - С. 51-4.
12. Михайлова И.Н., Бурова О.С., Лукашина М.И. и др. Вакцинотерапия диссеминированной меланомы геномодифицированными клетками // Материалы 15-ой Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» 22-26 мая 2006. Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». -2006. - № 2. - С. 25.
13. Михайлова И.Н., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. и др. Клинические испытания аутологичной вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных геном tag-7 // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - № 1. - С. 23-7.
14. Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С. и др. Клеточные линии меланомы // Материалы V Симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2006. - № 4. - С. 15.
15. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 2005. -№ 7. - С. 37-40.
16. Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Чкадуа Г.З. и др. Вакцинотерапия метастатической меланомы с использованием дендритных клеток: клиническое исследование I/II фазы // Российский биотерапевти-ческий журнал. - 2007. - Т. 6, № 2. - С. 39-43.
17. Шоуа А.Б., Сергиенко Н.Ф., Ситников Н.В., Чкадуа Г.З. Предварительные результаты использования вакцин на основе аутологичных дендритных клеток, нагруженных опухолевыми антигенами in vitro, в лечении рака мочевого пузыря // Урология. - 2008. - № 5. - С. 54-7.
18. Avigan D., Rosenblatt J., Kufe D. Dendritic/tumor fusion cells as cancer vaccines// Semin Oncol. - 2012. -39. - Р. 287-95.
19. Bender A., Sapp M., Schuler G. Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood // J. Immunol. Methods. - 1996. - 196. - P. 121-35.
20. Camarero J., Ruiz S. Cancer immunotherapy products: regulatory aspects in the European Union// Human Vaccines & Immunotherapeutics. - 2012. - 8. - Р.1-6.
21. Copier J., Dalgleish A. Whole-cell vaccines: A failure or a success waiting to happen? // Curr Opin Mol Ther. - 2010. - 12. - Р. 14-20.
22. Czerkinsky C., Nilsson L.-A, Nygren H. et al. A Solid-phase Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells // Journal of Immunological Methods. - 1983. - 65. - Р. 109-21.
23. Dalgleish A. Therapeutic cancer vaccines: why so few randomised phase III studies reflect the initial optimism of phase II studies // Vaccine. - 2011. - 29. - Р. 8501-5.
24. Duperrier K., Eljaafari A., Dezutter-Dambuyant C. Distinct subsets of dendritic cells resembling dermal DCs can be generated in vitro from monocytes, in the presence of different serum supplements // J. Immunol. Methods. - 2000. - 238. - P. 119-31.
25. Kudrin А. Overview of cancer vaccines: Considerations for development // Human Vaccines & Immunotherapeutics. - 2012. - 8. - Р. 1-19.
26. Mellman I., Coukos G., Dranoff G. Cancer immunotherapy comes of age // Nature. - 2011. - 480. - Р. 480-
9.
27. Oshita C., Takikawa M., Kume A. et al. Dendritic cell-based vaccination in metastatic melanoma patients: Phase II clinical trial // Oncol Rep. - 2012. - Р. 1-8.
28. Ridolfi L., Petrini M., Fiammenghi L. et al. Dendritic cell-based vaccine in advanced melanoma: update of clinical outcome // Melanoma Research. - 2011. - 21. - Р. 524-9.
29. Romani N., Reider D., Heuer M. Generation of mature dendritic cells from human blood - an improved method with special regard to clinical applicability // J. Immunol. Methods. - 1996. - 196. - P. 137-51.
30. Shanker A., Brooks A., Jacobsen K. et al. Antigen presented by tumors in vivo determines the nature of CD8+ T-cell cytotoxicity // Cancer Res. - 2009. - 69. - Р. 6615-23.
31. Thurner B., Roder C., Dieckmann D. et al. Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical application // J Immunol Methods. - 1999. - 223. - Р. 1-15.
32. Vergati M., Intrivici C., Huen N. et al. Strategies for Cancer Vaccine Development // J Biomed Biotechnol.
- 2010. - ?. - Р.1-13.
33. Whiteside T., Zhao Y., Tsukishiro T. et al. Enzyme-linked immunospot, cytokine flow cytometry, and tetramers in the detection of T-cell responses to a dendritic cell-based multipeptide vaccine in patients with melanoma // Clin. Cancer Res. - 2003. - 9. - P. 641-9.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
