CC BY
56
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... 47
УДК 616-006.81-085.371.015.2 И.В. Манина, НМ. Перетолчина, Н.С. Сапрыкина, А М. Козлов, И.Н. Михайлова, А .Ю. Барышников ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОТЕРАПИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ С ПОМОЩЬЮ ЦЕЛЬНОКЛЕТОЧНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН,
СЕКРЕТИРУЮЩИХ GM-CSF РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Манина Ирина Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей
адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)612-81-08 e-mail: [email protected]
Статья поступила: 01.07.2010, принята к печати 22.07.2010.
Резюме
В работе на экспериментальной модели меланомы проведены доклинические исследования различных подходов к увеличению эффективности терапии опухолей путем сочетания вакцинотерапии, химиотерапии и хирургического удаления первичного опухолевого узла, а также проведен сравнительный анализ терапевтического и профилактического применения противоопухолевых вакцин. На фоне проведения вакцинопрофилактики возможно предотвращение развития опухолевого процесса до 70 %. Сочетание вакцинотерапии и хирургического лечения меланомы увеличивает антиметастатическую активность вакцинации до 43 %. В результате разработки рациональных схем комбинированной терапии можно рассчитывать на расширение терапевтических возможностей лечения опухолевого процесса.
Ключевые слова: меланома, цельноклеточная противоопухолевая секретирующая GM-CSF вакцина, комбинированная терапия.
I.V. Manna, N.M. Peretolchina, N.S. Saprikina, A.M. Kozlov, I.N. Mikhaylova, A.Yu. Barishnikov EXPERIMENTAL RESEARCHES OF CUTANEOUS MELANOMA IMMUNOTHERAPY BY ANTITUMOR CELL-WHOLE GM-CSF-PRODUCING VACCINES
N.N. Blokhin Russian Cancer Resrarch Center of RAMS, Moscow
Abstract
Various approaches to increase efficiency of antitumour therapy by a combination of vaccinotherapy, chemotherapy and surgical excision of primary tumoral node, and also the comparative analysis of therapeutic and preventive application of antitumoral vaccines is carried out in melanoma experimental model. It was postulated that preventive vaccination is able to prevent tumour process by 70 %. The combination of vaccinotherapy and surgical treatment of a melanoma increases antimetastatic activity of vaccination by 43 %. We conclude the combine therapy would led to more effective antitumor response.
Key words: melanoma, antitumor cell-whole GM-CSF-produced vaccine, combine therapy.
Введение
На настоящий момент в клинической практике активно разрабатываются и внедряются методы иммунотерапии опухолей, в частности - вакцинотерапия. [1; 5; 8]. Введение инактивированных опухолевых клеток больному сравнимы с введением опухолевых антигенов, так как предполагается, что после инъекции опухолевые клетки будут захвачены антигенпрезентирующими клетками (АПК), процес-сированы и представлены в виде антигенных пептидов в комплексе с молекулами МНС. В настоящее время в научных центрах мира проходят исследования по применению противоопухолевых вакцин на основе опухолевых клеток [1; 7]. Для генерации более мощного иммунологического ответа опухолевые клетки трансфицируют геном, который кодирует тот или иной цитокин. Наибольшей активностью обладает СМ-ОБР [1; 3; 7]. Ключевым фактором, обусловливающим иммуно-генность СМ-ОБР-секретирующих вакцин, является способность этого цитокина индуцировать диф-ференцировку ранних предшественников в направ-
лении наиболее эффективных «профессиональных» АПК - дендритных клеток. Под действием GM-CSF повышается продукция IL-1 и TNF макрофагами и развивается местная воспалительной реакция, в процессе которой происходит активация макрофагов, гранулоцитов и дополнительно привлекаемых в область инъекции NK и NKT-клеток [8] .Опыт клинического применения GM-CSF-секретирую-щих вакцин из транзиторно трансфицированных аутологичных опухолевых клеток пациентов подтвердил эффективность такого вида иммунотерапии опухолей человека [12]. Позитивные клинические изменения были получены у 25-30 % пациентов с III и IV стадией меланомы, недостаточно отвечающих на предшествующие курсы химиотерапии. В то же время противоопухолевая вакцинация оказалась недостаточно эффективной в качестве самостоятельного средства терапии злокачественных новообразований. [7; 9; 10].
С целью повышения эффективности вакцинотерапии на адекватных экспериментальных моделях in vivo апробируются различные методики и режимы иммунотерапии [6; 10; 15].
Применение современных схем комбинированной химиотерапии позволило добиться повышения эффективности лечения, но показатели выживаемости при этом остались без изменений [11]. Внедрение методов иммунотерапии в составе комбинированного лечения способствует увеличению продолжительности ремиссий без необходимости поддерживающей терапии.
Такие препараты как циклофосфамид, док-сорубицин способны значительно потенциировать противоопухолевый эффект иммунизации [9; 14]. Обоснованием этого считают способность ряда химиопрепаратов, в первую очередь, подавлять регуляторные Т-клетки, удаление которых усиливает иммунный ответ на многие антигены, в том числе опухолевого происхождения.
Комбинация иммунотерапии GM-CSF секре-тирующими вакцинами с циклофосфамидом и док-сорубицином с 2003 г. используется в клинической практике [10; 13].
Стойкое излечение после хирургического иссечения первичного очага опухоли на ранних стадиях развития может быть достигнуто у 80-90 % больных. С другой стороны, стандартная операция по удалению локальной инвазивной меланомы кожи не гарантирует больному возможность длительного безрецидивного выживания, под которым понимается отсутствие местного рецидива и отдаленных метастазов.
Для более поздних этапов течения заболевания, как правило, необходимо комбинировать разные виды терапии: иммунотерапию, химиотерапию, хирургическое лечение [2].
Цель работы - на экспериментальной модели меланомы изучить различные подходы к увеличению эффективности терапии опухолей путем сочетания вакцинотерапии, химиотерапии и хирургического удаления первичного опухолевого узла, а также провести сравнительный анализ терапевтического и профилактического применения противоопухолевых вакцин.
Материалы и методы
Исследование выполнено на мышах линии С57В1/6, самцах массой 22-25 г. (получены из питомника лабораторных животных РАМН «Столбовая») с подкожно трансплантированными клетками экспериментальной меланомы.
Для индукции развития меланомы использовались клетки B16F10 мышей, которые по своему иммунофенотипу наиболее полно воспроизводят модель меланомы человека. Формирующиеся опухоли измеряли дважды в неделю, объем опухоли определяли по формуле:
V = Dmax X D X (Df.), где
Dmax = максимальному диаметру опухоли,
Di - диаметр, перпендикулярный максимальному.
Они экспрессируют ряд специфических опухолевых антигенов, и в то же время характеризуются отсутствием или низкой экспрессией молекул МНС. Для вакцинотерапии использовали облученные на источнике у-излучения Агат-Р с применением 60Co в клинике экспериментальной терапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (в дозе 100 Гр) клетки меланомы B16F10, секретирующий GM-CSF клон BG.
Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухоли и динамике продолжительности жизни мышей, антиметастатический - по массе и количеству метастатических колоний в легких в соответствие со стандартными методиками. Хирургические операции проводились на фоне гексеналового наркоза (100 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно).
Результаты и обсуждение
При профилактической вакцинации в режиме монотерапии с последующей трансплантацией клеток экспериментальной меланомы В16Р10 показано достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных до 53,1±3,0 суток (р<0,05), по сравнению с контрольной группой (29,7±4,0), а у 70% в группе отмечено полное предотвращение развития опухолевого процесса. Вакцину вводили животным за 7 суток до трансплантации опухолей.
Для индукции опухолей животным трансплантировали подкожно 1х106 нетрансфецирован-ных клеток линии П0. При иммунизации каждой мыши вводили подкожно 1х106 клеток цельноклеточной вакцины.
Динамика развития опухолевого процесса в типичном эксперименте представлена в табл. 1.
Таблица 1
Частота развития опухоли по отношению к общему количеству мышей в группе ___________________________
Время наблюдения, сутки Контроль Профилактическая вакцинация
7 3/7 2/7
9 6/7 2/7
11 7/7 6/7
14 7/7 4/7
18 7/7 4/7
22 6/6 5/7
25 6/6 3/7
29 5/5 2/7
32 3/3 2/6
37 - 2/6
45 - 1/5
52 - 1/5
В ходе проведения экспериментов выявлено появление инфильтратов на месте введения вакцин. К концу эксперимента у всех животных эти образования на месте введения вакцин рассасывались.
Данный процесс отражает индукцию иммунной реакции на месте введения вакцины по типу ГЗТ и степень ее выраженности. [4].
Для лечения развившегося опухолевого процесса вакцинотерапия в режиме монотерапии не проявила эффекта в отношении ТРО и антиметастати-ческого действия.
Более того, отмечена небольшая стимуляция роста опухолей. В то же время нельзя исключить, что в данном случае мы имеем дело с «ложной» стимуляцией опухолевого роста, обусловленной повышенной ее инфильтрацией иммунных клеток и клеток стромы, гиперпролиферирующих в зоне опухолевого роста.
В пользу этого предположения говорят и данные, представленные в табл. 2, указывающие на одинаковую продолжительность жизни контрольных животных и животных, получавших вакцину.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... 49
Таблица 2
Влияние терапевтического применения вакцины на развитие подкожно привитой меланомы В16Р10
Воздействие СПЖ, дни УПЖ, % Средняя масса опухоли, г ТРО, % Средняя масса легких, мг ТРМ, %
Контроль 23,6±3,0 - 6,1±0,8 - 209,4±20,5 -
Вакцинация 24,1±3,5 2 (-0,7+4,7) 11 ±1,9 (+) 80 194,3±35,3 7 (2,0+12,0)
При комбинированном применении цитостати-ков: циклофосфамид, цисплатин, доксорубицин, ли-зомустин (в высоких и низких терапевтических дозах) и противоопухолевой вакцины усиления терапевтического эффекта в отношении первичной опухоли не выявлено. Однако на этом фоне отмечено увеличение средней продолжительности жизни животных с меланомой В1бИ0. Максимально эффективным оказалось применение ЦФ в дозе 30 мг/кг ежедневно в течение пяти последующих дней до и после вакцинации. Динамика торможения опухолевого процесса в типичном эксперименте с введением ЦФ в дозе 30 мг/кг представлена на рис. 1.
На фоне комбинированного применения вакцины и ЦФ отмечено подавление роста опухоли более, чем на 90 %. На 25 сутки эксперимента, к моменту начала гибели контрольных не леченных животных, торможение роста опухоли составило 73 %. Контрольные животные, не получавшие лечение, прожили 24,9±1,2 дня, а животные, получавшие комбинированное лечение 37,0±5,1 (р<0,05), дней (УПЖ - 49 %, 95 %ДИ (39,2+58,8)). Помимо цито-токсического действия на опухолевые клетки, ЦФ оказывает иммуномодулирующее действие, что выражается в существенном повышении противоопухолевой активности вакцинотерапии.
Рис. 1. Торможение роста опухоли в отсроченный период наблюдения при комбинированной терапии: вакцинация и химиотерапия (ЦФ).
На фоне хирургического удаления первичного опухолевого узла вакцинотерапия ингибировала процесс метастазирования меланомы В-16 на 29-43 % (в разных режимах вакцинации).
Наиболее эффективным оказался режим, предполагающий двукратное введение вакцины (до и после хирургического удаления первичного опухолевого узла).
При проведении биотерапии каждой мыши подкожно вводили по 1х106 клеток вакцины.
Животным разных групп вакцину вводили до операции (за 5 дней до удаления первичного опухолевого узла), после операции (через 5 дней после операции), а также до и после операции (в те же сроки). Интенсивность метастазирования опухоли у леченных животных на 20-30 % была ниже, чем у контрольных. Сравнительный анализ антиметаста-тической активности вакцины в разных режимах вакцинации на фоне хирургического удаления первичного опухолевого узла представлен на рис. 2.
Рис. 2. Антиметастатическая активность цельноклеточной противоопухолевой вакцины (при разных режимах введения) на фоне хирургического удаления.
so ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...
Выводы
1. С целью эффективного лечебного воздействия на развитие опухолевого процесса целесообразно сочетание различных видов противоопухолевой терапии.
2. Показана возможность применения двух видов противоопухолевых лекарственных средств: противоопухолевой вакцины и цитостатиков, в частности, цикло-фосфамида. В результате разработки рациональных схем их сочетанного применения можно рассчитывать на расширение терапевтических возможностей противоопухолевой терапии.
3. Хирургическое удаление первичного опухолевого узла в сочетании с двукратным введением вакцины оказывает выражен-
ный антиметастатический эффект. Эти результаты создают предпосылки для оп-тиматизации режимов проведения вакцинотерапии в клинической практике.
4. Высокая профилактическая эффективность противоопухолевой цельноклеточной вакцины СМ-ОБР-секретирующей вакцины является экспериментальным обоснованием разработки подходов к вакцинации пациентов с меланомой.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы в рамках научно-технической программы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний».
Литература
1. Барышников А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - 2004. - Т. 2. - С. 59-63.
2. Барышников А.Ю., Демидов Л.В, Кадагидзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник Московского онкологического общества. - 2008. - Т. 1. - С. 6-10.
3. Бережной А.Е., Сапрыкина Н.С., Ларин С.С. и др. Изучение противоопухолевой активности вакцин на основе генетически модифицированных опухолевых клеток, секретирующих ГМ-КСФ // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5, № 4. - С. 47-53.
4. Михайлова И.Н., Иванов П.В., Петренко Н.Н. и др. Внутрикожная клеточная реакция на фоне вакцинотерапии меланомы кожи // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 1. - С. 63-7.
5. Моисеенко ВМ., Балдуева И А. Проблемы иммунологии опухолевого роста и возможности вакцино-
терапии // Медицинский академический журнал. - 2007. - Т. 7, № 4. - С. 17-35.
6. Berinstein N.L. Strategies to enhance the therapeutic activity of cancer vaccines: using melanoma as a model
// Ann N Y Acad Sci. - 2009. - 1174. - P. 107-17.
7. Borrello I., Pardoll D. GM-CSF-based cellular vaccines: a review of the clinical experience // Cytokine Growth Factor Rev. - 2002. - Vol. 13. - P. 185-93.
8. DranoffG. GM-CSF-secreting melanoma vaccines // Oncogene. - 2003. - Vol. 22. - P. 3188-92.
9. Emens L.A., ArmstrongА, Emens D. et al. A phase I vaccine safety and chemotherapy dose-finding trial of an
allogeneic GM-CSF-secreting breast cancer vaccine given in a specifically timed sequence with immunomodulatory doses of cyclophosphamide and doxorubicin // Hum Gene Ther. - 2004. - Vol. 15. - P. 313-37.
10. Hege K.M., Joss К, Pardoll D. GM-CSF gene-modified cancer cell immunotherapies: of mice and men //
Int Rev Immunol. - 2006. - Vol. 25. - P. 321-52.
11. Kohlmeyer J, Cron M, Landsberg J. et al. Complete regression of advanced primary and metastatic mouse melanomas following combination chemoimmunotherapy // Cancer Res. - 2009. - 69(15). - P. 6265-74.
12. Li B, Simmons A., Du Т. et al. Allogeneic GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapies generate potent anti-tumor responses comparable to autologous tumor cell immunotherapies // Clin Immunol. - 2009. -133(2). - P. 184-97.
13. Machiels J.P, Reilly R.T., Emens L.A. et al. Cyclophosphamide, doxorubicin, and paclitaxel enhance the antitumor immune response of granulocyte/macrophage-colony stimulating factor-secreting whole-cell vaccines in HER-2/neu tolerized mice // Cancer Res. - 2001. - Vol. 61. - P. 3689-97.
14. Treisman J, Garlie N. Systemic therapy for cutaneous melanoma // Clin Plast Surg. - 2010. - 37(1). - P. 127-46.
15. Willem W, Overwijk N, Restifo P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma // Curr Protoc Immunol. -2009. - 20(1). - P. 1-33.
Издание 2-е, переработанное и дополненное
ЭНЦИКЛОПЕДИЯ
КЛИНИЧЕСКОЙ
ОНКОЛОГИИ
Готовится к печати Издательская группа РОНЦ
