CC BY
36
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
Кузнецов П.В., Сухих А.С., Гуров Е.А., Барсегян И.Б.
Кемеровская государственная медицинская академия, Кафедра фармацевтической и токсикологической химии,
г. Кемерово
ПОЛИМЕРНЫЕ АДСОРБЕНТЫ АФФИННОГО ТИПА В ИССЛЕДОВАНИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ. ИЗУЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ФИБС НА ЭПОКСИАЗОАДСОРБЕНТАХ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ
Сегодня неклассическая аффинная хроматография (НАФХ) — признанный перспективным метод разделения, очистки и анализа не только разнообразных природных соединений (ку-марины, фено-локислоты, дубильные вещества, фла-воноиды и др.) [1, 5], но и некоторых лекарственных средств (настойка родиолы розовой и др.) [3, 5]. Недавно получены интересные данные [2] по применению НАФХ для разделения и очистки фармакопейных субстанций ряда ноотропных препаратов (фенибут, гаммоксин и др.).
Цель исследования — изучение методом НАФХ лекарственного средства ФиБС, получаемого на основе грязевых отложений одесского лимана с добавлением коричной кислоты (КК) и кумарина (КМ). В качестве хроматографических материалов использовались эпоксиазоадсорбенты аффинного типа (азо-ААФТ) нового поколения (эпоксиактивация реагентом Хуберта) на основе полисахаридных носителей сефадексов G-10 и LН-20.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования использовали ФиБС фармакопейного качества (ампулы 0,1 % раствора по 1,0 мл). Лигандами азо-ААФТ являлись: новокаина гидрохлорид (НОВ), троксевазин (ТРОКС) и резорцин (РЦ), соответствующие требованиям ГФ Х. Полимерными носителями для азо-ААФТ являлись сефадекс G-10 и LН-20. Эпоксиактивацию проводили реагентом Хуберта (диглицидиловый эфир 1,2-э-тандиола. Полный синтез азо-ААФТ приводили известным способом по [1].
Реактивы и растворители: тетрабутиламмония бромид (ТБАБ), натрия тетраборат, натрия нитрит, спирт этиловый и др. имели квалификацию ч.д.а. Эпоксиактивацию сефадекса G-10 проводили следующим способом: около 7,0 г сухого носителя заливали, при перемешивании, 30 мл воды дистиллированной и оставляли для набухания на 24 часа. 20 мл полученного геля промывали на стеклянном фильтре водой дистиллированной (80 мл), 1М раствором натрия гидроксида (40 мл), 0,5М растворов натрия гидроксида в 25 % диметилсульфок-сиде (15 мл). Промытый гель переносили в реакционную колбу с 20 мл смеси: 0,5М раствор натрия гидроксида в 25 % диметилсульфоксиде, перемешивали и добавляли 7 мл 1,5 % водного раствора ТБАБ и 12 мл ДГЭЭ. Реакционную смесь перемешивали при 45°С в течение 50 минут на роторном испарителе (ИР-1) и дополнительно встряхи-
вали от руки еще 10 минут. Эпоксиактивирован-ный гель (слегка желтоватый) промывали на стеклянном фильтре последовательно: 25 % водным раствором диметилсульфоксида (80 мл), насыщенным раствором натрия тетрабората (150-200 мл), водой дистиллированной (около 400 мл). После дополнительной промывки геля 50 % водным раствором ди-метилсульфоксида (40 мл) его отмывали водой дистиллированной до отрицательной фенолфталеиновой пробы [1] промывных вод. Концентрация концевых эпоксигрупп, определенная титриметричес-ки по [1], составила около 12-20 мкмолей/мл упакованного геля.
Подготовку хроматографической колонки с 3035 мл геля азо-ААФТ проводили (после промывки водой дистиллированной 15-20 мл), промывая ее последовательно: 0,05М раствором натрия гидрок-сида (5 мл), водой дистиллированной до рН около 7,0 (по универсальному индикатору), 0,05М раствором кислоты хлористоводородной (5 мл). После дополнительной промывки колонки до рН 7,0, на ней хроматографировали 1 мл раствора ФиБС со скоростью 0,15-0,2 мл/мин. Элюцию приводили водой дистиллированной, объем фракций — 2,5 мл, детектирование осуществляли на длине волны 280 и 320 нм (СФ-26). Аналогично проводили хроматографирование 1 мл ФиБС на немодифици-рованных носителях. УФ-спектры пиковых фракций получали известным способом в диапазоне 230340 нм.
Качественней состав полученных пиковых фракций (I и II) дополнительно изучали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в стандартных условиях: прибор «Миллихром А-02», неподвижная фаза — РгоП^^ С-18, объем пробы — 4,0 мкл, подвижная фаза: 4М перхлорат лития-0,1М кислота хлорная — Н20 (5 : 95)/ ацетонитрил (линейный градиент), скорость подачи — 100 мкл/мин. Хроматограммы регистрировали в режиме многоволнового детектирования с опорной длиной волны 210 нм. В указанных выше условиях проводили ВЭЖХ на-тивного (ампульного) раствора ФиБС.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Известно, что медицина и фармация активно используют биологически активные вещества (БАВ) грязевых отложений соленых озер, гумусового слоя почв, торфяников в виде оригинальных лекарственных препаратов широкого спектра действия [4]. Наиболее яркий пример лекарственных средств этого
. и № 4 2005 97
в Кузбассе *
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ КЛИНИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ, МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ
типа — препарат ФиБС, созданный группой исследователей во главе с академиком Филатовым еще в 40-50 годы прошлого века [4].
По данным нормативно-технических документов (НТД: № 42-9771-99, 1999 г.) на ФиБС, сегодня в них отсутствуют тесты на основные компоненты: определение КК пробой с реактивом Марки и КМ-ре-акцией азосочетания. Эти компоненты теперь определяют только по данным УФ-спектроскопии (изменение оптической плотности до и после гидролиза нативного раствора ФиБС). Если учесть, что КК и КМ достаточно термо- и фотолабильны (процессы димеризации, переход цис-, транс изомеров и др.), то проблема изучения БАВ этого сложного композитного средства хроматографическими методами актуальна и перспективна.
Ранее нами в работе [3] для изучения ключевых компонентов препарата методом НАФХ проведен хро-матографический скрининг нескольких типов эпок-сиактивированных азо-ААФТ с различными лиган-дами, вставками (гидразиды п-нитробензойной и салициловой кислот, а-нафтилэтилендиамин). В качестве полимерных матриц использовались сефадексы G-25 и LH-20. Контрольными гелями являлись не-модифицированные носители. Полученные экспериментальные данные показали, что только на азо-А-АФТ на основе сефадекса LH-20 с НОВ-лигандом при водной элюции происходило четкое разделение двух пиков (I и II) Третий пик, иногда выходивший в условиях водно-спиртовай элюции, по-видимому, связан с концентрированием (и частичным разделением) микропримесей (сложные эфиры фталевой кислоты), присутствующих в образцах применяемого этилового спирта.
Таким образом, в настоящей работе для НАФХ нативного раствора ФиБС нами использовался только сефадекс LН-20-БЭП-ГСК-НОВ в объеме 2530 мл, контрольным гелем служил немодифициро-ванный носитель (в тех же объемах). Как и ожидалось, лучшее разделение пиков I и II наблюдалось на модифицированном азо-ААФТ, чем на контрольном геле.
Аналогичное хроматографическое разделение нативного раствора ФиБС отмечено и на впервые полученном в данной работе азо-ААФТ на основе сефадекса G-10. Другие аналоги на основе сефадекса G-10 с ТРОКС и РЦ-лигандами показали менее эффективное разделение. Интересно отметить, что 2-3-кратное хроматографирование исследуемого раствора ФиБС на азо-ААФТ с НОВ-лигандом приводило (независимо от типа полимерного носителя) к ухудшению разделения I и II пиков. Этот феномен не наблюдался при хроматографировании ФиБС на немодифицированных (контрольных) гелях сефадекса ^-10 и LН-20). По-видимому, повторное хроматографирование нативного раствора ФиБС, имеющего рН около 4-5, существенно изменяло (сдвиг в слабокислую сторону) хроматог-рафические параметры колонки. Данные результаты еще раз подтвердили ионообменный характер гелей азо-ААФТ.
Идентификация компонентов пиков I и II, проведенная по данным УФ-спектроскопии, показала, что в пике I (умах = 270 нм), в основном, выходит КМ, а в пик II (умах = 275 нм и плечо 305 нм) видимо КК, но неясно, в какой изомерной форме, цис или транс.
Применение метода ВЭЖХ для проверки феномена разделения основных (УФ-активных) компонентов нативного раствора ФиБС полностью подтвердило вышеизложенные экспериментальные данные, полученные методом НАФХ. Так, по данным ВЭЖХ нативный раствор ФиБС имеет также два основных пика: А — время выхода 13,37 мин и Б — время выхода около 15,37 мин. Небольшой минорный пик (В) имеет время удерживания около 14,28 мин. Анализ методом ВЭЖХ разделенных пиков I и II показал, что компонент пика Б обнаруживается во фракции I, полученной методом НАФХ, а компонент пика А — во фракции II, что еще раз подтверждает различный хроматографический статус адсорбентов в методах НАФХ и ВЭЖХ. Интересно, что и ВЭЖХ - профили I и II пиков, значимо различаются по минорным компонентам.
Таким образом, применяя в анализе качества ФиБС метод НАФХ, позволяющий проводить по-лумикропрепаративное накопление фракций I и II, можно в перспективе изучить и специфику минорных примесей препарата.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе впервые синтезирован ряд новых азо-ААФТ на основе эпоксиактивированного сефадекса G-10. Адсорбент этого типа с НОВ-ли-гандом показал аналогичную разделительную способность УФ-активных компонентов ФиБС, как и азо-ААФТ на основе сефадекса L^20 (с тем же ли-гандом).
Впервые отмечен феномен влияния (на качество разделения) изменения рН хроматографической колонки (в методе НАФХ). Методом ВЭЖХ впервые четко доказано полное разделение (на азо-ААФТ с НОВ-лигандом) ключевых (УФ-активных) компонентов препарата ФиБС.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Кузнецов, П.В. Эпоксиактивированные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ /П.В. Кузнецов. - Кемерово, 2002.
2. Кузнецов, П.В. Разделение фармакопейных образцов ноотроп-ных препаратов методом неклассической аффинной хроматографии /П.В. Кузнецов, Е.А. Букина //Тез. докл. XII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2005. - С. 155.
3. Кузнецов, П.В. Хроматографический скрининг эпоксиазоадсорбен-тов для исследования лекарственного средства ФИБС /П.В. Кузнецов, А.С. Сухих //Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: Матер. XI Междунар. конф. - Ялта-Гурзуф, 2003. - С. 223-225.
4. Кузнецов, П.В. О проблеме современных подходов к изучению методов выделения, очистки и анализа нативных БАВ из лечебных грязей /П.В. Кузнецов, А.С. Сухих //Вест. РАЕН (ЗСО). -2004. - Вып. 6. - С. 59-65.
оо № 4 2005 ^УПвощина
° в Кузбассе
О^Абдици
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
5. Мальцева, Е.М. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исс- /Е.М. Мальцева, П.В. Кузнецов //Вест. РАЕН (ЗСО). - 2004. -
ледовании и анализе фенольных соединений настойки пиона Вып. 6. - С. 30-33.
Ласточкина Л.А., Абросова О.Е., Евгенова О.В., Нестеров Ю.И.
Кемеровская государственная медицинская академия, МУЗ Городская клиническая больница № 1 им. М.Н. Горбуновой,
г. Кемерово
КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ДИСПЛАЗИИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА
Проблема синдрома дисплазии соединительной ткани (ДСТ) является весьма актуальной из-за высокой частоты его распространенности, влияния на формирование множества заболеваний.
В основе группы заболеваний, объединенной понятием «дисплазия соединительной ткани», лежит наследственная коллагенопатия. Степень выраженности дисплазий может варьировать от минимальной недифференцированной до значительной, формирующей нозологические формы (например, синдромы Марфана, Элерса-Данло) [1]. Распространенность ДСТ, с учетом малых недифференцированных форм, достигает 69 % [2], чаще эти изменения выявляются у женщин [3].
В связи со сложностью специфической диагностики соединительно-тканной дисплазии (биохимической, гистологической, генетической), ведущим является выявление фенотипических и клинических проявлений данной аномалии [4]. ДСТ может проявляться локомоторными и висцеральными симптомами, аномалии развития внутренних органов достаточно часто сочетаются с внешними проявлениями. Помимо этого, ДСТ служит предрасполагающим фактором развития большого количества заболеваний [1, 5]. Наиболее часто встречаются изменения опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистой, вегетативной нервной систем, кожи, глаз, являясь фактически фенотипическими маркерами ДСТ [2]. Ведущими клиническими проявлениями дисплазии соединительной ткани являются искривления позвоночника, астеническая форма грудной клетки, гипотония, гипотрофия (дефицит массы тела), плоскостопие, гипермобильность суставов, миопия, астигматизм, пролапс митрального клапана, нефроптоз [6].
Комплексная оценка этих маркеров позволяет заподозрить наличие синдрома ДСТ уже на этапе физического обследования больного, планировать индивидуальную систему реабилитации с учетом выявленных изменений [5, 6].
Цель исследования — оценить частоту проявлений дисплазии соединительной ткани, особенности в зависимости от пола, сочетания некоторых локомоторных проявлений ДСТ у лиц молодого возраста.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведен анализ результатов профилактического медицинского осмотра 26525 учащихся и студен-
тов 1-х курсов 34 учебных заведений высшего, среднего и начального профобразования за 2002-2004 гг. Возраст обследованных 15-18 лет, девушки составили 56 %, юноши — 44 %.
В комплекс обследования входили: клинический осмотр пациентов терапевтом, хирургом, акушером-гинекологом и врачами-специалистами (неврологом, оториноларингологом, офтальмологом), антропометрия (рост, вес, окружность грудной клетки), динамометрия, общие лабораторные методы; определение остроты зрения, плантография. По показаниям проводились дополнительные исследования: электрокардиография, ультразвуковое исследование (почек лежа и стоя, желчевыводящих путей, сердца), рентгенологическое исследование костной системы.
РЕЗУЛЬТАТЫ
По результатам медицинского осмотра выявлена высокая патологическая пораженность студентов и учащихся — 117,4 случаев заболеваний на 100 обследованных. На одного подростка, имеющего патологию, приходилось, в среднем, 1,3-1,8 заболевания. Здоровые подростки среди осмотренных составили 37 %.
Выявлено, что среди проявлений ДСТ наиболее часто встречались локомоторные — искривление позвоночника (кифоз, сколиоз, нарушение осанки), уплощение стоп, плоскостопие, ювенильный остеохондроз, остеохондропатии (болезнь Шеерман-Мау, Ос-гуд-Шлаттера) и висцеральные — пролапс митрального клапана, вегетативная дисфункция, миопия, искривление носовой перегородки, нефроптоз, варикозное расширение вен.
Локомоторные проявления ДСТ в виде поражения опорно-двигательного аппарата занимают 1-е место среди данной патологии у обследованных. В большинстве случаев это различные формы деформаций позвоночника, преимущественно, в виде нарушения осанки (4142 чел. — 15,4 %,) и сколиоза III степени (408 чел. — 1,5 %), и деформаций стоп — уплощение стоп (1522 чел. — 5,7 %) и плоскостопие (783 чел. — 2,9 %). Остеохондропатии и ранний остеохондроз — более редкие состояния (291 чел. — 1,1 % и 518 чел. — 2 %). В общей структуре патологии опорно-двигательного аппарата данная патология составила 98 %. Остальные 2 % в подавляющем большинстве представлены другими заболеваниями и состояниями, ассоциированными с ДСТ: врожденные деформации позвоночника (кифоз) и грудной клетки
. и № 4 2005 9д
в Кузбассе
