CC BY
165
Мальцева Е.М.
Кемеровская государственная медицинская академия
ИССЛЕДОВАНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ДУБИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ НАСТОЙКИ ПИОНА
Методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления на поливиниловом адсорбенте аффинного типа с троксевазиновым лигандом получен образец дубильных веществ пиона (Paeonia anomala L.) с высокой степенью очистки от низкомолекулярных фенольных соединений. Показано, что данный образец может использоваться в качестве рабочего стандартного образца (РСО) при контроле качества и стандартизации сырья пиона и лекарственных препаратов на его основе. Предложен селективный комплексо-нометрический метод количественного определения гидролизуемых дубильных веществ в препарате «Настойка пиона» с использованием РСО.
Ключевые слова: настойка пиона, дубильные вещества гидролизуемого типа, адсорбенты аффинного типа с фенольными лигандами.
The sample tannins of tincture Peony (Paeonia anomala L.) with high rate purification from low molecular phenol compounds has been obtained by the method liquid column low presure chromatography on polyvinil adsorber of affiniti type with troxevasin lygand. It has been proved that this sample can be used as chemical reference substance (CRS) in quality and standardization control of peony material and medicines made on its base. Selective comple-xometric method of hydrolyzable tannins quantity estimination in «Peony Tincture» with CRS usage has been offered.
Key words: tincture Peony, hydrolyzable tannins, adsorber affiniti type with phenol lygands.
За два последних десятилетия значительно возрос интерес к растительным лекарственным средствам, которые обеспечивают более мягкое действие, отличаются меньшим привыканием и побочными эффектами в сравнении с синтетическими лекарственными средствами. Особое внимание уделяется витаминным, иммуномодули-рующим и успокаивающим средствам природного происхождения. В этой связи резолюция ВОЗ WHA40.33, принятая в 1987 году, призвала обеспечивать контроль качества растительных лекарственных средств с помощью современных аналитических методов, с использованием необходимых стандартов и надлежащей производственной практики (GMP) [1].
Неоспоримым преимуществом в исследовании биологически активных веществ (БАВ) лекарственных растений, стандартизации и повышении качества растительных лекарственных средств имеют хроматографические методы (ТСХ, ВЭТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ), которые включены во все ведущие зарубежные фармакопеи [2, 3]. В отечественной нормативной документации (ФС, ВФС, ФСП) на лекарственное растительное сырье и препараты на его основе использование хроматографических методов для стандартизации встречается крайне редко [4,
5]. Широкое использование этих методов, к сожалению, сдерживается высокой стоимостью необходимого оборудования и расходных материалов.
Наряду с применением классических вариантов хроматографии, во всем мире растет интерес к новым, альтернативным хроматографическим, методам разделения и анализа природных БАВ, где используются химически модифицированные адсорбенты [6]. Иммобилизация в качестве лигандов низкомолекулярных и высокомолекулярных соединений на поверхности полимерного или кремнеземного носителя позволяет решать сложные задачи по разделению смесей природных соединений, в том числе, растительного происхождения.
Исследования по внедрению нового метода неклассической аффинной хроматографии (НАфХ) для выделения, очистки и анализа БАВ растительного происхождения (кумарины, флавоноиды, фе-нолокислоты, дубильные вещества гидролизуемого и конденсированного типов и др.) активно ведутся на кафедре фармацевтической химии КГМА под руководством профессора П.В. Кузнецова [7]. Хроматография на адсорбентах аффинного типа (ААфТ) с различными типами иммобилизованных лигандов в аналитическом и препаративном режимах позволяет разделять сложные смеси раститель-
Медицина № 3 2003
в Кузбассе № 3 2003 21
ных БАВ и получать индивидуальные соединения с высокой степенью очистки [8, 9]. Причем метод не требует сложного лабораторного оборудования, прост и удобен в исполнении. По данным [10], исследования в области НАфХ для изучения и стандартизации природных БАВ входят в число приоритетных и перспективных направлений развития фармации.
Целью настоящей работы явилось выделение дубильных веществ пиона уклоняющегося с помощью хроматографии на поливиниловом ААфТ «бензгидразидного» типа с фенольными лиганда-ми, их изучение и использование для стандартизации растительных препаратов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использован полимерный носитель Тоуореаг1 HW-55 (Toyo Soda, Япония). Гидразид n-нитробензойной кислоты (т. пл. 2 09-2 1 00С) получен гидразинолизом этилового эфира n-нитро-бензойной кислоты. Использованы эпихлоргидрин (Sigma,США) и троксевазин фармакопейного качества. Все остальные реактивы и реагенты имели квалификацию х.ч. и ч.д.а. Лекарственный препарат «Настойка пиона» изготовлен Новосибирской и Кемеровской фармацевтическими фабриками, АО «Новосибхимфарм» и соответствовал НТД.
Получение азоААфТ «бензгидразидного» типа
Эпоксидирование тойопала проводили по модифицированному методу Аксена [11]. На полученный эпокситойопал иммобилизовали гидразид n-нитробензойной кислоты и затем восстанавливали нитропроизводное тойопала до аминопроизвод-ного дитионитом натрия по методу, описанному в
[12]. Наличие ароматической аминогруппы подтверждено положительной реакцией с 2,4,6-три-нитробензолсульфонатом натрия (оранжевое окрашивание). Иммобилизацию троксевазина проводили согласно методике получения азоадсорбен-тов, описанной в [12].
Количественное определение суммы ДВ в препарате «Настойка пиона»
Количественное определение суммы ДВ в препарате проводили методом комплексонометрии
[13]. Для этого 10 мл препарата помещали в пробирку для центрифугирования вместимостью 50 мл, прибавляли 10 мл реактива осаждения. Через 30 минут смесь центрифугировали в течение 10 минут, с частотой вращения 5000 об/мин. Осадок последовательно промывали 10 мл 0,25 % раствора аммиака и 5 мл 95 % этанола, и повторяли центрифугирование. Осадок растворяли в 3 мл 30 % раствора уксусной кислоты и количественно переносили в колбу для титрования вместимостью 250 мл с помощью 100 мл воды. Добавляли 25 мл 5 % раствора гидрокарбоната натрия, 1 мл 1 % раствора ксиленолового оранжевого и титровали
0,01 М раствором трилона Б до лимонно-желтого окрашивания.
1 мл 0,01 М раствора трилона Б соответствует 0,001136 г РСО танина [8].
Выделение и исследование суммы ДВ настойки пиона
100 мл препарата «Настойка пиона» упаривали на водяной бане до 30 мл и трехкратно экстрагировали смесью н-бутанол-этилацетат (1 : 1), по 30 мл. Органические извлечения объединяли, и отгоняли растворитель в токе теплого воздуха. Полученный экстракт растворяли в 15 мл 10 % этанола, фильтровали в мерную колбу на 25 мл и доводили объем раствора водой до метки.
На препаративную колонку, упакованную 10 мл адсорбента (95 x 15 мм), наносили 10 мл полученного раствора и элюировали 10 % этанолом до показателя оптической плотности элюата 0,050,1 (~ 500 мл). Фракцию, содержащую сумму ДВ, выделяли 50 % раствором ацетона и помещали в делительную воронку. Элюат последовательно экстрагировали хлороформом (по 20 мл 3 раза) и смесью н-бутанол-этилацетат (1 : 1) (по 30 мл 3 раза). Бутанол-этилацетатный экстракт высушивали в токе теплого воздуха до полного удаления растворителя.
Степень очистки от низкомолекулярных примесей контролировали методом ТСХ на пластинках «Silufol» в системе растворителей толуол — этила-цетат — муравьиная кислота (5 : 4 : 1). УФ-спектр снимали на спектрофотометре СФ-26 в интервале длин волн 250-350 нм. ИК-спектр образца снимали в таблетках бромида калия (5 мг/500 мг) на спектрометре «Specord» (Германия).
Хроматография ДВ настойки пиона на АафТ
На аналитическую колонку (25 x 0,5 см, Pharmacia, Швеция), упакованную 2 мл адсорбента (50 x 5 мм) наносили 1 мл 0,02 % раствора выделенного образца ДВ пиона. Элюировали ступенчатым градиентом: 15 мл воды, 70 мл 20 % этанола, 60 мл 30 % этанола, 60 мл 40 % этанола и 15 мл 50 % раствора ацетона, собирая фракции по 3 мл. Детектирование проводили на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм.
Результаты и обсуждение
Известно, что седативное, обезболивающее и противосудорожное действие настойки пиона уклоняющегося (Paeoniae anómala L.) обусловлено наличием целого комплекса БАВ, в том числе соединений фенольного типа, который представлен, в основном, фенолокислотами (салициловая, галловая), их производными (метилсалицилат, салицин) и дубильными веществами пирогаллоловой группы (до 8,8 %) [14]. Дубильные вещества (ДВ) пиона обладают широким спектром фармакологического действия. Так, настойка корней пиона используется в народной медицине в качестве противовоспалительного средства, для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (язва 12-перстной кишки,
№ 3 2003 Медицина
22 № 3 2003 в Кузбассе
диарея, гастрит и др.) [14]. В китайской медицине корни пиона являются составной частью противоопухолевых средств [14]. По данным [15], ДВ растений семейства Раеошасеае обладают выраженной противовирусной активностью. При этом, нормативно техническая документация на данный препарат не регламентирует даже качественной оценки фенольных БАВ, ограничиваясь только анализом иридоидов (в пересчете на пионефлорин и др.) [5].
Предварительное количественное определение суммы ДВ в препарате «Настойка пиона» выполняли методом комплексонометрического титрования [13]. Данный метод отличается высокой избирательностью, так как низкомолекулярные феноль-ные соединения и иридоиды не осаждаются солями цинка, и дает более точные результаты по сравнению с методом перманганатометрии, рекомендуемом фармакопеей [4]. Исследование показало, что в образцах, изготовленных различными предприятиями, содержание ДВ находится в пределах 0,2140,238 % (таблица), в пересчете на полученный нами хроматографически очищенный образец фармакопейного танина сумаха [8].
Таблица
Результаты комплексонометрического определения суммы дубильных веществ в препарате "Настойка пиона" ^ = 9, Р = 95 %)
Предприятие-изготовитель Метрологическая характеристика Х б АХ е
Новосибирская фармацевтическая фабрика АО "Новосибхимфарм" Кемеровская фармацевтическая фабрика 0,2136 % 1,402 Х10-3 ± 0,003168 ± 1,48 % 0,2384 % 3,23 х 10-3 ± 0,0073 ± 3,062 % 0,2115 % 2,67 х 10-3 ± 0,00603 ± 2,85 %
Проведенные исследования по выделению ДВ пиона из препаратов и сырья с помощью хорошо известных экстракционных и осадительных методов, в частности раствором желатина, не дали положительных результатов. Низкое содержание ДВ не позволяет получать нативный образец суммы ДВ пиона для его дальнейших исследований.
Поэтому для выделения суммарного образца ДВ пиона был использован метод препаративной
жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) на поливиниловом ААфТ «бензгидразидного» типа [8], с иммобилизованным в качестве лиганда в-оксиэтилпроизводным рутина — троксевазином (рис. 1).
В экспериментах по выделению и очистке дубильных веществ из различных видов лекарственного растительного сырья данный адсорбент показал высокие емкостные характеристики и отсутствие неспецифической сорбции в отношении полифенольных соединений [8, 12]. Полученный таким образом образец суммы ДВ пиона, характеризующийся по данным ТСХ высокой степенью очистки от низкомолекулярных примесей, использовался в дальнейших исследованиях.
На основании химических реакций, рекомендованных [16], установлено, что ДВ пиона относятся к группе галлотанинов и не содержат связанной эл-лаговой кислоты. УФ-спектр раствора данного образца имеет характерный максимум поглощения при длине волны 275 нм и минимум — при 255 нм, что несколько не согласуется с данными Блажея и Шутого [3] о классификации ДВ по их спектральным характеристикам. В ИК-спектре полученного образца ДВ пиона, снятого в таблетках КВг (рис. 2), присутствуют следующие основные полосы поглощения: ^он, фенольный) -
3400 см-1, V(С=О) - 1710 см-1, V(С=С) -1600 см-1, V(C_o-c) — 1205 см-1, V(C_Н) — 740 см-1. Следует отметить, что ИК-спектр образца ДВ пиона по основным характеристическим частотам и их интенсивности совпадает с ИК-спектром танина сумаха [8]. Это обстоятельство подтверждает, что ДВ пиона относятся к соединениям гидролизуемого типа.
Известно, что для разделения ДВ растений рода Раеошае используются различные методы ЖКХ. Так, авторы работы [17], с помощью ЖКХ на Сефадексе LH-20, выделили из ацетонового экстракта корней Раеошае а1ЬШога шесть галлотанинов, которые представляют собой пента-декагал-лоилированные производные глюкозы. Изучение
Рисунок 1
Структура ААфТ "бензгидразидного" типа с троксевазиновым лигандом
О
— О-СН2—сн-СН2- Z
он
О
и—О
он
О
О-G1u-Ram
z =-т-га-с-
О—и
И =-СН2-СН2-он
Медицина № 3 2003
в Кузбассе № 3 2003 ¿3
Рисунок 2
ИК-спектр образца ДВ пиона уклоняющегося
66,5 65
ф
5 г
га К
о ^
К
о
6
К
60 -
55
50
45 -
40
35 -
30
25 -
20 16,8
800 600 Частота, см-1
данного экстракта на ^с1ео8П 50-10 в условиях изократического элюирования подвижной фазой гексан — метанол — тетрагидрофуран — муравьиная кислота (52 : 33 : 11 : 1) подтвердило наличие данных соединений в экстракте.
Разделение суммарного образца ДВ пиона проводилось на ААфТ «бензгидразидного» типа с троксевазиновым лигандом в условиях аналитической хроматографии. В режиме градиентного элюи-рования растворами этанола с увеличивающейся концентрацией, получены основные фракции оли-гомерных ДВ, причем, основные фракции элюиро-вались подвижной фазой с высоким содержанием этанола (рис. 3) и 50 % раствором ацетона. Это еще раз подтверждает, что ДВ пиона представлены полифенольными соединениями с высокой степенью галлоилирования. Фракция, полученная в условиях водной элюции, по данным ТСХ и УФ-спек-троскопии, содержит галловую, салициловую кислоту и ее производные (глюкозид салицин, метилса-лицилат и др.).
Таким образом, полученный образец ДВ пиона с высокой степенью очистки от низкомолекулярных фенольных соединений может использоваться в качестве рабочего стандартного образца (РСО) при контроле качества сырья и лекарственных препаратов на его основе. Применение ЖКХ низкого давления на ААфТ «бензгидразидного» типа с фе-
Рисунок 3 Хроматограмма ДВ пиона на ААфТ "бензгидразидного" типа с троксевазиновым лигандом (объем 2 мл). Проба - 2 мг. ПФ: А - вода, Б - 20 % этанол, В - 30 % этанол, Г - 40 % этанол, Д - 50 % ацетон
А Б В
II I
0 10 20 30 40
Номер фракции
нольными лигандами может служить основой для создания хроматографических систем для концентрирования, выделения и получения высокоочи-щенных от низкомолекулярных фенольных соединений суммарных образцов ДВ из растительных лекарственных препаратов для целей фармацевтического и фитохимического анализа.
24
№ 3 2003
бдицина
в Кузбассе
ЛИТЕРАТУРА:
1. Сур, С.В. Проблемы и перспективы разработки и внедрения современных лекарственных средств растительного происхождения /С.В. Сур, Э.Н. Гриценко //Фарматека. - 2001. - № 9/10. -С.10-14.
2. European Pharmacopoeia. 3rd Edn. 1997. - Strasburg, Council of Europe, 1996. - 1800 p.
3. The United States Pharmacopeia USP 24. - Rockville, US Pharmacope-ial Convention Inc. - 2001. - 2391 p.
4. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье /МЗ СССР. - XI издание. - М., 1989. - 400 с.
5. Стандартизация отечественных жидких спиртосодержащих фитопрепаратов в рамках фармакопейных нормативов России /Н.А. Тюкавкина, И.Г. Зенкевич, Л.В. Прохорова и др. //Настойки, экстракты, эликсиры и их стандартизация. - СПб., 2001. -С. 129-177.
6. Кузнецов, П.В. Современные тенденции развития классических и нетрадиционных вариантов аффинной хроматографии /П.В. Кузнецов //Хим.-фарм. журнал. - 1992. - № 2. - С. 78-84.
7. Кузнецов, П.В. Синтез, исследование и применение адсорбентов аффинного типа биомедицинского и фармацевтического назначения /П.В. Кузнецов: Автореф. дис. ... д-ра фарм. наук. - Рязань, 1994. - 78 с.
8. Антипенко, Е.М. Исследование очистки, разделения и анализа растительных дубильных веществ методами хроматографии на адсорбентах аффинного типа /Е.М. Антипенко: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. - СПб, 1996. - 25 с.
9. Шкаренда, В.В. Исследование адсорбентов аффинного типа для разделения, очистки и анализа кумаринов, их производных и ку-маринсодержащих лекарственных средств /В.В. Шкаренда: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. - СПб, 1992. - 22 с.
IG. Аналитический обзор результатов исследований, завершенных в 1993 г., по основным проблемам фармацевтической науки /И.С. Гри-цаенко, Н.К. Горчакова, Л.Г. Нукова и др. - M., 1994. - С. 97.
11. Бондарь, В.С. Синтез, скрининг и использование новых аффинных адсорбентов для получения высокоочищенных НАДФ-зависимых ферментов /В.С. Бондарь, П.В. Кузнецов, В.В. Mежевикин. - Красноярск, 1987. - С. 3S.
12. Кузнецов, П.В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ. IX. Исследование танина на адсорбентах с фенольными и полифенольными лиган-дами /П.В. Кузнецов, ЕМ. Антипенко, В.В. Шкаренда //Хим.-фарм. ж. - 199б. - № 7. - С. S1-S3.
13. Беликов, В.В. Способ количественного определения танина. Авт. св. СССР № 741149 /В.В. Беликов //БИ. - 198G. - № 22. - С. 1S.
14. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Paeoniaceae-Thymelaeceae. -Л., 198S. - С. 7-11.
15. Takechi, M. Antiviral substances from the root of Paeonia species /M. Takechi, Y. Tanaka //Planta medica. - 1982. - Vol. 45, N 4. -P. 2S2-2S3.
16. Запрометов, M.K Биохимия катехинов /M.K Запрометов. - M., 19б4. - 3S2 с.
17. Structure of gaIIotаnnins in Paeoniae radix /M. Nishizawa, T. Jama-gishi, T. Nonaka et al. //Chem. Pharm. Bull. - 198G. - Vol. 28, N 9. -P. 28SG-28S2.
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ЕСТЕСТВОЗНАНИЯ ПРОВОДИТ 22-29 февраля 2004 г. в Египте (г. Хургада) СЛЕДУЮЩИЕ КОНФЕРЕНЦИИ:
- "ГОМЕОСТАЗ И ЭНДОКРИНОЛОГИЯ"
- "СОВРЕМЕННЫЕ НАУКОЕМКИЕ ТЕХНОЛОГИИ"
- "СТРАТЕГИЯ ЕСТЕСТВЕННОНАУЧНОГО ОБРАЗОВАНИЯ"
- "ЭКОЛОГИЯ И РАЦИОНАЛЬНОЕ ПРИРОДОИСПОЛЬЗОВАНИЕ"
- "ЭКОНОМИЧЕСКИЕ НАУКИ. АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ"
Материалы конференций будут опубликованы в журналах РАЕ. Прием заявок и тезисов до 1 января 2004 г.
IV МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС ПО АСТМЕ IX МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС ПО КЛИНИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ Бангкок, Тайланд, 15-23 февраля 2004 г.
Прием заявок и тезисов до 10 января 2004 г.
Медицина № 3 2Ш3
в Кузбассе № 3 2GG3 25
