CC BY
484
Погружённое культивирование и химический состав мицелия Иепешт егтаевж
А. В. АВТОНОМОВА', А. В. БАКАНОВ', М. И. ШУКТУЕВА', В. А. ВИНОКУРОВ2, О. В. ПОПОВА2, А. И. УСОВ3, Л. М. КРАСНОПОЛЬСКАЯ'
Submerged Cultivation and Chemical Composition of Hericium erinaceus Mycelium
A. V. AVTONOMOVA, A. V. BAKANOV, M. I. SHUKTUEVA, V. A. VINOKUROV, O. V. POPOVA, A. I. USOV, L. M. KRASNOPOLSKAYA
G. F. Gauze Research Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
I. M. Gubkin Russian State University of Petroleum and Gas, Moscow
N. D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow
На основе изучения трофических потребностей лекарственного гриба Hericium erinaceus и оптимизации одной из наиболее перспективных жидких питательных сред разработан способ погружённого культивирования, обеспечивающий получение 22—23 г/л воздушно-сухой биомассы на 7-е сутки ферментации. Способ погружённого культивирования масштабирован для условий лабораторного ферментёра. Изучен химический состав мицелия H.erinaceus, полученного по разработанному способу. По содержанию всех незаменимых аминокислот за исключением триптофана биомасса H.erinaceus соответствовала требованиям ФАО/ВОЗ. Основными жирными кислотами мицелия H.erinaceus являются олеиновая и линолевая. Содержание водорастворимых полисахаридов составляет 19%. Выделены две фракции водорастворимых полисахаридов, содержащие в своём составе рамнозу, фукозу, ксилозу, глюкозу и галактозу. В погружённой биомассе H.erinaceus обнаружены витамины В1, В2, В6, PP и Е, эргостерин, коэнзим Q.
Ключевые слова: погруж'еннж культивирование, мищлий Hericium erinaceus.
Submerged cultivation of Hericium erinaceus in various media was studied. The yield of the biomass was shown to depend mainly on the carbon source, whereas the content of water soluble polysaccharides depended mainly on the nitrogen source. The optimal medium composition provided the biomass yield of 21—23 g/l in 7 days. The biomass was characterized by the content of total protein, lipids and carbohydrates. In addition, the amino acid composition of the biomass was determined and shown to meet all the requirements of FAO/WHO concerning the amounts of essential amino acids (with exception of tryptophane). Oleinic and linoleic acids were identified as the main components of the fatty acids. Two water soluble polysaccharide fractions differing in solubility in aqueous ethanol were isolated and shown to contain rhamnose, fucose, xylose, glucose and galactose in different proportions. Vitamins B1, B2, B6, PP and E, ergosterol and coenzyme Q were also detected in the biomass of H.erinaceus.
Key words: submerged cultivation, Hericium erinaceus.
' НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, Москва
2 Российский государственный университет нефти и газа им. И. М. Губкина, Москва
3 Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН, Москва
Введение
львиная грива, ямабушитаке. Обладая удивительным вкусом и формой, этот гриб содержит биологически активные вещества, способные оказывать положительное воздействие на человеческий организм. За последние два десятилетия у Н.еп-наеет были обнаружены метаболиты, способные стимулировать образование нейротрофинов, в том числе фактора роста нервов (МОБ) и нейрот-рофического фактора головного мозга (ББМР), оказывать цитотоксическое действие на опухолевые клетки, проявлять гиполипидемические и иммуномодулирующие свойства. В последнее время для получения биологически активных соединений Н.епнаеет разрабатывают способы выращивания не только плодовых тел, но и погру-
Поиск, изучение и технологии получения из природных объектов новых субстанций для лекарственных препаратов являются важными направлениями современных исследований в областях медицины и биотехнологии. Базидиальные грибы, обладающие широкими биосинтетическими возможностями, относятся к наиболее перспективным в этом отношении объектам. Один из них — ксилотрофный гриб Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. — гериций решетчатовидный,
© Коллектив авторов, 2012
Адрес для корреспонденции: 119021 Москва, Б.Пироговская, 11, строение 1. НИИНА
жённого мицелия гриба. Из культуральной жидкости Herinaceus была изолирована полисахарид-ная фракция, обладающая противоопухолевым и иммуномодулирующим эффектом и содержащая в своём составе преимущественно глюкозу [1]. Эринацин, обладающий стимулирующим действием на синтез фактора роста нервов, был выделен из мицелия H.erinaceus, выращенного в погружённой культуре [2]. Позднее способ получения эринацина был оптимизирован, максимальное содержание эринацина А составило 192+42 мг/л культуральной жидкости, длительность процесса культивирования — 8 суток [3]. Эндополисахариды H.erinaceus, выращенного в погружённой культуре, обладают антиоксидант-ным и гепатопротекторным свойствами [4], оказывают противоопухолевое действие [5, 6]. В литературе описаны способы погружённого культивировании Herinaceus, эффективность накопления погружённой биомассы в которых существенно варьирует: 2,7—9,2 г/л [7], 14+0,45 г/л [8], 19,92 г/л [9].
Данная статья посвящена разработке метода выращивания Hericium erinaceus в погружённой культуре и определению химического состава полученного мицелия.
Материал и методы
В работе использовали штамм H.erinaceus из коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных соединений ФГБУ «НИИНА» РАМН.
Погружённое культивирование осуществляли в колбах вместимостью 0,5 и 0,75 л на ротационной качалке при 220 об/мин и в лабораторном биореакторе (15 л, фирма New Brunswick) при аэрации стерильным воздухом 1,0 об/об-мин с механическим перемешиванием (n=200) мешалкой лопастного типа. Температура культивирования составляла 26—28°C. Среду стерилизовали при 1,2 атм. 30 мин. Среды содержали минеральные соли и органические источники углерода и азота, такие как глюкоза, сахароза, растительное масло, меласса, соевая мука, амарантовая мука, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт. Длительность процесса культивирования составляла от 4 до 11 суток. В процессе культивирования измеряли накопление биомассы (весовым методом после высушивания) и рН культурального фильтрата (потенциомет-рически). Опыты ставили в двух повторностях. По завершении процесса культивирования мицелий отделяли от культураль-ной жидкости фильтрованием, промывали дистиллированной водой и сушили до постоянного веса при температуре, не превышающей 45°С. Содержание влаги в воздушно-сухом образце составляло 6,5%.
Для приготовления водных экстрактов навеску сухого мицелия заливали дистиллированной водой и автоклавирова-ли 2 ч при 1,2 атм. а затем полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр и хранили при — 20°C.
Определение количественного содержания полисахаридов в водных экстрактах мицелия проводили с использованием фенол-сернокислотного метода [5].
Полисахаридные фракции (I и II) водного экстракта погружённого мицелия H.erinaceus получали последовательным осаждением полимеров путём добавления в экстракт 96% этанола. Полисахаридная фракция I была получена после добавления к водному экстракту двух равных объёмов этанола. Оса-
док отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин. Для получения полисахаридной фракции II к супер-натанту добавляли ещё два объёма этанола и центрифугировали в том же режиме. После осаждения осадки лиофилизирова-ли. Для определения моносахаридного состава полисахариды подвергали полному гидролизу обработкой 2М трифторуксус-ной кислотой в присутствии в качестве маркёра миоинозита. Полученные моносахариды переводили в ацетаты полиолов, которые идентифицировали и количественно определяли с применением газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе НР 5890А [6].
Липиды выделяли по методу Фолча [7] из сухой биомассы. Содержание липидов в мицелии определяли весовым методом. Для определения состава жирных кислот выделенный липидный остаток обрабатывали по ГОСТ Р 51486-99 с целью получения метиловых эфиров жирных кислот и далее исследовали хроматографически согласно ГОСТ Р 51483-99. Газожидкостная хроматография проведена на хроматографе AI Cambridge GC 95M с пламенно-ионизационным детектором (капиллярная колонка SP-2340 30 м х 0,25 мм х 0,2 мкм/тол-щина жидкого слоя). Для калибровки системы использован стандартный образец метиловых эфиров рапсового масла фирмы Supelco (Cat No. 07756-1AMP).
Определение содержания общего белка в биомассе проводили по методу определения азота по Кьельдалю с последующим пересчётом на белок [9]. Используемый коэффициент пересчета — 4,38. Определение аминокислотного состава проводили после гидролиза образцов с помощью аминокислотного анализатора Биотроник LC-7000 [9].
Метод определения витаминов А, Е основан на экстракции витаминов и введении экстракта на ВЭЖХ колонку для хроматографического разделения и последующего определения с помощью флуоресцентного («Джаско» 821-FP) и спект-рофотометрического («Джаско» 870-UV) детекторов. Использована ВЭЖХ система HP 1050. Определение витаминов Вь В2 и B6 проводили методом ВЭЖХ в обращённофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме со спектрофлуо-рометрическим детектированием (интервал длин волн 220650 нм) [9]. Содержание эргостерина оценивали методом ГЖХ, анализируя стерины, выделенные из липидов путём тонкослойной хроматографии фракции неомыляемых веществ [9]. Определение коэнзима Q проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на жидкостном хроматографе с УФ-детектором в соответствии с рекомендациями Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России [9].
Содержание изучаемых веществ пересчитывали на абсолютно сухую биомассу.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования было оценено влияние различных сочетаний источников углерода и азота на накопление биомассы использованного штамма H.erinaceus и содержание в ней водорастворимых полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием [5, 6]. Полученные результаты приведены в табл. 1 и на рисунке. H.erinaceus на всех средах рос в виде округлых рыхлых пеллет. По обеспечению выхода воздушно-сухой биомассы все среды можно было разбить на две группы. На средах первой группы накопление биомассы варьировало в пределах 8,1—11,0 г/л. В состав этой группы входили все среды с растительным маслом и мелассой, за исключением среды, содержащей мелассу в сочета-
Таблица 1. Накопление воздушно-сухой биомассы и водорастворимых полисахаридов мицелия на средах с различными источниками питания
Источник углерода Источник азота Выход воздушно-сухой _Водорастворимые полисахариды_
биомассы, г/л содержание в абсолютно выход, г/л
сухом мицелии,%
Сахароза Соевая мука 5,4 37,4 1,89
Дрожжевой экстракт 4,0 18,2 0,68
Амарантовая мука 3,6 20,3 0,68
Кукурузный экстракт 4,5 13,9 0,58
Растительное масло Соевая мука 9,2 19,8 1,75
Дрожжевой экстракт 11,0 23,5 2,42
Амарантовая мука 8,1 24,6 1,86
Кукурузный экстракт 9,3 10,7 0,93
Меласса Соевая мука 9,9 19,3 1,78
Дрожжевой экстракт 9,8 28,9 2,65
Амарантовая мука 8,9 21,4 1,78
Кукурузный экстракт 5,8 12,8 0,70
20
0-1-,-,-,-,-,-,-,-
4 5 6 7 8 9 10 11
Сутки
—О— Среда с растительным маслом и дрожжевым экстрактом
—■— Среда с мелассой и соевой мукой
—А— Среда с мелассой и дрожжевым экстрактом
Накопление воздушно-сухой биомассы H.erinaceus на неоптимизированных средах с различными источниками углерода и азота.
нии с кукурузным экстрактом. Среды второй группы обеспечивали выход биомассы в пределах 3,6—5,8 г/л. Эту группу менее эффективных сред составили все среды с сахарозой и среда с мелассой и кукурузным экстрактом. Таким образом, выход биомассы H.erinaceus в большей степени зависел от источника углерода, чем от источника азота. Содержание водорастворимых полисахаридов в погружённом мицелии, выращенном на разных средах, варьировало в широких пределах 10—35% и зависело, прежде всего, от источника азота в среде. Наиболее низкое содержание водорастворимых полисахаридов было отмечено в мицелии, полученном на всех средах с кукурузным экстрактом. Среда с сахарозой и соевой мукой обеспечивала самое высокое содержание водорастворимых полисахаридов в мицелии. По выходу водорастворимых полисахаридов в расчёте на литр среды изученные композиции сред были разделены на три группы. Наибольший выход водорастворимых полисахаридов, составивший
2,42—2,65 г/л, был отмечен на средах с дрожжевым экстрактом, за исключением среды с сочетанием дрожжевого экстракта и сахарозы. Выход водорастворимых полисахаридов в диапазоне 1,75—1,89 г/л, обеспечивали все среды с соевой мукой и амарантовой мукой в сочетании с растительным маслом и мелассой. Остальные среды были малоэффективны для получения водорастворимых полисахаридов, выход которых составил 0,58—0,93 г/л.
Максимальное накопление биомассы H.eri-naceus на всех изученных средах приходилось на 8—9-е сутки культивирования. На среде с растительным маслом и дрожжевым экстрактом максимум содержания биомассы был отмечен на 8-е сутки. Активное накопление погружённого мицелия на этой среде заканчивалось к 6-м суткам, за последующие двое суток выход воздушно-сухой биомассы возрастал только на 1 г/л (рисунок). Содержание водорастворимых полисахаридов в мицелии снижалось к 6-м суткам процесса и далее оставалось практически без изменений. Снижение было достаточно резким. Так, за двое суток (с 4 по 6) доля водорастворимых полисахаридов в мицелии уменьшилась примерно на 10%. Несмотря на снижение содержания водорастворимых полисахаридов в мицелии, их выход в течение процесса погружённого культивирования постоянно возрастал до 8-х суток за счёт увеличения накопления биомассы.
На следующем этапе работы была проведена оптимизация состава жидкой питательной среды для погружённого культивирования H.erinaceus. Задача этого этапа исследования заключалась в достижении выхода воздушно-сухой биомассы гриба не менее 20 г/л. В качестве источников углерода и азота были выбраны растительное масло и соевая мука, т. к. дорогостоящий дрожжевой экстракт в неоптимизированных количествах по сравнению с соевой мукой увеличивал выход биомассы только на 2 г/л. Работу проводили по ранее предложенному алгоритму создания биотехноло-
Таблица 2. Потребность взрослого человека в незаменимых аминокислотах (НА) согласно рекомендации ФАО/ВОЗ (Food and Agriculture Organization & World Health Organization, 1990) и содержание НА в мицелии H.erinaceus (г / 100 г белка)
Аминокислота Необходимый уровень НА Оптимальный уровень НА. Содержание в мицелии
Эталон ФАО/ВОЗ H.erinaceus
Изолейцин 1,80 2,80 3,42
Лейцин 2,50 6,60 7,49
Лизин 2,20 5,80 4,28
Метионин + цистин 2,40 2,50 3,21
Фенилаланин + тирозин 2,50 6,30 14,55
Треонин 1,30 3,40 5,13
Триптофан 0,65 1,10 —
Валин 1,80 3,50 4,39
Таблица 3. Состав нейтральных моносахаридов во фракциях водорастворимых полисахаридов погружённого мицелия Н.еппасеа5
Фракция Содержание моносахарида, %
рамноза фукоза ксилоза глюкоза галактоза
I 1,8 4,3 2,8 30,6 3,8
II 2,0 4,4 1,2 21,8 11,2
гических способов погруженного культивирования мицелиальных грибов [11]. Поставленная задача была решена, благодаря постановке экспериментов с использованием методов математического планирования. Были использованы такие методы, как метод полного факторного эксперимента (ПФЭ) и метод крутого восхождения (КВ). В двухуровневом ПФЭ было изучено влияние четырех факторов (соль магния, дигид-рофосфат калия, растительное масло и соевая мука) на накопление биомассы Н.еппаееш. Согласно полученным в ПФЭ результатам значимыми факторами для накопления биомассы Н.еппаееш были дигидрофосфат калия, растительное масло и соевая мука. Результаты ПФЭ были использованы для постановки опыта по методу КВ, в котором на протяжении семи шагов одновременно меняли концентрации всех значимых факторов в соответствии с величиной и знаком их коэффициентов регрессии. Результатом этой части работы стал способ погружённого культивирования Н.еппаееш, обеспечивающий получение 22—23 г/л воздушно-сухой биомассы на 7-е сутки ферментации.
Разработанный способ погружённого культивирования был масштабирован для условий лабораторного биореактора. Выход биомассы Н.еп-паееш варьировал в диапазоне 21—23 г/л, выход водорастворимых полисахаридов от 4,2 до 4,6 г/л. Полученные экспериментальные партии погружённого мицелия Н.еппаееш были использованы для дальнейших химических и медико-биологических исследований.
Общее содержание жиров в погружённой биомассе Н.еппаееш составило 15,5%. Суммарное содержание аминокислот составило 20,1%. Для сравнения был использован метод определения общего белка по Кьельдалю, заключающийся в
определении азота в образце и использовании коэффициента 4,38. Расчётное содержание белка по этому методу составило 19,1%.
Изучение аминокислотного состава показало, что в процентном отношении от общего количества аминокислот больше всего в погружённой биомассе содержалось глутаминовой кислоты (20,2%), а также аспарагиновой кислоты (10,4%) и тирозина (9,8%). Содержание незаменимых кислот лейцина, треонина, фенилаланина, лизина, валина, изолейцина и метионина в целом было выше или совпадало с содержанием этих аминокислот в стандартном белке ФАО/ВОЗ (табл. 2). Исключение составило содержание лизина, которое было немного ниже оптимального.
Содержание водорастворимых полисахаридов в мицелии, выращенном на разработанной среде, составило 19,6%. Из водного экстракта погружённого мицелия осаждением этанолом были получены две фракции полисахаридов I и II, различающиеся по растворимости в водном этаноле, и изучен их моносахаридный состав. По данным ГЖХ, обе полисахаридные фракции содержали в своём составе рамнозу, фукозу, ксилозу, глюкозу и галактозу, количественные соотношения которых в этих фракциях были различны (табл. 3). Основным моносахаридом обеих групп была глюкоза.
При определении состава и содержания жирных кислот было показано, что погружённая биомасса Н.еппаееш содержала такие жирные кислоты, как олеиновая, линолевая, пальмитиновая, стеариновая, линоленовая, арахиновая (эйкоза-новая), эруковая. Из общего количества жирных кислот на ненасыщенные приходилось немногим более 80%. Больше всего во фракции жирных кислот содержалось олеиновой кислоты (59%). На втором месте была линолевая кислота (21%).
В экспериментальном образце погружённой биомассы H.erinaceus было изучено наличие жиро- и водорастворимых витаминов и эргостерина. Витамины А и D в биомассе обнаружены не были. Содержание эргостерина в биомассе составило
0.64.. Из изученных витаминов больше всего в биомассе H.erinaceus содержалось витамина PP — 152 мг/100 г. Количество витамина B1 составило 2,2 мг/100 г биомассы, B2 — 3,6 мг/100 г, B6 — 3,6 мг/100 г. Витамин E содержался в мицелии в количестве 30 мг/100 г.
В биомассе H.erinaceus был обнаружен коэн-зим Q10 в количестве 5,3 мг/100 г мицелия.
Заключение
Таким образом, было оценено влияние источников питания на накопление в погружённой культуре биомассы H.erinaceus и содержание в ней водорастворимых полисахаридов, что позволило выбрать одно из наиболее эффективных сочетаний источников углерода и азота. Оптимизация жидкой питательной среды позволила
ЛИТЕРАТУРА
1. Wang J. C. Hu S. H, Lee T. M. Antitumor and immunoenhancing activities of polysaccharide from culture broth of Hericium spp. Kaoshing J Med Sci 2001; 17: 9: 461—467.
2. Shimbo M, Kawagishi H, Yokogoshi H. Erinacine A increases catecholamine and nerve growth factor content in the central nervous system of rats. Nutrition Research 2005; 25: 6: 617—623.
3. Krzyczkowski W, Malinowska E, Herold F. Erinacine A biosynthesis in submerged cultivation of Hericium erinaceum: quantification and improved cultivation. Engineering in Life Sciences 2010; 10: I: 5: 446—457.
4. Zhanga Z, Lva G, Pana H, Pandeyb A., Hec W. Antioxidant and hepatoprotective potential of endo-polysaccharides from Hericium eri-naceus grown on tofu whey. I.J.Biologocal Macromolecules 2012; 51: I: 5: 1140—1146.
5. Краснополъская Л. M, Белицкий И. В., Автономова А. В., Соболева Н. Ю, Усов А. И., Исакова Е. Б., Либензон А. В., Бухман В. МСис-тема скрининга экстрактов базидиальных грибов, обладающих противоопухолевой активностью. Успехи медицинской микологии. Материалы III Всерос. конгр. по медицинской микологии. М.: 2005; 5: 192—195.
6. Автономова А. В., Леонтъева М. И., Исакова Е. Б., Баканов А. В., Усов А. И., Бухман В. М., Краснополъская Л. МИзучение противоопухолевых свойств мицелия Hericium erinaceus, полученного в условиях погруженного культивирования. В сб.: Биотехнология и
разработать способ погружённого культивирования H.erinaceus, обеспечивающий получение 21—23 г/л воздушно-сухой биомассы на 7 сутки ферментации. Способ погружённого культивирования масштабирован для условий лабораторного ферментёра. Изучен химический состав мицелия H.erinaceus, полученного по разработанному способу. Оценено общее количество белков, жиров и углеводов, изучен аминокислотный состав, жирнокислотный состав, содержание витаминов группы В и витамина E, эргос-терина и коэнзима Q. Полученные результаты свидетельствуют о том, что погружённая биомасса H.erinaceus может служить источником промышленного получения биологически активных соединений для биомедицины и био-фармацевитики.
Работа частично выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009—2013 годы» при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.
биомедицинская инженерия (Труды 3 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, Курск, 7—8 июня 2010 г.). Курск, 2010; 5—8.
7. Lomberh M. L., Solomko E. F., Buchalo A. S., Kirchhoff B. Studies of medicinal mushrooms in submerged cultures. Mushroom Biology and Mushroom Products. Proceedings of the 4th International Conference. Mexico, 2002; 367—377.
8. Malinowska E., Krzyczkowski W., Lapienis G., HeroldF. J Industr Microbiol Biotech 2009; 36: 12: 1513—1527.
9. Cui F., Liu Z., Li Y., Ping L., Zhang Z., Lin L., Dong Y., Huang D. Productionof mycelial biomass and exo-polymer by Hericium erinaceus CZ-2: Optimization of nutrient levels using response surface methodology. Biotech Bioprocess Engineering 2010; 15: 2: 299—307.
10. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 1956; 28: 3: 350—356.
11. СлонекерДж. Методы исследования углеводов / Под ред. А. Я. Хор-лина. М.: 1975; 22—25.
12. Folch J., Lees M., Sloan-Stanley G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids animal tissue (for brain, liver and muscle). J Biol Chem 1957; 226: 497—509.
13. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. Руководство Р 4.1.1672-03. М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004; 240.
