CC BY
160
Л. М. Краснопольская (д.б.н., зав.лаб.)1, А. В. Автономова (к.б.н., с.н.с.)1,
О. Н. Щегловитова (д.м.н., )2, Н. Н. Склянкина (н.с.)2, П. А. Гущин (с.н.с., к.т.н.)3
Получение погруженного мицелия штаммов ganoderma lucidum и интерферон-индуцирующая активность эндополисахаридов гриба
1 Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, лаборатория биосинтеза биологически активных соединений 119021, г. Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11; тел. (499) 2552391, факс (499) 2450295,
e-mail: [email protected] 2Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи,
123098 г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18; тел. (499) 1936143, e-mail: [email protected] 3 Российский государственный университет нефти и газа имени И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии 119331, г. Москва, Ленинский просп, 65, корп. 1; тел. (499)2339589, e-mail: [email protected]
L. M. Krasnopolskaya1, A. V. Avtonomova1,
O. N. Scheglovitova2, N. N. Sklyznkina2, P. A. Guschin3
Production of ganoderma lucidum strains submerged mycelium and interferon-inducing activity of endo-polysaccharides
1 Gauze Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences,
11, Bol'shaya Pirogovskaya Str, 119992, Moscow, Russia; ph. (499)2552391, e-mail: [email protected] 2Gubkin Russian State University of Oil and Gas,
65, Leninskii pr, 119331, Moscow, Russia; ph. (499)2339589, e-mail: [email protected].
3Gamaleya Institute of Epidemiology and Microbiology the Ministry of health and social development of Russia,
123098, Moscow, Russia; ph. (499)1936143, e-mail: [email protected]
Изучено накопление мицелия и длительность процессов погруженного культивирования 10 штаммов Ganoderma lucidum. Наиболее высокие выходы погруженной биомассы каждого из штаммов были получены в наиболее длительных процессах. В качестве высокопродуктивных культур были отобраны пять штаммов G. lucidum (1. 2. 3. 9 и 10). Максимальное значение выхода биомассы в неоптимизированных условиях было выше 14 г/л. Способность к кратким процессам погруженного культивирования показали три штамма G. lucidum: 2, 4 и
5. В кратких процессах выход биомассы штаммов 4 и 5 был выше по сравнению с выходом биомассы штамма 2. В опыте in vitro суммарная фракция эндополисахаридов G. lucidum показала интерферон-индуцирующую активность.
Ключевые слова: базидиальные грибы; Ganoderma lucidum; интерферон-индуцирующая активность; мицелий; погруженное культивирование; эндополисахариды.
Дата поступления 20.11.12
The mycelium accumulation and duration of processes of Ganoderma lucidum strains submerged cultivation were studied. The higher submerged biomass yields of each strain were obtained in the long-term processes. Five G. lucidum strains (1, 2, 3, 9 and 10) were select as highly productive. The maximum oh biomass yield under non-optimized conditions reach 14 g/l. Three strains (2, 4 and 5) showed the speeded processes of submerged cultivation. In short processes the biomass yield of strains 4 and 5 were higher when biomass yield of strain 2. The total fraction of G. lucidum endo-polysaccharides showed the interferon-inducing activity in vitro.
Key words: basidiomycetes; Ganoderma
lucidum; submerged cultivation; mycelium; endo-polysaccharides; interferon-inducing activity.
Лекарственные базидиальные грибы могут служить источниками биологически активных метаболитов, перспективных для использования в биофармацевтике и биомедицине. Выделены и охарактеризованы метаболиты лекарственных базидиомицетов с иммуномодулирующими, противоопухолевыми, противовирусными, антибактериальными, антипарази-тарными, гиполипидемическими, гипоглике-мическими, антиоксидантными, противовоспалительными и другими свойствами 1,2. Трутовик лакированный Ganoderma lucidum ( Curt.:Fr.) P. Karst. — один из наиболее известных лекарственных базидиальных грибов благодаря широте спектра биологических свойств, включающего все вышеперечисленные биологические свойства, выраженности биологической активности и длительности практического использования в народной медицине. По своей химической природе большинство биологически активных метаболитов G. lucidum относится к тритерпенам и полисахаридам 3-6.
В последние годы особое внимание привлекают противовирусные свойства G. lucidum, которые могут выражаться в ингибировании различных этапов жизнедеятельности вируса и повышении иммунной защиты организма, подвергающегося воздействию вируса. Полисахаридные фракции, полученные из мицелия G.lucidum, и гликопротеины, выделенные из плодовых тел, проявляли ингибирующее действие в отношении вирусов герпеса I и II второго типа 7,8. Препарат Ганополи, содержащий не менее 25% полисахаридов из плодовых тел G.lucidum, продемонстрировал достоверную ингибирующую активность в отношении вируса гепатита B в клинических испытаниях 9. В опытах in vitro было показано, что водорастворимые и метанолрастворимые субстанции из плодовых тел G. lucidum обладали противовирусным действием, ингибируя цито-патические эффекты вируса везикулярного стоматита 10. Метаболиты G. lucidum способны индуцировать образование интерферона. Обработанные полисахаридной фракцией G. lucidum дендритные клетки стимулировали Т-лимфоциты, в которых усиливалась секреция интерферона 11. Ганодеровая кислота Me, выделенная из мицелия G.lucidum в опытах in vivo, достоверно повышала экспрессию интерферона-у 12.
Перспективными методами получения биологически активных соединений G. lucidum являются биотехнологии выращивания гриба в погруженной культуре, обеспечивающие строгий контроль всех параметров процесса.
Цель настоящей работы заключалась в сравнительном изучении закономерностей роста штаммов G. lucidum в погруженной культуре и выявлении интерферон-индуцирующей способности эндополисахаридов наиболее продуктивного штамма.
В работе использовали 10 штаммов G. Ш-cidum из лаборатории биосинтеза биологически активных соединений ФГБУ «НИИНА» РАМН. Штаммы приведены под их рабочими номерами.
Хранение штаммов и их культивирование на плотных средах и в периодической погруженной культуре описано ранее 13. Погруженное культивирование штаммов G.lucidum проводили в качалочных колбах на 500 и 750 мл. Процесс культивирования включал два этапа: выращивание жидкого посевного материала и собственно накопление биомассы гриба.
Для установления трофических предпочтений штаммов G.lucidum использовали жидкие питательные среды, различающиеся сочетаниями источников углерода и азота. Среды содержали также минеральные источники фосфора, калия и магния. Состав сред приведен в табл. 1.
Таблица 1
Источники углерода и азота в жидких средах для культивирования й. lucidum
^^-Источник N Источник Соевая мука Пеп- тон Дрожжевой экстракт+ +нитрат натрия
глюкоза Ф1 Ф2 ФЗ
Масло растительное Ф4 Ф5 Фб
Таблица 2 Максимальный выход биомассы штаммов G. lucidum
Штамм Среда Выход биомассы, г/л Длительность культивирования, сут
1 ФА 13.5 9
Фб 13.5 11
2 ФА 14.8 8
З Фб 14.2 9
А Фб 11.5 7
б Фб 11.7 7
б Ф1 7.7 9
7 ФА 10.9 14
8 ФА 11.05 10
9 ФА 13.2 9
10 ФА 13.1 8
Среды стерилизовали в автоклаве при 1.2 атм. 30 мин. Длительность процесса культивирования от 1 до 14 сут. В процессе культивирования изучали накопление воздушно-сухой биомассы (весовым методом). Содержание
влаги в воздушно-сухом мицелии составляло 5—6 %. Опыты ставили в трех повторностях.
По окончании культивирования мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, сушили до постоянного веса при 40 0С и измельчали на бытовой кофемолке. Для приготовления водного экстракта навеску сухого мицелия 3.6 заливали 100 мл дистиллированной водой и автоклавировали при 1.2 атм. в течение 2 ч. Экстракт фильтровали через бумажный фильтр. Суммарную фракцию водорастворимых эндополисахариднов получали путем добавления в водный экстракт 4-х объемов 96% этанола. Полученный осадок отделяли центрифугированием при 3000 об./мин в течение 20 мин. Затем осадок растворяли в небольшом количестве воды, раствор фильтровали и лиофилизировали.
Для изучения интерферон-индуцирующей способности готовили исходный раствор суммарной фракции водорастворимых полисахаридов с концентрацией 800 мкг/мл. К навеске массой 4 мг добавляли 5 мл дистиллированной воды. Затем методом разведений готовили растворы суммарной фракции водорастворимых полисахаридов с концентрацией 400, 200, 100, 50, 10, 5, 1 и 0.1 мкг/мл. Эти образцы использовали в качестве индукторов интерферона.
Клетками-продуцентами служили лейкоциты донорской крови человека. Концентрация лейкоцитов составляла 1х106 /мл. В качестве среды использовали среду ИРМ1 1640, объем среды в каждой пробе составлял 1.0 мл. К взвеси лейкоцитов в каждой пробе добавляли по 0.1 мл соответствующего разведения исследуемой суммарной фракции. В качестве контроля использовали вирус болезни Ньюкасла (ВБН) как индуктор -интерферона и фитогемагглютинин Р (ФГА) как индуктор -интерферона, а также взвесь лейкоцитов в среде без добавления индуктора. Синтез интерферона проводили при температуре 37 0С. Образцы отбирали через 24, 48 и 72 ч. Активность интерферона определяли путем титрования в диплоидной культуре фирбобластов эмбриона человека против 10 и 1 ЦПД50 вируса энцефаломиокардита мышей. За титр интерферона принимали последнее его разведение, в котором наблюдалось 50% защиты клеточного монослоя от цитопатического действия вируса.
Изучение трофических потребностей штаммов G. lucidum позволяет, во-первых, осуществить качественный подбор источников питания для дальнейшей разработки эффективных сред, в том числе с применением методов математического планирования экспери-
мента, во-вторых, установить варьирование в неоптимизированных условиях таких показателей, как выход биомассы и длительность процесса культивирования, в-третьих, оценить штаммовое разнообразие в изучаемых условиях.
В результате предварительных исследований, для каждого штамма G. lucidum были отобраны по три среды, обеспечивающие наиболее высокие выходы их биомассы. Для 1, 2, 9 и 10 штаммов этими средами оказались Ф4, Ф5 и Ф6, для штаммов 6 и 7 это были среды Ф1, Ф4 и Ф6, для штаммов 3, 4, 5 и 8 — среды Ф1, Ф4 и Ф5 (табл. 4, 9).
На отобранных для каждого штамма средах был изучен процесс погруженного культивирования (рис.). Длительность опытов по изучению динамики накопления биомассы всех штаммов не превышала 11 сут, вне зависимости от того, достигала ли культура стадии идиофазы или нет.
Полученные результаты показали, что уровень накопления мицелия каждого из штаммов мог существенно различаться, что зависело от качественного состава жидкой питательной среды. При этом наибольший выход биомассы наблюдали в процессах, отличающихся большей длительностью. Так, на среде Ф4 максимальное содержание биомассы штамма 2, составляющее более 14 г/л воздушно-сухой биомассы, было достигнуто за 8 сут, в то время как максимальное содержание биомассы на среде Ф6 достигало менее 8 г/л за 5 сут. Лишь в единичных вариантах опыта не был достигнут максимум накопления биомассы.
В качестве наиболее продуктивных были отобраны штаммы 1, 2, 3, 9 и 10. Наименее продуктивным оказался штамм 6. В табл. 2 показаны максимальные результаты выхода биомассы штаммов G. lucidum, среды, их обеспечивающие, и длительности процессов. Таким образом, в неоптимизированных условиях наиболее высокий выход биомассы был отмечен у штамма 2 на среде, содержащей растительное масло и соевую муку.
Длительность процесса погруженного культивирования оказывает существенное влияние на рентабельность производства. В табл. 3 для каждого из изученных штаммов G. lucidum приведены показатели наиболее кратких процессов их погруженного культивирования: среды, их обеспечивающие, длительность процесса и максимальный выход в них биомассы. Результаты показывают, что наиболее краткие процессы погруженного культивирования были отмечены у штаммов 2, 4, 5, в неоптимизи-рованных условиях их длительность составляла
б) штамм 2
е) штамм 6
к) штамм 10
в) штамм 3
е) штамм 6
г) штамм 4
з) штамм 8
Рис. Накопление биомассы штаммов С. lucidum на отобранных средах
5 сут. При этом штаммы 4 и 5 обеспечивали наиболее высокий выход погруженной биомассы. Наименьшую скорость накопления погруженной биомассы продемонстрировал штамм 7.
Таблица 3
Наиболее краткие процессы погруженного культивирования штаммов й. lucidum
Штамм Среда Длительность культивирования, сут Выход биомассы, г/л
1 Ф5 8 11.5
2 Фб 5 7.б
3 Ф1 б 8.2
4 Ф4 5 10.98
5 Ф4 5 10.95
б Фб 8 б
7 Ф1 10 8.7
8 Ф5 8 10.5
9 Ф5 7 8.8
10 Ф5 7 10.5
Фб 7 11.1
Далее была оценена биологическая активность суммарной фракции водорастворимых эндополисахаридов. Для ее получения был использован один из наиболее продуктивных штаммов. Была оценена способность полученной фракции к индукции интерферона. Исследование было проведено in vitro с использованием лейкоцитов донорской крови человека. Тестирование интерферона проводили биологическим методом в культуре диплоидных фибробластов человека по подавлению репродукции индикаторного вируса. Полученные результаты представлены в табл. 4.
Таблица 4 Способность суммарной фракции водорастворимых полисахаридов погруженного мицелия G.lucidum индуцировать в лейкоцитах крови человека продукцию интерферона (ед/мл)
Концентрация препарата, мг/мл Время после индукции, ч
24 72
200 - -
100 32-б4 б4
50 32 б4
10 б4 128
1 32 б4
0,4 1б-32 1б-32
контроль клеток <2 <2
контроль ВБН 320 -
контроль ФГА 32 б4
Полученые результаты показали, что препарат суммарной фракции водорастворимых эндополисахаридов G.lucidum в концентрации от 0.4м г/мл до 100 мг/мл индуцирует в лей-
коцитах человека продукцию интерферона. Концентрация препарата, равная 200 мг/мл, является токсичной для клеток диплоидных фибробластов человека, в которых определяли активность интерферона. Наибольшая активность интерферона составляла 64—128 ед/мл и была выявлена при использовании препарата в концентрации от до 100 мг/мл. Оптимальное время для выявления наибольшего титра интерферона составляло 72 ч. Максимальная ин-терферон-индуцирующая активность суммарной фракции водорастворимых эндополисахаридов G.lucidum соответствовала аналогичному показателю контрольного индуктора гамма-интерферона — фитогемагглютинину.
Проведенное исследование выявило штам-мовое разнообразие культур G.lucidum по таким признакам, как трофические потребности в источниках углерода и азота, длительность процессов периодического погруженного культивирования и уровень накопления погруженной биомассы. Применительно к каждому штамму выход биомассы и длительность процесса его получения зависели от сочетания в жидкой питательной среде источников углерода и азота. Наиболее высокий выход биомассы всех штаммов в неоптимизированных условиях обеспечивали процессы погруженного культивирования, отличающиеся большей длительностью. При этом согласно полученным результатам наибольшей продуктивностью в пролонгированных процессах культивирования отличались штаммы 1. 2, 3, 9 и 10. Способность к кратким процессам периодического погруженного культивирования, составляющим 5 сут, была зарегистрирована у штаммов 2, 4 и 5. Выход биомассы штаммов 4 и 5 был выше, по сравнению с выходом биомассы штамма 2. Полученные результаты представляют собой необходимую основу для проведения дальнейшей оптимизации состава жидкой питательной среды и указывают на возможность двух ее путей. Первый путь предполагает выбор в качестве исходной среды такую ее композицию, которая обеспечивает наибольший выход погруженной биомассы. Оптимизация в этом случае должна быть одновременно направлена на дальнейшее повышение выхода биомассы и на сокращение длительности процесса культивирования. Во втором случае оптимизация будет базироваться на среде, обеспечивающей наиболее краткий процесс культивирования. Основная цель оптимизации, проводимой по второму пути, заключается в принципиальном (не менее чем в 2 раза) повышении выхода биомассы. Дальнейшее сокра-
щение длительности процесса погруженного культивирования играет в этом случае второстепенную роль.
Погруженное культивирование G.lucidum позволяет получать биомассу, содержащую биологически активные метаболиты. В настоящей работе показана интерферон-индуцирую-щая активность суммарной фракции водорастворимых эндополисахаридов G.lucidum, не уступающая аналогичному показателю положительного контроля — фитогемагглютинина.
Литература
1. Тулигуэл Юй Л., Хайин Б., Широких А. А., Широких И. Г., Егошина Т. Л., Кириллов Д. В. / Лекарственные грибы в традиционной китайской медицине и современных биотехнологиях.— Киров: О-Краткое, 2009.— C. 320.
2. Hobbs C. Medicinal mushrooms: an exploration of tradition, healing and cultures.— Loveland: Interweave Press, Inc., 1995.— 251 p.
3. Bao X. F., Wang X. S., Dong Q., Fang J. N., Li X. Y.//Phytochemistry.— 2002.— V.59.— P. 175.
4. Chien C. M., Cheng J. L., Chang W. T., Tien M. H., Tsao C. M., Chang Y. H., et al. // Bioorg. and Med. Chem.- 2004.- V.12, №21.- P.5603.
5. Gao J. J. Min B. N., Ahn E. M., Nakamura N., Lee H. K., Hattori M. // Chem. and Pharm. Bull.- 2002.- V.50, №6.- P.837.
6. Han H. F.,Nakamura N., Hattori M. // J. Nat. Medic.- 2006.- V.60.- P.295.
7. Eo S. K., Kim Y. S., Lee C. K., Han S. S. // Journal of Ethnopharmacology.- 1999.- V.68.-P.129.
8. Li Z., Liu J., Zhao Y. // Journal of Biochemistry and Molecular Biology.- 2005.- V.38, №1.- P. 34.
9. Gao Y., Zhou S., Chen G., Dai X., Ye J. and Gao H. A. // International Journal of Medicinal Mushrooms.- 2002.- V.4.- P.321.
10. Eo S.K., Kim Y.S., Lee C.K., Han S.S. // Journal of Ethnopharmacology.- 1999.- V.68.-P.129.
11. Lin Z. B. // Journal of Pharmacological Science.- 2005.- V.99.- P.144.
12. Wang G., Zhao J., Liu J., Huang Y., Zhong J. J., Tang W. // International immunopharmacology.-2007.- V.7, №6.- P.864.
1З.
Автономова А. симов В. H. // №2.- С.186.
В., Краснопольская Л. М., Мак-х Микробиология.- 2OO6.- Т.7З,
Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на2009—2013 гг.» при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (государственный контракт № 16.740.11.0193 от 24 сентября 2010 г.).
