CC BY
86
УДК 579.61 + 615.322
А. В. Автономова (к.биол.н., с.н.с.)2, А. В. Баканов (асп.)2, В. А. Винокуров (д.х.н., проф.)1, В. М. Бухман (д.м.н., зав.лаб.)3, Л. М. Краснопольская (д.биол.н., зав.лаб.)2
Противоопухолевые свойства погруженной биомассы Hericium erinaceus
1 Российский государственный университет нефти и газа им. И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии 119991, ГСП -1,В-296, г. Москва, Ленинский проспект, 65, корп. 1; тел. (499) 2339589, e-mail: [email protected], [email protected] 2Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, лаборатория биологически активных соединений 119021, г. Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11, e-mail: [email protected] 3Российский Онкологический Научный Центр им. Н. Н. Блохина РАМН,
115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24; тел. 8 (495) 4242244
A. V. Avtonomova, A. V. Bakanov 2, V. A. Vinokurov1, V. M. Bukhman3, L. M. Krasnopolskaya2
Antitumor activity of submerged biomass of Hericium erinaceus
1 Gubkin Russian State University of Oil and Gas 65, Leninskiy Pr, 119331, Moscow, Russia; ph. +7(499) 2339589, e-mail: [email protected], [email protected] 2Gause Institute of New Antibiotics Russian Academy of Medical Sciences,
11, B. Pirogovskaya Str, 119021, Moscow, Russia; e-mail: labbas @yandex.ru 3Russian academy of medical sciences Russian Cancer Research Center 24, Kashirskaya Str., 115478, Moscow, Russia; ph. +7(495) 4242244
Приведены результаты работы по оценке влияния источников питания на накопление в погруженной культуре биомассы H. erinaceus и содержание в ней водорастворимых полисахаридов. Разработан способ погруженного культивирования H. erinaceus, обеспечивающий получение 22—23 г/л воздушно-сухой биомассы на 7-е сутки ферментации. Противоопухолевое действие водных экстрактов и полисахаридных фракций было изучено в опытах in vivo на двух штаммах опухолей. Торможение роста опухоли достигало 86%. Совместное применение циклофосфамида в низкой дозе с водным экстрактом мицелия
H. erinaceus достоверно увеличивало эффект циклофосфамида.
Ключевые слова: базидиомицеты; погруженное культивирование; полисахариды; Hericium erinaceus; противоопухолевое действие.
Одним из самых необычных съедобных ксилотрофных базидиальных грибов можно назвать Hericium erinaceus (Bull.:Fr.) Pers. (гериций решетчатовидный, львиная грива, ямабушитаке). Его необычная форма, напоминающая кораллы, вкус, присущий лобстерам, и удивительные биологические свойства ставят
Дата поступления 30.09.11
Submerged cultivation of Hericium erinaceus in various media has been studied. The yield of biomass was shown to depend mainly on the carbon source, whereas the content of water-soluble polysaccharides depended primarily on the nitrogen source. Using optimal medium composition, the biomass yield of 22—23 g/l in 7 days was achieved. The antitumor activity was studied in vivo with using 2 tumor strains. The inhibition ratio of tumor in these experience reached 86%. An exposure of mice with tumor to cyclophophamide in a low dose induced an increase in the efficacy of H. erinaceus biomass aqueous extract.
Key words: basidiomycetes; submerged cultivation; polysaccharides; Hericium erinaceus; antitumor activity.
его в ряд наиболее интересных объектов для биотехнологии и изучения биологической активности. Исследования последних десятилетий показали наличие у H. erinaceus метаболитов, способных стимулировать образование факторов роста нервов, оказывать цитотокси-ческий эффект на опухолевые клетки, проявлять гиполипидемические и иммуномодулирующие свойства. Большинство работ было про-
ведено с плодовыми телами этого объекта. Известно, что различные экстракты и индивидуальные вещества, в том числе гетерогликаны, выделенные из плодовых тел H. erinaceus, способны проявлять противоопухолевую активность. Фракция, осажденная ацетоном из водного экстракта плодовых тел H. erinaceus, демонстрировала противоопухолевое действие в опытах in vivo в отношении саркомы 180. Противоопухолевая активность, выраженная в торможении роста опухоли (ТРО), при перо-ральном введении этой фракции в дозах 250 и 500 мг/кг/сут курсом, проводившимся до и после трансплантации опухоли и составившим 18 сут, была 47.2 и 51.8 % соответственно. Внутрибрюшинное введение этой фракции в дозах 50 и 100 мг/кг/сут позволило получить ТРО 55.8 и 63%, соответственно *. В опытах in vivo на модели привитой саркомы 180 полисахариды, выделенные из водного экстракта плодовых тел, показали ТРО от 40.3 до 73.0 %. Наиболее активными оказались индивидуальные полисахариды ксилан, глюкоксилан и ге-тероксилоглюкан. Связанный с белком глюкоксилан, присутствующий в экстракте плодовых тел оксалатом аммония, продемонстрировал ТРО 67.9%. ТРО связанного с белком галактоксилоглюкана, полученного из щелочного экстракта плодовых тел, составило 75.9%. Определение моносахаридного состава выделенных полисахаридов показало наличие глюкозы, галактозы, монозы и большого количества ксилозы 2. Несмотря на достаточно большой объем публикаций, посвященных изучению плодовых тел, с мицелием и погруженной культурой этого гриба работали очень мало и почти нет данных об индивидуальных полисахаридах погруженной культуры и мицелия. Известно, что полисахаридная фракция, выделенная из культуральной жидкости H. erinaceus, проявляла противоопухолевое действие в отношении метастазирующей опухоли лег-
3
кого в опытах in vivo .
Экспериментальная часть
В работе использовали штамм H. erinaceus из коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН.
Погруженное культивирование осуществляли в колбах 0.5 и 0.75 л на ротационной качалке при 220 об/мин и в лабораторном биореакторе с геометрическим объемом 15 л, снабженном системами перемешивания и подачи
воздуха. Температура культивирования составляла 26—28 оС. Среду стерилизовали при
1.2 атм. 30 мин. Среды содержали минеральные соли и органические источники углерода и азота, такие как глюкоза, сахароза, растительное масло, меласса, соевая мука, амарантовая мука, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт. Длительность процесса культивирования составляла от 1 до 10 сут. В процессе культивирования изучали накопление воздушно-сухой биомассы (весовым методом), значения рН культурального фильтрата (потенциомет-рически). Опыты ставили в двух повторностях. По завершении процесса культивирования мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, промывали дистиллированной водой и сушили до постоянного веса при температуре, не превышающей 45 оС.
Для приготовления водных экстрактов навеску сухого мицелия заливали дистиллированной водой и автоклавировали при 1.2 атм.
2 ч, затем полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр и хранили при — 20 о С.
Определение количественного содержания полисахаридов в водных экстрактах мицелия проводили с использованием фенол-серно-кислотного метода 4.
Полисахаридные фракции (I и II) водного экстракта погруженного мицелия Н. еттасет получали последовательным осаждением полимеров путем добавления в экстракт 96% этанола. Полисахаридная фракция I была получена после добавления к водному экстракту двух равных объемов этанола. Осадок отделили центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин. Для получения полисахаридной фракции II к супернатанту добавили еще два объема этанола и центрифугировали в том же режиме. Суммарную полисахаридную фракцию получали путем добавления 4-х объемов 96% этанола к водному экстракту, с последующим центрифугированием в режиме, описанном выше. После осаждения осадки лиофили-зировали.
Для определения моносахаридного состава полисахариды подвергали полному гидролизу действием 2М трифторуксусной кислоты в присутствии в качестве маркера мио-инозита. Полученные моносахариды переводили в ацетаты полиолов, которые идентифицировали методом ГЖХ на хроматографе НР 5890А 5.
Опыты по исследованию противоопухолевого действия препаратов при пероральном введении проводили на мышах с привитыми подкожно лимфомой ЕЬ-4 и лимфолейкозом Р388. Мышей получали из питомника РАМН
«Крюково». После поступления мышей выдерживали в карантине 21 день. Количество мышей в контрольных и экспериментальных группах составляло 8—10 животных. Опухоли прививали гибридным мышам C57B1/6J х ЭВА/2)Р1 (БЭРД самцам. В опытах с солидной Т-лимфомой ЕЬ-4 в 0-й день мышам подкожно инокулировали 105 опухолевых клеток. Препараты грибов вводили ежедневно, с 7-х по 22-е сутки. Суточная доза водного экстракта погруженного мицелия была 0.3 мл/мышь. В отдельных группах мышам однократно вводили циклофосфамид (ЦФ) внутрибрюшинно в низкой дозе (50 мг/кг) на 7-е сутки опыта. В опытах с лимфолейкозом Р388 в 0-й день мышам подкожно инокулировали 106 опухолевых клеток. Лечение проводили 10 сут — со 2-х по 11-е сутки; и 5 сут — со 2-х по 6-е сут. Суточная доза сублимированной погруженной культуры составляла 50 мг/кг, водного экстракта погруженного мицелия — 0.3 мл/мышь, полисахаридных фракций I и II — 2 мг/кг, суммарной полисахаридной фракции — 50 мг/кг.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования было оценено влияние различных сочетаний источников углерода и азота на накопление биомассы Н. еттасет и содержания в ней водорастворимых полисахаридов, отвечающих за проти-
воопухолевые свойства этого штамма 6. Полученные результаты приведены в табл. 1. Н. еттасет на всех средах в погруженной культуре рос в виде пеллет. По обеспечению выхода воздушно-сухой биомассы все среды можно было разбить на две группы. На средах первой группы накопление биомассы варьировало в пределах 8.1—11.0 г/л. В состав этой группы входили все среды с растительным маслом и мелассой, за исключением среды, содержащей мелассу в сочетании с кукурузным экстрактом. Среды второй группы обеспечивали выход биомассы в пределах 3.6—5.8 г/л. Эту группу менее эффективных сред составили все среды с сахарозой и среда с мелассой и кукурузным экстрактом. Таким образом, выход биомассы Н. еттасет в большей степени зависел от источника углерода, чем от источника азота. Содержание водорастворимых полисахаридов в погруженном мицелии, выращенном на разных средах, варьировало в широких пределах 10—35 % и зависело, прежде всего, от источника азота в среде. Наиболее низкое содержание водорастворимых полисахаридов было отмечено в мицелии, полученном на всех средах с кукурузным экстрактом. Среда с сахарозой и соевой мукой обеспечивала самое высокое содержание водорастворимых полисахаридов в мицелии. По выходу водорастворимых полисахаридов в расчете на литр среды изученные композиции сред были
Таблица 1
Накопление воздушно-сухой биомассы и водорастворимых полисахаридов мицелия на
средах с различными источниками питания
Источник С Источник N Выход воздушно-сухой биомассы, г/л Водорастворимые полисахариды
Содержание в мицелии, % Выход, г/л
Сахароза Соевая мука 5.4 35 1.89
Дрожжевой Экстракт 4.0 17 0.68
Амарантовая мука 3.6 19 0.68
Кукурузный Экстракт 4.5 13 0.58
Растительное масло Соевая мука 9.2 19 1.75
Дрожжевой Экстракт 11.0 22 2.42
Амарантовая мука 8.1 23 1.86
Кукурузный Экстракт 9.3 10 0.93
Меласса Соевая мука 9.9 18 1.78
Дрожжевой Экстракт 9.8 27 2.65
Амарантовая мука 8.9 20 1.78
Кукурузный Экстракт 5.8 12 0.70
разделены на три группы. Наибольший выход водорастворимых полисахаридов, составивший 2.42—2.65 г/л, был отмечен на средах с дрожжевым экстрактом, за исключением среды с сочетанием дрожжевого экстракта и сахарозы. Выход водорастворимых полисахаридов, варьировавший в диапазоне 1.75—1.89 г/ л, обеспечивали все среды с соевой мукой и амарантовой мукой в сочетании с растительным маслом и мелассой. Остальные среды оказались малоэффективными для получения водорастворимых полисахаридов, выход которых составил 0.58—0.93 г/л.
Максимальное накопление биомассы Н. еттасвт на всех изученных средах приходилось на 8—9-е сутки процесса погруженного культивирования. На среде с растительным маслом и дрожжевым экстрактом максимум содержания биомассы был отмечен на 8-е сутки. Активное накопление погруженного мицелия на этой среде заканчивалось к 6-м суткам, за последующие двое суток выход воздушносухой биомассы возрастал только на 1 г/л (рис. 1). Содержание водорастворимых полисахаридов в мицелии постепенно снижалось к 6-м суткам процесса и далее оставалось практически без изменений. Снижение было достаточно резким. Так, за двое суток (с 4 по 6) доля водорастворимых полисахаридов в погруженном мицелии уменьшилась примерно на 10%. Несмотря на снижение содержания водорастворимых полисахаридов в мицелии, их выход в течение процесса погруженного культивирования постоянно возрастал до 8-х суток за счет увеличения накопления биомассы.
1200,0
1000,0
i_ 800,0
s
s'
с
о
| 600,0 о
Е 400,0
200,0
0,0
|п Контроль роста опухоли п экстракт мицелия Н.еппасеиэ!
Рис. 1. Противоопухолевое действие водного экстракта Н. егшаевыэ на модели Т-лимфолейкоза Р388. Масса опухоли на 11-е и 15-е сутки опыта
ТР0=§6%
-: .-Jr-
На следующем этапе работы была проведена оптимизация состава жидкой питательной среды для погруженного культивирования H. erinaceus. Задача этого раздела исследования заключалась в достижении выхода воздушносухой биомассы гриба не менее 20 г/л. В качестве источников углерода и азота были выбраны растительное масло и соевая мука, так как дорогостоящий дрожжевой экстракт по сравнению с соевой мукой в неоптимизированных количествах увеличивал выход биомассы только на 2 г/л. Работу проводили по ранее предложенному алгоритму создания биотехнологических способов погруженного культивирования мицелиальных грибов 6. Поставленная задача была решена благодаря постановке экспериментов с использованием методов математического планирования. Были использованы такие методы, как метод полного факторного эксперимента (ПФЭ) и метод крутого восхождения (КВ). В двухуровневом ПФЭ было изучено влияние четырех факторов (соль магния, дигидрофосфат калия, растительное масло и соевая мука) на накопление биомассы H. erinaceus. Согласно полученным в ПФЭ результатам значимыми факторами для накопления биомассы H. erinaceus были дигидрофосфат калия, растительное масло и соевая мука. Результаты ПФЭ были использованы для постановки опыта по методу КВ, в котором на протяжении семи шагов одновременно меняли концентрации всех значимых факторов в соответствии с величиной и знаком их коэффициентов регрессии. Результатом этой части работы стал способ погруженного культивирования H. erinaceus, обеспечивающий получение 22—23 г/л воздушно-сухой биомассы на 7-е сутки ферментации.
Разработанный способ погруженного культивирования был масштабирован для условий лабораторного биореактора. По основным показателям, включая выход биомассы H. erinaceus и содержание в ней водорастворимых полисахаридов, процессы погруженного культивирования в биореакторе соответствовали таковым в колбах на качалке.
Изучение противоопухолевых свойств препаратов на основе погруженного мицелия H. erinaceus проводили на модели in vivo, на мышах с привитыми подкожно Т-лимофлейко-зом Р388 и Т-лимфомой EL-4.
При пероральном введении препараты погруженной культуры H. erinaceus проявили выраженный противоопухолевый эффект. Водный экстракт, полученный из сухого мицелия, демонстрировал ТРО 65% на 15-е сутки
опыта (рис. 1). Суточная доза водного экстракта в пересчете на сухое вещество составила
8.3 мг/кг. Осажденные этанолом из водного экстракта две полисахаридные фракции I и II в суточной дозе 2 мг/кг тормозили рост опухоли, соответственно, на 28% и 53% на 15-е сутки опыта. Несмотря на невысокие показатели торможения роста опухоли, обе полисахаридные фракции мицелия Н. еттасеш были способны удлинять жизнь лабораторных животных с Т-лимфолейкозом Р388. Действие фракций на продолжительность жизни животных было сходно. Так, на 22-е сутки опыта количество мышей в группах, получавших водный раствор полисахаридных фракций I и II, составило 80 и 90 % соответственно, а в контрольной группе — 50%. Уменьшение показателей торможения роста опухоли при введении лабораторным животным полисахаридных фракций по сравнению с введением водного экстракта может быть следствием того, что не все биологически активные метаболиты осаждаются этанолом.
На модели привитой подкожно саркомы 180 водный экстракт сухого мицелия Н. еттасеш проявил аналогичную противоопухолевую активность, показанную на мышах с Т-лимфолейкозом Р388. ТРО на 14-е сутки опыта составило 65%. В опыте на модели аденокарциномы молочной железы Са 755 водный экстракт мицелия Н. еттасеш вводили 5-ти суточным курсом. На 6-е сутки опыта ТРО составило 92%.
В опыте на лимфоме ЕЬ-4 водный экстракт сухого погруженного мицелия Н. етта-сет проявил достоверную противоопухолевую активность (рис. 2). ТРО составило 86% на 15-е сутки опыта. На этой модели было показано потенцирование противоопухолевого действия широко применяемого в онкологии цитостатика циклофосфамида (ЦФ). Циклофосфа-мид вводили однократно в низкой дозе 50 мг/ кг внутрибрюшинно. ТРО на 18-е сутки опыта составило в группе, получавшей водный экстракт 58.0%, в группе, однократно получившей ЦФ — 92.0%, в группе, получившей комплексное лечение — 99.9%.
Таким образом, было оценено влияние источников питания на накопление в погруженной культуре биомассы Н. еттасеш и содержания в ней водорастворимых полисахаридов. Разработан способ погруженного культивиро-
вания Н. еттасет, обеспечивающий получение 22—23 г/л воздушно-сухой биомассы за 7 сут. Способ погруженного культивирования масштабирован для условий лабораторного ферментера.
2200 2000 2 1800
11 15 18 22 сутки
• Контроль роста опухоли ~iA~Экстракт мицелия + ЦФ * ♦* ЦФ___________•» • Экстракт мицелия_
Рис. 2. Противоопухолевое действие экстракта мицелия H. erinaceus в отношении лимфомы EL-4. Динамика роста опухоли
Было показано, что водный экстракт и водорастворимые фракции погруженного мицелия проявляют противоопухолевое действия в опытах in vivo в отношении солидной Т-лим-фомы EL-4 и Т-лимфолейкоза Р388.
Коллектив авторов выражает глубокую благодарность доктору химических наук, профессору Усову Анатолию Ивановичу за помощь в определении моносахаридного состава полисахаридных фракций.
Литература
1. Mizuno T. // International Journal of Medicinal Mushrooms.— 1999.— V. 1.— P.105.
2. Mizuno T., Wasa T., Ito H., Suzuki C., Ukai N. // Bioscince, Biotechnology and Biochemistry.— 1992.- V.56, №2.- P.347.
3. Wang J. C. Hu S. H., Lee T. M. // Kaoshing J. Med. Sci.- 2001.- V.17, №9.- P.461.
4. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F. // Analytical Chemistry.- 1956.-V. 28, №3.- P.350.
5. Слонекер Дж. Методы исследования углеводов. Под ред. А. Я. Хорлина.- М.: Мир, 1975.- С. 22.
6. Краснопольская Л. М., Белицкий И. В., Автономова А. В., Соболева Н. Ю, Усов А. И., Исакова Е. Б., Либензон А. В., Бухман В. М.// Успехи медицинской микологии: Материалы III Всерос. конгр. по медицинской микологии. Москва, 2005.- Т.5.- С. 192.
Исследование проводится в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.
