CC BY
11
Подходы к оценке противоопухолевой резистентности на фоне развития злокачественной опухоли у мышей и к ее стимуляции
А. А. Кадырова, Н. О. Гудратов
Азербайджанский медицинский университет, Онкологический научный центр, г. Баку
Важнейшим фактором, определяющим устойчивость организма к опухолевому росту, является функциональное состояние неспецифической иммунологически обусловленной резистентности (ИОР) и, в частности, того ее звена, которое обеспечивает противоопухолевую резистентность (ПОР), что в итоге предопределяет вероятность возникновения и развития в нем злокачественных опухолей (ЗО) (6). Угнетение ПОР, происходящее под воздействием целого ряда факторов внешней среды (ионизирующее и ультрафиолетовое излучения, воздействие химических веществ, физических перегрузок и психоэмоционального стресса), является тем фоном, на котором формируется предиспозиция к возникновению онкологических заболеваний (18).
Известно, что, объективно определив состояние ПОР у конкретного индивида (при отсутствии генетически обусловленной предиспози-ции к опухолевому росту), можно с достаточно высокой вероятностью оценить риск развития у него онкологических заболеваний (13). В силу этого рациональное применение методов, позволяющих объективно оценивать состояние эффекторных звеньев ПОР, на современном этапе приобретает важное значение.
Известно также, что, стимулируя ПОР, можно добиться определенного снижения относительного риска возникновения у индивида ЗО (11). Очевидно, что этот подход мог бы стать одним из наиболее перспективных способов снижения частоты возникновения ЗО и, будучи широко внедрен в практику, способствовал бы существенному повышению эффективности первичной профилактики онкологических заболеваний (19).
Однако возможность стимуляции ПОР ограничена, поскольку до сих пор не созданы лекарственные препараты, способные селективно активизировать обеспечивающие ее клеточные и гуморальные факторы. Рекомендуемые к использованию с этой целью адаптогенные (в том числе, витаминные) препараты оказывают
на ПОР лишь умеренное стимулирующее действие (12). Между тем, в ряде ситуаций (например, у лиц, подвергшихся сильному ионизирующему излучению или получивших ранее массивную иммуносупрессивную терапию) возникает необходимость интенсивного стимулирующего воздействия на ПОР. Следует отметить,что в литературе имеются отдельные сообщения об успешном применении с этой целью ин-терферонов, которые в проспективных многолетних исследованиях (в отдельных регионах среди инфицированного вирусами гепатита В и С населения с высоким риском возникновения гепатоцеллюлярного рака) уже проявили выраженную антиканцерогенную активность (5). Однако, их введение сопровождается неизбежным развитием тягостных побочных эффектов, в связи с чем их применение у практически здоровых людей не может быть признано целесообразным. Поэтому целенаправленный поиск лекарственных препаратов, способных активизировать клеточные и гуморальные факторы ПОР, остается весьма актуальным. В равной степени это относится и к оптимизации экспериментальных методов, пригодных для скрининга такой активности среди природных и синтетических соединений.
Изложенное выше в достаточной степени демонстрирует важное значение как методов объективной оценки состояния ПОР, так и средств и подходов к ее стимуляции. Эти соображения побудили нас провести настоящее исследование по оценке возможности мони-торировать состояние ПОР в процессе развития злокачественной опухоли и стимулировать ее с помощью иммунотропных лекарственных препаратов с разным механизмом действия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Исследование проведено на экспериментальной модели опухолевого роста, обусловленного пролиферацией клеток асцитного варианта карциномы Эрлиха (анеупло-идный штамм ELD, полученный в НИИ ЭДиТО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН), введенных в виде суспензии в дозе 10й опухолевых клеток (ОК) внутрибрюшин-но мышам породы SHK с массой тела 20-25 г.
Ha 6-й день после перевивки опухоли мышей вскрывали и в их брюшную полость вводили 0,5 мл среды 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П. Чумакова РАМН), которую затем отсасывали шприцем с затупленной иглой и вновь вводили в брюшную полость. Такой цикл повторяли 3-4 раза. Затем жидкость отсасывали полностью и переливали в пробирку. Ее считали неразведенной суспензией опухолевых клеток (такая суспензия содержала порядка 109 ОК). При необходимости ее концентрировали путем центрифугирования в среде 199, содержащей 10% феталь-ной сыворотки, в которую добавляли глутамин и антибиотик (гентамицин). Далее 0,1 мл концентрированной суспензии ОК переносили в камеру Горяева и определяли число клеток в 1 мл суспензии. Затем готовили такие ее разведения, в 0,2 мл которых содержались по 108, 107, 106, 105, 104 и 103 ОК.
Для количественной оценки состояния ПОР и определения характера ее изменений у животных на фоне развития перевитой им ЗО и под действием различных лекарственных препаратов использовали 2 методических подхода (7).
Первый из них позволял оценить in vitro функциональное состояние иммуноцитов, принимающих участие в обеспечении ПОР (нейтрофилов и естественных киллерных клеток - ЕКК), а также цитокинов, регулирующих их активность. Этот подход был реализован посредством пяти методов: 1) определение фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов с помощью НСТ-теста, выражаемой в форме процента НСТ-пози-тивности нейтрофилов (1); 2) определение цито-токсической активности ЕКК по отношению к ал-логенным клеткам, выражаемой величиной индекса цитотоксической активности (ИЦА) (16); 3) определение удельной активности аденозиндеза-миназы (АДА) в иммуноцитах (4); 4) подсчет в мазках периферической крови ЕКК, идентифицируемых как "большие гранулосодержащие лимфоциты" (БГЛ) (15) и 5) определение в сыворотке крови животных концентраций альфа-интерферона (а-ИФН), гамма-интерферона (г-ИФН) и фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а) с помощью твердофазного иммуноферментного метода (9). Для его постановки использовали коммерческие наборы реагентов фирмы Biosource Int. (США).
Первые три метода использовали для исследования иммуноцитов, находящихся в составе суспензии спленоцитов, которую готовили по известной методике (12). Подсчет процента БГЛ осуществляли в мазках крови, окрашенных по Ро-мановскому-Гимзе. Последний метод использовали для исследования сыворотки крови, полученной при декапитации животных.
Второй подход основан на постановке трансплантационного теста (ТТ), позволяющего дать интегративную оценку состояния ПОР мышей in vitro (14). ТТ воспроизводили по ранее описанной нами методике (3).
В качестве показателя, количественно отражающего эффективность ПОР, использовали рассчитываемую по результатам ТТ величину десятичного логарифма такого количества ОК, введение которых обеспечивало успешную перевивку ЗО и,
соответственно, гибель у половины инокулирован-ных животных. Эту величину, обозначаемую как 1дТЮ5о%, определяли с помощью метода кумулятивных процентов по Риду-Менчу. О характере и выраженности влияния препаратов на ПОР судили по величине индекса "усиления" опухоли (ИУО), определяемого как разница между 1дТЮ50% для мышей опытной группы и 1дТЮ50% для интактных мышей: если ИУО был выше нуля, то влияние считали стимулирующим, при ИУО ниже нуля - угнетающим.
Для стимуляции ПОР использовали: циклоферон (индуктор интерферона), полидан (стимулятор лей-коцитопоэза) и задаксин (тимозин альфа1). В качестве средства, угнетающего ПОР, использовали цик-лофосфамид в виде препарата "циклофосфан", который за 4 суток до опыта (но не в день его постановки) ежедневно внутрибрюшинно вводили мышам в дозе из расчета 200 мг/кг массы (всего 3 инъекции).
Полученные результаты обрабатывали с помощью формул вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. В первой серии опытов мы исследовали характер изменения показателей, отражающих состояние ПОР у мышей, которым были введены ОК.
Вначале на 8 интактных мышах были определены исходные значения процента НСТ-позитив-ности и ИЦА спленоцитов, активности АДА в спленоцитах и концентраций а-ИфН, г-ИФН и ФНО-а.
Затем 24 опытным мышам внутрибрюшинно инокулировали по 106 ОК. Спустя 2, 4 и 6 суток после инокуляции забивали по 8 мышей, суспензию их спленоцитов и сыворотку крови исследовали с помощью указанных выше методов.
У мышей, забитых спустя 2 суток после инокуляции, отмечалось заметное повышение показателя НСТ-позитивности, процента БГЛ в крови, ИЦА спленоцитов и активности АДА в этих клетках, а также уровней а-ИфН, г-ИФН и ФНО-а.
Спустя 4 суток было отмечено снижение всех этих показателей (наиболее выраженным оказалось снижение НСТ-позитивности и ИЦА спленоцитов), кроме уровня ФНОа в сыворотке крови, который продолжал увеличиваться. Спустя 6 суток после инокуляции процент НСТ-позитивных клеток снизился примерно в 3 раза, ИЦА спленоцитов - более, чем в 4 раза, а активность АДА - почти в 6 раз. Уровень а-ИФН оказался почти в 2 раза ниже исходного, а уровень г-ИФН - более, чем в 3 раза. В то же время уровень ФНОа оставался выше исходного более, чем в 8 раз.
Оценивая эти результаты в комплексе, мы пришли к заключению о том, что развитие ЗО сопровождалось прогрессивным угнетением активности как клеточных (ЕКК, нейтрофилы), так и гуморальных факторов (интерфероны), непосредственно ответственных за обеспечение ПОР. Здесь же надо отметить, что аналогичное
Таблица. Величины 1дТ^5о% и СПЖ (в сутках) мышей, которым до инокуляции опухолевыми
клетками вводили иммунотропные препараты
Мыши, которым Число Число СПЖ
до ТТ вводили: мышей групп lgTrÜ5o% сутки
Циклофосфан 60 5 3,63 6,4
Циклоферон 60 5 6,07 8,4
Полидан 60 5 6,60 8,7
Задаксин 72 6 7,09 9,6
Интактные мыши 60 5 5,50 7,7
явление ранее отмечалось нами (по крайней мере, в отношение снижения ИЦА спленоцитов и активности в них АДА) и при росте других штаммов перевивных опухолей (12), что подтверждает способность растущей ЗО, независимо от ее особенностей, угнетать ПОР.
Практически полностью повторив этот же опыт на мышах, которым до инокуляции вводили задаксин, мы убедились, что данный препарат, обладающий очень высокой иммунотропной активностью, способен заметно ослабить угнетающее действие ЗО на клеточные и гуморальные факторы ПОР. Аналогичный эффект задаксина был документирован и в ходе постановки ТТ (3). Здесь же отметим, что в наших предшествующих наблюдениях введение задаксина отчетливо стимулировало и факторы противоинфекцион-ной резистентности (20).
Учитывая, что функциональное состояние ПОР наиболее объективно оценивается только in vivo, возможность стимуляции ПОР иммунотропными препаратами мы исследовали с помощью ТТ.
Всего было воспроизведено 5 серий ТТ. В первой серии с помощью ТТ было оценено функциональное состояние ПОР у интактных мышей, а во второй серии - ее изменение у мышей, которым до инокуляции опухоли вводили циклофос-фан. В остальных сериях ТТ была количественно оценена способность трех иммунотропных препаратов (циклоферона, полидана и задакси-на) стимулировать факторы ПОР.
Первые четыре серии ТТ воспроизводили на 60 мышах, из которых формировали 5 групп по 12 мышей в каждой. Мышам этих групп внутрибрюшинно вводили по 107, 106, 105, 104 и 103 ОК, соответственно. Пятую серию ТТ, в которой исследовали активность задаксина, воспроизводили на 72 мышах, разделенных на 6 групп по 12 мышей в каждой (6-й группе животных вводили по 108 ОК). Использовать дополнительную группу мышей нас побудил тот факт, что в предыдущем наблюдении премедикация животных задаксином не позволила достичь успешной перевивки ЗО более, чем у половины животных и, соответственно, снизила точность определения величины lgTrD50% (3).
Постановку всего опыта осуществляли следующим образом. Мыши 1-й группы до инокуля-
ции ОК оставались интактными. Мышам остальных групп за 4 суток до инокуляции (но не в день постановки ТТ) ежедневно внутрибрюшинно вводили препараты в соответствующих дозах (всего 3 инъекции). Мышам 2-й группы вводили цикло-фосфан в дозе из расчета 200 мг/кг массы тела, мышам 3 группы - полидан в дозе 75 мг/кг, мышам 4-й группы - циклоферон в дозе 3,5 мг/кг и мышам 5-й группы - задаксин в дозе 30 мкг/кг. Через сутки после последней инъекции мышей инокулировали определенным количеством ОК.
Наблюдение за инокулированными мышами продолжали в течение 15 дней. Мониторинг развития опухоли осуществляли по признакам развития у мышей асцита и изменению их общего состояния. Ежедневно в каждой группе регистрировали число погибших от опухолевого процесса мышей. По завершении опыта для каждой группы животных определяли среднюю продолжительность жизни (СПЖ), которая отражала, хотя и косвенно, быстроту развития опухолевого процесса, а значит, и эффективность ПОР у животных.
В таблице представлены величины 1дТЮ50% и СПЖ животных, которым до постановки ТТ вводили соответствующие иммунотропные препараты.
Как следует из цифровых показателей, отражающих состояние ПОР, введение цикло-фосфана привело к снижению величины 1дТЮ50% почти в 100 раз: величина ИУО была отрицательной (-1,87). Об этом же свидетельствовало и сокращение СПЖ по сравнению с интактными животными на 16,9%. Надо отметить, что подобное угнетающее влияния циклофосфана на ПОР мы ранее отмечали во всех предыдущих экспериментах и связывали его с тем, что в использованных дозах этот препарат обладает отчетливой иммуносупрессивной активностью.
Премедикация мышей циклофероном обеспечила стимуляцию ПОР, что проявилось в некотором повышении величины 1дТЮ50% (ИУО = 0,57) и увеличении СПЖ почти на 10%. Это действие цикло-ферона мы объяснили его способностью повышать интенсивность продукции эндогенных интерферонов и, соответственно, стимулировать функциональную активность ЕКК (8).
Предварительное введение полидана также привело к умеренной стимуляции ПОР в виде по-
вышения lgTrDöo% в 10 раз (ИУО = 1,1) и увеличения СПЖ почти на 13%. Вероятно, такое действие полидана на ПОР связано с тем, что препарат обладает двояким действием: стимулятора лей-коцитопоэза и интерфероногена (17). Здесь же надо отметить, что стимулирующее действие полидана на ПОР почти не отличалось от аналогичного действия циклоферона.
И, наконец, введение животным задаксина обеспечило выраженную стимуляцию ПОР in vivo: величина ИУО составила +1,6, а увеличение СПЖ достигло почти 25%, т.е. той пороговой величины, которая в экспериментальной онкологии считается достаточной для признания наличия у вещества антиканцерогенной активности (2, 10).
Таким образом, на основании полученных в данном исследовании результатов можно придти к следующему заключению.
Прежде всего, использованные в нем методы оказались способными выявлять наличие у различных веществ как угнетающего (циклофос-фан), так и стимулирующего (циклоферон, поли-дан и задаксин) влияния на эффективность ПОР. Более того, применение для этой цели ТТ позволило количественно оценить стимулирующее действие различных препаратов на ПОР. Из этого вытекает вывод, что ТТ вполне пригоден не только для первичного скрининга веществ и препаратов, потенциально обладающих способностью оказывать стимулирующее действие на ПОР, но и для предварительной количественной оценки выраженности этого действия.
Наличие способности стимулировать ПОР у трех препаратов, отличающихся механизмами действия, косвенно свидетельствует о целесообразности поиска веществ с такой же активностью среди других классов лекарственных препаратов. Вероятно, что в процессе такого поиска можно будет выявить средства, которые окажутся приемлемыми для широкого использования с целью первичной профилактики онкологических заболеваний, по крайней мере, среди контингента с высоким риском их возникновения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вагнер В.К., Насонкин О.С., Борискина Н.Д. Количественная оценка теста восстановления нитросинего тетразолия. - Лабораторное дело, 1989, N. 12, c.31-33; 2. Гудратов Н.О., Мамедов М.К. Введение в экспериментальную онкологию. Баку: Элм, 1995; 3. Гудратов Н.О., Ахмедова И.Н., Кадырова А.А.,Гамидова H.A. Возможность использования несингенной системы для определения естественной противоопухолевой резистентности in vivo. - Азерб.Ж.онкологии, 2004, N.1, c.73-76; 4. Гудратов Н.О., М.К.Мамедов М.К., Мамедбеков Э.Н., Ади-гезалова Д.А. Диагностика иммунологической недостаточности на ос-
нове определения активности в иммуноцигах ферментов обмена пуриновых нуклеотидов у больных онкологическими заболеваниями и туберкулезом. Методические рекомендации. Баку, 1995, 18 с.; 5. Ершов Ф.И., Кадырова А.А. Интерфероны как стимуляторы иммуно-логически обусловленной резистентности. - Биомедицина, 2004, N.1, с.17-22; 6. Кадырова А.А. Иммунологически обусловленная естественная резистентность и подходы к ее оценке. - Боимедицина, 2003, N.4, с.3-10; 7. Кадырова А.А. Современные методы оценки состояния естественной резистентности в медицинских наблюдениях. - Здоровье, 2003, N.10, с.46-49; 8. Кадырова А.А. Интерфероногены и их использование для стимуляции иммунологически обусловленной резистентности. - Здоровье, 2004, N.6, с.49-51; 9. Кадырова А.А., Ершов Ф.И., Мамедов М.К. Методы количественного определения интерферонов и их значение в современной медицине. - В кн.: Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии. Баку, 2002, с.179-181; 10. Кребс Р. Биология и иммунофармакрология тимозина-альфа1. - Биомедицина, 2003, N.2, с.9-13; 11. Мамедов М.К. О предиспозиции к опухолям.-Азерб.Ж.онкологии, 2001, N.2, с.99-108; 12. Мамедов М.К., Гудратов Н.О. Экспериментальная патология печени и противоопухолевая резистентность. М.: Кристалл, 2003; 13. Мамедов М.К., Дадашева А.Э. Современные представления о противоопухолевой защите организма -Азерб.Ж.онкологии, 2001, N.2, с.9-15; 14. Мамедов М.К., Гудратов Н.О., Кадырова А.А. Трансплантационный тест как метод количественной оценки естественной противоопухолевой резистентности.-Азерб.Ж.онкологии, 2004, N.1, с.68-73; 15. Мамедов М.К., Кадырова А.А., Ахундова Д.М. Модификация метода подсчета естественных киллерных клеток в периферической крови. - Здоровье, 2004, N.5, с.59-61; 16. Мамедов М.К., Гудратов Н.О., Кадырова А.А. и др. Биохимический метод количественной оценки цитотоксической активности эффекторных иммуноцитов естественной резистентности в клинических и экспериментальных исследованиях. - Азерб. Ж. метаболизма, 2004, N.1, с.51-54; 17. Оруджли Р.Н., Мамедов М.К., Кадырова А.А. и др. Изменение уровней альфа- и гамма-интерферонов под действием стимуляторов лейкопоеза у здоровых лиц и больных лим-фомами. - В кн.: Мат-лы 3-го съезда онкологов и радиологов СНГ. Минск, 2004, ч.2, с.296-297; 18. Aliyev J., Mamedov M., Mardanly F. Modern views to risk factors of occurrence of oncological diseases. - In: 6-th Int. Congr.: Energy, ecology, economy. Baku, 2002, р.370-372; 19. Cancer in the next millenium. Eds. K.Sikora. Proc. WHO Symp. London, 1998; 20. Kadyrova A.A., Gamidova N.A. Immu^ti^^ drugs as a stimulators of the antiinfectious resistence at mice. - Azerb. J. oncology, 2004, N.1, р.161.
SUMMARY
Approaches to estimation of antitumor resistance at mice with malignant tumor growth and to its stimulation AKadyrova, N.Gudratov
The article contains experimantal data demonstrated the possibility of quantitation of host antitumor resistence condition with the help of methods based two approaches: in vitro and in vivo. The authors presented results confirmed that trans-plantated tumor development was accompanied with deppression of the host antitumor resistence condition and method applied could be able to detect this fact. Besides it was demonstrated that depressed host antitumor resistence can be stimulated with immunotropic drugs with different mechanism of action to immune system.
Поступила 20.07.2004
