CC BY
0
© Коллектив авторов, 2024
Булыгин А.С.1, Филиппова Ю.Г.1, Алсаллум А.1, Алрхмун С.1, Киреев Ф.Д.1, Шевченко ЮА.1, Фишер М.С.1, Перик-Заводский Р.Ю.1, Перик-Заводская О.Ю.1, Назаров К.В.1, Шику Х.1 2, Силков А.Н.1, Сенников С.В.1
Оценка метаболизма TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток в ЭБ-культуре
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630099, г. Новосибирск, Российская Федерация
2 Университет Миэ, 514-8507, г. Цу, Япония
Резюме
Введение. Адоптивная клеточная терапия направлена на введение иммунных эффекторов с активированной естественной или искусственно созданной противоопухолевой активностью для подавления роста опухоли. Основными направлениями для адоптивного переноса клеток является использование генетически модифицированных T- клеток (TCR- и CAR-T-клетки). Изучение метаболизма иммунных клеток в моделях опухолевого роста in vitro позволяет определить сохранность и эффективность Т-клеток в условиях опухолевого микроокружения.
Цель исследования - анализ метаболической активности различных типов генно-инженерных T-клеток в совместной культуре с опухолевыми клетками в форме 3Б-сфероидов.
Материал и методы. Генетически-модифицированные T-клетки получали из клеток периферической крови здоровых доноров после трансдукции гамма-ретровирусными векторами, кодирующими рецепторы для распознавания опухолевых антигенов. Оценку интенсивности процессов гликолиза и окислительного фосфорилирования в NY-ESO-1 TCR-T, MAGE-A4 TCR-подобных CAR-T-клетках и вБ2-специфичных CAR-T-клетках после культивирования с 3Б-сфероидами оценивали с помощью анализатора Seahorse XFp. Метаболическую активность трансдуцированных клеток при сокультивирова-нии с 3Б-сфероидами опухолевой линии SK-Mel-37 оценивали по митохондриальному потенциалу и продукции активных форм кислорода с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием IN Cell Analyzer 6000 с модулем жизнеобеспечения клеточных культур. Формирование структуры 3Б-сфероидов опухолевой линии SK-Mel-37 оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии.
Результаты. Оценка параметров гликолиза и окислительного фосфорилирования показала, что базальный уровень OCR у NY-ESO-1 TCR и GD2-CAR-Т-клеток при контакте с опухолями увеличивается в несколько раз, при этом MAGE-A4 TCR-подобные CAR-Т-клетки показали слабую метаболическую активность при контакте c опухолевым сфероидом по сравнению с контрольными клетками. При суточном прижизненном наблюдении совместной культуры NY-ESO-1 TCR-T, MAGE-A4 TCR-подобных CAR-T-и GD2-специфичных CAR-T-клеток со сфероидами показано, что при наличии активных форм кислорода они проявляют достаточно высокую митохондриальную активность и способны подавлять опухолевые клетки.
Заключение. Полученные MAGE-A4 TCR-подобные CAR-Т-клетки, GD2-специфичные CAR-T-клетки и NY-ESO-1 TCR-T-клетки при сокультивировании со сфероидами опухолевой линии меланомы SK-Mel-37 используют преимущественно окислительное фосфорилирование и при этом разрушают 3D-структуры опухолевых клеток.
Ключевые слова: TCR-подобные/CAR/TCR-T-клетки; SK-Mel-37; 3D-сфероид; Seahorse-анализ; прижизненная микросъемка
Статья получена 17.10.2024. Принята в печать 14.11.2024.
Для цитирования: Булыгин А.С., Филиппова Ю.Г., Алсаллум А., Алрахмун С., Киреев Ф.Д., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Перик-Заводский Р.Ю., Перик-Заводская О.Ю., Назаров К.В., Шику Х., Силков А.Н., Сенников С.В. Оценка метаболизма TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток в 3D-культуре. Иммунология. 2024; 45 (6): 691-700. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-691-700 Финансирование. Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 21-65-00004. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Сенников Сергей Витальевич -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Булыгин А. С., Филиппова Ю.Г., Шевченко Ю.А., Шику Х., Сенников С.В.; сбор и обработка материала - Фишер М.С., Шевченко Ю.А., Филиппова Ю.Г., Киреев Ф.Д., Назаров К.В., Булыгин А.С.; статистическая обработка - Булыгин А.С., Алрхмун С., Перик-Заводский Р.Ю., Перик-Заводская О.Ю.; написание текста - Булыгин А.С., Филиппова Ю.Г., Киреев Ф.Д., Алсаллум А.; редактирование - Сенников С.В., Силков А.Н.
Bulygin A.S.1, Philippova J.G.1, Alsalloum A.1, Alrhmoun S.1, Kireev F.D.1, Shevchenko YU.A.1, Fisher M.S.1, Perik-Zavodskii R.YU.1, Perik-Zavodskaia O.Yu.1, Nazarov K.V.1, Shiku H.1 2, Silkov A.N.1, Sennikov S.V.1
Evaluation of TCR-like CAR/CAR/TCR T-cells metabolism in 3D culture
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 630099, Novosibirsk, Russian Federation
2 Mie University, 514-8507, Tsu City, Japan
Abstract
Introduction. Adoptive cell therapy is aimed at introducing immune effectors with activated natural or artificially created antitumor activity to suppress tumor growth. The main directions for adoptive cell transfer are the use of genetically modified T cells (TCR and CAR T cells). Studying the metabolism of immune cells in in vitro tumor growth models allows us to determine the safety and effectiveness of T cells in the tumor microenvironment.
Aim of the study - to analysis of metabolic activity of different types of genetically engineered T cells in co-culture with tumor cells in the form of 3D spheroids.
Material and methods. Genetically modified T cells were obtained from peripheral blood cells of healthy donors after transduction with gamma-retroviral vectors encoding receptors for recognition of tumor antigens. The intensity of glycolysis and oxidative phosphorylation processes in NY-ESO-1 TCR-T, MAGE-A4 TCR-like CAR-T and GD2-specific CAR-T cells after culturing with 3D spheroids was assessed using the Seahorse XFp extracellular flux analyzer. Metabolic activity of transduced cells during co-cultivation with 3D spheroids of the SK-Mel-37 tumor line was assessed as mitochondrial potential and production of reactive oxygen species using fluorescence microscopy using the IN Cell Analyzer 6000 with a cell culture life support module. The formation of the 3D spheroid structure of the SK-Mel-37 tumor line was assessed using fluorescence microscopy.
Results. Evaluation of glycolysis and oxidative phosphorylation parameters showed that the basal level of OCR in NY-ESO-1 TCR and GD2-CAR T cells upon contact with tumors increases several times, while MAGE-A4 TCR-like CAR T cells showed weak metabolic activity upon contact with tumor spheroids compared to the control group. During daily intravital observation of the joint culture of NY-ESO-1 TCR-T, MAGE-A4 TCR-like CAR-T and GD2-specific CAR-T cells with spheroids, it was shown that in the presence of active oxygen species, they exhibit sufficiently high mitochondrial activity and are capable of suppressing tumor cells.
Conclusion. The resulting MAGE-A4 TCR-like CAR, GD2-specific CAR-T, and NY-ESO-1-TCR-T cells, when co-cultured with SK-Mel-37 melanoma tumor line spheroids, predominantly utilize oxidative phosphorylation and, in doing so, disrupt the 3D structures of tumor cells.
Keywords: TCR-like/CAR/TCR T-cells; SK-Mel-37; 3D spheroid; Seahorse analysis; Real-time microcopy
Received 17.10.2024. Accepted 14.11.2024. For citation: Bulygin A.S., Philippova J.G., Alsalloum A., Alrhmoun S., Kireev F.D., Shevchenko Yu.A., Fisher M.S., Perik-Zavodskii R.Yu., Perik-Zavodskaia O.Yu., Nazarov K.V., Shiku H., Silkov A.N., Sennikov S.V. Evaluation of TCR-like CAR/CAR/TCR T-cells metabolism in 3D-culture. Immunologiya. 2024; 45 (6): 691-700. DOI: https://doi. org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-691-700 (in Russian)
Funding. The study was supported by the grant of Russian Science Foundation No. 21-65-00004. Conflicts of interests. Authors declare no conflict of interests.
Authors' contributions. The concept and design of the study - Bulygin A.S., Philippova J.G., Shevchenko Yu.A., Shiku H., Sennikov S.V.; collection and processing of material - Fisher M.S., Shevchenko Yu.A., Philippova J.G., Kireev F.D., Nazarov K.V., Bulygin A.S.; statistical processing - Bulygin A.S., Alrhmoun S., Perik-Zavodskii R.Yu., Perik-Zavodskaia O.Yu.; writing the text - Bulygin A.S., Philippova J.G., Kireev F.D., Alsalloum A.; editing -Sennikov S.V., Silkov A.N.
For correspondence
Sergey V. Sennikov -MD, PhD, Professor, Head of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Булыгин А.С., Филиппова Ю.Г., Алсаллум А., Алрахмун С., Киреев Ф.Д., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Перик-Заводский Р.Ю., Перик-Заводская О.Ю., Назаров К.В., Шику Х., Силков А.Н., Сенников С.В.
Оценка метаболизма ТСИ-подобных СЛК/СЛК/ТСК-Т-клеток в 3Б-культуре
Введение
Адоптивная иммунотерапия (ЛИ) является одним из методов лечения путем стимулирования иммунной системы к уничтожению солидных опухолей и восстановлению иммунной функции после химиотерапии [1, 2]. В настоящее время в AИ применяются различные подходы со своим уникальным механизмом действия: использование генетической модификации Т-кле-точных рецепторов (TCR) и химерных антигенных рецепторов (CAR). Такие модифицированные T- клетки высокоспецифичны к опухолевому антигену даже при низкой экспрессии целевого антигена, но при этом обладают значительной токсичностью против клеток, несущих целевой антиген в нормальных тканях. Решение данной проблемы остается одной из главных задач для повышения эффективности в терапии [3].
На сегодняшний день известно, что опухолевые клетки оказывают негативное влияние не только на эффекторную функцию Т-клеток, но и на метаболизм в целом [4]. Так, опухолевые клетки имеют особый тип метаболизма, описанный как эффект Варбурга [5], который приводит к выделению большого количества молочной кислоты и соответствующему закислению среды, что оказывает многочисленные ингибирующие эффекты на активность и функцию инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, особенно цитотоксических Т-лимфоцитов. TCR-подобные/CAR-T-клетки имеют схожие принципы функционирования метаболизма с цитотоксическими T-лимфоцитами, которые выражаются во взаимосвязи между активацией Т-клеточного рецептора и перепрограммированием метаболизма [6]. При этом известно, что Т-клеточный рецептор и костимулирующие факторы CD28 и 4-1BB при запуске Т-клеточных путей активации иммунной функции Т-клеток запускают и транскрипционные факторы (mTORC1, HIF-1a и т.д.), которые регулируют направленность метаболизма клеток [7]. Это в свою очередь способствует обеспечению энергией и накоплению веществ, которые необходимы для продукции цитокинов и поддержания иммунной функции клеток по отношению к опухолям [7]. Многие исследователи стремятся найти альтернативные подходы по регуляции метаболизма Т-клеток для их усиления в борьбе с опухолевыми клетками [8].
Цель нашего исследования - изучение метаболической динамики при реализации цитотоксической активности против 3D-сфероидов опухолевых клеток для генетически-модифицированных T-клеток различных типов, полученных при трансдукции Т-лимфоци-тов тремя уникальными ретровирусными векторами, кодирующими NY-ESO-1-специфичный TCR, MAGE-A4-специфичный TCR-подобный CAR и GD2-специфичный CAR.
Материал и методы
Получение генетически модифицированных Т-лимфоцитов. Для получения TCR Т-клеток (специфичных к NY-ESO-1), TCR-подобных CAR-Т-клеток (специфичных к MAGE-A4) и CAR-Т-клеток GD2 (спе-
цифичных к GD2), были использованы гамма-ретрови-русные векторы [9-11], полученные в Высшей школе медицины Университета Миэ (Япония) под руководством профессора Х. Шику.
Участники исследования. Получение периферической крови от здоровых взрослых доноров одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России (протокол № 139 от 30.05.2022). В исследование были включены 6 доноров обоих полов, средний возраст - 27,33 ± 6,34 года.
Получение мононуклеарных клеток. Мононуклеар-ные клетки (МНК ПК) выделяли из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-урографина (р = 1,077 г/л, «ПанЭко», Россия). Дальнейшие манипуляции по получению TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток проводились согласно ранее описанными и опубликованными нами методами [9]. Относительное количество живых TCR-подобных/CAR/TCR-Т-клеток определяли перед сокультивированием со сфероидами с помощью окрашивания трипановым синим, в среднем доля живых клеток составляла 95 %.
Получение сфероидов линии SK-Mel-37. Для изучения иммунометаболических изменений в TCR-подоб-ных/CAR/TCR-Т-клетках использовали опухолевую линию меланомы SK-Mel-37, поскольку примерно 80 % этих клеток имеют поверхностную экспрессию антигенов GD2 и внутриклеточную экспрессию антигенов NY-ESO-1 и MAGE-A4, что подтверждено собственными данными и источниками литературы [12-14]. Сфероиды опухолевых клеток SK-Mel-37 получали с помощью метода «висячей капли» [15]. По достижению сфероидами оптимального размера (1 мм) оценивали формирование зон пролиферации и покоя с помощью окраски суправитальными красителями кальцеином (Biolegend, США) для определения живых клеток (зоны пролиферации) и родамином (ThermoFisher, США) для определения мертвых клеток (зона покоя).
Оценка интенсивности процессов гликолиза и окислительного фосфорилирования. Анализ интенсивности процессов гликолиза и окислительного фос-форилирования оценивали с помощью анализатора внеклеточного потока Seahorse XF. Технология Seahorse XF позволяет измерять поток кислорода, скорость потребления кислорода (OCR) и поток протонов, скорость внеклеточного закисления (ECAR) в среде, непосредственно окружающей клетки, в специальном Seahorse-планшете. Параметр OCR отображает процесс окислительного фос-форилирования, тогда как ECAR показывает значения, характерные для гликолиза. Для анализа метаболического профиля CAR-T-клеток на приборе Seahorse XFp использовали Seahorse XF Real-time ATP Rate Assay Kit (Agilent Technologies, США). Оценку метаболизма полученных TCR-подобных CAR/CAR/TCR-Т-клеток проводили в смешанной культуре, где в каждой лунке было 2 сфероида и 400 тыс. трансдуцированных клеток. Культивирование длилось в течение 24 ч. После сокультивиро-вания выделяли CD3+-T-клетки с помощью позитивной
магнитной сортировки (MojoSort™, Biolegend США). Для анализа брали 2,5 • 1G5 Т-клеток, которые адгезиро-вали с помощью поли-Ь-лизина («Панэко», Россия) в концентрации 22,4 нг/мл, на Cell Culture Miniplates (Seahorse XFp FluxPak) в течение 1б-18 ч в CO2-инкyбаторе.
После адгезирования клеток оценивали конфлюент-ность клеток в анализируемых лунках. Конфлюентность составляла около 8G-9G%. Одновременно в калибровочный планшет и картридж с сенсорами вносили по 2GG мкл дистиллированной воды для гидратации в течение ночи при 37 °C. На следующий день в картриджах с сенсорами воду заменяли на XF Calibrant и инкубировали 1 ч при 37 °C в инкубаторе без CO2. Адгези-рованные клетки 1 раз отмывали в XF-среде (DMEM, содержащая 25 мМ глюкозы, 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия) и инкубировали 1 ч при 37 °C в инкубаторе без CO2. После инкубации в планшет с адгезиро-ванными клетками добавляли 18G мкл XF-среды. OCR и ECAR анализировали в XF-среде в базовых условиях и в ответ на 1 мкЫ олигомицина (порт A) и G,5 мкЫ ротенона с антимицином А (порт B).
В планшет для калибровки прибора добавляли XF Calibrant, картридж с сенсорами устанавливали в подставку Seahorse XFp Analyzer и выполняли калибровку сигналов, генерируемых всеми 8 лунками. Затем планшет с целевыми клетками устанавливали в подставку вместо калибровочного планшета и запускали программу. Программа включает в себя этап регулировки сенсоров и pH, за которым следуют измерения базовых значений ECAR и OCR, после чего прибор добавляет в лунку поэтапно олигомицин и ротенон/антимицин А. Каждый из этих трех этапов включает З цикла по З мин смешивания, 2 мин ожидания и З мин измерения.
Анализ данных проводили с помощью приложения Wave версия 2.б.3 (Agilent Technologies, США) после чего полученные данные транспортировали из формата .asyr в формат .rzfx для дальнейшей визуализации и статистической обработки. Чтобы понять, какой тип метаболических путей используют TCR-подобные CAR/ CAR/TCR-Т-клетки, мы построили диаграммы ATP Rate Index. ATP Rate Index высчитывается путем сравнения базальной скорости продукции митохондриального АТФ (OCR) на гликолитический АТФ (ECAR) (рис. 1В). В качестве контроля использовали нетрансдуцирован-ные клетки после культивирования со сфероидами, а также сравнение проводили с трансдуцированными TCR-подобными CAR/CAR/TCR-Т-клетками, которые не сокультивировали со сфероидами.
Определение мембранного потенциала (Ay m) и активных форм кислорода (ROS) в TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клетках. За день до анализа полученные TCR-подобные CAR/CAR/TCR-Т-клетки культивировали в неполной среде RPMI-164G с добавлением суправи-тальных красителей тетраметилродамина (ThermoFisher, США) для оценки Aym и CEllROX (ThermoFisher, США) для оценки продукции ROS и 1GG мкг верапамила (Sigma-Aldrich, США) для ингибирования Na/Ca-каналов во избежание экспорта красителей из цитоплазмы.
В день анализа окрашенные TCR-подобные CAR/ CAR/TCR-T-клетки объединяли в 96-луночном планшете (Eppendorf, USA) с 3Б-культурой опухолевых клеток линии SK-Mel-37 в соотношении 2 • 105 Т-клеток на
1 сфероид. В качестве контроля использовали нетранс-дуцированные клетки после культивирования со сфероидами (контроль на рис. 2). Анализ проводили с помощью флуоресцентной микроскопии на приборе IN Cell Analyzer 6000 с модулем жизнеобеспечения клеточных культур (GE Healthcare, США). Микроскопические изображения в каналах светлого поля, dsRed (TMRM) и Cy5 (CEllRox) делали при 20-кратном разрешении каждые
2 ч до 24 ч после начала культивирования клеток. Для каждой лунки было проанализировано не менее 9 полей зрения. Подсчет детектированных клеток в каждой временной точке проводили с помощью программы In Cell Developer Toolbox 1.9.3 (GE Healthcare, США).
Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 10.1 (GraphPad Software, США). Полученные данные проверяли на нормальность тестами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Далее данные анализировали подходящими статистическими методами. Использованные статистические методы указаны в подписях к рисункам.
Результаты
Сфероиды оказывают существенное влияние на метаболический профиль TCR-подобных CAR/ CAR/TCR-T-клеток
Для понимания метаболического профиля TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток после сокультиви-рования со сфероидами и определения, насколько функционально снижается продукция митохондриального АТФ и повышается продукция гликолитического АТФ, был проведен анализ скорости продукции АТФ с помощью Seahorse XFp.
Как видно на рис. 1А, у TCR-подобных CAR/CAR/ TCR-T-клеток при сокультивировании со сфероидами базальный уровень OCR увеличен в несколько раз по сравнению с контролем (NY-ESO-1 - 85 пмоль/мин; MAGE-A4 - 52 пмоль/мин; GD2 - 205 пмоль/мин; контроль - 37 пмоль/мин). В это же время анализ ECAR показал умеренное увеличение скорости продукции гликолитического АТФ у TCR-подобных CAR/CAR/ TCR-T-клеток после добавления ингибиторов олигомицина и ротенона/антимицина А (рис. 1Б).
При определении метаболического профиля TCR-подобных CAR/CAR/TCR-Т-клеток было рассчитано соотношении митохондриального и гликолитического АТФ. Результаты показали, что во всех группах мито-хондриальный АТФ превалирует над гликолитичес-ким (рис. 1В). При сокультивировании со сфероидами у NY-ESO-1-Т- и GD2-T-клеток общая продукция АТФ значительно больше по сравнению с аналогичными клетками, которые не сокультивировались со сфероидами, и контролем (рис. 1В).
Булыгин А.С., Филиппова Ю.Г., Алсаллум А., Алрахмун С., Киреев Ф.Д., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Перик-Заводский Р.Ю., Перик-Заводская О.Ю., Назаров К.В., Шику Х., Силков А.Н., Сенников С.В.
Оценка метаболизма ТСИ-подобных СЛН/СЛИ/ТСК-Т-клеток в ЭБ-культуре
э
250 -,
200-
и х
S
150 -I g 150 1
s
^ 100 -Pi
О
0 50 -I
Олигомицин
Рот/АА
20 40
Время, мин
60
Олигомицин
Рот/АА
NY-ESO-1-специфические Т-клетки МЛОБ-А4-специфические Т-клетки
20 40
Время, мин
60
ОБ2-специфические Т-клетки Контроль
^^^ Контроль
ОБ2-специфические Т-клетки+3Б ОБ2-специфические Т-клетки МЛОЕ-А4-специфические Т-клетки+3Б МЛОЕ-А4-специфические Т-клетки NY-ESO-1-специфические Т-клетки+3Б NY-ESO-1-специфические Т-клетки
Мито-АТФ Глико-АТФ
0
100
200
300
Скорость продукции АТФ, пмоль/мин/2,5*105 клеток Рис. 1. Определение продукции АТФ в TCR-подобных NY-ESO-1-специфичных Т-клетках, TCR-подобных CAR-T-клетках, МАОЕ-А4-специфичных Т-клетках и ОБ2-специфичных CAR-T-клетках после совместного культивирования со сфероидами линии SK-Mel-37 (24 ч) (и=4)
А - кинетический профиль OCR TCR-подобных CAR/CAR/TCR-Т-клеток при сокультивировании со сфероидами; Б - кинетический профиль ECAR TCR-подобных CAR/CAR/TCR-Т-клеток при сокультивировании со сфероидами; В - анализ метаболического профиля TCR-подобных CAR/CAR/TCR-Т-клеток при сокультивировании со сфероидами, без сфероидов и в контрольных клетках. Пунктирные линии обозначают добавления ингибиторов олигомицина (1,5 мкМ) и ротенона/антимицина А (Рот/АА) (0,5 мкМ). Данные выражены как среднее значение ± SEM. Первичные данные были статистически обработаны с использованием программного обеспечения Seahorse Wave (версия 2.6.3), а затем представлены в виде графика с использованием GraphPad Prism версии 10.0.1. Чертой обозначается достоверность различий между определяемыми группами. & - достоверность различий между контролем и TCR-подобными CAR/CAR/TCR-Т-клетками в 30-культурах. При анализе данных применялся парный двусторонний t-критерий Стьюдента; * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001; **** - p < 0,0001.
0
У MAGE-A4-Т-клеток при сокультивировании со сфероидами наблюдается значимо низкая скорость потока АТФ по сравнению с аналогичными клетками, которые не сокультивировались со сфероидами, но выше по сравнению с контролем (рис. 1В). Таким образом, можно сказать, что при сокультивировании с 3D-сфероидами SK-Mel-37 у TCR-подобных CAR/ CAR/TCR-Т-клеток не меняется метаболический профиль, а базальные уровни OCR в некоторых случаях даже увеличиваются.
TCR-подобные CAR/CAR/TCR-T-клетки обладают высоким уровнем метаболизма при взаимодействии со сфероидами SK-Mel-37
Результаты показали, что мембранный потенциал митохондрий (Aym) NY-ESO-1-специфичных TCR-Т-клеток во время совместного культивирования с 3D-сфероидом находился на максимальном уровне
от 6 до 12 ч наблюдения (рис. 2А), а уровень активных форм кислорода (ROS) в NY-ESO-1-специфичных Т-клетках находился на максимальном уровне от 6 до 18 ч наблюдения (рис. 2Б). Анализ Душ МАвЕ-А4-спе-цифичных TCR-подобных CAR-T-клеток показал, что наблюдалось значительное увеличение мембранного потенциала митохондрий со 2-го по 4-й час культивирования и дальше он умеренно снижался на всех точках наблюдения (рис. 2А). Анализ уровней ROS продемонстрировал значительное увеличение данного параметра от 4 до 12 ч культивирования в МАвЕ-А4-специфич-ных TCR-подобных CAR-T-клетках, но с резким снижением уровня ROS после 14 ч наблюдения (рис. 2Б). В вБ2-специфичных CAR-T-клетках во время совместного культивирования со сфероидами Душ находится на высоком уровне в течение всего времени наблюдения (рис. 2А). Анализ уровня ROS в вБ2-специфичных
Э
А¥ш
0,25 i
8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, ч
8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, ч
GD2
Контроль
■Щ- NY-ESO-1 MAGE-A4
Рис. 2. Определение мембранного потенциала митохондрий и активных форм кислорода в совместных культурах TCR-подобных NY-ESO-1-специфичных TCR-клеток, МАОЕ-А4-специфичных TCR-подобных CAR-T-клеток и ОБ2-специфичных CAR-T-кле-ток с ЗБ-культурой опухолевых клеток SK-Mel-37 в течение 24 ч наблюдения (n = 5). В качестве контроля были использованы нетрансдуцированные Т-клетки (RV-)
Л - достоверность различий между совместным со сфероидами культивированием NY-ESO-1-специфичных Т-клеток и нетранс-дуцированных Т-клеток; # - достоверность различий между совместным со сфероидами культивированием МАОЕ-А4-спе-цифичных Т-клеток и нетрансдуцированных Т-клеток; * - достоверность различий между совместным со сфероидами культивированием 002-специфичных Т-клеток и нетрансдуцированных Т-клеток. Данные представлены как среднее значение ± SEM. В анализе применяли стандартный двуфакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Тьюки (p < 0,05; 0,01; 0,001).
CAR-Т-клетках показал, что от 4 по 20 ч культивирования вБ2-специфичные Т-клетки демонстрировали умеренное повышение уровня ROS, сравнимое с контрольными клетками (рис. 2Б). В целом эти данные показывают, что в присутствии активных форм кислорода все трансдуцированные Т-клетки проявляют достаточно высокую митохондриальную активность, способствующую уничтожению опухолевых клеток и их собственному выживанию в условиях опухолевого микроокружения.
Обсуждение
Злокачественная опухоль в процессе роста формирует агрессивное микроокружение, в котором инфильтрирующие лимфоциты конкурируют с опухолевыми клетками за доступ к глюкозе и кислороду. В условиях гипоксии и низкого pH происходит ослабление активации иммунных клеток и поляризация клеточных реакций в сторону иммунной анергии [16]. Поэтому исследование с использованием 3Б-культуры поможет понять особенности метаболизма Т-клеток при контакте с опухолями.
Исследование метаболического профиля клеток с использованием технологии Seahorse показало, что при совместном культивировании с SK-MEL-37 NY-ESO-1-специфические, МАвЕ-А4-специфические и GD2-специфические Т-клетки используют потенциал окислительного фосфорилирования. При этом потенциал OCR в NY-ESO-1-специфических и GD2-специфических Т-клетках был заметно выше по сравнению с MAGE-А4-специфическими Т-клетками (рис. 1А).
Результаты вызывают интерес, поскольку в работе показано, что фактор опухолевого микроокружения не мешает TCR-подобным CAR/CAR/TCR-T-клеткам
использовать потенциал окислительного фосфорили-рования, хотя известно, что опухолевые клетки выделяют большое количество молочной кислоты, чем привлекают регуляторные Т-клетки, и они начинают действовать как единое целое, подавляя эффекторную функцию Т-лимфоцитов. Наивные Т-клетки при диффе-ренцировке в эффекторные Т-лимфоциты перепрограммируют свой метаболизм в сторону гликолиза, чтобы иметь возможность поддерживать повышенные потребности в энергии, биосинтез различных белков и выживаемость клеток в опухолевом микроокружении [17]. В связи с этим столь сильный метаболический профиль можно объяснить их высокой специфичностью к антигенам меланомы SK-Mel-37 и последующей активацией, что позволяет им окислять альтернативные источники среды через дыхательные цепи и тем самым адаптироваться к метаболизму опухолей без потери активности [18]. В свою очередь, МАвБ-А4-специфичные Т-клетки демонстрируют довольно низкий метаболический потенциал, оставаясь при этом живыми в культуре.
Исследования функции митохондрий в TCR-подоб-ных/САК/ТСЯ-Т-клетках продемонстрировали высокую разность мембранных потенциалов митохондрий при относительно высоком уровне ROS. Эти данные позволяют предположить, что ROS действуют как активатор иммунной функции эффекторных Т-клеток благодаря NOXs (НАДФН-оксидазы), которые отвечают за дифференцировку Т-клеток во время окислительного взрыва и формирование эффекторного фенотипа Т-кле-ток с переключением на аэробный гликолиз как основной путь метаболизма через взаимодействие с белковым комплексом mTORCl. NOX вызывают быструю генерацию ROS, которая затем активирует c-Jun N-терминаль-ную киназу (JNK) и NF-kB-опосредованный сигнал,
Булыгин А.С., Филиппова Ю.Г., Алсаллум А., Алрахмун С., Киреев Ф.Д., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Перик-Заводский Р.Ю., Перик-Заводская О.Ю., Назаров К.В., Шику Х., Силков А.Н., Сенников С.В.
Оценка метаболизма ТСИ-подобных СЛК/СЛК/ТСИ-Т-клеток в ЭБ-культуре
вызывая увеличение экспрессии IFN-y и CD39 [19]. Известно, что трансдукция ретровирусными векторами активирует белковый комплекс mTORC1, вследствие чего генетически-модифицированные Т-клетки приобретают высокую цитотоксическую активность, что проявляется в подавлении опухолевого рост in vitro и in vivo [20-22].
Приведенные выше результаты показывают, что TCR-подобные CAR/CAR/TCR-Т-клетки обладают механизмами, позволяющими эффективно подавлять опухолевые клетки, и сохранять собственную жизнеспособность. Наши результаты дают представление о регуляции клеточного метаболизма и противоопухолевой эффекторной функции Т-клеток, что расширяет понимание роли метаболизма TCR-подобных/CAR/ TCR-Т-клеток в противоопухолевом иммунном ответе.
■ Литература
1. Zhang P., Zhang G., Wan X. Challenges and new technologies in adoptive cell therapy. J. Hematol. Oncol. 2023; 16 (97): 1-55. DOI: https:// doi.org/10.1186/s13045-023-01492-8
2. Rohaan M.W., Wilgenhof S., Haanen JBAG. Adoptive cellular therapies: the current landscape. Virchows. Arch. 2019; 474 (4): 449-61. DOI: https://doi.org/10.1007/s00428-018-2484-0
3. Wachsmann T.L.A., Wouters A.K., Remst D.F.G., Hagedoorn R.S., Meeuwsen M.H., van Diest E., Leusen J., Kuball J., Falkenburg JHF., Heemskerk MHM. Comparing CAR and TCR engineered T cell performance as a function of tumor cell exposure. Oncoimmunology. 2022; 11 (1): 2033528. DOI: https://doi.org/10.1080/2162402X.2022.2033528
4. Rangel Rivera G.O., Knochelmann H.M., Dwyer C.J., Smith A.S., Wyatt M.M., Rivera-Reyes A.M., Thaxton J.E., Paulos C.M. Fundamentals of T Cell Metabolism and Strategies to Enhance Cancer Immunotherapy. Front. Immunol. 2021; 12: 645242. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2021.645242
5. Liberti M.V., Locasale J.W. The Warburg Effect: How Does it Benefit Cancer Cells? Trends Biochem Sci. 2016; 41 (3): 211-8. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.tibs.2015.12.001
6. Zhang M., Jin X., Sun R., Xiong X., Wang J., Xie D., Zhao M. Optimization of metabolism to improve efficacy during CAR-T cell manufacturing. J. Transl. Med. 2021; 19: 499. DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-021-03165-x
7. Shyer J.A., Flavell R.A., Bailis W. Metabolic signaling in T cells. Cell Res. 2020; 30: 649-59. DOI: https://doi.org/10.1038/s41422-020-0379-5
8. Chen C., Wang Z., Ding Y., Qin Y. Manipulating T-cell metabolism to enhance immunotherapy in solid tumor. Front. Immunol. 2022; 13: 1090429. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1090429
9. Alsalloum A., Alrhmoun S., Shevchenko J., Fisher M., Philip-pova J., Perik-Zavodskii R., Perik-Zavodskaia O., Lopatnikova J., Kuri-lin V., Volynets M., Zavjalov E., Solovjeva O., Akahori Y., Shiku H., Silkov A., Sennikov S. TCR-Engineered Lymphocytes Targeting NY-ESO-1: In Vitro Assessment of Cytotoxicity against Tumors. Biomedicines. 2023; 11 (10): 2805. DOI: https://doi.org/10.3390/biomedicines11102805
10. Wang L., Matsumoto M., Akahori Y., Seo N., Shirakura K., Kato T., Katsumoto Y., Miyahara Y., Shiku H. Preclinical evaluation of a novel CAR-T therapy utilizing a scFv antibody highly specific to MAGE-A4p230-239/HLA-A*02:01 complex. Molecular Therapy. 2024; 32 (3): 734-48. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2024.01.018
11. Wang Y., Wang L., Seo N., Okumura S., Hayashi T., Akahori Y., Fuji-wara H., Amaishi Y., Okamoto S., Mineno J., Tanaka Y., Kato T., Shiku H. CAR-Modified Vy9V52 T Cells Propagated Using a Novel Bisphosphonate Prodrug for Allogeneic Adoptive Immunotherapy. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (13): 10873. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms241310873
12. Sommermeyer D., Conrad H., Kronig H., Gelfort H., Bernhard H., Uckert W. NY-ESO-1 antigen-reactive T cell receptors exhibit diverse therapeutic capability. Int. J. Cancer. 2013; 132 (6): 1360-7. DOI: https://doi. org/10.1002/ijc.27792
Заключение
Изучение межмолекулярного взаимодействия метаболических процессов и иммунной функции Т-лимфо-цитов - актуальная задача. Использование 3Б-культуры является хорошим инструментом для изучения межклеточных взаимодействий между Т-лимфоцитами и опухолевыми клетками различных линий перед переносом эксперимента на модели in vivo. Полученные знания в дальнейшем помогут лучше регулировать эффективность воздействия ТСК-подобных/СЛЯ/ТСЯ-Т-клеток на опухоли и снизить цитотоксический эффект модифицированных Т-лимфоцитов на ткани пациента. Таким образом, изучение метаболического профиля Т-клеток при контакте с опухолями дает дополнительные возможности для создания новых подходов в терапии злокачественных новообразований.
13. Cesson V., Rivals J.P., Escher A., Piotet E., Thielemans K., Posevitz V., Dojcinovic D., Monnier P., Speiser D., Bron L., Romero P. MAGE-A3 and MAGE-A4 specific CD4(+) T cells in head and neck cancer patients: detection of naturally acquired responses and identification of new epitopes. Cancer Immunol. Immunother. 2011; 60 (1): 23-35. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-010-0916-z.
14. Tsao C.Y., Sabbatino F., Cheung N.K., Hsu J.C., Villani V., Wang X., Ferrone S. Anti-proliferative and pro-apoptotic activity of GD2 ganglioside-specific monoclonal antibody 3F8 in human melanoma cells. Oncoimmunology. 2015; 4 (8): e1023975. DOI: https://doi.org/10.1080/2 162402X.2015.1023975
15. Foty R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. 2011; 51: 2720. DOI: https://doi. org/10.3791/2720
16. Yin Z., Bai L., Li W., Zeng T., Tian H., Jiuwei Cui J. Targeting T cell metabolism in the tumor microenvironment: an anti-cancer therapeutic strategy. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2019; 38: 403. DOI: https://doi. org/10.1186/s13046-019-1409-3
17. Xiao C., Tian H., Zheng Y., Yang Z., Li S., Fan T., Xu J., Bai G., Liu J., Deng Z., Li C., He J. Glycolysis in tumor microenvironment as a target to improve cancer immunotherapy. Front. Cell Dev. Biol. 2022; 10: 1013885. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2022
18. Poorebrahim M., Mohammadkhani N., Mahmoudi R., Gholiza-deh M., Fakhr E., Cid-Arregui A. TCR-like CARs and TCR-CARs targeting neoepitopes: an emerging potential. Cancer Gene Ther. 2021; 28: 5819. DOI: https://doi.org/10.1038/s41417-021-00307-7
19. Peng H.Y., Lucavs J., Ballard D., Das J.K., Kumar A., Wang L., Ren Y., Xiong X., Song J. Metabolic Reprogramming and Reactive Oxygen Species in T Cell Immunity. Front Immunol. 2021; 12: 652687. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.652687
20. Филиппова Ю.Г., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Фишер М.С., Курилин В.В., Пашкина Е.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотип и эффекторные функции GD2-спе-цифичных CAR-T-клеток in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535
21. Кузнецова М.С., Терещенко В.П., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Алрхмун С., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотипические и функциональные особенности генерированных in vitro TCR-Т-клеток, специфичных к опу-холь-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Иммунология. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547
22. Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю.А., Филиппова Ю.В., Фишер М.С., Облеухова И.А., Завьялов Е.Л., Соловьева О.И., Разумов И.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Разработка экспериментальных моделей ксенотрансплантата опухолей человека на мышах для доклинических исследований in vivo препаратов для клеточной иммунотерапии. Иммунология. 2023; 44 (6): 709-20. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-709-720
■ References
1. Zhang P., Zhang G., Wan X. Challenges and new technologies in adoptive cell therapy. J Hematol Oncol. 2023; 16 (97): 1-55. DOI: https:// doi.org/10.1186/s13045-023-01492-8
2. Rohaan M.W., Wilgenhof S., Haanen JBAG. Adoptive cellular therapies: the current landscape. Virchows Arch. 2019; 474 (4): 449-61. DOI: https://doi.org/10.1007/s00428-018-2484-0
3. Wachsmann T.L.A., Wouters A.K., Remst D.F.G., Hagedo-orn R.S., Meeuwsen M.H., van Diest E., Leusen J., Kuball J., Falkenburg J.H.F., Heemskerk M.H.M. Comparing CAR and TCR engineered T cell performance as a function of tumor cell exposure. Oncoimmu-nology. 2022; 11 (1): 2033528. DOI: https://doi.org/10.1080/21624 02X.2022.2033528
4. Rangel Rivera G.O., Knochelmann H.M., Dwyer C.J., Smith A.S., Wyatt M.M., Rivera-Reyes A.M., Thaxton J.E., Paulos C.M. Fundamentals of T Cell Metabolism and Strategies to Enhance Cancer Immuno-therapy. Front Immunol. 2021; 12: 645242. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2021.645242
5. Liberti M.V., Locasale J.W. The Warburg Effect: How Does it Benefit Cancer Cells? Trends Biochem Sci. 2016; 41 (3): 211-8. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.tibs.2015.12.001
6. Zhang M., Jin X., Sun R., Xiong X., Wang J., Xie D., Zhao M. Optimization of metabolism to improve efficacy during CAR-T cell manufacturing. J Transl Med. 2021; 19: 499. DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-021-03165-x
7. Shyer J.A., Flavell R.A., Bailis W. Metabolic signaling in T cells. Cell Res. 2020; 30: 649-59. DOI: https://doi.org/10.1038/s41422-020-0379-5
8. Chen C., Wang Z., Ding Y., Qin Y. Manipulating T-cell metabolism to enhance immunotherapy in solid tumor. Front Immunol. 2022; 13: 1090429. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1090429
9. Alsalloum A., Alrhmoun S., Shevchenko J., Fisher M., Philip-pova J., Perik-Zavodskii R., Perik-Zavodskaia O., Lopatnikova J., Kuri-lin V., Volynets M., Zavjalov E., Solovjeva O., Akahori Y., Shiku H., Silkov A., Sennikov S. TCR-Engineered Lymphocytes Targeting NY-ESO-1: In Vitro Assessment of Cytotoxicity against Tumors. Biomedi-cines. 2023; 11 (10): 2805. DOI: https://doi.org/10.3390/biomedicines 11102805
10. Wang L., Matsumoto M., Akahori Y., Seo N., Shirakura K., Kato T., Katsumoto Y., Miyahara Y., Shiku H. Preclinical evaluation of a novel CAR-T therapy utilizing a scFv antibody highly specific to MAGE-A4p230-239/HLA-A*02:01 complex. Molecular Therapy. 2024; 32 (3): 734-48. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.ymthe.2024.01.018
11. Wang Y., Wang L., Seo N., Okumura S., Hayashi T., Aka-hori Y., Fujiwara H., Amaishi Y., Okamoto S., Mineno J., Tanaka Y., Kato T., Shiku H. CAR-Modified Vy9V82 T Cells Propagated Using a Novel Bisphosphonate Prodrug for Allogeneic Adoptive Immunothe-rapy. Int J Mol Sci. 2023; 24 (13): 10873. DOI: https://doi.org/10.3390/ ijms241310873
12. Sommermeyer D., Conrad H., Krönig H., Gelfort H., Bernhard H., Uckert W. NY-ESO-1 antigen-reactive T cell receptors exhibit diverse the-
■ Сведения об авторах
Булыгин Алексей Сергеевич - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Мин-обрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-9055-6069
Филиппова Юлия Григорьевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Мин-обрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1158-887X
rapeutic capability. Int J Cancer. 2013; 132 (6): 1360-7. DOI: https://doi. org/10.1002/ijc.27792
13. Cesson V., Rivals J.P., Escher A., Piotet E., Thielemans K., Posevitz V., Dojcinovic D., Monnier P., Speiser D., Bron L., Romero P. MAGE-A3 and MAGE-A4 specific CD4(+) T cells in head and neck cancer patients: detection of naturally acquired responses and identification of new epitopes. Cancer Immunol Immunother. 2011; 60 (1): 23-35. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-010-0916-z
14. Tsao C.Y., Sabbatino F., Cheung N.K., Hsu J.C., Villani V, Wang X., Ferrone S. Anti-proliferative and pro-apoptotic activity of GD2 ganglioside-specific monoclonal antibody 3F8 in human melanoma cells. Oncoimmunology. 2015; 4 (8): e1023975. DOI: https://doi.org/10.1080/2 162402X.2015.1023975
15. Foty R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 2011; 51: 2720. DOI: https://doi. org/10.3791/2720
16. Yin Z., Bai L., Li W., Zeng T., Tian H., Jiuwei Cui J. Targeting T cell metabolism in the tumor microenvironment: an anti-cancer therapeutic strategy. J Exp Clin Cancer Res. 2019; 38: 403. DOI: https://doi. org/10.1186/s13046-019-1409-3
17. Xiao C., Tian H., Zheng Y., Yang Z., Li S., Fan T., Xu J., Bai G., Liu J., Deng Z., Li C., He J. Glycolysis in tumor microenvironment as a target to improve cancer immunotherapy. Front Cell Dev Biol. 2022; 10: 1013885. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2022
18. Poorebrahim M., Mohammadkhani N., Mahmoudi R., Gholiza-deh M., Fakhr E., Cid-Arregui A. TCR-like CARs and TCR-CARs targeting neoepitopes: an emerging potential. Cancer Gene Ther. 2021; 28: 5819. DOI: https://doi.org/10.1038/s41417-021-00307-7
19. Peng H.Y., Lucavs J., Ballard D., Das J.K., Kumar A., Wang L., Ren Y., Xiong X., Song J. Metabolic Reprogramming and Reactive Oxygen Species in T Cell Immunity. Front Immunol. 2021; 12: 652687. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.652687
20. Philippova J.G., Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Teresh-chenko V.P., Fisher M.S., Kurilin V.V., Pashkina E.A., Akahori Ya., Shiku H., Sennikov S.V. Phenotype and effector functions of GD2-spe-cific CAR-T lymphocytes in vitro. Immunologiya. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535 (in Russian)
21. Kuznetsova M.S., Tereshchenko V.P., Shevchenko J.A., Fisher M.S., Kurilin V. V., Alsalloum A., Alrhmoun S., Akahori Y., Shiku H., Sennikov S.V. Phenotypic and functional features of in vitro generated TCR-T lymphocytes specific for the tumor-associated antigen NY-ESO-1. Immunologiya. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547 (in Russian)
22. Lopatnikova J.A., Shevchenko J.A., Filippova J.G., Fisher M.S., Obleuhova I.A., Zavjalov E.L., Solovjeva O.I., Razumov I.A., Akahori Ya., Shiku H., Sennikov S.V. Development of experimental mouse xenograft models of human tumors for preclinical in vivo studies of product for cellular immunotherapy. Immunologiya. 2023; 44 (6): 709-20. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-709-720 (in Russian)
■ Authors' information
Aleksey S. Bulygin - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-9055-6069
Julia G. Philippova - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1158-887X
Булыгин А.С., Филиппова Ю.Г., Алсаллум А., Алрахмун С., Киреев Ф.Д., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Перик-Заводский Р.Ю., Перик-Заводская О.Ю., Назаров К.В., Шику Х., Силков А.Н., Сенников С.В.
Оценка метаболизма TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток в 3Б-культуре
Алсаллум Алаа - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-4395-5822
Алрхмун Салех - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-4395-5822
Киреев Федор Дмитриевич - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобр-науки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail [email protected] https://orcid.org/0009-0008-9309-6676
Шевченко Юлия Александровна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0001-8773-0599
Фишер Марина Сергеевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобр-науки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Перик-Заводский Роман Юрьевич - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5055-4859
Перик-Заводская Ольга Юрьевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4911-1994
Назаров Кирилл Вячеславович - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Мин-обрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7175-4051
Шику Хироши - MD, PhD, зав. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация; проф. каф. иммунной генной терапии, Университет Миэ, Цу, Япония
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-0362-755X
Alaa Alsalloum - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-4395-5822
Saleh Alrhmoun - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-4395-5822
Fedor D. Kireev - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0008-9309-6676
Julia A. Shevchenko - PhD, Senior Researcher of the Lab. of Cellular Immunotherapy Technologies, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8773-0599
Marina S. Fisher - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Roman Yu. Perik-Zavodskii - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5055-4859
Olga Yu. Perik-Zavodskaia - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4911-1994
Kirill V. Nazarov - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7175-4051
Hiroshi Shiku - MD, PhD, Head of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation; Prof. of Immunogene Therapy Dept., Mie University, Tsu, Japan E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-0362-755X
Силков Александр Николаевич - д-р биол. наук, директор ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1897-8675
Сенников Сергей Витальевич - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Alexander N. Silkov - Dr.Sci., PhD, Director of RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1897-8675
Sergey V. Sennikov - MD, PhD, Prof., Head of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
