CC BY
18
© Коллектив авторов, 2023
Лопатникова Ю.А.1, Шевченко Ю.А.1, Филиппова Ю.Г.1, Фишер М.С.1, Облеухова И. А.1, Завьялов Е.Л.1-3, Соловьева О.И.1-3, Разумов И.А.2' 3, Акахори Я.4, Шику Х.4, Сенников С.В.1
Разработка экспериментальных моделей ксенотрансплантата опухолей человека на мышах для доклинических исследований in vivo препаратов для клеточной иммунотерапии
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630099, г. Новосибирск, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630090, г. Новосибирск, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630090, г. Новосибирск, Российская Федерация
4 Отдел персонализированной иммунотерапии злокачественных новообразований Медицинского университета Мие, 514-8507, г. Мие, Япония
Резюме
Введение. В связи с активным развитием новых направлений в клеточной иммунотерапии остро встает вопрос подходов для проведения доклинических исследований безопасности и эффективности. Оптимальным для решения данной задачи является использование опухолевых ксенотрансплантатов для имитации опухолевого роста в организме с поддержанием гомеостаза, метаболизма и возможных механизмов толерантности к терапевтическому агенту. Эффективность такого подхода к анализу эффективности клеточных препаратов привела к следующему шагу: необходимости стандартизации методических подходов по подбору опухолевых клеточных линий человека и линий иммунодефицитных мышей.
Цель исследования - оценка эффективности формирования ксенотрансплантата у иммунодефицитных мышей различных линий для получения оптимальных моделей доклинических исследований препаратов модифицированных клеток человека.
Материал и методы. Для отработки моделей использовали мышей линий NRG (NOD.Cg-RagltmlMom Il2rgtm1Wjl/SzJ) и SCID, а также линии опухолевых клеток человека SW620 (аденокарцинома толстой кишки человека), U-87MG (эпителиальная опухоль головного мозга человека), SK-MEL-37 (меланома), NW-MEL-38 (меланома) и S6 (меланома). Экспериментальным животным подкожно в область правой лопатки вводили 100 мкл суспензии опухолевых клеток в дозах 1, 3 и 5 млн/мышь с последующим измерением размера опухолевого узла.
Результаты. Была проведена оценка эффективности формирования ксенотранс-плантатов различных клеточных линий человека в разных линиях мышей с иммунодефицитом. Показано, что линия мышей NRG по сравнению с мышами SCID обладает более высокой способностью по приживлению опухолевых клеточных линий, а сами клеточные линии отличаются по уровням экспрессии опухоль-ассоциированных белков и формируют ксенотрансплантат с разной эффективностью. Оптимальным оказалось использование мышей линии NRG и клеточной линии SK-MEL-37 с высоким уровнем экспрессии антигенов GD2, NY-ESO-1 и MAGE-A4. Эксперимент по терапии солидной опухоли, полученной после трансплантации животным опухолевых клеточных линий человека, с помощью анти-GD2-CAR-T-клеток показал эффективность в снижении размеров опухолевого узла при внутриопухолевом введении модифицированных клеток человека.
Заключение. Полученные результаты подтверждают эффективность использования ксенотрансплантатов для оценки эффективности противоопухолевого иммунного ответа препаратов модифицированных клеток в условиях in vivo.
Для корреспонденции
Сенников Сергей Витальевич -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Ключевые слова: опухоль; опухолевые ксенотрансплантаты; опухолевые клеточные линии; иммунодефицит-ные мыши; генетически модифицированные Т-лимфоциты
Статья получена 10.08.2023. Принята в печать 29.08.2023.
Для цитирования: Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю.А., Филиппова Ю.В., Фишер М.С., Облеухова И.А., Завьялов Е.Л., Соловьева О.И., Разумов И. А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Разработка экспериментальных моделей ксенотрансплантата опухолей человека на мышах для доклинических исследований in vivo препаратов для клеточной иммунотерапии. Иммунология. 2023; 44 (6): 709-720. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-709-720
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 21-65-00004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Лопатникова Ю.А., Сенников С.В.; работа с культурами клеточных линий - Шевченко Ю.А., Филиппова Ю.Г., Фишер М.С., Разумов И.А.; работа с первичными клетками человека - Фишер М.С., Облеухова И.А.; работа с экспериментальными животными - Завьялов Е.Л., Соловьева О.И.; получение ретровирусных конструкций - Акахори Я., Шику Х.; статистическая обработка данных - Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю.А.; написание текста - Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю.А.; редактирование текста - Филиппова Ю.Г., Облеухова И.А., Завьялов Е.Л., утверждение окончательного варианта статьи - Сенников С.В.; ответственность за целостность всех частей статьи - Лопатникова Ю. А.
Lopatnikova J.A.1, Shevchenko J.A.1, Filippova J.G.1, Fisher M.S.1, Obleuhova I.A.1, Zavjalov E.L.1-3, Solovjeva O.I.1-3, Razumov I.A.2, 3, Akahori Ya.4, Shiku H.4, Sennikov S.V.1
Development of experimental mouse xenograft models of human tumors for preclinical in vivo studies of product for cellular immunotherapy
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology of the Ministry of Science and High Education of the Russian Federation, 630099, Novosibirsk, Russian Federation
2 Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences of the Ministry of Science and High Education of the Russian Federation, 630090, Novosibirsk, Russian Federation
3 Novosibirsk State University of the Ministry of Science and High Education of the Russian Federation, 630090, Novosibirsk, Russian Federation
4 Department of Personalized Cancer Immunotherapy, Mie University Graduate School of Medicine, 514-8507, Mie, Japan
Abstract
Introduction. In connection with the active development of new directions in cellular immunotherapy, the question of approaches for conducting preclinical studies on safety and efficacy is acute. The most optimal for solving this problem is the use of tumor xenografts to simulate tumor growth in the body while maintaining homeostasis, metabolism and possible mechanisms of tolerance to a therapeutic agent. The effectiveness of this approach to the analysis of the effectiveness of cell preparations led to the need to standardize methodological approaches to the selection of human tumor cell lines and lines of immunodeficient mice.
The purpose of the study was to evaluate the effectiveness of xenograft formation in two strains of immunodeficient mice in order to obtain optimal models for preclinical studies of preparations of modified human cells.
Material and methods. To test the models we used mice of the NRG (NOD.Cg-Raglt-mlMom Il2rgtm1Wjl/SzJ) and SCID lines and human tumor cell lines SW620 (human colon adenocarcinoma), U-87MG (human epithelial brain tumor), SK-MEL-37 (melanoma), NW-MEL-38 (melanoma) and S6 (melanoma). Experimental animals were injected subcutane-ously into the region of the right shoulder blade with 100 ^l of tumor cell suspension at doses of 1, 3 and 5 mln/mouse, followed by measurement of the size of the tumor node.
Results. The effectiveness of the formation of xenografts of various human cell lines in mice with immunodeficiency was evaluated. It has been shown that the NRG mice, compared to the SCID mice, has a higher ability to engraft tumor cell lines. And the cell lines themselves differ in the levels of expression of tumor-associated proteins and form a xenograft with different efficiency. The most optimal was the use of NRG mice and the SK-MEL-37 cell line,
For correspondence
Sergey V. Sennikov -MD, PhD, Professor, Head of the Molecular Immunology Laboratory, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
with a high level of expression of the GD2, NY-ESO-1 and MAGE-A4 antigens. An experiment on the treatment of solid tumors obtained after transplantation of human tumor cell lines into animals using anti-GD2-CAR-T cells showed effectiveness in reducing the size of the tumor node with intratumoral administration of modified human cells.
Conclusion. The results obtained confirm the efficiency of using xenografts in evaluating the effectiveness of the antitumor immune response of modified cell preparations in vivo.
Keywords: tumor; tumor xenografts; tumor cell lines; lines of immunodeficient mice; genetically modified T-lymphocytes
Received 10.08.2023. Accepted 29.08.2023.
For citation: Lopatnikova J.A., Shevchenko J.A., Filippova J.G., Fisher M.S., Obleuhova I.A., Zavjalov E.L., Solovjeva O.I., Razumov I.A., Akahori Ya., Shiku H., Sennikov S.V. Development of experimental mouse xenograft models of human tumors for preclinical in vivo studies of product for cellular immunotherapy. Immunologiya. 2023; 44 (6): 709-20. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-709-720 (in Russian)
Funding. The present study was supported by the Russian Science Foundation grant no. 21-65-00004, URL: https:// rscf.ru/project/21-65-00004/
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. The concept and design of the study - Lopatnikova Ju.A., Sennikov S.V.; work with cultures of cell lines - Shevchenko Ju.A., Filippova Ju.G., Fisher M.S.; work with primary human cells - Fisher M.S., Obleukhova I.A.; work with experimental animals - Zavyalov E.L., Solovieva O.I.; obtaining retroviral constructs -Akahori Ya., Shiku H.; statistical data processing - Lopatnikova Ju.A., Shevchenko Ju.A.; writing the text - Lopatnikova Ju.A., Shevchenko Ju.A.; text editing - Filippova Ju.G., Obleukhova I.A., Zavyalov E.L., approval of the final version of the article - Sennikov S.V.; responsibility for the integrity of all parts of the article - Lopatnikova Ju.A.
Введение
В настоящее время активно развиваются методы терапии различных злокачественных новообразований, основанные на адоптивном переносе генетически модифицированных клеточных препаратов дендритных клеток, макрофагов, НК-клеток, НКТ-клеток и T-лимфоцитов. Такой тип клеточных препаратов требует тщательного изучения безопасности и эффективности на этапе доклинических исследований, т. е. до первого введения препарата человеку.
В последние годы разрабатываются новые подходы по изучению эффективности противоопухолевого действия клеточных препаратов: модели генетически модифицированных животных, модели ксенотрансплантатов (мыши, данио рерио), а также несколько вариантов моделей in vitro (органоиды, сфероиды) [1-4]. Указанные платформы имеют собственные характеристики с точки зрения архитектуры опухоли, микроокружения, клеточного состава и гетерогенности, моделей роста и реакции на лечение. В условиях in vitro используются двух- и трехмерные системы. Классические 2D-модели не могут воспроизвести ключевые элементы микроокружения in vivo. Трехмерные сфероиды - это группы роста, сформированные in vitro, они отражают морфологическую структуру опухолей человека, они полезны для изучения эффективности лекарств [5]. Модели на животных включают химическую индукцию и генетические манипуляции, а также ксенотрансплантаты клеточных опухолевых линий или первичных опухолей человека, которые эффективно используются в доклинических исследованиях и при изучении особенностей опухолевого роста [6].
Среди вариантов ксенотрансплантации существуют два подхода: использование клеточных линий и вариант
с использованием биоптата первичных опухолей пациентов, полученных во время операционного вмешательства. Эти подходы имеют свои плюсы и минусы.
К положительным характеристикам подхода с использованием опухолевых клеточных линий для формирования опухолевого узла относятся высокая воспроизводимость и стабильность результатов даже спустя длительное время. Однако подход с использованием биоптата лучше отражает взаимодействия опухоли и стромы, присутствующие в первичных опухолях, и обеспечивает высокую однотипность гистологически и генетически с исходными опухолями пациентов [7]. Однако было показано, что после 2-5 пассажей строма опухоли почти полностью замещается внеклеточным матриксом и стромальными клетками мышиного происхождения, что создает существенные проблемы для временного окна исследований и вносит неопределенность в различные виды исследований. Кроме того, каждая такая модель отражает состояние опухолевых клеток определенного индивидуума только на одной стадии [8].
Таким образом, доклинические исследования на иммунодефицитных мышах с трансплантацией им клеток опухолевых линий человека оптимальны для скрининга эффективности новых препаратов для клеточной иммунотерапии злокачественных заболеваний.
Основные моменты, которые необходимо учитывать при работе с ксенотрансплантатами, - это подбор оптимальной клеточной линии согласно задачам исследования (в том числе по экспрессии таргетных молекул и молекул главного комплекса гистосовместимости), подбор линии мышей, у которых данная клеточная линия будет эффективно формировать опухолевый узел
в сроках и размерах, подходящих для доклинических исследований, а также подбор условий трансплантации (количество клеток, способ введения).
В нашем исследовании был проведен анализ нескольких вариантов ксенотрансплантатов в различных моделях у мышей, что может быть востребовано исследовательскими группами, занимающимися разработкой и тестированием эффективности современных клеточных препаратов иммунотерапии онкологических заболеваний для подбора наиболее адекватной и информативной модели для исследования.
Цель данного исследования - оценка эффективности формирования ксенотрансплантата у иммуно-дефицитных мышей различных линий для получения оптимальных моделей доклинических исследований препаратов модифицированных клеток человека.
Материал и методы
Клеточные линии. Клеточные линии SW-620 (коло-ректальная аденокарцинома человека), U-87 (глиоблас-тома человека) были предоставлены ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск); SK-MEL-37 (меланома человека), NW-MEL-38 (меланома человека), S6 (меланома человека), V9 (меланома) - профессором Х. Шику (Университет Мие, Япония). Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (HyClone, США), 2 мМ L-глютамина (ООО «БиолоТ», Россия), 5 • 10-4 М 2-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich, США), 80 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения), 10 мМ HEPES буфера (Sigma-Aldrich, США), 100 мкг/мл бензилпенициллина (ОАО «Био-синтез», Россия), в инкубаторе во влажной атмосфере при 37 °С и концентрации СО2 5 %.
Оценка экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов. Для оценки экспрессии опухоль ассоциированных белков на клетках опухолевых линий использовали следующие реагенты anti-GD-2-PE (BioLegend, США), моноклональные кроличьи антитела NY-ESO-1-PE (Cell Signaling Technology, США), моноклональные антитела MAGE-A4-Coralite 650 (ProteinTech, США) согласно инструкции производителей. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Attune (ThermoFisher, США).
Линии мышей. В работе использовали линии имму-нодефицитных мышей NRG (NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ) и SCID (SHO-PrkdcscidHrhr). Исследование выполнено на базе Центра генетических ресурсов лабораторных животных ИЦиГ СО РАН (RFMEFI62119X0023). В работе использовали самцов и самок в возрасте 8 нед SPF-статуса. Животных содержали однополыми группами по 2-5 особей в индивидуально вентилируемых клетках (IVC) системы Opti Mice (Animal Care Systems, США) в контролируемых условиях, при температуре 21-24 °C, относительной влажности 30-50 % и световом режиме свет/темнота 12/12 ч с рассветом в 02:00. Корм Ssniff (Германия) и вода после обратного осмоса, обогащенная минеральной смесью, животным предоставлялись ad libitum.
Трансплантация и оценка эффективности формирования опухолевого узла. За 2-3 нед до начала эксперимента опухолевые клетки размораживали и культивировали в течение 4-5 пассажей на среде RPMI-1640 с 10 % FBS (HyClone, США), при 37 °С в культуральных пластиковых флаконах (TPP, Швейцария). Перед инъекцией клетки опухоли снимали с подложки смесью раствора трипсина и раствора Версена (БиолоТ, Россия) и после 5 мин центрифугирования при 1000 об/мин осадок тщательно ресуспендировали в среде без сыворотки. Для получения ксенотрансплантатов животным подкожно в область правой лопатки вводили 100 мкл суспензии клеток в культуральной среде. При проведении экспериментальной терапии клетки анти-вБ2-CAR-T вводили внутривенно или в районе формирующегося опухолевого узла в объеме 50 мкл.
Эксперименты были выполнены с соблюдением принципов гуманности в соответствии с директивой Европейского сообщества (86/609/ЕЕС). В течение эксперимента состояние мышей регистрировали каждые 2-3 сут. В частности, оценивали изменения состояния кожных покровов, двигательной активности и поведения. Если мышь демонстрировала выраженные признаки токсичности (например, изогнутость, сгорбленность, снижение активности), потерю массы тела > 20 % или значительный объем ксенотрансплантата, этих особей выводили из эксперимента в соответствии с требованиями гуманного отношения к животным с помощью передозировки CO2, сопровождаемой церви-кальной дислокацией. Для оценки объемов ксенотранс-плантатов при помощи штангенциркуля определяли линейные размеры опухоли и затем рассчитывали объем по формуле: V = а х Ь2 х 0,52 (а - длина, Ь - ширина).
Получение CAR-T-GD-2-клеток. МНК выделяли из периферической крови на градиенте плотности фиколла-урографина. Далее 1 млн МНК в 2 мл среды GT-T551 (Takara Bio, Япония) с добавлением 300 ед/ мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия), 6 мкл/мл сыворотки IV группы крови человека высевали в лунку 12-луноч-ного планшета, заранее покрытого 400 мкл раствора, содержащего 25 мг/мл ретронектина (Takara Bio, Япония) и 5 мг/мл анти-СБ3-антител (Biolegend, США). На 2-е и 3-и сутки культивирования меняли половину среды. На 3-и сутки готовили планшеты для ретровирусной трансдукции. Для получения CAR-T-клеток, специфичных к антигену GD-2, лимфоциты условно-здорового донора трансдуцировали ретровирусными векторами (синтезированы научной группой профессора Х. Шику на базе Высшей школы медицины Университета Мие). Растворы ретровирусов размораживали при 37 °С и разводили в соотношении 1 : 4.
Далее 1 мл полученного раствора переносили в лунку 24-луночного планшета, заранее покрытого 25 мг/мл ретронектина (Takara Bio, Япония) и центрифугировали с ускорением 2000 g 2 ч при 32 °С. После центрифугирования раствор ретровируса удаляли и в лунки добавляли 1,5-2 • 105 полученных лимфоцитов (преимущественно CD3+-лимфоцитов после анти-CD3-стимуляции),
в среде RPMI-1640, содержащей 10 % FBS (Invitrogen, США), 2 мМ L-глутамина (ООО «БиолоТ», Россия), 5 • 10-4 М 2-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich, США), 80 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения), 10 мМ HEPES-буфера (Sigma-Aldrich, США), 100 мкг/мл бен-зилпенициллина (ОАО «Био-синтез», Россия). Клетки в планшетах центрифугировали при ускорении 1000 g 10 мин при 32 оС. На 4-й день трансдукцию повторяли и через 4-5 ч клетки переносили в 6-луночные планшеты в 3,5 мл культуральной среды. На 7-й день полученные клетки использовали для инъекции экспериментальным животным.
Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения STATISTICA 7.0 (StatSoft, США). В качестве порогового уровня статистической значимости во всех проводимых анализах использовался p < 0,05. Данные для количественных показателей представлены в виде среднего и ошибки среднего, сравнение независимых выборок с определением статистической значимости отличий проводилось с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.
Результаты
Сравнительная эффективность формирования ксенотрансплантатов опухолевыми клеточными линиями SW-620 и U-87 у мышей линий NRG и SCID
Для эффективного приживления трансплантируемых клеток человека используются модели на мышах с генетическим иммунодефицитом, однако разные линии мышей имеют различные повреждения системы иммунитета, что является определяющим фактором в эффективности формирования ксенотрансплантата. Линии мышей NRG и SCID имеют минимальное количество Т- и В-лимфоцитов с олигоклональным репертуаром рецепторов. Успешность трансплантации солидных опухолей мышам линии SCID, согласно данным литературы, составляет 20-50 %, тогда как для линии NRG данный показатель достигает значений 95-100 %.
При исследовании динамики роста ксенотрансплантата SW620 (рис. 1) оказалось, что как для NRG, так и для SCID характерен устойчивый рост опухолевого узла при введении опухолевых клеток в дозе 5 млн/мышь на протяжении всего периода наблюдения, а именно до 30 сут с момента введения клеток. При этом объемы опухолевых узлов для различных линий на 30-е сутки не различались. При оценке размеров ксенотрансплан-татов у мышей NRG с различной дозой введения клеток, оказалось, что динамика роста и объемы опухолевых узлов у животных, которым вводили 3 и 5 млн клеток, практически не различалась.
Рост ксенотрансплантатов с дозой введения 1 млн клеток замедлялся начиная с 23-х суток после введения клеток относительно опухолевых узлов у мышей с другими дозами введения клеток. Иная картина
Э
6000
5000
Ксенотрансплантат SW620 у мышей NRG
4000
3000
§ 2000
1С
° 1000
7 9 11 14 16 18 21 23 25 28 30 Сутки от инокуляции клеток Дозы: 1 млн, n=5 ♦ 3 млн, n=5 -i 5 млн, n=5
э
6000
3м5000
и
¡ 4000
у
п
ем3000
2000
Ксенотрансплантат SW620 у мышей NRG и SCID
1000
7 9 11 14 16 18 21 23 25 28 30 Сутки от инокуляции клеток Ч SCID -A-NRG
Рис. 1. Динамика роста ксенотрансплантатов SW-620 (M ± SE) А - у мышей NRG, Б - у мышей линий NRG и SCID при дозе
5 млн/мышь; * - достоверные различия между группами (1 млн/мышь и 3/5 млн/мышь). Здесь и на рис. 2, 4, 5: тест Манна-Уитни; p < 0,05.
наблюдалась при оценке роста ксенотрансплантатов, полученных введением клеток глиобластомы человека U-87MG (рис. 2).
Для мышей линии NRG было обнаружено, что при введении 5 млн клеток ксенотрансплантаты демонстрировали высокие темпы роста, начиная с 16-х суток, по сравнению с ксенотрансплантатами, полученными введением 1 и 3 млн клеток (рис. 2 А). Причем эти темпы превосходили темпы роста опухолевого узла, полученного введением 5 млн клеток мышам SCID (рис. 2Б). Кроме того, рост ксенотрансплантатов значительно отставал у мышей SCID от NRG для всех доз и при введении 5 млн клеток соответствовал темпам, которые отмечались для ксенотрансплантатов, полученных введением 1 или 3 млн клеток мышам NRG. Таким образом, было показано, что инокуляция клеток SW620 и U-87MG во всех использованных дозах (1, 3, 5 млн на животное) позволяет
0
0
7000 6000 ÈÎ 5000
£ 4000
о
§ 3000 О 2000
1000 0
Дозы:
7000
36000
S 5000 is
§ 4000
х ^
g 3000
s
¡3 2000
ю О
1000 0
Дозы:
Ксенотрансплантат U-87 у мышей NRG
9 11 14 16 18 21 23 25 28 30 Сутки от инокуляции клеток
1 млн/мышь —Д— 3 млн/мышь 5 млн/мышь
Ксенотрансплантат и-87 у мышей 8СГО
3
7000 6000
4 5000
g
Ü 3000
to
О 2000
1000 0
Ксенотрансплантат U-87 в дозе 3 млн/мышь у мышей NRG и SCID
@ @
@
9 11 14 16 18 21 23 25 28 30 Сутки от инокуляции клеток
-ф- SCID -^-NRG Ксенотрансплантат U-87 в дозе 5 млн/мышь у мышей NRG и SCID
11 14 16 18 21 23 25 Сутки от инокуляции клеток
3 млн/мышь -И- 5 млн/мышь
7000
36000
S 5000 s
ло4000
X
у
g 3000 м
g 2000
1000 0
@
@
@
@ у » ;
I 1 1
_ —г
28 30
11 14 16 18 21 23 25 Сутки от инокуляции клеток
-A- SCID * NRG
28 30
Рис. 2. Динамика роста ксенотрансплантатов U-87 (M ± SE)
А - у мышей NRG, * - достоверные различия между группами (1 млн/мышь и 5 млн/мышь), # - достоверные различия между группами (3 и 5 млн/мышь); Б - у мышей SCID, # - достоверные различия между группами (3 и 5 млн/мышь); В - в сравнении у мышей разных линий при дозе 3 млн/мышь, @ - достоверные различия между разными группами мышей; Г - в сравнении у мышей разных линий при дозе 5 млн/мышь, @ - достоверные различия между разными группами мышей.
7
#
#
7
9
7
9
получить стабильно растущие гетеротопические ксенот-рансплантаты у иммунодефицитных мышей линии NRG. Для получения ксенотрансплантатов глиобластомы или карциномы кишечника с целью проведения каких-либо исследований наиболее подходящими являются модели, полученные введением 3 млн клеток как U-87MG, так и SW620 мышам линии NRG.
Анализ уровня экспрессии специфических опухолевых антигенов на клеточных линиях SK-MEL-37, NW-MEL-38 и S6
Одним из важных этапов подбора оптимальной клеточной линии для проведения экспериментов по ксенотрансплантации является оценка поверхностных и внутриклеточных таргетных молекул. Клеточные линии SK-MEL-37, NW-MEL-38 и S6 были проанализированы по экспрессии опухоль-ассоциированных белков: GD2, HER2, MAGE-A4, NY-ESO-1 (рис. 3).
Показано, что клеточные линии значимо различались по экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов, в частности клеточная линия меланомы SK-MEL-37 экспрессировала все исследуемые антигены почти на 100 % клетках и с высокой плотностью, тогда как линия
меланомы NW-MEL-38 не экспрессировала GD-2, уровень экспрессии MAGA-A4 был аналогичным с клеточной линией SK-MEL-37, а содержание клеток с экспрессией NY-ESO-1 в среднем составляло 83 %. Линии S6 и V9 являются оппозитными по экспрессии GD-2.
Сравнительная эффективность ксенотрансплантатов опухолевых клеточных линий SK-MEL-37, NW-MEL-38 и S6 у мышей линий NRG
Анализ экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов показал, что клетки линии меланомы SK-MEL-37 экспрессируют все исследуемые опухолевые антигены (GD2, MAGE-A4, NY-ESO-1) с относительным содержанием от 80 до 100 %. Для сравнительного исследования скорости роста ксенотрансплантатов клетки линии SK-MEL-37 вводили подкожно в дозах по 1, 3 и 5 млн/мышь (рис. 4).
Для дозы 5 млн/мышь был характерен устойчивый рост опухолевого узла на протяжении всего периода наблюдения и начиная с 30-х суток значимо отличался от группы с введением дозы 3 млн/мышь.
Для клеточной линии NW-Mel-3S, которая показала высокий уровень экспрессии опухолевых антигенов MAGE-A4 и NY-ESO-l, для подбора оптимальной дозы и срока развития опухоли трем группам мышей (по 5 мышей в группе) выполнено введение опухолевых клеток в дозах l, 3 и 5 млн/мышь (рис. 5).
Для данной опухолевой линии показано, что объемы опухолевых узлов 300 мм3 были достигнуты одновременно на срок l6 сут после инокуляции в дозах 3 и 5 млн/мышь. Однако при дальнейшем росте ксенотрансплантата в группе мышей с дозой введения 3 млн/мышь наблюдался более выраженный рост опухолевого узла. Доза l млн/мышь, как и в случае с клеточной линией SK-Mel-37, показала значимо меньшую эффективность формирования опухолевого узла.
Для проверки эффективности формирования ксенотрансплантата была также проверена линия S6, которая является производной от линии SK-Mel-37 и активно используется в Mie University Graduate School of Medicine Department of Personalized Cancer Immunotherapy Center for Comprehensive Cancer Immunotherapy (Япония) как мишень для GD2-специфическиx клеток. Однако в наших экспериментах у мышей линии NRG данная клеточная линия не показала формирования опухолевого узла (рис. 6). Введение дозы 5 млн/мышь привело к полной самоэлиминации опухолевого узла к 21-м суткам, а дозы 1 и 3 млн/мышь вообще не способны были сформировать опухолевый узел.
Таким образом, нами показаны существенные различия в росте опухоли с помощью различных линий клеток, что еще раз подчеркивает необходимость внимательного подбора клеточных линий как по экспрессии целевых антигенов, так и по эффективности формирования ксенотрансплантата у мышей различных линий.
Полученные данные подтверждают эффективность модели ксенотрансплантата с использованием клеточных линий SK-MEL-37 и NW-MEL-3S для оценки эффективности противоопухолевых препаратов, нацеленных на такие молекулы, как GD2, NY-ESO-l, MAGE-A4.
Экспериментальная терапия affrn-GD2-CAR-T-клетками опухолей ксенотрансплантата линии SK-Mel-37
Мышам линии NRG было выполнено подкожное введение клеток линии SK-Mel-37 в дозе 5 млн/мышь и по достижении среднего объема опухоли 100 мм3 начата экспериментальная терапия. Были сформированы следующие группы по S мышей:
1. Интактная группа.
2. Контроль с внутривенным введением активированных Т-лимфоцитов в дозе S млн/мышь.
3. Контроль с внутриопухолевым введением активированных Т-лимфоцитов в дозе S млн/мышь.
4. Терапия с внутривенным введением aнти-GD2-CAR-T-клеток в дозе S млн/мышь.
5. Терапия с внутриопухолевым введением анти-GD2-CAR-T-клеток в дозе S млн/мышь.
Экспрессия GD2
100 90 80 V0
ок60
50 40 30 20 10 0
GD-2
Э
SK MEL-3V
Экспрессия MAGA-A4 и NY-ESO-1
105
100
к95 ок
клет 90
5
85 80 V5
SK-MEL-3V NW-MEL-38
MAGE-A4
NY-ESO-1
Рис. 3. Экспрессия опухоль-ассоциированных антигенов на клеточных линиях человека
А - экспрессия ОБ2 на клеточных линиях БК-МЕЬ-37, МЕЬ-38, Бб, У9; Б - экспрессия МАОА-А4 и М-ЕБО-1 на линиях БК-МЕЬ-37 и NW-MEL-38.
800 V00
600 500 ,400 300 200 100 0
Ксенотрансплантат SK-MEL-3V у мышей линии NRG
' @
68
Дозы:
10
33 35
13 15 1V 22 24 29 31 Сутки от инокуляции клеток
1 млн/мышь 3 млн/мышь 5 млн/мышь
Рис. 4. Динамика роста ксенотрансплантатов SK-MEL-37 (M ± SE) у мышей линии NRG. Дозы - 1, 3 и 5 млн/мышь по 5 мышей в каждой группе
Здесь и на рис.5: * - достоверные различия между группами с введением 1 и 5 млн/мышь; # - достоверные различия между группами с введением 1 и 3 млн/мышь; @ - достоверные различия между группами с введением 3 и 5 млн/мышь.
3000 Ксенотрансплантат NW-Mel-38у мышей линии NRG
#
т 2500
2000 и
ло
1500
п о
ем1000
° 500 0-'
3 7 9 11 14 16 18 21 23 25 28 30 Сутки от инокуляции клеток 1 млн/мышь -»»-3 млн/мышь ^-5 млн/мышь
Рис. 5. Динамика роста ксенотрансплантатов М№-Ме1-38 (М ± Ж) у мышей линии N5.0. Дозы 1, 3 и 5 млн/мышь по 5 мышей в каждой группе
Ксенотрансплантат S6 у мышей линии NRG
Сутки от инокуляции клеток -ф. 1 млн/мышь -»«-3 млн/мышь 5 млн/мышь
Рис. 6. Динамика роста ксенотрансплантатов Бб (М ± Ж) у мышей линии N5.0. Дозы 1, 3 и 5 млн/мышь по 5 мышей в каждой группе
Для получения САЯ-Т клеток был выбран донор, у лимфоцитов которого по результатам предыдущих экспериментов была показана максимальная эффективность трансдукции и хорошая пролиферативная активность. Эффективность трансдукции составила 72 %. В качестве контроля были использованы активированные Т-лимфоциты, полученные в тех же экспериментальных условиях, но без трансдукции ретровирусным вектором. В первые 2 нед после введения клеток человека группа с внутриопухолевым введением анти-вБ2-
Ксенотрансплантат SK-MEL-37 у мышей NRG с экспериментальной терапией анти-GD2-CAR-T клетками
Сутки от инокуляции CAR-T клеток ■♦■ Интактные *анти-GD2-CAR-T в/в
* Контроль в/в *анти-GD2-CAR-T в/опух Контроль в/опух
Рис. 7. Развитие ксенотрансплантата БК-Ме1-37 в мышах линии ЫЯО после терапии анти-ОБ2-САЯ-Т-клетками. Мышам вводили опухолевые клетки подкожно в дозе 5 млн/мышь. После достижения размера опухоли 80-100 мм3 проводилось введение Т-клеток человека: в контрольных группах - активированных лимфоцитов, в экспериментальных группах -анти-ОБ2-САЯ-Т-клеток, в дозах 8 млн/мышь внутривенно или внутрь опухоли (п = 40 мышей)
* - достоверные различия между группой с внутриопухолевым введением анти-ОБ2-СЛЯ-Т-клеток и остальными группами.
CAR-T-клеток показала значимое снижение размера опухолевого узла по сравнению с группами контроля и интактной группой (рис. 7).
Обсуждение
Бурное развитие новых подходов в клеточной иммунотерапии привело к острой потребности в стандартизированных методах для оценки эффективности получаемых препаратов на этапе доклинических исследований [1]. Все разнообразные варианты культуральных экспериментов, включая 3Б-модели сфероидов, не могут обеспечить условия, которые создаются в живом модельном организме. С этой точки зрения поиск сочетаний линий мышей и линий клеток с определенным ландшафтом экспрессии опухоль-ассоциированных и опухоль-специфических белков имеет большое значение для формирования платформы для проведения доклинических исследований с возможностью стандартизации.
При сравнении ксенотрансплантатов у мышей с помощью клеточных опухолевых линий и биоптатов первичных опухолей человека можно заключить, что, несмотря на сохранность гистологической и клеточных структур первичной опухоли у экспериментальных животных данный вариант оптимален для изучения биологии опухоли, но не для скрининга эффективности различных вариантов препаратов, поскольку не может обеспечить длительной стабильности результатов [8].
Таким образом, подход с формированием у мышей опухолевого узла из клеточных линий представляется оптимальным для доклинических исследований. Однако в данном направлении остро встают вопросы подбора линии мышей и линии клеток с экспрессией специфических молекул. Иммунодефицитные мыши с возможностью переноса иммунокомпетентных клеток человека представляют собой эффективные модели для изучения иммунологии человека in vivo, а модели на основе ксенотрансплантатов являются важным инструментом оценки взаимодействия иммунных клеток с опухолевыми. В настоящее время для создания
моделей на основе ксенотрансплантатов используются несколько линий мышей с иммунодефицитом: голые мыши, мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), мыши SCID/Beige, мыши с диабетом без ожирения (NOD), мыши NOD/SCID, мыши NSG/ NRG. Линии мышей с мутациями IL2rg (такие как NRG, NSG) обладают сильно выраженным иммунодефицитом и в основном используются для доклинических исследований эффективности терапии онкологических заболеваний [9, 10]. Разные линии мышей имеют различную степень иммуносупрессии и, таким образом, у них наблюдается разная скорость приживления ксенотранс-плантатов, которая выше у мышей с более ослабленным иммунитетом (BRG/BRJ > NSG/NRG > NOD/SCID > SCID > nude) [8].
Мы также подтвердили, что мыши линии SCID имеют существенно меньший потенциал по приживлению клеточных линий человека, что объясняется более слабым подавлением собственного иммунитета. Линия мышей NRG в свою очередь показала высокую перспективность в качестве базы для проведения экспериментов по оценке эффективности клеточной терапии солидных опухолей.
Только для одной исследуемой линии S6 (меланома) было обнаружено отсутствие формирующихся опухолевых узлов при введении низкой дозы клеток опухоли, а при высоких дозах формирующийся опухолевый узел самоэлиминировался в течение 10-14 сут, что свидетельствует о высокой антигенности данных клеток.
Для двух клеточных линий (SK-MEL-37 и NW-MEL-38) линия мышей NRG показала эффективное приживление и рост опухолевого узла без признаков элиминации в течение 30 дней. Клетки линии SK-Mel-37 экспрессируют поверхностный антиген GD2 и внутриклеточные антигены NY-ESO-1, MAGE-A4, что было подтверждено с помощью моноклональных антител. Все эти антигены относятся к классу опухоль-ассоци-ированных и часто используются в качестве таргетных молекул при разработке препаратов для терапии онкологических заболеваний.
Дисиалоганглиозид GD2 экспрессируется на поверхности опухолевых клеток различного происхождения, включая меланому, нейробластому, глиобластому, рак молочной железы и ряд других [11]. NY-ESO-1 - это опухоль-ассоциированный белок, который ограниченно экспрессируется в нормальных тканях, но резко повышает уровень экспрессии в эпителиальных опухолях яичников и других солидных новообразованиях. Функция NY-ESO-1 до сих пор неизвестна, но предполагается, что он может участвовать в иммортализации, самообновлении, миграции [12]. Раково-тестикулярный антиген MAGE-A4 имеет высокий уровень экспрессии в метастазах солидных опухолей по сравнению с первичными опухолями, но отсутствует в большинстве нормальных тканей [13]. К настоящему времени для каждого описанного выше антигена активно изучаются специфические клеточные продукты: дендритные клетки, CAR-T-клетки, TCR-T-клетки.
В эксперименте по оценке цитотоксического эффекта на солидную опухоль использовались мыши NRG, клеточная линия SK-MEL-37 и CAR-T-клетки, специфичные к GD2. Ранее было показано, что CAR-T-клетки были эффективны для лечения гематологических злокачественных новообразований [14]. При этом данных по эффективности данной терапии при солидных опухолях к настоящему моменту недостаточно, однако такие подходы активно разрабатываются [15]. В данной работе в эксперименте на солидной опухоли, индуцированной клетками меланомы, было показано, что внутриопухолевое введение лимфоцитов, трансдуци-рованных ретровирусной конструкцией, кодирующей CAR-GD2, приводит к значимому снижению размеров опухолевого узла. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности модели, которая позволяет как обеспечить приживление и рост опухоли, так и функционирование трансплантированных лимфоцитов человека.
Дальнейшее развитие технологий модификации клеток на уровне генома позволяет все более тонко настраивать иммунокомпетентные клетки и обучать их корректному распознаванию опухолевых клеток. При этом следующим этапом идут доклинические исследования, на основании которых необходимо оценивать эффективность и безопасность применения клеточных продуктов при различных патологических состояниях. Таким образом, ксенотрансплантаты на экспериментальных животных представляют собой оптимальную модель как для первичного скрининга эффективности клеточных препаратов для иммунотерапии, так и для более глубокого изучения процессов противоопухолевого иммунного ответа.
Заключение
В результате исследования была проведена оценка эффективности формирования ксенотрансплантатов различных клеточных линий человека линиям мышей с иммунодефицитом. Показано, что линия мышей NRG по сравнению с линей мышей SCID обладает более высокой способностью по приживлению опухолевых клеточных линий, а сами клеточные линии отличаются по уровням экспрессии опухоль-ассоциированных белков и формируют ксенотрансплантат с разной эффективностью.
Оптимальным оказалось использование мышей линии NRG и клеточной линии SK-MEL-37 с высоким уровнем экспрессии антигенов GD2, NY-ESO-1 и MAGE-A4. Эксперимент по терапии полученной солидной опухоли с помощью анти-GD2-CAR-T-клеток показал эффективность в снижении размеров опухолевого узла при внутриопухолевом введении модифицированных клеток человека. Полученные результаты подтверждают эффективность использования ксено-трансплантатов в оценке эффективности противоопухолевого иммунного ответа модифицированных клеточных препаратов в условиях in vivo.
■ Литература
1. Терещенко В.П., Сенников С.В. Опухолевые ксенотранс-плантаты как модель для доклинических испытаний генетически модифицированных клеточных препаратов. Иммунология. 2021; 42 (6): 730-41. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-730-741
2. Zhu Y., Huang W., Wu Y., Jia L., Li Y., Chen R., Guo L., Chen Q. Establishment of a patient-derived xenotransplantation animal model for small cell lung cancer and drug resistance model. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2019; 22 (1): 6-14. Chinese. DOI: https://doi.org/10.3779/j. issn.1009-3419.2019.01.03
3. Mahmoudian R.A., Farshchian M., Abbaszadegan M.R. Genetically engineered mouse models of esophageal cancer. Exp. Cell Res. 2021; 406 (2): 112757. DOI: https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2021. 112757
4. Xing J., Ding P., Wan X., Xu G., Mao Y., Sang X., Du S., Yang H. Application and progress of cultured models of gallbladder carcinoma. J. Clin. Transl. Hepatol. 2023; 11 (3): 695-704. DOI: https://doi. org/10.14218/JCTH.2022.00351
5. Nunes A.S., Barros A.S., Costa E.C., Moreira A.F., Correia I.J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnol Bioeng. 2019; 116 (1): 206-26. DOI: https://doi.org/10.1002/bit.26845
6. Barroca C.B., Della Santa G., Suchecki D., Garcia-Cairasco N., Umeoka E.H. Challenges in the use of animal models and perspectives for a translational view of stress and psychopathologies. Neurosci. Biobehav. Rev. 2022; 40: 104771. DOI: https://doi.org/10.1016/j. neubiorev.2022.104771
7. Lallo A., Schenk M.W., Frese K.K., Blackhall F., Dive C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Transl. Lung Cancer Res. 2017; 6 (4): 397-408. DOI: https://doi. org/10.21037/tlcr. 2017.08.01
8. Liu Y., Wu W., Cai C., Zhang H., Shen H., Han Y. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct. Target Ther. 2023; 8 (1): 160. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41392-023-01419-2
9. Zeng M., Ruan Z., Tang J., Liu M., Hu C., Fan P., Dai X. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 2023; 23 (1): 120. DOI: https://doi.org/10.1186/s12935-023-02953-3
10. Neto I., Rocha J., Gaspar M.M., Reis C.P. Experimental murine models for colorectal cancer research. Cancers (Basel). 2023; 15 (9): 2570. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers15092570
11. Suzuki M., Cheung N.K. Disialoganglioside GD2 as a therapeutic target for human diseases. Expert Opin. Ther. Targets. 2015; 19 (3): 349-62. DOI: https://doi.org/10.1517/14728222.2014.986459
12. Giesen E., Jilaveanu L.B., Parisi F., Kluger Y., Camp R.L., Kluger H.M. NY-ESO-1 as a potential immunotherapeutic target in renal cell carcinoma. Oncotarget. 2014; 5 (14): 5209-17. DOI: https://doi. org/10.18632/oncotarget.2101
13. Ishihara M., Kageyama S., Miyahara Y., Ishikawa T., Ueda S., Soga N., Naota H., Mukai K., Harada N., Ikeda H., Shiku H. MAGE-A4, NY-ESO-1 and SAGE mRNA expression rates and co-expression relationships in solid tumours. BMC Cancer. 2020; 20 (1): 606. DOI: https://doi. org/10.1186/s12885-020-07098-4
14. Mancikova V., Smida M. Current State of CAR T-Cell Therapy in chronic lymphocytic leukemia. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22 (11): 5536. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22115536
15. Филиппова Ю.Г., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Фишер М.С., Курилин В.В., Пашкина Е.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотип и эффекторные функции GD2-специ-фичных CAR-T-клеток in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952- 2022-43-5-525-535
■ References
1. Tereshchenko V.P., Sennikov S.V. Tumor xenografts as a model for preclinical trials of genetically modified cell preparations. Immunologiya. 2021; 42 (6): 730-41. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-730-741 (in Russian)
2. Zhu Y., Huang W., Wu Y., Jia L., Li Y., Chen R., Guo L., Chen Q. Establishment of a patient-derived xenotransplantation animal model for small cell lung cancer and drug resistance model. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2019; 22 (1): 6-14. Chinese. DOI: https://doi.org/10.3779/j.issn.1009-3419.2019.01.03
3. Mahmoudian R.A., Farshchian M., Abbaszadegan M.R. Genetically engineered mouse models of esophageal cancer. Exp Cell Res. 2021; 406 (2): 112757. DOI: https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2021.112757
4. Xing J., Ding P., Wan X., Xu G., Mao Y., Sang X., Du S., Yang H. Application and progress of cultured models of gallbladder carcinoma. J Clin Transl Hepatol. 2023; 11 (3): 695-704. DOI: https://doi.org/10.14218/ JCTH.2022.00351
5. Nunes A.S., Barros A.S., Costa E.C., Moreira A.F., Correia I.J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnol Bioeng. 2019; 116 (1): 206-26. DOI: https://doi.org/10.1002/bit.26845
6. Barroca C.B., Della Santa G., Suchecki D., Garcia-Cairasco N., Umeoka E.H. Challenges in the use of animal models and perspectives for a translational view of stress and psychopathologies. Neurosci Biobehav Rev. 2022; 40: 104771. DOI: https://doi.org/10.1016/j.neubiorev.2022.104771
7. Lallo A., Schenk M.W., Frese K.K., Blackhall F., Dive C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Transl Lung Cancer Res. 2017; 6 (4): 397-408. DOI: https://doi. org/10.21037/tlcr. 2017.08.01
8. Liu Y., Wu W., Cai C., Zhang H., Shen H., Han Y. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal
Transduct Target Ther. 2023; 8 (1): 160. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41392-023-01419-2
9. Zeng M., Ruan Z., Tang J., Liu M., Hu C., Fan P., Dai X. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 2023; 23 (1): 120. DOI: https://doi.org/10.1186/s12935-023-02953-3
10. Neto I., Rocha J., Gaspar M.M., Reis C.P. Experimental murine models for colorectal cancer research. Cancers (Basel). 2023; 15 (9): 2570. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers15092570
11. Suzuki M., Cheung N.K. Disialoganglioside GD2 as a therapeutic target for human diseases. Expert Opin Ther Targets. 2015; 19 (3): 349-62. DOI: https://doi.org/10.1517/14728222.2014.986459
12. Giesen E., Jilaveanu L.B., Parisi F., Kluger Y., Camp R.L., Kluger H.M. NY-ESO-1 as a potential immunotherapeutic target in renal cell carcinoma. Oncotarget. 2014; 5 (14): 5209-17. DOI: https://doi. org/10.18632/oncotarget.2101
13. Ishihara M., Kageyama S., Miyahara Y., Ishikawa T., Ueda S., Soga N., Naota H., Mukai K., Harada N., Ikeda H., Shiku H. MAGE-A4, NY-ESO-1 and SAGE mRNA expression rates and co-expression relationships in solid tumours. BMC Cancer. 2020; 20 (1): 606. DOI: https://doi. org/10.1186/s12885-020-07098-4
14. Mancikova V., Smida M. Current State of CAR T-Cell Therapy in Chronic Lymphocytic Leukemia. Int J Mol Sci. 2021; 22 (11): 5536. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22115536
15. Filippova J.G., Kuznecova M.S., Shevchenko J.A., Tereshchen-ko V.P., Fisher M.S., Kurilin V.V., Pashkina E.A., Akahori Y., Shiku H., Sennikov S.V. Phenotype and effector functions of GD2-specific CAR-T cells in vitro. Immunologiya. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535 (in Russian)
Сведения об авторах
Лопатникова Юлия Анатольевна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0089-5054
Шевченко Юлия Александровна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0001-8773-0599
Филиппова Юлия Геннадьевна - лаборант-исследователь лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Фишер Марина Сергеевна - лаборант-исслед. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0001-6261-7557
Облеухова Ирина Александровна - канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2180-3243
Завьялов Евгений Леонидович - канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России; зав. Центра коллективного пользования «SPF-виварий» ФГБНУ ИЦиГ СО РАН Минобрнауки России; ст. науч. сотр. лаб. ядерной и инновационной медицины, Физический факультет ФГАОУ ВО НГУ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9412-3874
Соловьева Ольга Игоревна - лаборант-исслед. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России; мл. науч. сотр. Центра коллективного пользования «SPF-виварий» ФГБНУ ИЦиГ СО РАН Минобрнауки России; науч. сотр. лаб. ядерной и инновационной медицины, Физический факультет ФГАОУ ВО НГУ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0002-8218-2690
Authors' information
Julia A. Lopatnikova - PhD, Senior Researcher of the Lab. of Cellular Immunotherapy Technologies, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0089-5054
Julia A. Shevchenko - PhD, Senior Researcher of the Lab. of Cellular Immunotherapy Technologies, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0001-8773-0599
Julia G. Filippova - Research Assistant of the Lab. of Cellular Immunotherapy Technologies, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected]
Marina S. Fisher - Research Assistant of the Lab. of Cellular Immunotherapy Technologies, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0001-6261-7557
Irina A. Obleukhova - PhD, Researcher of the of the Lab. of Cellular Immunotherapy Technologies, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2180-3243
Evgenii L. Zavjalov - PhD, Leading Researcher of the Lab. of Cellular Immunotherapy Technologies, RIFCI of the MSHE of Russia; Head of the Animal Facility «SPF vivarium», ICG SD RAS of the MSHE of Russia; Senior Researcher of the Lab. of Nuclear and Innovative Medicine, Faculty of Physics, NSU of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9412-3874
Olga I. Solovjeva - Research Assistant of the Lab. of Cellular immunotherapy technologies, RIFCI of the MSHE of Russia; Junior Researcher of the Animal Facility SPF «vivarium», ICG SB RAS of the MSHE of Russia; Researcher of the Lab. of Nuclear and Innovative Medicine, Faculty of Physics, NSU of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0002-8218-2690
Разумов Иван Алексеевич - д-р биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. генетики лабораторных животных ФГБНУ ИЦиГ СО РАН Минобрнауки России; ст. науч. сотр. лаб. ядерной и инновационной медицины, Физический факультет ФГАОУ ВО НГУ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0002-6756-1457
Акахори Ясуши - PhD, старший исследователь отдела персонализированной иммунотерапии злокачественных новообразований Медицинского университета Мие, Мие, Япония
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-0362-755X
Шику Хироши - PhD, глава отдела персонализированной иммунотерапии злокачественных новообразований Медицинского университета Мие, Мие, Япония E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0002-0362-755X
Сенников Сергей Витальевич - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Ivan A. Razumov - Dr.Sci., PhD, Senior Researcher of the Laboratory Animal Genetics, ICG SB RAS of the MSHE of Russia; Senior Researcher of the Lab. of Nuclear and Innovative Medicine, Faculty of Physics, NSU of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0002-6756-1457
Yasushi Akahori - PhD, Senior Researcher of the Dept. of Personalized Cancer Immunotherapy, Mie University Graduate School of Medicine, Mie, Japan E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0002-4053-909X
Hiroshi Shiku - PhD, Head of the Dept. of Personalized Cancer Immunotherapy, Mie University Graduate School of Medicine, Mie, Japan E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0002-0362-755X
Sergey V. Sennikov - MD, PhD, Prof., Head of the Lab. of Cellular Immunotherapy Technologies, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0002-7366-7768
