CC BY
0
© Коллектив авторов, 2024
Лопатникова Ю.А.1, Шевченко Ю.А.1, Филиппова Ю.Г.1, Фишер М.С.1, Облеухова И.А.1, Голикова Е.А.2, Корнеев А.А.2, Шаньгина П.А.1, Алрхмун С.1, Перик-Заводский Р.Ю.1, Савостьянова Т.А.1, Курилин В.В.1, Сенников С.В.1
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630099, г. Новосибирск, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
Цель исследования - описание различных подходов по прямому определению анти- https://orcid.org/0000-0002-7366-7768 ген-специфических клеток в практике разработок клеточных технологий.
Материал и методы. В качестве материала для исследований была использована периферическая кровь условно здоровых доноров. Для увеличения доли антиген-специфических клеток использовали разработанные в лаборатории протоколы стимуляции и клональной экспансии с помощью дендритных клеток. В качестве реагентов для определения антиген-специфических клеток использовали: тетрамеры для идентификации рецепторов, распознающих эпитоп КУ-ЕБ0-1; стрептамеры с пептидом белка ИЕЯ2; мультимеры, сделанные на основе Б1ех-Т мономеров, для рецепторов, распознающих эпитопы МАвЕ-АЗ; декстрамеры для определения клеток с рецепторами, распознающими эпитопы белков Е6 и Е7 вируса папилломы человека. Все реагенты распознают эпитопы антигенов в комплексе с ИЬА-А*0201.
Результаты. Проведена оценка содержания антиген-специфических Т-лимфоцитов с использованием реагентов, полученных по четырем технологиям. Тетраметры с эпи-топом №У-Е80-1 позволили эффективно оценить уровень экспрессии специфического рецептора после ретровирусной трансдукции мононуклеарных клеток. Для оценки биологических эффектов цитотоксических лимфоцитов использовали технологию стреп-тамеров с эпитопом белка ИЕИ2, что позволило не только анализировать антиген-специфические клетки, но и отсортировать чистую популяцию ИЕЯ-2 специфических Т-лимфоцитов, которая показала цитотоксический ответ против клеток-мишеней. Технология Б1ех-Т позволила получить мультимеры, конъюгированные с нужными пептидами, и подтвердила их эффективность для анализа и сортировки цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам белка МАвЕ-АЗ. Для использования в анализе транс-криптома единичных клеток использовали технологию декстрамеров как молекул с эпи-топами белков Е6 и Е7 ВПЧ, позволившую оценить клональность рецепторов в культуре с индукцией клональной экспансии.
Заключение. Мультимерное окрашивание - важный и ценный инструмент как для изучения формирования клеточного иммунного ответа, так и для разработки современных протоколов клеточной иммунотерапии онкологических, вирусных и аутоиммунных заболеваний, а также для оценки эффективности проводимой терапии. Существование ряда технологий позволяет выбрать необходимый инструмент для каждой задачи исследования.
Технологии оценки антиген-специфических СБ8+-лимфоцитов на основе мультимеров
Резюме
Введение. Разработка и использование подходов для анализа и выделения антиген-специфических клеток - это необходимый шаг к более глубокому пониманию механизмов иммунного ответа. Также он нужен для разработки новых терапевтических стратегий. На данный момент существует несколько подходов для определения и сортировки антиген-специфических клеток, которые имеют свои преимущества и недостатки, что позволяет подобрать оптимальный вариант для каждой задачи. Основной принцип всех методов основан на использовании лиганда Т-клеточного рецептора, который представляет собой комплекс МНС/пептид.
ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Для корреспонденции
Сенников Сергей Витальевич -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии
Ключевые слова: Т-лимфоциты; МНС; антиген-специфические клетки; Т-клеточный рецептор; мультимеры; тетрамеры
Статья получена 16.10.2024. Принята в печать 21.11.2024.
Для цитирования: Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю. А., Филиппова Ю.Г., Фишер М.С., Облеухова И. А., Голи -кова Е.А., Корнеев А. А., Шаньгина П. А., Алрхмун С., Перик-Заводский Р.Ю., Савостьянова Т. А., Курилин В.В., Сенников С.В. Технологии оценки антиген-специфических СБ8+-лимфоцитов на основе мультимеров. Иммунология. 2024; 45 (6): 777-791. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-777-791
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 21-65-00004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Лопатникова Ю.А., Сенников С.В.; работа по ретровирус-ной трансдукции - Шевченко Ю.А., Филиппова Ю.Г.; работа по технологии стрептамеров - Лопатникова Ю.А., Голикова Е.А.; работа по технологии Flex-T - Фишер М.С., Облеухова И.А.; Курилин В.В., Шаньгина П.А., работа по технологии декстрамеров - Алрхмун С., Корнеев А.А., Савостьянова Т.А., Перик-Заводский Р.Ю.; статистическая обработка данных - Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю.А.; написание текста - Лопатникова Ю.А., Сенников С.В.; редактирование текста - Филиппова Ю.Г., Облеухова И. А.; утверждение окончательного варианта статьи - Сенников С.В.; ответственность за целостность всех частей статьи - Лопатникова Ю.А.
Lopatnikova J.A.1, Shevchenko J.A.1, Filippova J.G.1, Fisher M.S.1, Obleuhova I.A.1, Golikova E.A.2, Korneev A.A.2, Shangina P.A.1, Alrhmun S.1, Perik-Zavodskii R.Yu.1, Savostyanova T.A.1, Kurilin V.V.1, Sennikov S.V.1
Multimer-based technologies for the assessment of antigen-specific CD8+-lymphocytes
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 630099, Novosibirsk, Russian Federation
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. The development and use of approaches for the analysis and isolation of antigen-specific cells is a necessary step towards a deeper understanding of the mechanisms of the immune response, and is also necessary for the development of new therapeutic strategies. At the moment, there are several approaches to identifying and sorting antigen-specific cells, which have their advantages and disadvantages, which allows you to choose the most optimal option for each task. The main principle of all methods is based on the use of a T-cell receptor ligand, which is an MHC/peptide complex.
The aim of the study is to describe various technologies for the direct detection of antigen-specific cells in the practice of developing cell technologies.
Material and methods. Peripheral blood of conditionally healthy donors was used as the material for the studies. To increase the proportion of antigen-specific cells, protocols for stimulation and clonal expansion using dendritic cells developed in the laboratory were used. The following reagents were used to detect antigen-specific cells: tetramers to identify receptors that recognize the NY-ESO-1 epitope; streptamers with the HER2 protein peptide; multimers based on Flex-T monomers for receptors recognizing MAGE-A3 epitopes; dextramers to detect cells with receptors that recognize epitopes of the E6 and E7 proteins of the human papillomavirus. All reagents recognize epitopes of antigens in complex with HLA-A*0201.
Results. The content of antigen-specific T-lymphocytes was assessed using reagents obtained by 4 technologies. Tetrameters with the NY-ESO-1 epitope allowed us to effectively assess the level of expression of the specific receptor after retroviral transduction of mononuclear cells. To assess the biological effects of cytotoxic lymphocytes, we used the streptamer technology with the HER2 protein epitope, which allowed us not only to analyze antigen-specific cells, but also to sort the pure population of HER-2 specific T-lymphocytes, which showed a cytotoxic response against target cells. The Flex-T technology allowed us to obtain multimers conjugated with the desired peptides and confirmed their effectiveness for the analysis and sorting of cytotoxic T-lymphocytes specific to the epitopes of the MAGE-A3 protein. For
For correspondence
Sergey V. Sennikov -MD, PhD, Professor, Head of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
use in the analysis of the transcriptome of single cells, the technology of Dextramers was used as molecules with epitopes of the E6 and E7 proteins of HPV, which made it possible to assess the clonality of receptors in culture with the induction of clonal expansion.
Conclusion. Multimeric staining is an important and valuable tool both for studying the formation of a cellular immune response and for the development of modern protocols for cellular immunotherapy of oncological, viral and autoimmune diseases, as well as for assessing the effectiveness of the therapy. The existence of a number of technologies allows you to choose the necessary tool for each research task.
Keywords: T-lymphocytes; MHC; antigen-specific cells; T-cell receptor; multimers; tetramers
Received 16.10.2024. Accepted 21.11.2024.
For citation: Lopatnikova J.A., Shevchenko J.A., Filippova J.G., Fisher M.S., Obleukhova I.A., Golikova E.A., Korneev A.A., Shangina P.A., Alrhmun S., Perik-Zavodsky R.Yu., Savostyanova T.A., Kurilin V.V., Sennikov S.V. Multimer-based technologies for the assessment of antigen-specific CD8+-lymphocytes. Immunologiya. 2024; 45 (6): 777-91. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-777-791 (in Russian)
Funding. The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation (project No. 21-65-00004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Study concept and design - Lopatnikova J.A., Sennikov S.V.; work on retroviral transduction - Shevchenko J.A., Filippova J.G.; work on streptamer technology - Lopatnikova J.A., Golikova E.A.; work on Flex-T technology - Fisher M.S., Obleukhova I.A., Kurilin V.V., Shangina P.A.; work on dextramer technology - Alrhmun S., Korneev A.A., Savostyanova T.A., Perik-Zavodskiy R.Yu.; statistical data processing - Lopatnikova J.A., Shevchenko J.A.; writing the text - Lopatnikova J.A., Sennikov S.V.; editing the text - Filippova J.G., Obleukhova I.A.; approval of the final version of the article - Sennikov S.V.; responsibility for the integrity of all parts of the article - Lopatnikova J.A.
Введение
Антиген-специфические Т-лимфоциты играют ключевую роль в формировании адаптивного иммунного ответа. Эти клетки способны распознавать специфические структуры благодаря взаимодействию их анти-ген-распознающих рецепторов с эпитопами антигенов, представленных в комплексе МНС. Ассортимент комбинаций генов ТСЯ дает широчайший спектр популяций Т-клеток и каждая обладает собственным уровнем аффинности к определенным пептидам [1]. Распознавание чужеродного пептида индуцирует активацию Т-кле-ток и в зависимости от коэкспрессии активационных и супрессорных молекул, цитокинов в окружающем межклеточном пространстве и межклеточных контактов позволяет Т-клеткам запускать и координировать антиген-специфический иммунный ответ.
Разработка и использование подходов для анализа и выделения антиген-специфических клеток - это необходимый шаг к более глубокому пониманию механизмов иммунного ответа, который используется на этапах разработки новых терапевтических стратегий [2], а также применяется для анализа эффективности иммунотерапии [3, 4]. Новейшие достижения в области технологий, такие как секвенирование единичных клеток и СЫЗРЯ-геномное редактирование, предлагают возможность проведения глубоких профилирований антиген-специфических ответов на уровне отдельных клеток, существенно увеличивая объем доступной информации по Т-лимфоцитам, способным распознавать эпитопы мишеней [5].
Современные подходы в клеточных технологиях направлены на запуск высокоспецифического иммун-
ного ответа; они активно используют потенциал эффективного распознавания опухолевых и вирусных эпитопов с помощью Т-клеточных рецепторов. Для разработок новых протоколов индукции иммунного ответа необходимо использовать методы, позволяющие оценивать эффективность формирования клонов антиген-специфических клеток на стадиях получения клеточного препарата для иммунотерапии, и соответственно, относительное содержание и функциональное состояние антиген-специфических клеток на этапе оценки эффективности проводимой терапии [6].
Частота встречаемости Т-клеток, которые реагируют на конкретный лиганд - пептид, представленный в контексте МНС, крайне низка, особенно в наивном репертуаре [7, 8]. Поэтому все существующие протоколы по работе с антиген-специфическими клетками дополнительно включают стадию магнитной сепарации. На данный момент существует несколько подходов для определения и сортировки антиген-специфических клеток. Они имеют свои преимущества и недостатки, что позволяет подобрать оптимальный вариант для каждой задачи. Основной принцип всех методов основан на использовании лиганда Т-клеточного рецептора, который представляет собой мономер, состоящий из одной молекулы МНС и пептида. Дальнейшие модификации позволяют получать реагенты для специфического и эффективного анализа клеток. Выбор метода идентификации и/или сортировки антиген-специфических клеток должен основываться на таких параметрах, как уровень специфичности, необходимость и особенности дальнейших манипуляций с клетками, а также на характеристиках целевого пептида.
Таким образом, необходимость активного использования подходов для определения и сортировки антиген-специфических клеток становится все более очевидной в свете множества вызовов, с которыми сталкиваются современная наука и медицина. Понимание роли и механизмов действия этих клеток при различных иммунопатологических состояниях, а также использование эффективных методов их обнаружения и анализа имеют критическое значение для улучшения диагностики и терапии онкологических, инфекционных и аутоиммунных заболеваний.
Цель данного исследования - описание различных подходов по прямому определению антиген-специфических клеток в практике разработок клеточных технологий.
Материал и методы
Материал для исследования. Получение периферической крови от здоровых взрослых доноров одобрено локальным этическим комитетом НИИФКИ Минобр-науки России (протокол № 139 от 30.05.2022). Образцы венозной крови условно здоровых доноров забирали в вакуумные пробирки c литий-гепарином. Мононук-леарные клетки периферической крови (МНПК) выделяли по стандартной методике на градиенте плотности фиколла-урографина. Предварительно был проведен подбор доноров по экспрессии аллеля HLA-A*02 методом проточной цитометрии с помощью антител PE antihuman HLA-A2 Antibody (Biolegend, США).
Ретровирусная трансдукция и анализ с помощью тетрамеров. Получение TCR-T-клеток, специфичных к антигену NY-ESO-1, из лимфоцитов условно здоровых доноров проводили с помощью трансдук-ции ретровирусными векторами, как описано в статье М.С. Кузнецовой и соавт. [9]. Оценку эффективности трансдукции проводили через 4 дня с помощью тетра-меров, синтезированных научной группой профессора Х. Шику на базе Высшей школы медицины Университета Мие (Япония). Окраска тетрамерами включала инкубацию 1 млн клеток с 0,5 мкл биотинилированных тетрамеров 20 мин, последующие 2 отмывки с центрифугированием в PBS и окрашивание стрептавиди-ном, меченным РЕ (Biolegend, США), в течение 20 мин 0,5 мкл/1млн кл.
Получение клеток, специфических к антигену HER2, и анализ антиген-специфических клеток с помощью технологии стрептамеров. Для индукции использовали дендритные клетки (ДК), индуцированные из МНПК. Протокол индукции, сортировки и метод оценки цитотоксичности описаны в статье М. Кузнецовой и соавт. [10]. Для нагрузки ДК использовали ДНК-конструкции pMax-2epitope (разработаны и предоставлены канд. биол. наук А.З. Максютовым), кодирующие эпитопы E75 (KIFGSLAFL, далее KIF) и E88 (RLLQETELV, далее RLL) антигена HER2/neu. Для выявления и сортировки популяции HER2-специ-фичных Т-лимфоцитов использовали мономеры (МНС I-Strep HLA-A*0201 KIFGSLAFL или МНС I-Strep
HLA-A*0201 RLLQETELV), Stop-tartin РЕ или Strep-tadtin APQ IS buffer (IBA, Германия) согласно инструкции производителя. Для оценки эффективности замены UV-пептида использовали набор LEGEND MAX™ Flex-T™ Human Class I Peptide Exchange ELISA Kit (Biolegend, США).
Индукция клональной экспансии клеток, специфичных к эпитопам белка MAGE-A3, и анализ антиген-специфических клеток с помощью технологии Flex-T. Индукцию клональной экспансии выполняли с использованием ДК, нагруженных пептидом белка MAGE-A3, по протоколу, который был разработан в лаборатории молекулярной иммунологии [заявка на патент «Способ получения человеческого Т-кле-точного рецептора, специфичного к эпитопу i i 2-i 20 (KVAELVHFL) рецептора M AGE-A3» № 2024113617 от 21.05.2024]. Для окрашивания клеток использовали реагенты FlexT HLA-A*0201 (Biolegend, США), подготовленные по протоколу производителя. В качестве пептидов для нагрузки ДК и получения мультимеров использовали пептиды белка MAGE-A3 [p271-279 FLW-GPRALV (далее FLW), p. 112-120 KVAELVHFL (далее KVA)], синтезированные на заказ фирмой «Иммуно-текс» (Россия). Оценку эффективности пептидного обмена проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью набора, предлагаемого производителем (Biolegend, США). Далее полученные реагенты метили двумя разными флуорохромами PE и APC для снижения уровня неспецифичности при анализе и сортировке.
Определение антиген-специфических клеток, распознающих эпитопы белков Е6 и Е7 ВПЧ, при анализе транскриптома единичных клеток. В качестве источника клеток использовали культуру, в которой проводили индукцию клональной экспансии цитотокси-ческих Т-лимфоцитов, распознающих пептиды белков вируса папилломы человека (ВПЧ) E6 и Е7, по протоколу, представленному выше. Для нагрузки ДК использовали синтезированные пептиды E6 (TIHDIILECV) и Е7 (YMLDLQPET) («Иммунотекс», Россия). Для анализа транскриптома и оценки последовательности Т-клеточного рецептора использовали реагент Dextramer (Immudex, Швеция). Окрашивание клеток проводили согласно инструкции производителя, перед загрузкой клеток выполняли этап обогащения с помощью магнитной сортировки MojoSort™ Human anti-PE Nanobeads (BioLegend, США).
Методы статистической обработки. Статистическую обработку и визуализацию данных проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 10.1.2 (GraphPad Software, Boston, Massachusetts, США). Данные выборок были представлены в виде медианы и межквартильного интервала. Для проверки гипотезы о нормальном распределении выборки использовали критерий Шапиро-Уилка. В анализе применяли стандартный двухфакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Тьюки (p < 0,05; 0,01; 0,001).
Шаньгина П.А., Алрхмун С., Перик-Заводский Р.Ю., Савостьянова Т.А., Курилин В.В., Сенников С.В. 781 Технологии оценки антиген-специфических CD8+-лимфоцитов на основе мультимеров
Э
[Ungated] FSC-A/SSC-A
1000 -
900-
800-
700-
600-
<
м 500-
400-
300
200
100
Лимфоциты
%
[Лимфоциты] Тетрамер anti-NY-ESO-1 PE-A
160-
140-
120
100
О 80
60
40
20
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 FSC-A
affra-NY-ESO-1-KaeTra
10
102 103 Тетрамер anti-NY-ESO-1 PE-A
103)
104
Э
C
300 i 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 -0
[Лимфоциты] Тетрамер anti-NY-ESO-1 PE-A
10
10
103
104
Тетрамер anti-NY-ESO-1 PE-A
Рис. 1. Гейтирование клеточной культуры при анализе эффективности трансдукции
А - определение гейта популяции лимфоцитов на дот-плоте прямого и бокового светорассеивания; Б - определение гейта тетрамер-окрашенных клеток в пробе без добавления ретровирусов; В - определение гейта тетрамер-окрашенных клеток в пробе после вирусной трансдукции.
Результаты
Технология тетрамеров
В нашем эксперименте тестировали определение №У-Е80-1-специфических клеток после трансдукции ретровирусным вектором предстимулированной культуры МНПК. Было показано, что данная технология позволяет эффективно оценивать содержание клеток, несущих рецептор, распознающий эпитоп белка ЫУ-ЕБ0-1 (рис. 1)
Кроме того, окрашивание тетраметрами в дальнейшем использовали для многоцветного фенотипирова-ния антиген-специфических Т-лимфоцитов [9].
Технология стрептамеров
Для эффективной оценки биологической активности антиген-специфических клеток производителем IBA (Германия) разработана технология, позволяющая удалять окрашивающий комплекс. В нашей работе с помощью ДК, трансфецированных плазмидой, кодирующей пептиды белка HER2, выполнена стимуляция антиген-специфических клеток. С использованием технологии стрептамеров клетки анализировали для подбора условий культивирования и стимуляции (рис. 2)
Для выделения фракции HER2-специфичных Т-лим-фоцитов из совместной культуры активированных
0
0
0,8
0,7
0,6
и 0,5 я
0,4 0,3
сч 0,2
-х i
0,1
0,0
KIF-специфические ЦТЛ RLL-специфические ЦТЛ □ МНПК + ДК(р5) ■ МНПК + ДК(HER2)
Рис. 2. Относительное содержание НЕЮ-специфичных лимфоцитов в совместных культурах МНПК и ДК (n = 12) Данные представлены в виде медианы, межквартильного интервала, минимума и максимума. Стрелками обозначены статистически значимые различия; * - p = 0,001; ** -p < 0,0001.
МНПК и ДК, нагруженных опухолевым антигеном, использовали метод сортировки на магнитных колонках. Среднее количество клеток в отсортированной фракции антиген-специфических лимфоцитов составляло 0,5-1 • 105, а последующее культивирование со стимуляцией пролиферации позволило увеличить их количество до 0,5-1 • 106 клеток. Оценка эффективности сортировки с помощью окраски CD8 показала в среднем 90,2 % в культуре KIF-специфичных Т-лимфоцитов и 71,5 % в культуре RLL-специфичных Т-лимфоцитов. Полученные клетки использовали для экспериментов по оценке цитотоксичности против опухолевой клеточной линии MCF-7 методом проточной цитометрии по проценту PI-позитивных CFSE-меченных опухолевых клеток (рис. 3).
Результаты эксперимента показали, что относительное содержание поврежденных опухолевых клеток в опытных пробах, состоящих из HER^-специфичных Т-лимфоцитов и клеток линии MCF-7, в среднем составило 60,2 % для RLL-специфических Т-лимфоцитов и 65,7 % для KIF-специфических Т-лимфоцитов. Таким образом, в данном эксперименте подтверждено наличие цитотоксических свойств у фракций Т-лимфоцитов, полученных с помощью технологии стрептамеров.
Технология Flex-T
Технология Flex-T от компании Biolegend (США) позволяет получать окрашивающие реагенты для целей исследований в лабораторных условиях. Единственным требованием является подбор эффективного пептида. В качестве исходного материала производитель поставляет мономеры HLA-A*0201, конъюгированные с UV-лабильным пептидом. В нашей работе данная технология была использована для оценки эффективности
при подборе условий для клональной экспансии клеток, специфических к эпитопам белка MAGE-A3 (p271-279 FLWGPRALV и p.112-120 KVAELVHFL).
Оценка эффективности замены UV-чувствительного пептида показала более 80 % эффективности (рис. 4). Предполагается, что в случае неэффективного разрушения UV-лабильного пептида или при некорректном подборе целевого пептида уровень замены будет ниже 30 %.
Полученные реагенты в дальнейшем использовали для оптимизации условий клональной экспансии антиген-специфических клеток с помощью ДК, нагруженных пептидами. После подбора всех условий с помощью технологии Flex-T было показано увеличение содержания MAGE-АЗ-специфических клеток с 0,003 до 3-9 % (рис. 5). По рекомендации производителя получали и использовали одновременно реагенты, конъюгированные с PE и АРС, для снижения эффекта неспецифического связывания.
Полученные результаты позволили провести эксперимент по выделению антиген-специфических клеток с помощью сортировки на проточном цитофлуоримет-ре - сортировщике клеток FACS Aria I. После подбора условий сортировки удалось получить культуру клеток с чистотой 67-88 %.
Таким образом, технология Flex-T подтвердила свою эффективность в качестве метода анализа и сортировки антиген-специфических клеток.
Декстрамеры
Поскольку антиген-специфические клетки являются наиболее эффективными факторами формирования иммунного ответа, представляется крайне актуальным изучение транскриптома и протеома данных клеток. В качестве источника для загрузки необходимо использовать либо чистую фракцию антиген-специфических клеток, либо определять нужные клетки в процессе анализа. Производителем Immudex (Швеция) был разработан реагент DCode Dextramer (декстрамер), совместимый с системой BD Rhapsody, для анализа отдельных клеток, представляющий собой мультимерный МНС-пептидный комплекс, эффективно связывающий Т-кле-точный рецептор нужной специфичности. Данный протокол был использован для определения клональности (числа клонов) клеток с определенной последовательностью рецептора, распознающего пептиды белков Е6 и Е7 ВПЧ, после протокола клональной экспансии клеток здоровых доноров. Сам реагент DCode Dextramer возможно использовать и для анализа клеток в проточной цитометрии, поскольку он конъюгирован с флуоро-хромом РЕ (рис. 6).
Также данный реагент был использован для предварительного обогащения фракции клеток с помощью магнитной сепарации с бусами anti-PE для последующей загрузки в BD Rhapsody для анализа транскрип-тома единичных клеток. После секвенирования полученных библиотек на основании идентификации клеток
А*
Э
Рч
105
104
103
102
-102 -304
м
-304 -102 0 102
Р1 + MCF-7 сеШ
.\ V®
К'" '
»-
10
104
CFSE FITC-A
105
Population % РагеП
| Р1 + MCF-7 cells 46,0
Э
105
104
Рч
Е 103
,2 -
10
0 -102
-304
Р1 + MCF-7 се1к
. ' ' ! 'А' » ' •ч/: ч, ? ' • . .
.-■'■чг,'.'- "
, " ' 1
м 2 2
-304 -102 0 102
10
104
105
CFSE FITC-A
Popu1ation % РагеП
| Р1 + MCF-7 ce11s 19,0
MCF-A7
м 2 2
-304 -102 0 102
10
104
105
CFSE FITC-A
Рис. 3. Гейтирование при анализе цитотоксичности НЖ.-2-специфических Т-лимфоцитов против клеточной линии MCF-7
А - точечная диаграмма событий гейта МСЕ-7 опытной пробы (совместная культура клеток С¥БЕ+-МС¥-7 и ИЕК2-специфичных ЦТЛ); Б - точечная диаграмма событий гейта МС¥-7 пробы-контроля спонтанной гибели клеток-мишеней (культура клеток С¥БЕ+-МС¥-7); В - точечная диаграмма событий гейта МС¥-7 Р1-негативного контроля (культура клеток С¥БЕ+-МС¥-7, немеченная Р1).
с помощью DCode Dextramer была определена частота встречаемости Т-клеточных рецепторов разных последовательностей (рис. 7).
Таким образом, технология DCode Dextramer позволяет проводить анализ, сортировку и идентификацию клеток с нужными рецепторами при анализе транскриптома.
Обсуждение
Содержание Т-клеток, распознающих определенную последовательность чужеродного белка, чрезвычайно низкое, особенно в пределах наивного репертуара (диапазон 0,2-60 клеток/106 Т-клеток), что является следствием огромного разнообразия репертуара Т-клеток по отношению к широкому спектру разнообразных антигенов, с которыми может столкнуться хозяин [1]. В настоящее время мониторинг антиген-специфических Т-лимфоцитов является необходимым методом для изучения специфических ответов клеток, разработок новых подходов в иммунотерапии и оценках эффектив-
120
100
80
60
40
20
FLW
КУА м/м без пептида м/м без ЦУ
Рис. 4. Иммуноферментный анализ эффективности замены иУ-лабильного пептида, конъюгированного с мономером, на целевые пептиды FLW и КУА
Для реагента «м/м без пептида» - к мономеру не добавляли целевой пептид при инкубации под ультрафиолетом; для реагента «м/м без и¥» - исходный мономер не подвергался воздействию ультрафиолета.
0
-3 04 -102 0 102
10
APC + РЕ
3,6 %
к*.
РЕ+
10'
105
Э
105
104
м о
103
н
X
102
АРС+
-102 " -304-
м 2 2
-304 -102 0 102
10
APC + РЕ
8,7 %
р? Км; V,: РЕ+
10
105
Е1ех-Т anti-MAGE-A3 РЕ-А
Е1ех-Т anti-MAGE-A3 РЕ-А
0
Рис. 5. Типичные диаграмма: флуоресценции при оценке содержания антиген-специфических Т-клеток, распознающих эпитоп КУЛ белка МЛОЕ-Л3
А и Б - результаты анализов образцов от двух доноров.
ности данных протоколов у больных. Существует два основных направления, связанные с изучением антиген-специфических клеток. Первое из них включает определение антиген-специфических клеток с помощью биологических тестов (ЕЬКро^ продукцию цитокинов и пролиферация), не зависит от рестрикции по МНС и позволяет оценивать тип функционального ответа [11]. Однако при этом невозможно провести многоцветное фенотипирование и выделить целевую популяцию. Второе направление - это методы по определению антиген-специфических клеток с помощью прямого анализа Т-клеточных рецепторов. Они позволяют провести анализ и сортировку пептид-специфических клеток с оценкой фенотипа, продукции цитокинов, клеточного цикла
э
о250
200
150
100
50
102
103
104
105
и т.п. К недостаткам данного направления можно отнести отсутствие прямой ассоциации с функциональной активностью клеток и ограничение по МНС.
Достоинства и недостатки четырех рассматриваемых модификаций мультимеров приведены в табл. Технология тетрамеров - это модификация в виде объединения четырех мономеров ИЬЛ-Л*0201, связанных с конкретным пептидом, в один комплекс на молекуле стрептави-дина. Она имеет хорошую стабильность по сравнению с мономерами и димерами, которые спонтанно диссоциируют от рецептора [12, 13]. При связывании с клетками тетрамеры позволяют проводить дополнительные исследования, включая внутриклеточное окрашивание, клеточный цикл, продукцию цитокинов и т.д. Одна из основных
о 250-
200
150
100
50
1,8 %
102
103
104
105
Бехйатег ап1л-Е6 РЕ^
Бехйатег ап1:>Е7 PE-A
Рис. 6. Типичные диаграммы флуоресценции при оценке содержания антиген-специфических Т-клеток, распознающих эпитопы белков Е6 (А) и Е7 (Б) вируса папилломы человека
80-
60 -
40 -
20 -
25 1
20-
15 -
10 -
5 -
^ипгпипоо^^оог^ооо^^^^гпоо^^^^ипгпооо^г^оипгпг^'-о'-оооип-^г^ипг-г-оочооо^о^оогпг-г^
Рис. 7. Распределение клонов последовательностей рецепторов, распознающих пептиды белков Е6 и Е7 вируса папилломы человека
По оси Х - кодовые обозначения последовательностей; по оси У - число клеток с определенной последовательностью.
сложностей заключается в ограничении выбора пептидов из спектра, предлагаемого производителем. В нашей работе технология тетрамеров позволила эффективно оценивать количество клеток с целевым рецептором после ретровирусной трансдукции. В дальнейшем эти клетки использовали для многоцветного фенотипирова-ния и оценки цитотоксичности против клеточной линии.
Однако в клинической практике для получения препаративных количеств СБ8+-Т-лимфоцитов, пригодных к введению пациенту, использование технологии тетрамеров невозможно, поскольку недопустимо введение в организм пациента молекул стрептавидина и его производных [14], а также поскольку показана высокая степень апоптоза Т-клеток, выделенных по технологии мультимеров, который происходит из-за длительной активации Т-клеточного рецептора тетрамерами [15].
В 2007 г. компанией IBA (Германия) была разработана технология стрептамеров, позволяющая обратимо окрашивать антиген-специфические Т-клетки [16, 17] за счет диссоциации окрашивающего комплекса при добавлении
в культуру ^биотина. В научной литературе описаны эксперименты и клинические случаи эффективного использования технологии стрептамеров для выделения фракции антиген-специфических клеток [16, 18]. В нашей работе технология стрептамеров позволила эффективно выделить ИБК2-специфические Т-лимфоциты из стимулированной культуры МНПК и ДК с доказанной сохранностью цитотоксической эффективности в отношении клеток-мишеней. Кроме того, окрашивающие реагенты по данной технологии также могут быть использованы для фенотипирования клеток, несущих рецепторы, распознающие эпитопы опухоль-ассоциированного белка.
В связи с активным развитием новых методов в иммунологии происходит активный поиск новых молекулярных мишеней для терапии рака, инфекционных, а также аутоиммунных заболеваний [19]. Запросы исследователей существенно выросли, появилась необходимость в быстром и эффективном создании необходимых мультимеров под задачи исследования прямо в лаборатории [20, 21].
0
0
Сравнение мультимеров
Свойства Тетрамеры Стрептамеры Flex-T Декстрамеры
Состав 4 комплекса пептид-мономер, связанные со стрептавидином через биотин 4 комплекса пептид-мономер, связанные с помощью 81хер-Та сЦп комплекса Мономер, конъюги-рованный с иУ-лабильным пептидом Десять комплексов пептид-мономер на декстрановой основе
Возможность удале -ния окрашивающего комплекса Отсутствует Обратимо при добавлении конкурирующей молекулы биотина Отсутствует Отсутствует
Возможность получения нужного комплекса в лабораторных условиях Отсутствует Отсутствует Возможно получить специфические реагенты к синтезированному пептиду Отсутствует
Возможность использования в анализе транскриптома Отсутствует Отсутствует Отсутствует Возможно, за счет наличия баркодиро-вания
Компания Вю^еМ (США) предложила в качестве решения данной проблемы технологию Б1ех-Т, которая включает мономеры МНС наиболее часто встречающихся генотипов, конъюгированные с иУ-лабильным пептидом. Таким образом, исследователям достаточно иметь необходимые синтезированные пептиды для получения стабильных и воспроизводимых результатов по анализу и /или сортировке антиген-специфических клеток. Использование по рекомендации производителя двойного окрашивания разными флуорохромами позволяет повысить чувствительность метода. Одним из вариантов использования данной технологии может быть скрининг пептидов и анализ функциональной активности полученных клеток [22]. В нашей работе данная технология показала хорошую эффективность в отработке протокола клональной экспансии клеток с рецепторами, распознающими пептиды белка МЛвЕ-Л3. Простота получения и использования реагентов позволяет оперативно проверять клеточный протокол на всех стадиях, а двойное окрашивание позволило провести эффективную сортировку с помощью проточного цитофлуориметра-сортировщика клеток.
Еще один метод идентификации антиген-специфических Т-клеток включает использование декстраме-ров - 10 рМИС-мономеров с присоединенной линейной цепью декстрана, что повышает сродство к связыванию. Декстрамеры более эффективны, чем тетра-меры, в обнаружении низкоаффинных Т-клеток. Их использовали для выявления Т-клеток, специфичных к цитомегаловирусу (СМУ), вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и антигенам, связанным с ТШ [23]. Следующим этапом изучения отдельных клеток стал подход с анализом транскриптома единичных клеток [24]. В связи с этим технология декстрамеров обогатилась добавлением баркодирования для возможности анализа только тех клеток, которые с высокой авид-ностью связали комплекс МНС-пептид. Этот подход позволяет генерировать высокомерные данные о специфичном для рМИС связывании на уровне отдельных клеток с использованием парных последовательностей
оф-цепей рецепторов Т-клеток [25]. При этом полученные данные могут быть использованы для биоинфор-матических исследований, в том числе для создания собственных нейросетей [26]. Эксперименты с использованием технологии декстрамеров показали эффективность данной технологии как при использовании в качестве метода анализа на проточном цитофлуо-риметре, так и при выделении чистой фракции клеток с помощью сортировки. В нашей работе подход с использованием технологии декстрамеров позволил провести анализ транскриптома клеток с рецепторами, распознающими пептиды белков Е6 и Е7 ВПЧ, и определить клональность их рецепторов.
Магнитная сортировка - это важный этап получения обогащенной фракции антиген-специфических клеток [27, 28]. Все рассматриваемые мультимеры позволяют проводить магнитную сортировку с использованием магнитных частиц с антителами против РЕ, а технология стрептамеров позволила усовершенствовать протокол магнитной сортировки, добавив возможность удаления окрашивающего комплекса рМНС-81гер-Тае1т-магнит-ные бусы с поверхности клеток. Для снижения эффекта неспецифического связывания используется предварительное гейтирование по маркеру жизнеспособности, исключение дуплетов, а также использование одного и того же мультимера, меченного разными флуорохро-мами [29]. Эта стратегия может быть полезна в случае редких СБ8+-Т-клеток и эффективно реализована в технологии Б1ех-Т [30].
Общая схема состава мультимерных комплексов, использовавшихся в данной работе, представлена на рис. 8.
Таким образом, методы мультимерного окрашивания позволяют подсчитывать, анализировать и выделять пептид-специфические Т-лимфоциты. Анализ с помощью тетрамеров является стандартом, который позволяет эффективно проанализировать необходимые образцы. Кроме того, технология стрептамеров позволяет выделять клетки с возможностью оперативного удаления окрашивающего комплекса и получать клетки
Декстран
Стрептамеры
Vs
UV-лабильный пептид
Пептид
Рис. 8. Схематическое изображение декстрамеров, стрептамеров, мультимеров, полученных по технологии Flex-T, и тетрамеров
для проведения функциональных тестов и трансплантации, технология Б1ех-Т позволяет в лабораторных условиях получить мультимеры необходимой специфичности, а технология декстрамеров позволяет проводить анализ транскриптома клеток, несущих рецепторы заданной специфичности. Спектр описанных технологий позволяет подобрать необходимые реагенты для выполнения каждого типа экспериментов.
Заключение
Мультимерное окрашивание - важный и ценный инструмент для фундаментальной и клинической иммунологии. Благодаря небольшому объему требуемого материала, быстрому и простому проведению анализа, а также хорошей воспроизводимости и надежности результатов мультимерный мониторинг подходит как
для изучения формирования клеточного иммунного ответа, так и для разработки современных протоколов клеточной иммунотерапии онкологических, вирусных и аутоиммунных заболеваний, а также для оценки эффективности проводимой терапии. В нашей работе стрептамеры с пептидами белка ИБЯ2 позволили получить чистую фракцию клеток с сохранной цитотокси-ческой активностью, тетрамеры, полученные по технологии Б1ех-Т с пептидами белка МАвБ-АЗ, позволили анализировать содержание антиген-специфических клеток в протоколе клональной экспансии, а технология декстрамеров с пептидами белков Е6 и Е7 была эффективно использована в анализе транскриптома единичных клеток. Существование ряда технологий позволяет для каждой задачи исследования выбрать необходимый инструмент.
■ Литература
1. Rojas M., Acosta-Ampudia Y., Heuer L.S., Zang W., Monsalve D., Ramirez-Santana C., Anaya J.M., M. Ridgway W., Ansari A., Gershwin M.E. Antigen-specific T cells and autoimmunity. J. Autoimmun. 2024; 148: 103303. DOI: https://doi.org/10.1016/jjaut.2024.103303
2. Schwarz M., Mzoughi S., Lozano-Ojalvo D., Tan A.T., Berto-letti A., Guccione E. T cell immunity is key to the pandemic endgame: How to measure and monitor it. Curr. Res. Immunol. 2022; 3: 215-21. DOI: https://doi.org/10.1016/j.crimmu.2022.08.004
3. Abdelaal H.M., Cartwright E.K., Skinner P.J. Detection of Antigen-Specific T Cells Using In Situ MHC Tetramer Staining. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20: 5165. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20205165
4. Lim K.P., Zainal N.S. Monitoring T Cells Responses Mounted by Therapeutic Cancer Vaccines. Front. Mol. Biosci. 2021; 15 (8): 623475. DOI: https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.623475
5. Перик-Заводская О.Ю., Перик-Заводский Р.Ю., Сенников С.В. Инновационные подходы в иммунологии: мультиомика единичных клеток и пространственная транскриптомика. Иммунология. 2024; 45 (4): 414-26. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-414-426
6. Golikova E.A., Alshevskaya A.A., Alrhmoun S., Sivitskaya N.A., Sennikov S.V. TCR-T cell therapy: current development approach. J. Transl. Med. 2024; 22 (1): 897. DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-024-05703-9
7. Kwok W.W., Tan V., Gillette L., Littell C.T., Soltis M.A., LaFond R.B., Yang J., James E.A., DeLong J.H. Frequency of epitope-spe-cific naive CD4(+) T cells correlates with immunodominance in the human memory repertoire. J. Immunol. 2012; 188 (6): 2537-44. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.1102190
8. Moon J.J., Chu H.H., Pepper M., McSorley S.J., Jameson S.C., Kedl R.M., Jenkins M.K. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 2007; 27 (2): 203-13. DOI: https://doi.org/10.1016/j. immuni.2007.07.007
9. Кузнецова М.С., Терещенко В.П., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Алрхмун С., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотипические и функциональные особенности генерированных in vitro TCR-T-клеток, специфичных к опу-холь-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Иммунология. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547
10. Kuznetsova M., Lopatnikova J., Shevchenko J., Silkov A., Maksyutov A., Sennikov S. Cytotoxic Activity and Memory T Cell Subset Distribution of in vitro-Stimulated CD8+ T Cells Specific for HER2/neu Epitopes. Front. Immunol. 2019; 10: 1017. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2019.01017
11. Bacher P., Scheffold A. Flow-cytometric analysis of rare antigen-specific T cells. Cytometry A. 2013; 83 (8): 692-701. DOI: https://doi. org/10.1002/cyto.a.22317
12. Altman J.D., Moss P.A., Goulder P.J., Barouch D.H., McHeyzer-Williams M.G., Bell J.I., McMichael A.J., Davis M.M. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 1996; 274 (5284): 94-6. DOI: https://doi.org/10.1126/science.274.5284.94
13. Altman J.D., Davis M.M. MHC-Peptide Tetramers to Visualize Antigen-Specific T Cells. Curr. Protoc. Immunol. 2016; 115: 17.3.117.3.44. DOI: https://doi.org/10.1002/cpim.14
14. Knabel M., Franz T.J., Schiemann M., Wulf A., Villmow B., Schmidt B., Bernhard H., Wagner H., Busch D.H. Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer. Nat. Med. 2002; 8 (6): 631-7. DOI: https://doi. org/10.1038/nm0602-631
15. Bouquie R., Bonnin A., Bernardeau K., Khammari A., Dreno B., Jotereau F., Labarriere N., Lang F. A fast and efficient HLA multimer-based sorting procedure that induces little apoptosis to isolate clinical grade human tumor specific T lymphocytes. Cancer Immunol Immunother. 2009; 58 (4): 553-66. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-008-0578-2
16. Schmitt A., Tonn T., Busch D.H., Grigoleit G.U., Einsele H., Odendahl M., Germeroth L., Ringhoffer M., Ringhoffer S., Wiesneth M., Greiner J., Michel D., Mertens T., Rojewski M., Marx M., von Harsdorf S., Döhner H., Seifried E., Bunjes D., Schmitt M. Adoptive transfer and selective reconstitution of streptamer-selected cytomegalovirus-specific CD8+ T cells leads to virus clearance in patients after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation. Transfusion. 2011; 51 (3): 591-9. DOI: https:// doi.org/10.1111/j.1537-2995.2010.02940.x
17. Borchers S., Ogonek J., Varanasi P.R., Tischer S., Bremm M., Eiz-Vesper B., Koehl U., Weissinger E.M. Multimer monitoring of CMV-specific T cells in research and in clinical applications. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 78 (3): 201-12. DOI: https://doi.org/10.1016/j.diagmic-robio. 2013.11.007
18. Fuji S., Einsele H., Kapp M. Cytomegalovirus disease in hemato-poietic stem cell transplant patients: current and future therapeutic options. Curr. Opin. Infect. Dis. 2017; 30 (4): 372-6. DOI: https://doi.org/10.1097/ QCO.0000000000000375
■ References
1. Rojas M., Acosta-Ampudia Y., Heuer L.S., Zang W., Monsalve D., Ramirez-Santana C., Anaya J.M., M. Ridgway W., Ansari A., Gershwin M.E. Antigen-specific T cells and autoimmunity. J Autoimmun. 2024; 148: 103303. DOI: https://doi.org/10.1016/jjaut.2024.103303
2. Schwarz M., Mzoughi S., Lozano-Ojalvo D., Tan A.T., Berto-letti A., Guccione E. T cell immunity is key to the pandemic endgame: How to measure and monitor it. Curr Res Immunol. 2022; 3: 215-21. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.crimmu.2022.08.004
3. Abdelaal H.M., Cartwright E.K., Skinner P.J. Detection of Antigen-Specific T Cells Using In Situ MHC Tetramer Staining. Int J Mol Sci. 2019; 20: 5165. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20205165
19. Фишер М.С., Сенников С.В. Клеточные технологии в иммунотерапии аутоиммунных заболеваний. Иммунология. 2023; 44 (6): 813-24. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-6-813-824
20. Kozono H., White J., Clements J., Marrack P., Kappler J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 1994; 369 (6476): 151-4. DOI: https://doi.org/10.1038/369151a0
21. Magnin M., Guillaume P., Coukos G., Harari A., Schmidt J. High-throughput identification of human antigen-specific CD8+ and CD4+ T cells using soluble pMHC multimers. Methods Enzymol. 2020; 631: 21-42. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.mie.2019.05.019
22. Bieling M., Tischer S., Kalinke U., Blasczyk R., Buus S., Maecker-Kolhoff B., Eiz-Vesper B. Personalized adoptive immunothe-rapy for patients with EBV-associated tumors and complications: Evaluation of novel naturally processed and presented EBV-derived T-cell epi-topes. Oncotarget. 2017; 9 (4): 4737-57. DOI: https://doi.org/10.18632/ oncotarget.23531
23. Dolton G., Zervoudi E., Rius C., Wall A., Thomas H.L., Fuller A., Yeo L., Legut M., Wheeler S., Attaf M., Chudakov D.M., Choy E., Peak-man M., Sewell A.K. Optimized Peptide-MHC Multimer Protocols for Detection and Isolation of Autoimmune T-Cells. Front. Immunol. 2018; 9: 1378. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01378
24. See P., Lum J., Chen J., Ginhoux F. A Single-Cell Sequencing Guide for Immunologists. Front. Immunol. 2018; 9: 2425. DOI: https:// doi.org/10.3389/fimmu.2018.02425
25. Kula T., Dezfulian M.H., Wang C.I., Abdelfattah N.S., Hartman Z.C., Wucherpfennig K.W., Lyerly H.K., Elledge S.J. T-Scan: A Genome-wide Method for the Systematic Discovery of T Cell Epitopes. Cell. 2019; 178 (4): 1016-28.e13. DOI: https://doi.org/10.1016/j. cell.2019.07.009
26. Zhang W., Hawkins P.G., He J., Gupta N.T., Liu J., Choonoo G., Jeong S.W., Chen C.R., Dhanik A., Dillon M., Deering R., Macdonald L.E., Thurston G., Atwal G.S. A framework for highly multiplexed dextramer mapping and prediction of T cell receptor sequences to antigen specificity. Sci. Adv. 2021; 7 (20): eabf5835. DOI: https://doi.org/10.1126/ sciadv.abf5835
27. Radbruch A., Recktenwald D. Detection and isolation of rare cells. Curr Opin Immunol. 1995; 7 (2): 270-3. DOI: https://doi. org/10.1016/0952-7915(95)80014-x
28. Peng S., Zaretsky J.M., Ng A.H.C, Chour W., Bethune M.T., Choi J., Hsu A., Holman E., Ding X., Guo K., Kim J., Xu A.M., Heath J.E., Noh W.J., Zhou J., Su Y., Lu Y., McLaughlin J., Cheng D., Witte O.N., Baltimore D., Ribas A., Heath J.R. Sensitive Detection and Analysis of Neoantigen-Specific T Cell Populations from Tumors and Blood. Cell Rep. 2019; 28 (10): 2728-38.e7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cel-rep.2019.07.106
29. Chattopadhyay P.K., Melenhorst J.J., Ladell K., Gostick E., Scheinberg P., Barrett A.J., Wooldridge L., Roederer M., Sewell A.K., Price D.A. Techniques to improve the direct ex vivo detection of low frequency antigen-specific CD8+ T cells with peptide-major histocompatibi-lity complex class I tetramers. Cytometry A. 2008; 73 (11): 1001-9. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.a.20642
30. Zippelius A., Batard P., Rubio-Godoy V., Bioley G., Lienard D., Lejeune F., Rimoldi D., Guillaume P., Meidenbauer N., Mackensen A., Rufer N., Lubenow N., Speiser D., Cerottini J.C., Romero P., Pittet M.J. Effector function of human tumor-specific CD8 T cells in melanoma lesions: a state of local functional tolerance. Cancer Res. 2004; 64 (8): 2865-73. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-03-3066
4. Lim K.P., Zainal N.S. Monitoring T Cells Responses Mounted by Therapeutic Cancer Vaccines. Front Mol Biosci. 2021; 15 (8): 623475. DOI: https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.623475
5. Perik-Zavodskaia O.Yu., Perik-Zavodskii R.Yu., Sennikov S.V. Innovative approaches in immunology: single cell multi-omics and spatial transcriptomics. Immunologiya. 2024; 45 (4): 414-26. DOI: https://doi. org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-414-426 (in Russian)
6. Golikova E.A., Alshevskaya A.A., Alrhmoun S., Sivitskaya N.A., Sennikov S.V. TCR-T cell therapy: current development approach. J Transl Med. 2024; 22 (1): 897. DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-024-05703-9
7. Kwok W.W., Tan V., Gillette L., Littell C.T., Soltis M.A., LaFond R.B., Yang J., James E.A., DeLong J.H. Frequency of epitope-spe-cific naive CD4(+) T cells correlates with immunodominance in the human memory repertoire. J Immunol. 2012; 188 (6): 2537-44. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.1102190
8. Moon J.J., Chu H.H., Pepper M., McSorley S.J., Jameson S.C., Kedl R.M., Jenkins M.K. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 2007; 27 (2): 203-13. DOI: https://doi.org/10.1016/). immuni.2007.07.007
9. Kuznetsova M.S., Tereshchenko V.P., Shevchenko J.A., Fisher M.S., Kurilin V.V., Alsalloum A., Alrhmoun S., Akahori Y., Shiku H., Sen-nikov S.V. Phenotypic and functional features of in vitro generated TCR-T lymphocytes specific for the tumor-associated antigen NY-ESO-1. Immu-nologiya. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547 (in Russian)
10. Kuznetsova M., Lopatnikova J., Shevchenko J., Silkov A., Maksyutov A., Sennikov S. Cytotoxic Activity and Memory T Cell Subset Distribution of in vitro-Stimulated CD8+ T Cells Specific for HER2/neu Epitopes. Front Immunol. 2019; 10: 1017. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2019.01017
11. Bacher P., Scheffold A. Flow-cytometric analysis of rare antigen-specific T cells. Cytometry A. 2013; 83 (8): 692-701. DOI: https://doi. org/10.1002/cyto.a.22317
12. Altman J.D., Moss P.A., Goulder P.J., Barouch D.H., McHeyzer-Williams M.G., Bell J.I., McMichael A.J., Davis M.M. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 1996; 274 (5284): 94-6. DOI: https://doi.org/10.1126/science.274.5284.94
13. Altman J.D., Davis M.M. MHC-Peptide Tetramers to Visualize Antigen-Specific T Cells. Curr Protoc Immunol. 2016; 115: 17.3.117.3.44. DOI: https://doi.org/10.1002/cpim.14
14. Knabel M., Franz T.J., Schiemann M., Wulf A., Villmow B., Schmidt B., Bernhard H., Wagner H., Busch D.H. Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer. Nat Med. 2002; 8 (6): 631-7. DOI: https://doi. org/10.1038/nm0602-631
15. Bouquié R., Bonnin A., Bernardeau K., Khammari A., Dréno B., Jotereau F., Labarrière N., Lang F. A fast and efficient HLA multimer-based sorting procedure that induces little apoptosis to isolate clinical grade human tumor specific T lymphocytes. Cancer Immunol Immunother. 2009; 58 (4): 553-66. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-008-0578-2
16. Schmitt A., Tonn T., Busch D.H., Grigoleit G.U., Einsele H., Odendahl M., Germeroth L., Ringhoffer M., Ringhoffer S., Wiesneth M., Greiner J., Michel D., Mertens T., Rojewski M., Marx M., von Harsdorf S., Döhner H., Seifried E., Bunjes D., Schmitt M. Adoptive transfer and selective reconstitution of streptamer-selected cytomegalovirus-specific CD8+ T cells leads to virus clearance in patients after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation. Transfusion. 2011; 51 (3): 591-9. DOI: https:// doi.org/10.1111/j.1537-2995.2010.02940.x
17. Borchers S., Ogonek J., Varanasi P.R., Tischer S., Bremm M., Eiz-Vesper B., Koehl U., Weissinger E.M. Multimer monitoring of CMV-specific T cells in research and in clinical applications. Diagn Microbiol Infect Dis. 2014; 78 (3): 201-12. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.diagmic-robio.2013.11.007
18. Fuji S., Einsele H., Kapp M. Cytomegalovirus disease in hemato-poietic stem cell transplant patients: current and future therapeutic options. Curr Opin Infect Dis. 2017; 30 (4): 372-6. DOI: https://doi.org/10.1097/ QCO.0000000000000375
■ Сведения об авторах
Лопатникова Юлия Анатольевна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0089-5054
19. Fisher M.S., Sennikov S.V. Cellular technologies in immunotherapy of autoimmune diseases. Immunologiya. 2023; 44 (6): 813-24. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-6-813-824 (in Russian)
20. Kozono H., White J., Clements J., Marrack P., Kappler J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 1994; 369 (6476): 151-4. DOI: https://doi.org/10.1038/ 369151a0
21. Magnin M., Guillaume P., Coukos G., Harari A., Schmidt J. High-throughput identification of human antigen-specific CD8+ and CD4+ T cells using soluble pMHC multimers. Methods Enzymol. 2020; 631: 21-42. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.mie.2019.05.019
22. Bieling M., Tischer S., Kalinke U., Blasczyk R., Buus S., Maecker-Kolhoff B., Eiz-Vesper B. Personalized adoptive immunothe-rapy for patients with EBV-associated tumors and complications: Evaluation of novel naturally processed and presented EBV-derived T-cell epi-topes. Oncotarget. 2017; 9 (4): 4737-57. DOI: https://doi.org/10.18632/ oncotarget.23531
23. Dolton G., Zervoudi E., Rius C., Wall A., Thomas H.L., Fuller A., Yeo L., Legut M., Wheeler S., Attaf M., Chudakov D.M., Choy E., Peak-man M., Sewell A.K. Optimized Peptide-MHC Multimer Protocols for Detection and Isolation of Autoimmune T-Cells. Front Immunol. 2018; 9: 1378. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01378
24. See P., Lum J., Chen J., Ginhoux F. A Single-Cell Sequencing Guide for Immunologists. Front Immunol. 2018; 9: 2425. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2018.02425
25. Kula T., Dezfulian M.H., Wang C.I., Abdelfattah N.S., Hartman Z.C., Wucherpfennig K.W., Lyerly H.K., Elledge S.J. T-Scan: A Genome-wide Method for the Systematic Discovery of T Cell Epit-opes. Cell. 2019; 178 (4): 1016-28.e13. DOI: https://doi.org/10.1016/j. cell.2019.07.009
26. Zhang W., Hawkins P.G., He J., Gupta N.T., Liu J., Choonoo G., Jeong S.W., Chen C.R., Dhanik A., Dillon M., Deering R., Macdonald L.E., Thurston G., Atwal G.S. A framework for highly multiplexed dextramer mapping and prediction of T cell receptor sequences to antigen specificity. Sci Adv. 2021; 7 (20): eabf5835. DOI: https://doi.org/10.1126/ sciadv.abf5835
27. Radbruch A., Recktenwald D. Detection and isolation of rare cells. Curr Opin Immunol. 1995; 7 (2): 270-3. DOI: https://doi. org/10.1016/0952-7915(95)80014-x
28. Peng S., Zaretsky J.M., Ng A.H.C, Chour W., Bethune M.T., Choi J., Hsu A., Holman E., Ding X., Guo K., Kim J., Xu A.M., Heath J.E., Noh W.J., Zhou J., Su Y., Lu Y., McLaughlin J., Cheng D., Witte O.N., Baltimore D., Ribas A., Heath J.R. Sensitive Detection and Analysis of Neoantigen-Specific T Cell Populations from Tumors and Blood. Cell Rep. 2019; 28 (10): 2728-38.e7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep. 2019.07.106
29. Chattopadhyay P.K., Melenhorst J.J., Ladell K., Gostick E., Scheinberg P., Barrett A.J., Wooldridge L., Roederer M., Sewell A.K., Price D.A. Techniques to improve the direct ex vivo detection of low frequency antigen-specific CD8+ T cells with peptide-major histocompatibi-lity complex class I tetramers. Cytometry A. 2008; 73 (11): 1001-9. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.a.20642
30. Zippelius A., Batard P., Rubio-Godoy V., Bioley G., Lienard D., Lejeune F., Rimoldi D., Guillaume P., Meidenbauer N., Mackensen A., Rufer N., Lubenow N., Speiser D., Cerottini J.C., Romero P., Pittet M.J. Effector function of human tumor-specific CD8 T cells in melanoma lesions: a state of local functional tolerance. Cancer Res. 2004; 64 (8): 2865-73. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-03-3066
■ Authors' information
Julia A. Lopatnikova - PhD, Senior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0089-5054
Шевченко Юлия Александровна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0001-8773-0599
Филиппова Юлия Геннадьевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Мин-обрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Фишер Марина Сергеевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобр-науки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Облеухова Ирина Александровна - канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2180-3243
Голикова Елена Алексеевна - канд. биол. наук, cx науч. сотр. лаб. иммунной инженерии Института регенеративной медицины Научно-технологического парка биомедицины ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0009-0000-8721-6127
Корнеев Александр Александрович - аналитик лаб. иммунной инженерии Института регенеративной медицины Научно-технологического парка биомедицины ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9522-1142
Шаньгина Полина Андреевна - лаборант-исследователь лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6925-121X
Алрхмун Салех - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0788-5385
Julia A. Shevchenko - PhD, Senior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0001-8773-0599
Julia G. Filippova - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected]
Marina S. Fisher - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0001-6261-7557
Irina A. Obleukhova - PhD, Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2180-3243
Elena A. Golikova - PhD, Senior Researcher of the Immune Engineering Lab., Institute of Regenerative Medicine, Bio-medicine Science and Technology Park of the I.M. Seche-nov First MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0009-0000-8721-6127
Alexander A. Korneev - Analyst of the Immune Engineering Lab., Institute of Regenerative Medicine, Biomedicine Science and Technology Park of the I.M. Sechenov First MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9522-1142
Polina A. Shangina - Laboratory Assistant of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6925-121X
Saleh Alrhmun - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0788-5385
Перик-Заводский Роман Юрьевич - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5055-4859
Савостьянова Татьяна Алексеевна - лаборант исследователь лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0005-8184-1569
Курилин Василий Васильевич - канд. мед. наук, cx науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5617-0450
Сенников Сергей Витальевич - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Roman Yu. Perik-Zavodskii - Junior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5055-4859
Tatjana A. Savostyanova - Laboratory Assistant of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0005-8184-1569
Vasily V. Kurilin - PhD, Senior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5617-0450
Sergey V. Sennikov - MD, PhD, Prof., Head of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0000-0002-7366-7768
