CC BY
44
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив. Серия Г. Медицина, фармация и дентална медицина т. XXII. ISSN 1311-9427 (Print), ISSN 2534-9392 (On-line). 2017. Scientific works of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series G. Medicine, Pharmacy and Dental medicine, Vol.XXII. ISSN 13119427 (Print), ISSN 2534-9392 (On-line). 2018.
МЕТОДИЧНИ ВЪЗМОЖНОСТИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА АНТИТЕЛА СРЕЩУ ФОСФОЛИПАЗА А2 РЕЦЕПТОР Йовко Рончев1, Дора Терзиева2 1.Клинична лаборатория, УМБАЛ "КАСПЕЛА" Пловдив, Медицински факултет, 2.Катедра КлиИична лаборатория, Фармацевтичен факултнт, МУ-Пловдив
OPPRTUNITIES FOR METHODICAL EVALUATION OF PHOSPHOLIPASE A2-RECEPTOR ANTIBODIES Yovko Ronchevi, Dora Terzieva2 l.Clinical laboratory, UMBAL "Kaspela", Plovdiv, Medical faculty, 2.Department of clinical laboratory, Faculty of pharmacy, Medical university-Plovdiv
Abstract: Phospholipase A2 receptor (PLA2R) is transmembrane glycoprotein expressed in human kidney glomeruli on the surface of podocytes. At present, two groups PLA2R are described - type M and type N. It is believed that antibodies against type M PLA2R (identified as a major target antigen), are thought to be responsible for development of primary membranous glomerulonephritis. In contemporary clinical laboratory practice are used two main groups of methods: qualitative and quantitative. ELISA method allows quantitative determination of autoantibodies against phospholipase A2 receptor and respond to the criteria of the high analytical reliability. No necessity for special instrumentation. This makes it suitable for use in routine clinicae laboratory practice. Keywords: phospholipase A2 receptor, antibody, methods for investigatione
ВЪВЕДЕНИЕ:
Фосфолипаза А2 рецепторът (PLA2R) е трансмембранен гликопротеин с молекулна маса 180 ^a, експресиран в човешки бъбречни гломерули по повъхността на подоцитните клетки. До сега са описани две групи PLA2R - тип М и тип N. Тип М фосфолипаза А2 рецептор е един от четирите рецептори включени в маноза рецепторната фамилия (East et al, 2002). С помощта на структурен анализ е установен голям екстрацелуларен участък, един трансмембранен сегмент и къс цитоплазмен участък. Екстрацелуларния участък е изграден от богат на цистеин N-терминален домен (N-C8), фибронектин подобен тип II домен и осем повтарящи се С-тип лектин подобни домени (фиг 1), (Kao et al, 2015; Beck et al, 2009; Augert et al, 2009). Освен по повърхността на човешки подоцитни клетки, ограничена експресия на тип М рецептора е установена и в други клетки, например алвеоларни епителни клетки, неутрофили и др. ( Fresquet et al 2015).
Фигура 1. Структура на PLA2R (химичен анализ)
Смята се, че антителата срещу тип М PLA2R (индентифициран като голям таргетен антиген), са отговорни за развитието на първична мезенгиална нефропатия. В научната литература са описани две основни групи методи за анализ на автоантитела срещу PLA2R: качествени и количествени. ЦЕЛ:
Да се представят съвременните методични възможности за анализ на автоантитела срещу PLA2R.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ: Направено е търсене на пълготекстови публикации в системите MEDLINE и PUBMED по ключови думи „фосфолипаза А2 рецептор", „антитела", "методи за определяне". Включени са данни от 218 литературни изтчника за периода 20092017 година. РЕЗУЛТАТИ:
Към качествените методи за анализ на антитела срещу PLA2R принадлежат микроскопски методи (поляризационна интерферометрия, флуоресцентна и електронна микроскопия), разделителни техники (ултрацентрофугиране) и имуноблот анализ (Western bloot). Двойната поляризационна интерферометрия предоставя данни за дебелината, рефракционния индекс, плътността на имобилизираните PLA2R и за конформационни промени в реално време. При анализът на необработените данни за плътност, дебелина и маса за единица площ най-често се използува AnaLight Bio 200 софтуерен продукт (Lai et al, 2015). Индиректната флуоресцентна микроскопия е на базата на биочип технология (трансфектирана с DNA човешка клетъчна линия HEK 239, кодираща фосфолипаза А2 рецептор). Като контрола се използват трансфектирани с празен вектор клетки. Тази техника дава възможност за качествен и полуколичествен анализ (фиг 2), (Hoxha et al, 2012; Keriaschki, 1983).
Фигура 2. Структура на PLA2R (индиректна флуоресцентна микроскопия)
Чрез електронно микроскопския анализ може да се изследва както PLA2R, така и анти-телата срещу него или комплекса PLA2R - антитяло (Lai et al, 2015). На фиг.3 е представен електронно микроскопски образ на мембранозна нефропатия с електронно плътни депозити в субепителното пространство.
Фигура 3. Електронно микроскопски образ на мембранозна нефропатия При Western bloot техниката гломерулния филтрат се разделя електрофоретично, а за детекция се използва маркирано с пероксидаза антиовче антитяло (фиг. 4), (Hoxha et al, 2012; Takahashi et al, 2015).
Фигура 4. Имуноблот анализ на PLA2R Сруктурен анализ на PLA2R е извършван с помощта на ултрацентрофугиране при скорост на ротора 74.500 g и температура 20° С (Fresquet et al, 2015).
За количествено определяне на антитела срещу PLA2R се използува ELISA техника на базата на сандвичев принцип. Използваният в ензимния конюгат античовешки IgG (заешки) е маркиран с пероксидаза. Концентрациите на анти-PLA2R се отчитат по пет точкова калибрационна крива. ELISA методът е с граница на откриване (Ld) 0.6 RU/ml, линейност -от 6 RU/ml до 1500 RU/ml, коефициент на вариация в серия < 5.7%, коефициент на вариация във време < 10.3%. Методът дава възможност и за полуколичествена оценка (Test instruction).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ:
ELISA методът за определяне на фосфолипаза А2-рецепторни антитела дава възможност за тяхното количествено определяне. Той е с много добри характеристики на аналитичната надеждност - линейност, граница на откриване и невъзпроизводимост. Методът не изисква скъпоструваща високоспециализирана апаратура. Това го прави подходящ за използване в рутинната лабораторна практика.
ЛИТЕРАТУРА:
1. East L., Isace CM. The mannose receptor family. Biochim Biophys Acta, 2002 Sep 19; 1572 (2-3):364-86.
2. Kao L.,V. Lam, М. Waldman, R. Glassock, and Q. Zhu. Identification of the Immunodominant Epitope Region in Phospholipase A2 Receptor-Mediating Autoantibody Binding in Idiopathic Membranous Nephropathy. J Am Soc Nephrol 26: 291-301, 2015. doi: 10.1681/ASN.2013121315
3. Beck L., R. Bonegio, G. Lambeau, D. Beck, D. Powell, T. Cummins, J. Klein and D. Salant. M-Type Phospholipase A2 Receptor as Target Antigen in Idiopathic Membranous Nephropathy. N Engl J Med 2009: 361:11-21
4. Augert A., Ch. Payrer, Y. Launoit, J. Gil, G. Lambeau and D. Bernard. The M-type receptor PLA2R regulates senescence through the p53 pathway. EMBO reports vol 10 (3) 2009: 271-277. doi: 10.1038/embor. 2008.255
5. Fresquet M., Th. Jowitt, J. Gummadova, R. Collins, R. O'Cualain, E. McKenzie, R. Lennon and P. Brenchley. Identification of a major Epitope Recognized by PLA2R autoantibodies in primary Membranous nephropathy. J Am Soc Nephrol 26; 2015: 302-313. doi: 10.1681/ASN.2014050502
6. Lai W., T. Ye, P. Chen, Ch. Chan,W. Chiang, Y. Chen, K. Wu,T. Tsai. Membranous nephropathy: A review on the pathogenesis, diagnosis, and treatment. Journal of the Formosan Medical Association (2015) 114, 102-111
7. Fervenza F., S. Sethi, U. Specks. Idiopathic Membranous Nephropathy: Diagnosis and Treatment. Clin J Am Soc Nephrol 3: 905-919, 2008. doi: 10.2215/CJN.04321007
8. Takahashi S., K. Watanabe, Y. Watanabe, D. Fujioka, T. Nakamura, K. Nakamura, J. Obata, K. Kugiyama. C-type lectin-like domain and fibronectin-like type II domain of phospholipase A2 receptor 1 modulate binding and migratory responses to collagen. FEBS Letters 589 (2015) 829-835
9. Hoxha E., U. KneiBler, G. Stege, G. Zahner, I. Thiele, U. Panzer, S. Harendza, U. Helmchen and R. Stah. Enhanced expression of the M-type phospholipase 2 receptor in glomeruli correlates with serum receptor antibodies in primary membranous nephropathy. Kidney International (2012) 82, 797-804
10. Kerjaschki D. and M. Farquhar. Immunocytochemical localization of the Heymann nephrithis antigen (GP330) in glomerular epithelial cells of normal lewis rats. J. Exp. Med., Volume 157, 1983: 667-686
11. Anti-PLA2R ELISA (IgG). Test instruction.
Aдрес за кореспонденция: д-р Йовко Рончев, УМБАЛ "КАСПЕЛА" ЕООД гр. Пловдив, Email: [email protected]
