CC BY
16
ISSN 1994-7836 (print) ISSN 2519-2477 (online)
УДК 581.1/.4:
582.711.712 Article info Received 21.02.2017
НЕПРЯМИИ МОРФОГЕНЕЗ ТА РЕГЕНЕРАЦ1ИНА ЗДАТН1СТЬ
ТКАНИН ТРОЯНДИ ЕФ1РООЛШНО1
О. О. Олшник
НУ 6iopecypciB i природокористування Украши, м. Кшв, Украша
Унаслщок проведених дослiджень отримано морфогенну калюсну культуру троянди ефiро-олшно'Т сорту Лань. Встановлено, що вдвiчi активнiше калюс починае утворюватись на частинах листковоТ пластинки, нiж на частинах пагошв. Проаналiзовано вплив регуляторiв росту ауксинового та цитокiнiнового тишв дГТ на формування калюсних тканин. Активне наростання калюсних тканин ввдбуваеться на живильному середовищi МС з половинним вмiстом макро- та мкросолей, 0,150 мг/л ТДЗ та 0,05 мг/л НОК. Показано просторову оргашзацш i гiстогенез морфогенних структур на досл^ джуваних калюсних зразках.
Ключоеi слова: калюс, троянда ефiроолiйна, культура in vitro, регулятори росту.
Вступ. Першi роботи щодо калюсно1 куль тури троянди ефiроолшноl були пов'язаш з перспективою створення клiтинних технологш для отримання аро-матичних речовин з бюмаси культивованих клiтин (Rubcova, 2009). Калюсну культуру було отримано внаслвдок використання як експлантати пелюсток троянди ефiроолiйноl сорт1в Кримська червона i Мiчурiн-ка. Калюсш клiтини зберiгали здатнiсть до бюсинтезу ефiрноl олп, склад якого залежав вiд генотипу росли-ни-донора i його фiзiологiчного стану. Подальшi дос-лiдження в цьому напрямку показали, що нагрома-дження ефiрноl оли в калюсних культурах залежало ввд складу живильного середовища, i в насамперед, ввд концентраци i сшвввдношення фiтогормонiв.
1нший аспект використання калюсних культур троянди - отримання рослин-регенеранпв i сомакло-нальних варiантiв. Для низки декоративних сорт1в вдалося показати можливкть щдукци калюсогенезу в рай використання як експлантати листових дисюв i стеблових сегментiв (Rubcova, 2009). Разом з тим цi дослвдження не призвели до вирiшення кшцевого зав-дання - отримання рослин-регенеранпв. Цей напря-мок роботи для троянди ефiроолiйноl також е досить перспективним, оск1льки дае змогу використовувати бютехнолопчш пiдходи до створення вихщного мате-рiалу для селекцп. Однак для !х реашзади потрiбно виршити цiлу низку методичних питань, пов'язаних з отриманням морфогенних калюсних культур i рос-лин-регенерантiв. У попередшх дослiдженнях встановлено, що серед дослвджуваних сорт1в троянди ефь роолшно1 украшсько1 селекци Лань, Лада та Райдуга найкращi показники адаптаци до умов in vitro (Oliynyk et al., 2016a), регенеративное' здатностi (Oliynyk, Kluvadenko, & Melnychuk, 2016) та наймен-
шим умiстом фенольних сполук у тканинах (ОИупук й а1., 2016Ь) характеризувався сорт Лань. Тому мета щеТ роботи - отримати морфогенний калюс троянди ефiроолшноl сорту Лань та формування рослин-реге-неранпв з калюсно! тканини.
Матерiали та методи дослщження. Для досль джень використовували троянду ефiроолiйну укра-!нсько! селекци сорту Лань.
Для отримання калюсно! тканини використовували стерильш листковi пластинки (Б=0,40-0,50 см2) та частини стебел з пазушними бруньками (1=0,5- 0,8 см), культивованi на живильних середовищах Мурасiге -Скуга (МС) та Куарша - Леповре ^Ь) з додаванням до !х складу рiзних груп цитокiнiнiв та ауксишв: 6-БАП (6-бензиламiнопурин), ТДЗ (тдаазурон), НОК (а-нафтилоцтова кислота) та 1ОК (Р-шдол1л-3-оцтова кислота) як окремо, так i комбiнуючи мiж собою (А1еИпо, & Vysockij, 1986).
Цитолопчш i гiстохiмiчнi дослiдження неморфо-генного й морфогенного калюсу сорив троянди ефь роолшно! (перший - п'ятий пасаж^ проводили на мш-ротомних зрiзах (завтовшки 10 мкм). Рослиннi тканини фарбували гематоксилшом за Гейденгайном та ацетофуксином. Рослинний матерiал фiксували 24 год за прописом Чемберлена (70 % етиловий спирт: фор-малiн: оцтова кислота - 90: 5: 5) (Б7Иешеп, 1965).
Результата та 1х обговорення. На живильних середовищах початок калюсогенезу експлантатав троянди ефiроолiйноl зафжсували на частинах листково! пластинки на 7-9-ту добу, на мжропагонах - на 10-14-ту добу культивування.
Надалi калюс субкультивували на живильних сере-довищах, доповнених регуляторами росту - БАП, НОК, 1ОК та ТДЗ (табл.).
№ з/п Морфометричний показник Склад живильного середовища
МС+ 0,5 мг/л БАП QL+ 2,0 мг/л БАП +0,1 мг/л 1ОК 1/2 МС+0,150 мг/л ТДЗ +0,05 мг/л НОК QL + 0,5 мг/л БАП
1 Забарвлення калюсу, 30-та доба культивування свгтло-жовте свгтло-жовте з осередками темно-салатового салатове з осередками темно-зеленого салатове з осередками темно-зеленого
2 Консистенщя калюсу, 30-та доба культивування рихла середньо'1 щiльностi щшьна щшьна
3 Регенеращя мкропагошв, шт. - 10-15 5-10 12-25
4 1нтенсивнють калюсоутворення + ++ +++ ++
*Примика: "+" - низька iнтенсивнiсть калюсоутворення; "++" - середня iнтенсивнiсть калюсоутворення; "+++" - висока iнтенсивнiсть калюсоутворення.
Citation APA: Oliynyk, O. (2017). Indirect Morphogenesis and Regenerative Ability of Tissues of Rosa Damascena Mill. Scientific Bulletin of UNFU, 27(1), 69-72. Retrieved from http://nv.nltu.edu.ua/index.php/journal/article/view/166
Вiзуально першi ознаки морфогенезу у культурi калюсу зафжсували на другу добу культивування. Ди-ференщащя клiтин i утворення у калюсних тканинах морфогенних структур значною мiрою залежить вiд концентраци та сшвввдношення регулятор1в росту, що за умов ввдповвдно!' компетентностi клiтин стимулю-ють процеси гемогенезу.
Аналiз експериментальних даних свiдчить про те, що використання тшьки БАП на середовищi МС не привело до шшдаци формування морфогенного калюсу. Консистенщя тканин залишилася рихлою, забар-влення - свiтло-жовтим. Пвд час культивування калюсу на середовищi QL + БАП на 30-ту добу отримали морфогенний калюс iз темно-зеленими зонами, а на 40-ву добу почали формуватись розетки та мжропаго-ни. Зi зменшенням у 2 рази мiнерального складника у живильному середовищi (1/2 МС), ТДЗ та НОК ввдбу-ваеться активне наростання калюсних тканин. Регенерация мiкропагонiв вiдбуваeться на 45-ту добу.
Пiд впливом гормональних стимушв на базальних частинах пагон1в експлантатв i на поверхнях листюв, що дотикаються до живильного середовища з потрiб-ними для пролiферацГi клиин компонентами, активно утворюються калюснi тканини. На перших етапах формування вони подан пухкою свiтло-зеленою ма-сою, яка розпадаеться на конгломерати за мехатчно-го навантаження. Поступово калюсна тканина твердie i набувае тенсивного жовто-зеленого забарвлення, внаслiдок асимтяцшно!' активносп клiтин калюсу (рис. 1).
Рис. 1. Морфогенний калюс сорту Лань на рiзних стадiях формування: а, в - первиннi регенеранти на морфогенному калюсц б, г - формування морфогенних структур у калюснш тканиш
На свiтлi клiтини поверхневого шару калюсу наг-ромаджують у вакуолях полiфеноли (елагi- i галоташ-ни, проантоцианiдини, ди- i тримери флаван-3-олiв). За умов доступу кисню вони активно окислюються фенолоксидазами. Через збiльшення вмкту окислених продукта клiтини буртать i поступово вiдмирають.
У бiльшостi дослiджених зразюв морфогенних ка-люсiв троянди ефiроолiйноl промеристемнi зони, що
Украши, 2017, т. 27, № 1 поданi дрiбними клiтинами з густою цитоплазмою, знаходились в 0T04eHHÍ великих клггин Í3 ввдкладен-нями у клиинних стшках ß-(1^•3)-глюкamв (калози). Калоза - бюполГмер, що у рослинному оргaнiзмi вико-нуе зaхиснi i регуляторш функци (Lotova, 2000). Ii' синтез iндукуeться збiльшенням загального пулу юнГв кальцию у цитоплaзмi рослинних клiтин (Lotova, 2000), дieю елкиторГв, мехaнiчними впливами (Valles, & Boxus, 1987). Вiдклaдення ß-(1^•3)-глюкaнiв впли-вають на симпластний транспорт метaболiтiв у тканинах i створюють систему бaр'eрiв, що перешкоджають транслокаци патогетв i переносу високомолекуляр-них сполук через плазмолему (Ray, 2006). Бiополiмер створюе в калюсах троянди ефГроолшно! передумови для селективного транспорту метаболшв i градкнтно-го перерозподiлу продукпв первинного i вторинного метaболiзму.
€ пГдстави вважати, що меристемогдт конуси або модулi та компaктнi групи промеристемних клiтин функцiонують як центри синтезу фиогормонГв та Гн-ших регуляторiв росту. В оточеннi недиференцшова-них клiтин пaренхiми вiдповiднi центри поступово формують навколо себе спецiaлiзовaнi тканини, ini-щюють формування проваскулярно'' системи, поступово'' диференцiaцГi клиин основних запасних, про-вiдних i прокaмбiaльних тканин, у яких визначаються структуры елементи анального органу.
За просторово-структурною оргaнiзaцieю морфо-геннi зони у системГ калюсних тканин троянди ефГро-олшно'' подaнi меристемо'дами. Потенцшно кожен з них здатен утворювати ашкальш меристеми з примор-дГями листкГв i формувати первиннi пагони. ОскГльки в таких умовах органогенез ввдбуваеться de novo, пер-шГ метамери за вГдсутнГстю потрГ6ного оточення, 6i-охГшчно! та просторово'' невпорядкованосп мають ознаки тератогенезу. Цей ефект мае масовий характер. ПершГ акти органогенезу завершаються утворенням структур з аномальною будовою. Для них характерна вадсутшсть чико! мережГ проввдних пучкГв, атипова просторова оркнтацГя клиин у тканинах. Ввдповвдно, порушуеться мГжклиинний зв'язок i екстрацелюляр-ний сигналГнг. ПервиннГ органи мають обмежений рГст, втГм вони виконують важливу функцГю: активно долучаються до фотосинтезу, утворюють потрГбт для нормального розвитку гормони i регулятори росту.
Кожен з таких новоутворених модулГв зазвичай частково або повшстю виокремлений вГд неморфоген-но'' зони калюсу крупними паренхГмними клиинами Гз розвиненими вторинними клГтинними стшками (рис. 2; д, ж). Подальша реалГзацГя морфогенного по-тенцгалу цих структур залежить вГд умов культивування тканин, а також вГд функцюнально! активностГ меристемо1дних зон.
Швидккть регенеращйних процесГв i нормальний розвитку органГв у системГ калюсних тканин залежала вГд збалансованостГ компонентГв живильного середовища, сшвввдношення регуляторГв росту i ключових ендоклГтинних метаболГтГв, синтез яких також зале-жав вГд штенсивносп i режиму освГтлення.
Рис. 2. Просторова оргашзащя i пстогенез морфогенних структур у калюсах троянди ефiроолiйноï сорту Лань: а, б - пролiфе-рацiя клiтин неморфогенного калюсу; в - утворення промеристемних зон в оточенш прошаркiв клiтин з л^шфкованими rai-тинними стiнками; г, е - диференщацк клiтин з утворенням проваскулярних тканин; д - облгтеращя клiтин паренхiми; ж - фор-мування гiсгохiмiчних бар'ерв (показано стршками), що роздiляють паренхiму калюсу на окремi зони; з - вщкладення у клгти-нах калюсу (вдюбластах) крупних призматичних кристалiв солей щавлево'1 кислоти (показано сгрiлками); лшшка: б, в, е -100 мкм; а, г, д, ж, з - 50 мкм
Висновки. Вперше, в наслiдок проведеного комплексу робгг було отримано морфогенний калюс сорту Лань. Встановлено, що у даного сорту вдвiчi актив-нiше калюс починае утворюватись на частинах лис-тково! пластинки, шж на частинах пагон1в.
На живильному сеpедовищi МС з половинним вмiстом макро- та мiкpосолей, 0,150 мг/л ТДЗ та 0,05 мг/л НОК ввдбуваеться активне наростання ка-люсних тканин. Регенеpацiя мiкpопагонiв ввдбу-ваеться на 45-ту добу.
Морфогенш зони у системi калюсних тканин тро-янди ефipоолiйноl поданi меристемо1дами. На почат-кових стадiях гемогенез завершуеться утворенням структур з аномальною будовою, для яких характерна вiдсутнiсть чггко! меpежi пpовiдних пучкiв, атипова просторова оpiентацiя клiтин у тканинах. Пеpвиннi органи мають обмежений piст, вт1м вони виконують важливу функцию: активно долучаються до фотосинтезу, утворюють потpiбнi для нормального розвитку гормони i регулятори росту.
Перелiк використаних джерел
Alehno, G. D., & Vysockij, V. A. (1986). Klonalnoe mikro-razmnozhenine roz. Fiziologija i biohimija kulturnyh rastenij, 18, pp. 489-493. [in Russian].
Dzhensen, U. (1965). Botanicheskaja gistohimija. Moscow: Mir, p. 377. [in Russian].
Lotova, L. I. (2000). Morfologija i anatomija vysshih rastenij. Moscow: Jeditorial URSS, p. 528. [in Russian].
Oliynyk, O. O. Kluvadenko, A. A., Melnychuk, M. D. (2016). Optimization of Culture Media Content for Acceleration of Growth and Cultivation of Rosa Damascena Mill. in In Vitro Culture. Scientific Bulletin of UNFU, 26(7), pp. 134-139. Retrived from: http://nltu.edu.ua/nv/Archive/2016/26_7/23.pdf
Oliynyk, O. O., Kljuvadenko, A. A., Lihanov, A. F., & Melnychuk, M. D. (2016a). Vplyv fenolnyh spoluk na efektyvnist uvedennja sortiv Rosa damascena Mill. u kulturu in vitro. Visnyk agrarnoi nauky, 2, pp. 28-31. [in Ukrainian].
Oliynyk, O. O., Kljuvadenko, A. A., Lihanov, A. F., & Melnychuk, M. D. (2016b). Osoblyvosti nagromadzhennja fenolnyh spoluk v eksplantatah trojandy efiroolijnoi v umovah in vitro. Agrobiodi-versity for Improving Nutrition, Health and Life Quality, pp. 337341. [in Ukrainian].
Ray, F. E. (2006). Esaus Plant anatomy: meristems, cells, and tissues of the plant body: their structure, function, and development. New Jersey: Hoboken, pp. 473-501.
Rubcova, O. L. (2009). Rid Rosa L. v Ukraini: genofond, istorija, naprjamy doslidzhen, dosjagnennja ta perspektyvy. Kyiv: Feniks, p. 375. [in Ukrainian].
Valles, M., & Boxus, P. (1987). Regeneration from Rosa callus. Acta Hort, 212, pp. 691-696.
О. А. Олейник
НЕПРЯМОЙ МОРФОГЕНЕЗ И РЕГЕНЕРАЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ ТКАНЕЙ
РОЗЫ ЭФИРОМАСЛИЧНОЙ
В результате проведенных исследований получена морфогенная калюсная культура розы эфиромасличной сорта Лань. Установлено, что в два раза активнее калюс начинает образовываться на частях листовой пластинки, чем на частях побегов. Проанализировано влияние регуляторов роста ауксинового и цитокининовым типов воздействия на формирование калюс-ных тканей. Активное нарастание калюсных тканей происходит на питательной среде МС с половинным содержанием макро- и микросолей, 0,150 мг/л ТДЗ и 0,05 мг/л НОК. Показано пространственную организацию и гистогенез морфогенных структур исследуемых образцов калюса.
Ключевые слова: калюс, роза эфиромасличная, культура in vitro, регуляторы роста.
O. О. Oliynyk
INDIRECT MORPHOGENESIS AND REGENERATIVE ABILITY OF TISSUES OF ROSA DAMASCENA MILL
Obtaining of morphogenic callus of Lan variety of ROSA and formation of the regenerant plants from callus tissues is a necessary issue nowadays. For the research we used Rosa Damascena Mill. variety of Ukrainian selection Lan. For obtaining of the callus tissue we used sterile leaf plates and parts of stems with axillary buds cultured in nutrient media with the addition of the various groups of cytokinins and auxins. Plant tissue was stained with hematoxylin by Heidenhain and acetofuxin. Plant material was recorded for 24 hours by Chamberlain's method. We have obtained the following results. Firstly, on the medium, the beginning of the calluso-genesis of aromatic rose's explants was recorded on parts of leaf plates after 7-9 days, and for microstems - 10-14 days of cultivation. Later callus was subcultured on the nutrient media, supplemented with growth regulators - BAP, NAA, IAA and TDZ. Visually, the first signs of the morphogenesis of callus culture were fixed on the 2nd day of cultivation. The differentiation of cells and the formation of callus tissue of morphogenic structures is largely dependent on the concentration and ratio of growth regulators that under relevant competences of cells stimulate processes hemogenesis. Analysis of experimental data shows that usage of only BAP in the MS medium did not lead to the initiation of the morphogenic callus formation. Secondly, under the influence of hormonal stimuli callus tissues actively formed on the basal parts of shoots of explants and on the surfaces of leaves contacting to the culture medium that contained the required components for the cell proliferation. Thus under these conditions the organogenesis occurs de novo, the first metameres, with absence of the necessary environment, biochemical and spatial disorder carry out the signs of teratogenesis. As a result of conducted studies we have determined that in Lan variety callus begins to form twice as actively in the parts of the leaf blades than in stem parts. Morphogenic zones in the system of callus cells of Rosa Damascena Mill. are represented as meristemoids. Primary bodies have limited growth; however they perform an important function: actively take part in photosynthesis, form hormones and growth regulators that are required for normal development.
Keywords: callus; rose essential oil; in vitro culture; growth regulators.
1нформащя про автора:
О. О. Олшник, асшрант, НУ бюресурав i природокористування УкраТни, м. КиТв, УкраТна. E-mail: [email protected]
