CC BY
58
УДК 611.018.821.822 Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
М. А. КАДЕ, А. А. ЕВГЛЕВСКИй, П. А. ГАЛЕНКО-ЯРОШЕВСКИЙ
морфометрическая характеристика нейронов спинного мозга и спинальных ганглиев при субарахноидальном введении бупивакаина, мексидола и их сочетания
ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4.
E-mail: [email protected], тел. 8-928-429-21-22
Показано, что в условиях субарахноидального введения бупивакаин (0,25%, 5 мг/кг) и мексидол (1,25%, 25 мг/кг) вызывают разнонаправленные изменения показателей (количество ядрышек в ядре, объемная плотность субстанции Нисля и оптическая плотность хроматина) белоксинтезирующей системы нейронов спинного мозга и спинальных ганглиев. Сочетание бупивакаин (0,25%, 5 мг/кг) + мексидол (1,25%, 25 мг/кг) не индуцирует существенных изменений в отмеченных показателях по сравнению с контролем.
Ключевые слова: бупивакаин, мексидол, субарахноидальное введение, нейроны спинного мозга и спинальных ганглиев.
M. A. KADE, A. A. EVGLEVSKY, P. A. GALENKo-YARoSHEVSKY
MORPHOMETRIC CHARACTERISTIC OF THE SPINAL CORD NEURONS AND SPINAL GANGLIONS IN SUBARAHNOID INJECTIONS OF BUPIVAKAINE, MEXIDOL AND ITS COMBINATION
Kuban State Medical University, Ministry of Public Health and Social Development,
Russia, 350063, Krasnodar, Sedin str., 4.
E-mail: [email protected], tel. 8-928-429-21-22
It has been shown that subarachnoid injections of bupivakaine (0,25 per cent, 5 mg/kg ) and mexidol (1,25%, 25 mg/ kg) cause multidirectional changes indicators ( number of nucleouli in nucleus, bulk density of Nisl substances and optical density of chromatin) of protein-synthesizing system of the neurons of spinal cord and spinal ganglions. Combination of bupivacaine (0,25%, 5 mg/kg)+ mexidol (1,25%, 25 mg/kg) induces no significiant changes in marked indicators in comparison to control data.
Key words: bupivakaine, mexidol, subarachnoid injections, neurons of the spinal cord and spinal ganglions.
Ранее нами показано [7], что местный анестетик бупивакаин (маркаин) в сочетании с мексидолом, обладающим антиоксидантными и антигипоксантными свойствами [2, 3], а также способностью блокировать потенциалзависимые натриевые, кальциевые и калиевые ионные токи [5], при субарахноидальном введении проявляет более продолжительную спинномозговую анестезию, чем бупивакаин, приготовленный на физиологическом растворе.
С учетом вышеизложенного целью настоящей работы явилось исследование влияния бупивакаина, мексидола и их сочетаний на морфофункциональное состояние нейронов спинного мозга и спинальных ганглиев при субарахноидальном введении.
Методика исследования
Исследование проводили с использованием нелинейных 12 крыс-самцов массой 275-290 г, которые были разделены на 4 группы, в каждую из которых входило по три животных. Первой группе крыс (контрольной) субарахноидально вводили (на уровне моклоковых бугров) физиологический раствор (ФР), второй, третьей и четверной - бупивакаин (0,25%, 5 мг/кг), мексидол (1,25%, 25 мг/кг) и сочетание бупивакаин (0,25%, 5 мг/кг) + мексидол (1,25%, 25 мг/кг) соответственно. Животных подвергали эвтаназии через 1 ч после введения ФР и исследованных лекарственных средств (ЛС). Материал для гистологического изучения нейронов спинного
мозга и спинальных ганглиев брали с уровня введения ФР и ЛС, затем фиксировали 10%-ным нейтральным формалином и заливали в парафин по общепринятой методике [7]. Гистологические срезы толщиной 15-20 мкм изготавливали на санном микротоме МС-2.
Обзорные препараты спинного мозга и спинальных ганглиев окрашивали соответственно азотно-кислым серебром [7] и гематоксилин-эозином [7], а также по Нислю [7] для выявления тигроидного вещества (рис. 1 и 2).
На гистологических препаратах, окрашенных по Фельгену, измеряли оптическую плотность ядер нейронов спинного мозга и спинальных ганглиев. Измерения проводили одноволновым методом двух площадей с использованием фотометрической насадки ФЭМЛ-1-У4.2 производства ЛОМО при длине волны 534 нм [4].
Обзорные микропрепараты, окрашенные гематоксилин-эозином и импрегнированные азотно-кислым серебром, использовали для общей визуальной оценки гистоархитектоники серого вещества спинного мозга и спинальных ганглиев контрольных животных и подвергнутых воздействию ЛС, а также для подсчета количества нейронов, содержащих в ядре одно или два ядрышка и не содержащих в нем ядрышки. Исследование проводили с использованием светового микроскопа МББ-1А при суммарном увеличении 400х. Учет нейронов осуществляли по всей плоскости среза серого вещества спинного мозга и спинального ганглия. Препараты,
Рис. 1. Нейроны серого вещества спинного мозга (А); окраска азотно-кислым серебром. Нейроны спинального ганглия (Б); окраска гематоксилин-эозином. Увеличение 400х
А
Б
В
Г
Рис. 2. Различный уровень содержания субстанции Нисля в цитоплазме нейронов спинного мозга (А, Б, В, Г). Окраска по Нислю. Увеличение 400х
окрашенные по Нислю, использовали для компьютерной морфометрии тигроидного вещества в цитоплазме нейронов спинного мозга и спинальных ганглиев. При этом микропрепараты изучали при большом увеличении микроскопа «МББ-1а». Изображения нейронов захватывались ПЗС-матрицей и передавались в персональный компьютер, где оцифровывались и сохранялись в гра-
фическом файле формата РСХ при разрешении 640х 480 пиксел в режиме «серая шкала» при 16 градациях этой шкалы. Полученные компьютерные изображения нейронов анализировали с помощью программы «М^СА№>, разработанной на кафедре гистологии Кубанского государственного медицинского университета. Анализу подвергали участок изображения размером
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
Таблица 1
Морфометрические характеристики нейронов серого вещества спинного мозга крыс в условиях субарахноидального введения бупивакаина, мексидола и их сочетания
Показатели Контроль Бупивакаин Мексидол Бупивакаин + мексидол
Оптическая плотность ядер, усл. ед. 0,89 ± 0,01 0,67 ± 0,03 р < 0,001 0,76 ± 0,03 р < 0,01 0,85 ± 0,07 р > 0,05
Объемная плотность субстанции Нисля, усл. ед. А 5,27 ± 1,92 Б 84,66 ± 1,93 А 0,2 ± 0,013 р < 0,05 Б 91,91 ± 1,1 р < 0,05 А 0,01 ± 0,002 р < 0,05 Б 61,96 ± 1,2 р < 0,001 А 4,87 ± 1,99 р > 0,05 Б 93,45 ± 1,81 р < 0,05
Уровень энтропии субстанции Нисля, усл. ед. 1,21 ± 0,1 1,61 ± 0,12 р < 0,05 2,4 ± 0,19 р < 0,001 1,22 ± 0,02 р > 0,05
Количество нейронов без ядрышка, % 32,0 ± 2,0 51,0 ± 3,0 р < 0,001 49,0 ± 1,0 р < 0,001 33,0 ± 2,0 р > 0,05
Количество нейронов с одним ядрышком, % 64,0 ± 3,0 49,0 ± 2,0 р < 0,001 51,0 ± 2,0 р < 0,01 60,0 ± 1,0 р > 0,05
Число нейронов с двумя ядрышками, % 4,0 ± 0,02 0 0 7,0 ± 0,01 р < 0,001
Примечание: здесь и в табл. 2: А и Б - объемная плотность цитоплазматических гранул соответственно высокой и низкой плотности субстанции Нисля.
400х 400 пиксел, соответствующий 52,1% всего изображения. Предварительно проводили анализ малых участков изображения 5 * 5 и 10 * 10 пиксел, что позволяло определять градационную принадлежность субстанции Нисля. При дальнейшем анализе изображения данные градации отождествлялись с этой субстанцией. По данной компьютерной морфометрии рассчитывали объемную плотность субстанции Нисля и уровень ее структурной неупорядоченности, или энтропии [1].
Полученные результаты подвергали обработке методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы «Micro Stat» фирмы «Borland Corparations».
результаты исследования и их обсуждение
Визуальный анализ микропрепаратов, полученных при импрегнации срезов спинного мозга крыс азотнокислым серебром, показал, что в условиях применения бупивакаина, мексидола и их сочетания гистологическая картина не отличается от наблюдаемой у животных контрольной группы.
Оптическая плотность ядер (ОпПЯ) нейронов спинного мозга, окрашенных по Фельгену на ДНК, у крыс контрольной группы составляет 0,89 ± 0,01 усл. ед. При использовании бупивакаина ОпПЯ нейронов снижается до уровня 0,67 ± 0,03 усл. ед. (р < 0,001). В условиях применения мексидола наблюдается менее значимое уменьшение ОпПЯ нейронов спинного мозга. Ее уровень снижается до 0,76 ± 0,03 усл. ед. (р < 0,01). Сочетанное применение бупивакаина и мексидола характеризуется ОпПЯ нейронов спинного мозга на уровне контроля (табл. 1).
Компьютерная морфометрия показала, что в цитоплазме нейронов крыс контрольной группы объемная плотность базофильного материала (ОбПБМ)
субстанции Нисля высокой плотности составляет 5,27 ± 1,92 усл. ед. При этом ОбПБМ низкой плотности равняется 84,66 ± 1,93 усл. ед. Общий уровень информационной энтропии (ОУИЭ) распределения материала субстанции Нисля составляет 1,21 ± 0,1 усл. ед. В условиях применения бупивакаина отмеченные показатели соответственно равны 0,2 ± 0,013, 91,91 ± 1,1 и 1,61 ± 0,12 (р < 0,05 во всех случаях). При применении мексидола ОбПБМ Нисля еще более снижается. Так, уровень ОбПБМ гранул высокой плотности составляет 0,01 ± 0,002 усл. ед. (р < 0,05), а гранул низкой плотности - 61,96 ± 1,2 усл. ед. (р < 0,001). Следует отметить, что снижение уровня ОбПБМ сопровождается существенным возрастанием ОУИЭ распределения базофильного материала в цитоплазме нейронов спинного мозга. При этом ОУИЭ по сравнению с контролем возрастает почти вдвое и составляет 2,4 ± 0,19 (р < 0,001). При сочетанном применении бупивакаина и мексидо-ла подобных изменений не наблюдается, за исключением умеренного увеличения ОбПБМ гранул низкой плотности (табл. 1).
Изучение содержания нейронов спинного мозга, имеющих в ядре 1 и 2 ядрышка, а также клеток, у которых ядрышки в ядре отсутствуют, выявило, что у крыс контрольной группы доля клеток, не имеющих ядрышек в ядре, равна 32,0 ± 2,0%. Нейроны, имеющие в ядре 1 ядрышко, составляют 64,0 ± 3,0%, а клетки, содержащие в ядре 2 ядрышка, - 4,0 ± 0,02%.
В условиях применения бупивакаина по сравнению с контролем количество нейронов, не имеющих ядрышек, существенно увеличивается, составляя 51,0 ± 3,0% (р < 0,001), а клеток с одним ядрышком в ядре снижается, равняясь 49,0 ± 2,0% (р < 0,001); с двумя ядрышками в ядре - отсутствует.
При использовании мексидола по сравнению с контролем количество нейронов, не содержащих в ядре ядрышек, также существенно увеличивается, достигая уровня 49,0 ± 1,0% (р < 0,001). В то же время число нейронов с одним ядрышком в ядре уменьшается и составляет 51,0 ± 2,0% (р < 0,01). Нейроны с двумя ядрышками в ядре, как и в случае применения бупива-каина, отсутствуют.
Сочетанное применение бупивакаина и мексидола по сравнению с контролем характеризуется отсутствием существенных отличий в количестве нейронов без ядрышек (33,0 ± 2,0%) и с одним ядрышком (60,0 ± 1,0%) в ядре. Количество нейронов с двумя ядрышками по отношению к контролю увеличивается на 75%, составляя 7,0 ± 0,01% (р < 0,001) (табл. 1).
Визуальное изучение срезов спинальных ганглиев, окрашенных гематоксилин-эозином, свидетельствует о том, что в условиях применения бупивакаина, мексидола и их сочетания гистологическая картина практически не отличается от таковой контрольной группы.
У крыс контрольной группы уровень ОпПЯ нейронов спинальных ганглиев, окрашенных по Фельгену на ДНК, составляет 0,81 ± 0,01 усл. ед. При применении бупивакаина ОпПЯ нейронов снижается до уровня 0,51 ± 0,03 усл. ед. (р < 0,001). В условиях использования мекси-дола имеет место менее значимое уменьшение ОпПЯ нейронов спинальных ганглиев, равное 0,66 ± 0,02 усл. ед. (р < 0,001). Сочетанное применение бупивакаина и мексидола вызывает практически сопоставимую с контролем ОпПЯ нейронов спинальных ганглиев, которая составляет 0,88 ± 0,02 усл. ед. (р < 0,05) (табл. 2).
Анализ данных компьютерной морфометрии показал, что в цитоплазме нейронов животных контрольной группы ОбПБМ, имеющая высокую плотность, равна 6,28 ± 1,93 усл. ед. ОбПБМ низкой плотности составляет 84,67 ± 1,93 усл. ед. Уровень ОУИЭ распределения материала субстанции Нисля равен 1,24 ± 0,1 усл. ед. При использовании бупивакаина данные
показатели соответственно равны 0,3 ± 0,013 (р < 0,05), 94,74 ± 1,2 (р < 0,01) и 1,71 ± 0,13 (р > 0,05) усл. ед. В условиях применения мексидола ОбПБМ также оказалась сниженной. Так, уровень ОбПБМ высокой плотности уменьшается относительно контроля до 0,03 ± 0,002 усл. ед. (р < 0,01), а гранул низкой плотности - до 71,97 ± 1,2 усл. ед. (р < 0,001). Следует отметить, что снижение уровня ОбПБМ сопровождается существенным возрастанием ОУИЭ распределения базофильного материала в цитоплазме нейронов спинного мозга. При этом ОУИЭ по сравнению с контролем возрастает более чем в два раза и составляет 2,8 ± 0,14 усл. ед. (р < 0,001). При сочетанном применении бупивакаина и мексидола подобных изменений не наблюдается (1,31 ± 0,03 усл. ед. против 1,24 ± 0,2 усл. ед. в контроле; р > 0,05) (табл. 2).
Анализ содержания нейронов спинальных ганглиев, имеющих в ядре одно или два ядрышка, а также клеток, у которых ядрышки в ядре отсутствуют, показал, что в контроле доля нейронов, не имеющих ядрышек в ядре, равна 36,0 ± 2,0%. Нейроны, содержащие в ядре одно ядрышко, составляют 61,0 ± 3,0%, а клетки, имеющие два ядрышка в ядре, - 3,0 ± 0,02%.
При использовании бупивакаина количество нейронов, не содержащих ядрышек в ядре, незначительно уменьшается, составляя 33,0 ± 3,0% (р > 0,05), а клеток с одним ядрышком несколько увеличивается, равняясь
67.0 ± 2,0% (р < 0,05); нейроны с двумя ядрышками в ядре отсутствуют.
В условиях использования мексидола количество нейронов, не содержащих в ядре ядрышек, по сравнению с контролем значимо увеличивается, составляя
59.0 ± 1,0% (р < 0,001), тогда как число клеток с двумя ядрышками в ядре уменьшается, равняясь 41,0 + 2,0% (р < 0,001); нейроны с двумя ядрышками в ядре отсутствуют. Использование бупивакаина в сочетании с мексидолом по сравнению с контрольными данными не вызывает существенных изменений в количестве
Таблица 2
Морфометрические характеристики нейронов спинальных ганглиев крыс в условиях субарахноидального введения бупивакаина, мексидола и их сочетания
Показатели Контроль Бупивакаин Мексидол Бупивакаин + мексидол
Оптическая плотность ядер, усл. ед. 0,81 ± 0,01 0,51 ± 0,03 р < 0,001 0,66 ± 0,02 р < 0,001 0,88 ± 0,02 р < 0,05
Объемная плотность субстанции Нисля, усл. ед. А 6,28 ± 1,93 Б 84,67 ± 1,95 А 0,3 ± 0,013 р < 0,05 Б 94,74 ± 1,2 р < 0,01 А 0,03 ± 0,002 р < 0,05 Б 71,97 ± 1,2 р < 0,001 А 6,91 ± 1,89 р > 0,05 Б 86,36 ± 1,79 р > 0,05
Уровень энтропии субстанции Нисля, усл. ед. 1,24 ± 0,2 1,71 ± 0,13 р > 0,05 2,8 ± 0,14 р < 0,001 1,31 ± 0,03 р > 0,05
Количество нейронов без ядрышка, % 36,0 ± 2,0 33,0 ± 3,0 р > 0,05 59,0 ± 1,0 р < 0,001 38,0 ± 3,0 р > 0,05
Количество нейронов с одним ядрышком, % 61,0 ± 3,0 67,0 ± 2,0 р < 0,05 41,0 ± 2,0 р < 0,001 61,0 ± 1,0 р > 0,05
Число нейронов с двумя ядрышками, % 3,0 ± 0,02 0 0 1,0 ± 0,01 р < 0,001
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
УДК 611.018.821.822 Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
нейронов без ядрышек в ядре (38,0 ± 3,0%) и клеток с одним ядрышком (61,0 ± 1,0%) в ядре; количество нейронов с двумя ядрышками снижается на 67% и составляет 1,0 ± 0,01% (р < 0,001) (табл. 2).
Таким образом, субарахноидальное введение бупивакаина оказывает резорбтивное действие на нейроны спинного мозга и спинальных ганглиев, что морфологически выражается в уменьшении окраши-ваемости хроматина их ядер по Фельгену и свидетельствует об умеренном снижении функциональной активности этих структур [8]. Кроме того, имеет место неоднозначное изменение активности функционирования ядрышкового аппарата нейронов. Так, нейроны с двумя ядрышками исчезают полностью. Это характерно, как для нейронов серого вещества спинного мозга, так и для псевдоуниполярных нейронов спинальных ганглиев. Число нейронов без ядрышек в ядре увеличивается в нейронах спинного мозга на 59% , а в псевдоуниполярных нейронов спинальных ганглиев практически не изменяется. Зона цитоплазмы, заполненная субстанцией Нисля с гранулами низкой плотности, обнаруживает умеренный прирост, что характерно как для нейронов спинного мозга, так и для спинальных ганглиев. При этом площадь, занимаемая ее компонентами, имеющими высокую плотность, существенно падает по сравнению с контролем. Подобные разнонаправленные изменения морфометрических показателей субстанции Нисля сопровождаются определенным ростом структурной неупорядоченности ее компонентов, о чем свидетельствует увеличение показателя ее энтропии. В целом суммарный эффект воздействия бупивакаина на нейроны, находящиеся в условиях острого эксперимента, выражается в умеренном снижении их функциональной активности и дезорганизации белоксинтезирующего аппарата.
При применении мексидола морфометрическая картина носит иной характер. Она характеризуется существенным снижением функциональной активности
ядер нейронов, выраженным уменьшением площади цитоплазмы, занимаемой субстанцией Нисля, и увеличением показателя ее структурной неупорядоченности, а также выраженной дезорганизацией ядрышкового аппарата. Описанные явления характерны как для нейронов серого вещества спинного мозга, так и для спинальных ганглиев.
В условиях использования бупивакаина в сочетании с мексидолом изменений, описанных при их раздельном применении, не выявлено. Практически все морфометрические показатели не имеют статистически значимых отличий от контроля.
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.
2. Галенко-Ярошевский П. А. Очерки фармакологии средств метаболической терапии / П. А. Галенко-Ярошевский, И. С. Чек-ман, Н. А. Горчакова. - М.: Медицина, 2001. - 240 с.
3. Галенко-Ярошевский П. А. Антипероксидантная активность сердечно-сосудистых средств / П. А. Галенко-Ярошевский, В. В. Гацура. - Краснодар, 2009. - 238 с.
4. Гарсиа А. Одноволновой метод двух площадей, применяемый для цитофотометрии мазков и отпечатков тканей / А. Гарсиа, -Р. Ирио // Введение в количественную цитохимию. - М.: МИР, 1969. С.196-201.
5. Вислобоков А. И. Фармакологическая модуляция ионных каналов мембраны нейронов / А. И. Вислобоков, Ю. Д. Игнатов, К. Н. Мельников. - СПб: издательство СПбГМУ, 2006. - 288 с.
6. Каде М. А. Активность и острая токсичность бупивакаина в сочетании с мексидолом при инфильтрационной, проводниковой, спинномозговой и эпидуральной анестезии / М. А. Каде, П. А. Га-ленко-Ярошевский, А. Н. Петровский // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 8. - С. 37-40.
7. Ромейс Б. Микроскопическая техника. - М., 1954. - 560 с.
8. Эренпрейса Е. А. Организация хроматина в ядре интерфазной клетки. - Рига, 1990. - 114 с.
Поступила 18.08.2009
М. А. КАДЕ, А. А. ЕВГлЕВСКИй, П. А. ГАлЕНКО-ЯРОшЕВСКИй
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙРОНОВ СПИННОГО МОЗГА И СПИНАЛЬНЫХ ГАНГЛИЕВ В УСЛОВИЯХ СУБАРАХНОИДАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО ИМИДАЗОБЕНЗИМИДАЗОЛА РУ-353
В СОЧЕТАНИИ С МЕКСИДОЛОМ
ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. E-mail: [email protected],
тел. 8-928-429-21-22
Установлено, что при субарахноидальном введении производное имидазобензимидазола с лабораторным шифром РУ-353 (0,25%, 5 мг/кг) вызывает малозначимое изменение в белоксинтезирующей системе нейронов спинного мозга и спинальных ганглиев: несколько дезорганизует объемную плотность гранул субстанции Нисля. Мексидол (1,25%, 25 мг/кг) индуцирует разнонаправленные изменения показателей (количество ядрышек в ядре, объемная плотность субстанции Нисля и оптическая плотность хроматина) белоксинтезирующей системы нейронов. Сочетание РУ-353 (0,25%, 5 мг/кг) + мексидол (1,25%, 25 мг/кг) не вызывает значимых изменений в отмеченных показателях по сравнению с контролем.
Ключевые слова: производное имидазобензимидазола РУ-353, мексидол, субарахноидальное введение, нейроны спинного мозга и спинальных ганглиев.
