CC BY
15
Микроэкологический статус кандидатов на пересадку печени
В.В. Киселев1, О.И. Андрейцева1, Н.Б. Бойко2, Г.А. Осипов2, Н.Ф. Федосова3, К.В. Лядов3
НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского; 2Академическая группа акад. РАМН Ю.Ф. Исакова (при НЦССХим. А.Н.Бакулева); 3Лечебно-реабилитационный центр Росздрава РФ, Москва
Контакты: Владимир Валерьевич Киселев [email protected]
Метод определения микст-инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов по специфическим маркерам (жирные кислоты, альдегиды и стеролы) с помощью хромато-масс-спектрометрии применен для исследования микроэкологического статуса больных — кандидатов на пересадку печени. В одном опыте в течение 3 ч с момента поступления проб в лабораторию по молекулярным маркерам количественно определены разнородные микроорганизмы (аэробы, анаэробы, актинобактерии, грибы, вирусы). Обнаружено, что у обследованных чаще наблюдается избыточный рост грамположительных анаэробов (клостридии, эубактерии), актинобактерий родов Streptomyces, Nocardia и дрожжей Candida. Далее по ранжиру следуют стафилококки, стрептококки и грамотрицательные микроорганизмы группы Moraxella/Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacterpylo-ry и Fusobacterium/Haemophylus. Выбор антибиотиков и пробиотиков для коррекции дисбиоза и инфекции осуществляли с учетом данных литературы. Скорость и точность методики обеспечивает оперативный мониторинг процесса лечения под контролем масс-спектрометрии.
Ключевые слова: трансплантация печени, микроэкология, дисбактериоз газовая хроматография, масс-спектрометрия, жирные кислоты, микробные маркеры, анаэробная инфекция, клостридии, эубактерии
The microecological status of candidates for liver transplantation
V. V. Kiselev1, O.I. Andreitseva1, N.B. Boiko2, G.A. Osipov2, N.F. Fedosova3, K.V. Lyadov3
2N.V. Sklifosovsky Research Institute of Emergency Care, Moscow;
2Acad. of the Russian Academy of Medical Sciences Yu.F. Isakov (A.N. Bakulev Research Center of Cardiovascular Surgery);
3Therapeutic Rehabilitation Center, Russian Agency for Health Care, Moscow
A method for identifying mixed infections, dysbioses, and inflammatory processes from specific markers (fatty acids, aldehydes, and sterols) by chromatographic mass spectrometry was used to study the microecological status of patients eligible for liver transplantation. Heterogeneous microorganisms (aerobes, anaerobes, actinobacteria, fungi, and viruses) were quantified from molecular markers in an experiment within 3 hours after the samples were sent to the laboratory. The examinees were found to have excessive growth of gram-positive anaerobes (Clostridia, eubacteria), actinobacteria of the genera Streptomyces, Nocardia, and Candida yeasts. Next were staphylococci, streptococci, and gram-negative microorganisms of the group Moraxella/Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter pylory, and Fusobacterium/Haemophylus. Antibiotics and probiotics were chosen to correct dysbiosis and infection, by taking into account the data available in the literature. The speed and accuracy of the procedure ensure real-time monitoring of a treatment process under control of mass spectrometry.
Key words: liver transplantation, microecology, dysbacteriosis, gas chromatography, mass spectrometry, fatty acids, microbial markers, anaerobic infection, Clostridia, eubacteria
Введение
Одним из последствий стрессовых воздействий на организм человека является нарушение, порой устойчивое, обмена веществ в организме, возникшее из-за изменения микрофлоры кишечника и ассоциированной с ним проницаемости кишечной стенки. В результате появляется диспропорция в поступлении биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами, в организм хозяина и происходит нарушение нормального функционирования его органов. Последствия могут быть патологическими, поскольку от микробиоты кишечной стенки зависит продукция более половины необходимых для человека витаминов, ферментов, факторов, сигнальных молекул, медиаторов и других гормоноподобных соединений, требуемых для обеспе-
чения метаболизма и репродукции его собственных клеток и систем — иммунной, нервной, эндокринной и др. Пептидогликан клеточных стенок грампо-ложительных микроорганизмов (они составляют абсолютное большинство пристеночной микробиоты кишечника человека) активно участвует в регуляции иммунного статуса хозяина на местном и системном уровнях. Считается, что именно микроэкологиче-ские изменения в организме хозяина являются запускающим механизмом подавляющего большинства патологических процессов, и существует столько же вариантов дисбаланса микробиоценозов человека, сколько известно нозологических форм заболеваний [1].
В связи с этим микроэкологический статус человека, точнее, поддержание его гомеостаза, являет-
Оригинальные исследования
Оригинальные исследования
ся необходимым условием стабильного функционирования всех его органов и систем. Соответственно, одним из первых этапов в реабилитации людей, переживающих стресс при серьезном хирургическом вмешательстве, коим является трансплантация органов, должен быть контроль и восстановление микробиоценоза, если он оказался нарушенным.
На основании того что микробиота человека состоит преимущественно из анаэробов, решением перечисленных выше проблем является учет анаэробов в этиологии дисбактериоза и инфекции с соответствующей модификацией антибиотикотерапии и коррекцией микробиоты пробиотиками [2, 3].
Новое направление в молекулярной микробной диагностике — определение микст-инфекции, дис-биозов и воспалительных процессов по специфическим маркерам (жирные кислоты, альдегиды и сте-ролы) с помощью хромато-масс-спектрометрии позволяет быстро и надежно выявлять малые доли веществ микробного происхождения в любых биологических средах организма человека. Этот метод микробиологического исследования быстр и универсален, поскольку не требует выращивания отдельных микроорганизмов на специальных средах и проведения для каждого из них специальных биохимических тестов для установления вида возбудителя [4, 5]. Точное количественное определение микроорганизмов способствует назначению целенаправленной антибактериальной терапии и оперативному контролю ее эффективности. Метод масс-спектрометрии, в отличие от применяемого в обычной практике посева клинического материала на культуральные среды, дает информацию о «замаскированной» части микст-инфекции, состоящей из некультивируемых в условиях лабораторий клинической микробиологии микроорганизмов.
Обнаруженный в результате систематических исследований гомеостаз микробных маркеров в крови [6, 7] и адекватность его профиля составу кишечной микробиоты здорового человека обеспечили уникальную возможность мониторировать состояние микробиоты кишечника малоинвазивным экспрессным методом — по анализу крови [8]. В связи с тем что в кровь попадают также липидные компоненты других отмирающих микроорганизмов, его можно считать экспрессным методом определения микроэкологического статуса высших организмов. Это не означает, что микробы сами присутствуют в крови. В кровь из зоны локализации микробов (кишечника, органов дыхания и т.п.) попадают специфические маркеры, причем концентрация соответствующего маркера в крови пропорциональна содержанию микроба в организме человека. По этой причине специфический маркер и его концентрация в крови являются эквивалентом наличия в организме определенного микроба и его содержания соответственно.
Цель исследования — попытка подтвердить и дополнить известные из предыдущих исследований сведения о микроэкологии больных с серьезными заболеваниями печени, а также описать ее становление после трансплантации с помощью метода масс-спектрометрии микробных маркеров.
Материалы и методы
Режим анализа подробно описан ранее в литературе [4, 5]. Вкратце он состоит в следующем. Кровь в количестве 0,04 мл подвергали кислому метанолизу в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение 1 ч при температуре 80°С. В результате реакции метанолиза жирные кислоты, входящие в состав сложных липидов, освобождаются в виде метиловых эфиров. Их двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл К,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при температуре 80°С для получения триметилсилильных эфиров гидроксикислот. Смесь эфиров в количестве 2 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы HP-5973 («Аджилент Технолоджис», США). Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms («Хьюлет-Паккард»). Длина колонки 25 мм, внутренний диаметр 0,25 мм. Режим анализа — программированный, скорость нагрева термостата колонки 50/мин в диапазоне 130—320°С.
Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически по заданной программе. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах Excel. Для количественного расчета использовали данные калибровки по дейтерирован-ной тридекановой кислоте и чистым культурам клинических изолятов микроорганизмов.
Ошибка количественных измерений численности микроорганизмов из-за погрешности в подготовке проб и анализа, несоответствия состава жирных кислот чистых культур банка данных и изучаемого сообщества in situ может составлять 20%.
Метод не требует использования биологических и биохимических тестовых материалов — культуральных сред, ферментов, тестовых субстратов, праймеров и характеризуется следующими показателями:
• определение > 50 микроорганизмов одновременно в одном анализе;
• универсальность в отношении разных групп микроорганизмов (бактерии, грибы, вирусы);
• время анализа — 2,5 ч;
• чувствительность 103—104 клеток в пробе;
• селективность — до вида при наличии маркера;
• анализ непосредственно в материале без посева и выращивания.
Материалом исследования были пробы крови 41 пациента из «листа ожидания» трансплантации печени. Причиной возникновения терминальной печеночной недостаточности у большинства обследованных был цирроз печени. При анализе селективных хроматограмм систематически фиксировали в крови обследованных пациентов маркеры 47 таксонов (роды или виды) микроорганизмов, включая некоторые группы грибов и вирусов.
Результаты
Результаты измерения концентраций микробных маркеров в крови с последующей реконструкцией микробного сообщества позволили определить изменение общего микроэкологического статуса больного, а также состав микст-инфекции в очаге поражения (табл. 1).
В соответствии с выработанным ранее статистическим критерием [7] отклонения от нормы приобретают клиническую значимость в том случае, когда численность микроорганизмов изменяется вдвое по сравнению с нормой. В табл. 1 полосы потемнее отражают регулярный избыточный рост бактерий в организме, а светло-серые — дефицит.
По экспериментальным данным, изменения носят как общий, так и индивидуальный характер (см. табл. 1). Наблюдается избыточный рост ряда микроорганизмов из состава нормальной микробиоты хозяина, что по определению свидетельствует о наличии инфекции. Общим признаком этой части пациентов является более чем двукратное превышение концентраций маркеров, клостридий группы Clostridium ramosum, Eubacterium lentum (Eggertella lenta), видов Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter pylory и актинобактерий Streptomyces, Nocardia. Наибольший прирост численности бактерий приходится на Clostridium ramosum, Eubacterium lentum, Helicobacter pylory и актинобактерий Streptomyces, Nocardia. К частным признакам относят увели -чение численности основной группы эубакте-рий (Eubacterium moniliforme, Eubacterium nodatum, Eubacterium sabureum), Fusobacterium/Haemophylus, клостридий группы Clostridium Perfringens, дрожжей Candida а также стафилококков и оральных стрептококков, отмечающееся не у всех пациентов. Частично участвуют в инфекционном процессе пептострептококки, анаэробные стрептококки Streptococcus mutans, Propionibacterium jensenii, виды Achromobacter. Грамотрицательные микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae Coli, Proteus, Klebsiella и другие, имеющие общие маркеры в ранге семейства) обнаружены в избыточном росте только у 4 пациентов. Число других выявленных грамотрицательных бактерий, таких как представители родов Stenotrophomonas, Acinetobacter, Neisseria, Bacteroides, Burkholderia, Francisella, не превышало уровня клинической значимости или предела детектирования. У 19 больных отмечен общий избыточ-
ный рост микробиоты по оценке микроэкологиче-ского статуса, у остальных пациентов (п=22) — снижение его по сравнению с нормой из-за дефицита лактобацилл, бифидо-, эу- и пропионобактерий.
Таким образом, изменения в микроэкологиче-ском статусе пациентов — кандидатов на пересадку печени проявляются в увеличении численности одной группы бактерий (инфекция, воспаление) и снижении — другой.
Подробные количественные данные, полученные с помощью метода масс-спектрометрии микробных маркеров, позволяют выявить микробные доминанты потенциальных агентов инфекции. Они служат объективной основой для тактики дальнейшего ведения больного с целью выбора средств подавления инфекции. Действительно, как показано на примере анализов одного и того же больного до и после лечения, это удается осуществить. В качестве примера можно привести коррекцию дисбактериоза у одного из больных (рис. 1).
5000
Рис. 1. Коррекция дисбактериоза
До лечения у больного обнаружен избыток Clostridium ramosum, стрептококков, нокардий и Actinomyces viscosus при существенном недостатке основных микроорганизмов нормальной микробиоты кишечника — лактобацилл, бифидо-, эу- и пропионобактерий. После лечения, включавшего применение жидких концентратов бифидо- и лактобактерий, микроэкологиче-ский статус в основном нормализовался, за исключением того что содержание лактобацилл не достигло нормы, а численность эубактерий перешла в избыток. При восстановлении нарушенного микроэкологического статуса оказалось полезным применение иммуномодуляторов (гепон, иммуномакс), препаратов висмута (Де-Нол), а также метронидазола, который, как оказалось, кроме подавления внедренных в слизистую оболочку бактероидов, стимулирует рост всех микроорганизмов нормальной микробиоты кишечника.
Оригинальные исследования
Оригинальные исследования
Таблица 1. Результаты анализа микроэкологического статуса пациентов — кандидатов на пересадку печени (п=41) в сравнении с нормой
Микроорганизм Норма, кл/мл X 10*5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
NT- 5554 NT- 5678 NT- 5688 NT- 5753 NT- 5772 NT- 5779r NT- 5788 NT- 5794 NT- 5807 NT- 5817 NT- 5818 NT- 5820 NT- 5821 NT- 5826 NT- 5827 NT- 5828 NT- 5829 NT- 5830 NT- 5836 NT- 5844
Streptococcus 249 1853 499 107 398 70 937 0 195 282 1315 367 106 0 345 551 408 0 486 310 390
Eubacterium lentum 68 174 344 670 387 381 162 316 336 483 497 732 545 577 542 135 414 232 407 167 809
Bacillus cereus 23 59 76 25 13 6 36 0 14 20 39 8 45 30 0 28 0 24 28 19 41
Peptostreptococcus anaerobius 0 217 366 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 107 0 0 0 0 0
Clostridium hystolyticum 95 58 0 20 0 0 67 0 0 19 0 0 0 51 7 39 50 53 13 0 0
Nocardia, 14:1 d11 262 1393 1450 321 830 308 1307 211 182 519 1526 416 1722 1532 318 579 633 375 1133 54 1119
Moraxella/Acinetobacter 0 1 4 6 1 16 0 0 0 12 2 7 4 21 15 0 19 0 2 1 2
Pseudomonas aeruginosa 0 2 9 3 6 8 0 5 5 4 4 4 6 0 24 77 5 18 9 5 4
Streptomyces 62 309 300 350 368 126 216 127 170 242 463 220 361 283 217 157 139 181 398 57 539
Clostridium ramosum 2000 4985 5594 5545 3846 2112 3281 2975 3335 4824 5010 2499 4739 10386 2701 3790 5558 3868 11156 2115 4271
Fusobacterium/Haemophylus 0 0 4 5 0 11 1 7 5 0 11 8 11 185 19 7 7 6 7 7 7
Alcaligenes 48 17 83 23 0 43 5 38 39 41 45 54 47 108 64 39 29 35 72 59 91
Rhodococcus 423 345 375 566 486 576 345 424 484 723 536 589 451 1273 725 409 519 554 609 493 1112
Corinebacterium 605 311 456 464 574 230 323 228 270 645 588 319 541 779 290 216 234 292 604 111 718
Lactobacillus 6613 2440 5523 7176 7196 4952 2948 6009 6342 7298 8604 5950 6885 16072 4825 4563 5791 6660 13167 5665 10135
Campylobacter mucosalis 99 0 345 404 116 632 29 28 27 23 59 60 51 102 63 25 72 29 71 25 75
Candida 549 793 2828 254 1102 560 740 371 476 1339 1383 496 1018 1666 439 496 535 386 1515 219 1377
Enterobacteriaceae (E.coli и др.) 0 6 0 0 0 0 0 0 0 74 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Cl.difficile 385 198 785 85 436 215 215 322 318 404 446 417 436 748 355 252 219 280 385 175 585
Prevotella 38 22 102 0 16 0 9 63 56 60 60 61 79 703 69 53 41 50 49 51 86
Eubacterium spp 6912 1892 9159 24031 5886 13444 2578 13326 15596 9992 7725 15484 10188 20465 12418 5059 12164 10993 18502 16727 17786
Bacteroides frag i I is 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Staphylococcus 120 237 357 319 354 220 154 165 177 425 374 353 361 630 279 170 223 224 333 114 512
Bifidobacterium 5067 1972 2915 8611 1188 3629 1593 7249 278 5883 4166 1104 7786 9787 4825 3539 6266 3209 4221 4846 5982
Helicobacter pylory 14 23 74 59 14 28 6 23 40 38 45 50 47 212 59 36 33 39 41 53 55
Clostridium perfringens 12 30 77 11 25 15 9 15 16 23 39 26 42 46 19 16 21 16 164 31 39
Enterococcus 290 421 2297 144 547 426 207 222 349 418 580 376 601 704 276 300 357 0 0 254 767
Eubacterium 59 12 244 0 0 0 3 0 12 14 15 18 0 18 15 7 10 8 13 18 15
Propionibacterium spp 4480 1454 3585 7113 6119 4554 1387 3800 4418 5294 5035 5002 4357 5804 7053 2379 4326 1998 3640 1589 5885
Streptococcus mutans 229 332 409 676 272 327 103 322 219 550 415 378 322 821 237 339 389 426 710 339 703
Herpes 59 7 247 15 0 0 0 0 27 0 15 14 47 60 22 0 12 8 23 41 46
Nocardia asteroides 274 329 614 699 582 345 278 482 544 955 861 804 583 1165 530 266 629 401 995 306 592
Цитомегало вирус 166 31 88 7 63 13 5 0 25 9 12 15 18 41 490 146 14 10 107 66 26
Микр грибы 384 218 814 44 260 168 46 13 138 330 91 879 204 413 142 32 135 247 117 272 1442
Ruminicoccus 640 855 1051 1338 1029 544 816 695 559 961 1571 1392 708 3350 518 367 509 713 4187 687 3868
Butyrivibrio/CI. fi metarum 0 75 123 196 0 0 0 0 0 65 0 0 0 0 12 5 0 0 0 0 0
Actinomyces viscosus 1190 1731 1003 1159 934 896 255 1184 733 899 1242 1135 1527 2233 791 1125 1164 717 811 545 1205
Микроорганизм Норма, кл/мл X 10*5 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
NT- 5852 NT- 5853 NT- 5867 NT- 5875 NT- 5876 NT- 5883 NT- 5921 NT- 5930 NT- 5933k NT- 5934 NT- 5951 NT- 5962 NT- 5947 NT- 5977 NT- 5984 NT- 5986 NT- 6022 NT- 6071 NT- 6072 NT- 6101 NT- 6111
Streptococcus 249 288 487 133 165 217 704 493 641 126 196 165 198 1244 117 207 212 208 0 75 176 96
Eubacterium lentum 68 454 414 315 295 96 186 171 156 94 111 26 46 147 305 189 345 131 220 311 314 113
Bacillus cereus 23 15 14 4 14 16 34 40 20 0 16 3 0 33 0 21 18 31 39 0 69 34
Peptostreptococcus anaerobius 0 0 0 0 0 0 0 0 45 0 0 1 0 80 0 0 0 1 0 0 0 0
Clostridium hystolyticum 95 0 0 0 0 39 78 21 7 0 24 15 4 7 0 0 0 27 57 0 66 0
Nocardia, 14:1 d11 262 763 456 1008 548 66 605 1311 905 773 448 567 140 847 307 719 711 1058 694 628 826 181
Moraxella/Acinetobacter 0 10 6 7 0 0 26 3 2 2 11 6 5 11 10 8 12 11 4 10 12 0
Pseudomonas aeruginosa 0 7 0 8 0 0 13 5 9 4 5 2 3 5 8 5 4 7 0 14 4 0
Streptomyces 62 302 211 351 211 346 287 66 201 0 179 74 67 212 167 345 200 172 68 240 455 37
Clostridium ramosum 2000 4330 2980 3357 3242 5906 6086 2355 4007 4489 3420 997 1875 1733 2791 4526 3322 3564 2371 2354 8647 2922
Fusobacterium/Haemophylus 0 10 5 9 0 1 18 5 7 4 4 0 4 6 9 7 8 9 2 14 13 0
Alcaligenes 48 75 49 47 0 0 62 31 41 28 23 14 20 20 46 37 28 48 9 42 52 0
Rhodococcus 423 362 385 1389 197 229 692 1060 430 365 776 392 105 262 724 422 1561 426 1080 292 987 324
Corinebacterium 605 452 313 560 176 146 427 170 243 112 159 117 75 199 253 298 349 273 241 360 615 168
Lactobacillus 6613 5877 4969 6505 4162 4378 5675 4008 3819 6463 5370 2598 1469 1925 4759 6273 4357 4648 6273 4467 8068 3401
Campylobacter mucosalis 99 24 26 66 9 34 90 119 15 0 22 17 5 12 28 18 172 30 26 8 80 289
Candida 549 785 469 1940 372 719 1116 1269 673 709 497 503 213 381 476 696 1285 615 1150 544 1416 367
Enterobacteriaceae (E.coli и др.) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 77
Cl.difficile 385 440 315 478 199 217 447 315 175 506 134 181 58 188 389 285 337 248 326 375 598 310
Prevotella 38 70 54 53 14 10 65 16 46 0 18 27 16 38 54 37 27 44 18 194 41 0
Eubacterium spp 6912 7169 11156 3498 1934 2555 2326 2260 4009 4875 1724 94 220 2721 4129 3670 1866 1385 4541 4060 9049 8102
Bacteroides frag i I is 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Staphylococcus 120 295 208 452 154 147 400 274 199 95 102 161 47 162 251 231 339 230 260 189 150 82
Bifidobacterium 5067 5006 4509 2207 995 1324 1450 1178 2040 1509 437 206 515 2329 2811 2026 2380 1263 1785 2743 4045 1809
Helicobacter pylory 14 47 32 41 1 5 75 17 17 17 11 12 15 17 34 27 26 33 7 44 75 40
Clostridium perfringens 12 20 14 19 5 5 66 30 37 89 17 9 35 20 242 78 184 32 11 94 17 15
Enterococcus 290 351 343 591 221 313 655 558 324 282 209 235 92 197 319 448 534 367 640 299 655 329
Eubacterium 59 10 11 13 0 0 9 10 14 0 0 0 5 5 9 11 12 10 5 3 15 0
Propionibacterium spp 4480 4945 3658 2413 828 769 1901 1386 1290 724 1070 312 913 1933 2956 1539 3412 1012 2312 3003 4753 1190
Streptococcus mutans 229 180 224 411 75 172 357 305 412 249 390 128 57 99 182 291 291 328 160 4374 410 247
Herpes 59 23 27 76 0 0 18 0 15 0 3 0 0 0 0 6 0 8 0 0 122 133
Nocardia asteroides 274 963 622 689 376 160 583 521 465 0 0 212 105 258 426 1184 1705 683 0 746 892 203
Цитомегаловирус 166 20 10 13 0 15 31 17 15 17 7 5 7 6 13 8 106 6 40 40 15 16
Микр грибы 384 190 133 171 25 13 40 149 571 171 43 104 85 68 72 607 494 329 76 98 44 97
Ruminicoccus 640 1609 659 1548 1177 1427 542 1315 668 2176 1065 595 319 495 439 1227 439 874 1573 884 1408 248
Butyrivibrio/CI. fi metarum 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 2 0 0 2 19
Actinomyces viscosus 1190 814 775 687 355 495 1174 391 735 366 320 216 278 368 745 904 583 737 596 542 1272 779
Примечание. Данные в размерности [клеток/мл х105]. Серым цветом выделены случаи изменения численности микроорганизмов в 2 раза по сравнению с нормой, темно-серым — превышение нормы в 2 раза, светло-серым — уменьшение ниже двукратного уровня.
Оригинальные исследования
Оригинальные исследования
В пробах обследованных пациентов отсутствуют маркеры, характерные для бактероидов, немногочисленны и другие привычные для диагностической практики анаэробы — пептострептококки. Однако выявлены редко культивируемые кишечные анаэробы — виды Eubacterium, Propionibacterium, кло-стридии группы Clostridium ramosum, а также многочисленные аэробы во главе с оральными стрептококками. Что касается Clostridium perfringens, то даже при малых абсолютных концентрациях этот микроб нельзя недооценивать в патологическом плане: он образует как минимум 12 идентифицированных токсинов и энтеротоксин. Мишени для основных токсинов — биологические мембраны в различных тканях. Поражения обусловливают ферментативные процессы, катализирующие гидролитическое расщепление и нарушение клеточной проницаемости с последующим отеком и аутолизом тканей, характерными для газовой гангрены.
Ниже представлено описание клинического случая.
Больная А., 57 лет. Диагноз: цирроз печени вирусной этиологии (HCV + HBV), класс А по критериям Чайлда — Пью, портальная гипертензия, гепатоспле-номегалия.
Первичный анализ микроэ-кологического статуса, выполненный в апреле 2007 г., показал дефицит основных компонентов нормальной микробиоты: эу- (Eubacterium moniliforme,
Eubacterium nodatum, Eubacterium sabureum), бифидо- и пропионо-бактерий при избыточном росте (инфекции) актинобактерии родов Rhodococcus, Streptomyces,
Nocardia, а также Pseudomonas aeruginosa, Moraxella/Acinetobacter,
Helicobacter pylory, Fusobacterium,
Eubacterium lentum, стафилококков, руминококков и дрожжей Candida (табл. 2). При повторном обследовании, проведенном в августе того же года, обнаружено увеличение общего дефицита колонизации на 30% при росте численности стрептококков, бацилл, Clostridium perfringens и Clostridium propionicum. В то же время уменьшилось содержание части условно-патогенной микрофлоры: анаэробных пепто-стрептококков, моракселл, стафилококков, фузобактерий, хе-ликобактера. После трансплан-
тации произошло резкое снижение численности нормальной микробиоты (в 4 раза по сравнению с нормой) до уровня колонизации кишечника, наблюдаемой при синдроме раздраженной кишки [8]. При этом выше нормы осталось количество нокардий, возросла численность группы Moraxella/Acinetobacter и появились бактерии семейства Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae coli, Proteus, Klebsiella и др.) общей численностью на уровне 106 клеток/мл.
На рис. 2 наглядно видно снижение численности основных групп микроорганизмов кишечника — лактобацилл, бифидобактерий, клостридий, эу-, про-пионобактерий и других, а также возвращение их к нормальному уровню в процессе реабилитации. Коррекция дисбактериоза
Для коррекции дисбиоза перспективным представляется применение жидких пробиотиков типа нормофлоринов или биовестинов. В них на два по-
Таблица 2. Коррекция микроэкологического статуса пациентов под контролем масс-спектрометрии микробных маркеров в процессе цикла первичный анализ — коррекция перед операцией трансплантации печени — контроль после операции — восстановление нарушенной микробиоты
Микроорганизм Норма, кл/мл х 10*5 NT-5867 NT-5921 NT-5951 NT-6071
Первичный анализ Коррекция После операции Восстанов- ление
Streptococcus (оральные) 249 133 493 165 0
Eubacterium lentum 68 315 171 26 220
Bacillus cereus 23 4 40 3 39
Clostridium hystolyticum 95 0 21 15 57
Nocardia, 14:1d11 262 1008 1311 567 694
Peptostreptococcus anaerob 0 20 0 0 0
Moraxella/Acinetobacter 0 7 3 6 4
Pseudomonas aeruginosa 0 8 5 2 0
Clostridium propionicum 288 0 201 7 218
Актиномицеты 77 107 84 25 88
Streptomyces 62 351 66 74 68
Clostridium ramosum 2000 3357 2355 997 2371
Fusobacterium/Haemophyl 0 9 5 0 2
Alcaligenes 48 47 31 14 9
Rhodococcus 423 1389 1060 392 1080
Lactobacillus 6613 6505 4008 2598 6273
Mycobacterium/Candida 549 1940 1269 503 1150
Enterobacteriaceae (E.coli и 0 0 0 35 0
Prevotella 38 53 16 27 18
Eubacterium 6912 3498 2260 94 4541
Staphylococcus 120 452 274 161 260
Bifidobacterium 5067 2207 1178 206 1785
Helicobacter pylory 14 41 17 12 7
Clostridium perfringens 12 19 30 9 11
Enterococcus 290 591 558 235 640
Propionibacterium freudeni 4480 2413 1386 312 2312
Streptococcus mutans 229 411 305 128 160
Herpes 59 76 0 0 0
Nocardia asteroides 274 689 521 212 0
Цитомегаловирус 166 13 17 5 40
Ruminicoccus 640 1548 1315 595 1573
Actinomyces viscosus 1190 687 391 216 596
Всего ... 30 248 31 126 21 308 8846 26 066
Примечание. Желтым цветом выделены показатели численности микроорганизмов, более чем вдвое превышающие норму (инфекция), а бирюзовым — вдвое ниже нормы — дефицит.
Рис. 2. Коррекция микроэкологического статуса пациентов
рядка больше живых бактерий (я=1010), кроме того, жидкая культуральная среда содержит естественный пул ростовых факторов микроорганизмов в качестве пребиотика. Конечно, этого мало для того, чтобы восполнить недостаток или подрастить дефицитные лактобациллы или бифидобактерии. Тем не менее, поскольку в кишечнике их содержание составляет примерно 1012, добавка пробиотика не восполняет дефицита по числу клеток, но на самом деле клинический эффект достигается. Можно предположить, что живые культуры бифидо- и лактобактерий вместе с частью культуральной среды содержат биоката-литические вещества, стимулирующие восстановление не только этих, но и других микробов — т.е. способствуют нормализации кишечного гомеостаза.
Нормализующее действие на нарушенную микробиоту кишечника оказывает синтетический тетрадекапептид гепон. В отличие от большинства известных иммуномодуляторов гепон обладает противовоспалительными свойствами, противовирус-
ной активностью, способностью к активации местного иммунитета, повышению устойчивости слизистой оболочки к инфекциям. Уровень колонизации микроорганизмами тощей кишки возрастает до 5 раз по сравнению с исходным, что актуально для пациентов с синдромом раздраженного кишечника, у которых дефицит микробиоты может быть 7-кратным по сумме микроорганизмов. Базовые кишечные микроорганизмы — эу-, бифидобактерии и клостридии — достигают или превышают уровень нормы. Лактобациллы остаются ниже нормы, хотя их численность увеличивается на порядок по сравнению с первоначальной. По многим микробам — кокки, актино-мицеты, энтеробактерии, грибы — обнаруживается восстановление нормы или избыточный рост более чем на порядок.
Препарат висмута де-нол, как оказалось, обладает воспроизводимым эффектом оптимизации общего уровня колонизации тощей кишки и концентрации отдельных микроорганизмов. Таким образом, происходит нивелирование дисбактериоза в сторону нормы: уменьшение концентрации микробов, проявляющих избыточный рост, и увеличение численности дефицитных микробов. Так реагируют на де-нол основные обитатели кишечника — бифидо-, эу- (Eubacterium moniliforme, Eubacterium nodatum, Eubacterium sabureum и пр.), а также пропионовые бактерии. К сожалению, исходный нормальный уровень лактобацилл в большинстве случаев понижается под действием препарата.
Лишь у 1 из 41 пациента в крови был обнаружен высокий титр маркера цитомегаловируса. С учетом опасности, которую представляет цитомегаловирус-ная инфекция после трансплантации печени и начала иммуносупрессии, пациенту был проведен курс лечения валганцикловиром. При последующем исследовании крови маркер определяться перестал. Обсуждение
Всего найдено 43 таксона микроорганизмов, маркеры которых имеют клинически значимое (более чем в 2 раза) превышение нормы (см. 1-й столбец табл. 1 слева), т.е. могут являться участниками инфекционного процесса. Потенциальная инфекция носит полимикробный характер. У разных пациентов одновременно клинически значимыми могут быть до 24 таксонов микроорганизмов из числа контролируемых. Ведущими микроорганизмами в количественном отношении являются анаэробы (уровень до 109 клеток/мл). Это клостридии Clostridium ramosum и Clostridium perfringens, эубак-терии Eubacterium moniliforme, Eubacterium nodatum, Eubacterium sabureum, Eubacterium lentum и румино-кокки. Все они составляют нормальную (индиген-ную) микробиоту организма человека. Им сопутствует группа кокковых бактерий: стафило-, стреп-то-, энтерококки — которые обычно выявляют при классическом бактериологическом исследовании.
Оригинальные исследования
Оригинальные исследования
Их уровень 107—108 клеток/мл. Выше нормы концентрация микроскопических грибов Candida, ак-тинобактерий Streptomyces, Nocardia, Rhodococcus и других, численность которых также составляет 107—108 клеток/мл. Минорная группа по численности (но не по значимости) представлена гра-мотрицательными микроорганизмами: Moraxella, Pseudomonas aeruginosa, Fusobacterium (альтернативно Haemophylus), Alcaligenes и Helicobacterpylory. Микробный эквивалент концентрации их маркеров в крови имеет порядок 106 клеток/мл.
Из экспериментальных данных следует, что при измерении микробных маркеров в крови выявляется новая группа микроорганизмов из числа трудно культивируемых и поэтому мало известных в клинической практике. Эти участники инфекционного процесса — клостридии, эубактерии, лактобациллы, хеликобактеры, стрептомицеты, родокок-ки — обладают высокой патогенетической активностью. Она известна благодаря специфически связанным с этими организмами нозологиям, каждая из которых воспринимается сама по себе как серьезное заболевание, трудно поддающееся лечению. Клостридии групп перфрингенс и рамозум (группа RIC — ramosum, inocuum, clostridioforme) — это гангрена, эубактерии — септический артрит, Helicobacter pylory — язвенная болезнь желудка, языка и атеросклероз; стрептомицеты и другие актинобактерии — туберкулез, нокардиозы и актиномикозы.
В крови 14 из 41 пациента мы обнаружили высокую концентрацию маркеров эубактерий. Eubacterium — родственные клостридиям микроорганизмы, являющиеся одними из основных обитателей кишечника. Эти условные патогены с развитой системой видов и штаммов, обладающие универсальными свойствами. Для них характерно индуцирование продукции провоспалительных цитокинов и фактора некроза опухоли-а, а также противовоспалительного цитокина интерлейкин-10 (липополисахарид — ЛПС или клеточные токсины Грам+-патогенов). Это обусловливает их участие в развитии патологии тяжелых заболеваний, таких как средиземноморская семейная лихорадка, эндокардит, врожденный порок сердца, кожные и кишечные патологии, связанные со сложным изменением концентрации их видов в биотопах. Eubacterium lentum — микроорганизм, ассоциированный с ректальным раком и продуцирующий хо-риогонадотропинподобный иммунореактивный материал [9]. Он также является возбудителем септического артрита и синуситов.
Helicobacter pylory — микроорганизм хорошо известный своим участием в микробной этиологии язвенной болезни, в последнее время обнаруживается и в других органах — полости рта, печени, прямой кишке, атеросклеротических бляшках. На этом фоне выявление Helicobacter pylory в других отделах пищеварительного тракта в норме и патологии не выгля-
дит странным. Патогенность Helicobacter pylory известна: проникая через слизь, бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам и поступают в железы слизистой оболочки. ЛПС микроорганизмов способствует миграции нейтрофилов и развитию острого воспаления. Под действием бактериальной уре-азы мочевина превращается в аммиак, повреждающий слизистую оболочку.
Родококки — факультативные внутриклеточные бактерии, способные персистировать и вегетировать в макрофагах и других клетках высших организмов, вызывая в конечном счете их разрушение. Результирующее действие родококков обусловливает поражение тканей аналогичное микобактериям туберкулеза [10]. Они вырабатывают ферменты, гидролизующие липиды (например, холестеролоксидазу), которые токсичны для организма человека и животных. При биопсии тканей, пораженных родококка-ми, выявляются многочисленные полиморфоядер-ные лейкоциты, вспученные клетки и каверны с внутриклеточными бактериями. Большинство штаммов родококков чувствительны к гликопептидным антибиотикам, в том числе ванкомицину, тейкопланину, и рифампину. Макролиды, такие как эритромицин и кларитромицин, также ингибируют рост многих штаммов. Родококки устойчивы к р-лактамным (за исключением карбапенемов, особенно имипенема) антибиотикам, хотя это свойство не связано с продукцией р-лактамазы. У людей, имеющих контакт с домашними животными, нередко причиной пневмонии и распада легкого является Rodococcus equi. В связи с тем что это внутриклеточный патоген, антибиотик должен проникать внутрь клеток. В таких случаях длительно применяют комбинацию эритромицина (или других новых макролидов) с рифампи-цином.
На наш взгляд, приведенные данные подтверждают существующее суждение о патогенетическом участии в инфекционном процессе микроорганизмов кишечника [11, 12], заполняя тем самым пробелы в представлении о том, какие именно таксоны микроорганизмов в нем участвуют, в каком количественном выражении и как часто. Авторы также надеются, что эта информации послужит поводом для расширения понятия «эндотоксикоз» [13, 14] при наличии инфекции в области хирургического вмешательства путем включения в число продуцентов токсинов грамположительных бактерий — основных обитателей кишечника: эубактерий, лактобацилл, клостридий, пропионо- и актинобакте-рий в первую очередь. Популяции этих бактерий, так же как и все прочие микроорганизмы, при избыточном росте (инфекции) с наибольшей вероятностью вырабатывают токсигенные штаммы и провос-палительные факторы. Известно, что анаэробы являются основными обитателями организма человека. Участие анаэробов в раневой инфекции и сепси-
се не вызывает сомнений, а доля этого участия приближается, по данным многочисленных работ, к их доле в микроэкологическом статусе человека [12]. В ходе проведения эмпирической антибиотикотера-пии также подтверждено участие анаэробов и акти-нобактерий, поскольку эффективным лечение ста-
новится тогда, когда в препараты выбора включены амоксиклав (действующий на клостридии и эубак-терии) с метронидазолом, а также амикацин, к которому чувствительны практически все актинобак-терии [15].
ЛИТЕРАТУРА
1. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1. М.: Грант, 1998.
2. Белобородова Н.В., Хабиб О.Н. Антибактериальная терапия инфекционного эндокардита. Анн хир 1999;6: 67-77.
3. Хабиб О.Н., Белобородова Н.В. Роль анаэробов в этиопатогенезе инфекционного эндокардита. Инфекц бол 2004;2:74-81.
4. Осипов Г.А., Демина А.М. Хроматомасс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах. Вестн РАМН 1996;13(2):52-9.
5. Хабиб О.Н., Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Детектирование молекулярных маркеров бактерий в ткани клапанов сердца в норме и при патологии с применением метода газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Журн микробиол эпидемиол иммунол 2004;(3):62-8.
6. Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Гомеостаз малых молекул микробного
происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином. Вестн РАМН 1999;16(7):25-31.
7. Beloborodova N.V., Osipov G.A. Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship. Microb Ecol Heal Dis SCUP 2000;12:12-21.
8. Осипов Г.А., Парфенов А.И., Верховцева Н.В. и др. Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника культурально-биохимическим и хромато-масс-спектрометрическим методами. Эксп клин гастроэнтерол 2003;4:59-67.
9. Acevedo H.F., Slifkin M., Pouchet-Melvin G.R. et al. Choriogonadotropinlike antigen in an anaerobic bacterium, eubacterium lentum, isolated from a rectal tumor. Infect Immun 1979;24(3):920-4.
10. Linder R. Rhodococcus equi and Arcanobacterium haemolyticum: Two «coryneform» bacteria increasingly recognized as agents of human infection. Emerg Infect Dis 1997;3(2):145-53.
11. Гельфанд Б.Р., Руднов В.А. Процен-ко Д.Н. и др. Сепсис: определение, диагностическая концепция, патогенез
и интенсивная терапия. Инфекц хир 2004;2(2):2-16.
12. Bowler P.G., Duerden B.I.,
Armstrong D.G. Wound microbiology and associated approaches to wound management. Clin Microbiol Rev 2001;14(2):244-69.
13. Брискин Б.С. Еще раз к вопросу
о сепсисе. Инфекц хир 2004;2(4):33-6.
14. Ерюхин И.А., Шашков Б.В. Эндотоксикоз в хирургической клинике. СПб.: Логос, 1995.
15. McNeil M.M., Brown J.M.,
Jarvis W.R., Ajello L. Comparison of species distribution and antimicrobial susceptibility of aerobic actinomycetes from clinical specimens. Rev Infect Dis 1990;12(5):778-83.
Оригинальные исследования
