CC BY
120
КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НАРУШЕНИЙ МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЙ ПРИ АЕСКВАМАТИВНЫХ ПОРАЖЕНИЯХ КОЖИ
И. В. Полеско, Ю. С. Бутов, Г. А. Осипов, А. А. Новокшонов, В. В. Малиновская
Кафедра кожных и венерических болезней, клинической микологии с курсом дермато-косметологии ФУВ РГМУ,
Российская академия медицинских наук, академическая группа академика РАМН Ю. Ф. Исакова, Лаборатория онтогенеза и коррекции системы интерферона ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи
Изучен количественный и качественный состав микрофлоры тонкого кишечника методом хромато-спектрометрии у больных с себорейным дерматитом и перхотью.
Выявлено резкое повышение маркеров анаэробных обитателей кишечника — Clostridium ramosum, С. perfringens и основных видов рода Eubacterium при одновременном снижении уровня лактобацилл и коринебактерий. Ключевые слова: себорейный дерматит, перхоть, хромато-масс-спектрометрия
Себорейный дерматит (СД) и перхоть представляют собой различные проявления одного и того же патологического процесса волосистой части кожи головы. При перхоти наблюдаются локализованные очаги десквамации с признаками зуда и покраснения кожи, тогда как себорейный дерматит характеризуется диффузным образованием чешуек желтоватого или серого цвета с поражением не только кожи волосистой части головы, но и линии роста волос, лба, лица, а также других участков кожи, имеющих волосяной покров.
По мнению большинства исследователей, в патогенезе этого заболевания ведущее значение имеет активация дрожжей рода МаНаввег/а [1, 2]. Показано, что при подавлении флоры дрожжеподобных грибов антимикотическими средствами интенсивность шелушения уменьшается. В то же время ряд исследователей отвергают роль микроорганизмов в образовании перхоти. По их мнению обильное шелушение обеспечивает образование участков, подходящих для колонизации микроорганизмами, а обилие питательных веществ, образующихся при этом, способствует увеличению численности микроорганизмов при обильном образовании чешуек [3].
Практически все исследователи сходятся в том, что факторами, предрасполагающими к возникновению и поддержанию воспалительных заболеваний кожи, являются наследственно обусловленные изменения в составе кожного сала, а также нарушения иммунного ответа, бактериальная колонизация очагов поражения и дисбиотические изменения кишечника. Показано, что у новорожденных с аллергическими состояниями происходит замедление темпов колонизации толстого кишечника энтерококками и бифидобактериями и увеличивается колонизация клостридиями и стафилококками [4]. У пациентов с вульгарными угрями в 54% случаев выявляется дисбактериоз кишечника различной степени выраженности [5].
По данным нашей клиники, у больных себорейным дерматитом возникают грубые изменения как количественного, так и качественного состава микробиоценоза кишечника за счет дефицита анаэробных микроорганизмов и увеличения условно-патогенных представителей микрофлоры [6].
Вполне очевидно, что углубленное изучение антагонистической активности нормальной микрофлоры кишечника в отношении условно-патогенных микроорганизмов позволит выявить механизм дисбиотических нарушений и патогенетически обосновать терапию с учетом микроэкологии организма при десквамативных заболеваниях кожи.
Однако решить эту задачу с помощью традиционных методов исследования микробиоценоза скорее всего не представляется возможным, поскольку ни микрофлора толстого отдела кишечника, ни тем более микрофлора волосистой части головы не отражают микробный пейзаж тонкого кишечника, особенно состояние пристеночной колонизации и, следовательно, нельзя точно знать какие конкретно колонисты кишечника и их антигены поступают из кишечника в общей кровоток и могут принимать участие в патогенезе заболевания.
Принципиально новым подходом к изучению микроорганизмов кишечника является молекулярный экспресс-метод газовой хроматографии-масс-спектро-метрии. Метод масс-спектрометрии позволяет получить уникальную информацию о составе мономерных химических компонентов микробной клетки и метаболитов [7]. Разные микроорганизмы имеют в сумме 200 жирных кислот, отличающих их от клеток организма человека. Число клеток или вес микроорганизмов вычисляется по концентрации вещества — маркера. Наличие маркеров микроорганизмов в крови обусловлено механизмом иммунного ответа на появление какого-либо возбудителя. В результате фагоцитоза, собственного аутолиза клеток, лизиса и воздействии различных компонентов иммунной системы клетки микроорганизмов разрушаются до мономерных составляющих биополимеров, которые поступают в кровь. То есть, наличие микробных маркеров в крови отражает состав микробных сообществ человека, независимо от места нахождения микроорганизмов или очага воспаления [8].
В отличие от посева фекалий на культуральные среды, по данным Осипова Г. А. [9], новый метод позволяет получить более достоверную информацию о микробиоте кишечной стенки, принимающей участие в различных физиологических процессах организма и, в
частности, в продукции химических веществ, негативно воздействующих на клетки кожи.
Целью нашего исследования явилось изучение количественного и качественного состава микрофлоры тонкого кишечника методом хромато-масс-спектромет-рии у больных с десквамативными поражениями кожи.
Материалы и методы исследования
Под нашим наблюдением находилось 22 пациента, в возрасте от 16 до 62 лет (13 мужчин и 9 женщин), в том числе 12 были с перхотью и 10 — с себорейным дерматитом, с длительностью заболевания от 1 года до 20 лет. Клинически у 7 пациентов с перхотью отмечались явления выраженного шелушения и сухости, у 5 эти симптомы сопровождались зудом и гиперемией. У 4 пациентов с СД процесс локализовался на коже волосистой части головы и коже лица с очагами десквамации, воспаления и инфильтрации. У 6 гиперкератоз распространялся и на другие участки кожного покрова, включая кожу головы, лица и туловища. Выпадение волос было отмечено у 3 пациентов с СД, протекающим в форме жирной себореи. В группе больных перхотью имела место сопутствующая гастроэнтерологическая патология в 50% случаях, при СД — в 70%.
В качестве контроля (нормы) использованы данные статистического анализа микробных маркеров в крови (п = 149), опубликованные ранее [10].
Цельную кровь в количестве 0,05 мл высушивали при добавлении метанола и подвергали кислому мета-нолизу в 1 М HCl в метаноле. Метанолиз проводили в 0,4 мл реактива в течение одного часа при 80 °С. В результате реакции метанолиза жирные кислоты освобождались в виде метиловых эфиров. Их двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл N, 0-бис-(триметилсилил)-трифто-рацетамида в течение 15 мин при 80 °С для получения метилсилильных эфиров гидрокси-кислот. Смесь эфиров в количестве 1 мкл вводили в инжектор ГХ-МС. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой.
Результаты и их обсуждение
При анализе результатов исследования были выявлены существенные нарушения количественного и качественного состава микрофлоры тонкого кишечника, главным образом его пристеночного слоя, что было расценено как дисбактериоз (табл. 1).
Для наглядности, результаты (усредненные) в сопоставлении с контролем приведены на рисунке 1.
Как видно на рисунке 1 дисбиотические изменения количественного состава основных представителей об-лигатной микрофлоры (бифидобактерий, лактобакте-рий и др.) имели такую же направленность, как и при дисбактериозах другой этиологии. Более чем в половине случаев (68,2%) имело место снижение количества бифидобактерий, у 50% больных — энтерококков, в том числе в 63,6% случаев — Enterococcus fae-calis. Однако обращает внимание, что при данной патологии практически у всех больных (95,4%) суще-
Таблица 1. Результаты исследования микробных маркеров в крови больных с перхотью и себорейным дерматитом методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (п = 22)
Микроорганизмы Оценка содержания микроорганизмов в тонком кишечнике (кл/гх105) у больных, в сравнении со средними показателями у здоровых лиц:
кратность повышено снижено кротость
Bifidobacterium 7 (31,8%) 15 (68,2%)
Lactobacillus 1 (4,6%) 21 (95,4%) 1,4
Enterococcus 11 (50%) 11 (50%)
Enterococcus faecalis 8 (36,4%) 14 (63,6%)
Eubacterium sp. 12 (54,5%) 1,6 10 (45,5%)
Eubacterium lentum 22 (100%) 5,6
Eubacterium moniliforme 13 (59,1%) - норма 0
Bacteroides ruminicola 5 (22,7%) 17 (77,3%)
Fusobacterium/ Haemophyius 16 (72,7%) — норма 0
Clostridium prop ionicum 7 (31,8%) 15 (68,2%)
Clostridium difficile 22 (100%) 1,9
Clostridium hys-toiyticum 7 (31,8%) 15 (68,2%) 2,9
Ciostridium ramosum 21 (95,4%) 1 (4,6%)
Ciostridium per-fringens 21 (95,4%) 1 (4,6%)
Актиномицеты 7 (31,8%) 11,2 15 (68,2%) 1,8
A ctinomycetes 10Mel4 10 (45,4%) 12 (54,5%)
Streptomyces 16 (72,7%) 2,9 6 (27,3%)
Nocardia, 14 : ldll 15 (68,2%) 1,9 7 (31,8%)
Nocardia asteroids 15 (68,2%) 1,7 7 (31,8%) 1,8
Pseudonocardia 6 (27,2%) 16 (72,7%)
Mycobacterium/ Candida 12 (54,5%) 10 (45,4%)
Микрогрибы, ситостерол 1 (4,6%) 21 (95,4%)
Микрогрибы, эргостерол 14 (63,6%) 8 (36,4%)
Pseudomonas aeruginosa 15 (68,2%) 7 (31,8%)
Ac netobacter 14 (63,6%) 8 (36,4%)
Baciiius cereus 14 (63,6%) 8 (36,4%)
Fia vobacterium 12 (54,5%) — норма 0 —
Porphyromonas 12 (54,5%) норма 0 —
Ruminicoccus 12 (54,5%) — норма 0
Campyiobacter mucosai s 7 (31,8%) 15 (68,2%)
Staphyiococcus 21 (95,4%) 1 (4,6%)
Staphyiococcus intermedius 10 (45,4%) 12 (54,5%)
Rhodococcus 10 (45,4%) 12 (54,5%)
Streptococcus 7 (31,8%) 15 (68,2%)
Prop ion¡bacterium acnes 5 (22,7%) 17 (77,3%)
Act nomadura 22 (100%)*
ственно (в среднем в 1,4 раза) снижено количество лактобактерий, которые в тонкой кишке в кооперации с организмом хозяина являются основным микробиологическим звеном колонизационной резистентности. В процессе нормального метаболизма лактобакте-рии способны образовывать молочную кислоту, перекись водорода, продуцировать лизоцим, другие вещества с антибиотической активностью в отношении представителей УПМ. Лактобациллам отводится также
иммуномодулирующая роль, в том числе стимуляция фагоцитарной активности нейтрофилов, макрофагов, синтеза иммуноглобулинов и др.
Из других представителей анаэробной симбиотиче-ской флоры тонкого кишечника, более чем в половине случаев (54,5%) повышалось количество ЕиЬас1епит ер. Причем, у всех больных существенно (в среднем в 5,6 раза) повышалось количество ЕиЬас1епит 1еп1ит, а в 59,1% случаев тонкий кишечник был заселен Еи-
Себорейный
Микроорганизм Норма дерматит,
перхоть
Streptococcus 249 111
Eubacterium lentum 68 385
Clostridium hystolyticum 95 32
Nocardia, 14 : Idll 262 515
Pseudomonas aeruginosa 4 5
Clostridium propionicum 288 72
Pseudonocardia 70 27
Streptomyces 62 175
Clostridium ramosum 769 4049
Corineform 605 248
Lactobacillus 6613 4644
Campylobacter mucosalis 99 26
Mycobacterium/Candida 549 496
E. coli 0 2
Eubacterium moniliforme 0 119
Cl. difficile 385 207
Prevotella 38 49
Eubacterium sp 6912 11376
Bacteroides fragilis 0 0
Staphylococcus 120 231
Bifidobacterium 5067 5357
Helicobacter pylori 14 31
Clostridium perfringens 12 89
Enterococcus 290 275
Propionibacterium 4480 3426
Streptococcus 229 537
MMKporpn6bi, KaMnecTepo^ 842 314
l4nT0Mera.ri0BMpyc 166 96
Actinomycetes 10Me14 309 239
Propionibacterium acnes 101 159
Ruminicoccus 640 800
Enterococcus faecalis 231 188
О 2000 4000 6000 8000 10000 12000
? > L f >
i p 1
>
i
"b p f f 1 3 1
Рйсунок 1. Диаграмма и таблица изменений численности части микробиоты кишечника, типичных для себорейного дерматита и перхоти
bacterium moniliforme, которые у здоровых лиц в тонком кишечнике практически не встречаются. Одновременно с этим количество анаэробных неспорообра-зующих микроорганизмов — бактероидов снижалось, в том числе у большинства больных (77,3%) за счет Bacteroides rummicola и в 72,7% случаев тонкий кишечник был обсеменен представителем анаэробной микрофлоры толстого кишечника — Fusobacterium/ Haemophylus, липидные маркеры которых в крови здоровых лиц не выявляются. Бактероиды принимают активное участие в пищеварении, расщепляют желчные кислоты, участвуют в процессах липидного обмена. Фузобактерии — это грамотрицательные бактерии семейства бактероидов, относятся к УПМ, метаболизируют пептоны, углеводы с образованием масляной кислоты, некоторые из них расщепляют желчные кислоты и вырабатывают экзотоксин с гемолитической активностью.
Одним из условий патогенности клостридий является их способность синтезировать и выделять в окружающую среду высокоэффективные токсины. Особая опасность клостридиальных инфекций заключается в спорообразующей природе возбудителя. Они практически нечувствительны к большинству химиоте-рапевтических препаратов и могут сохраняться в течение длительного времени в состоянии анабиоза, а при неблагоприятных условиях прорастать и размножаться. Попадая в пищеварительный тракт человека, часть вегетативных клеток гибнет при воздействии специфических и неспецифических факторов защиты макроорганизма, а споры беспрепятственно достигают толстого кишечника. Нормальное функционирование защитной флоры препятствует прорастанию кло-стридиальных спор и способствует их элиминации из организма.
В обследуемой группе больных были обнаружены изменения количественного и качественного состава клостридий: у большинства пациентов (68,2%) снижалось количество Clostridium propionicum и у всех больных среднем в 1,8 раза — Clostridium difficile. Изменения количественного содержании Clostridium hystolyticum были не однотипными, а именно — в 31,8% случаев обсеменение тонкого кишечника было значительным, в то время как у большинства больных (68,2%) содержание их было сниженным по сравнению с таковым у здоровых лиц в 2,9 раза. Обращает также внимание, что практически у всех больных (95,4%) тонкий кишечник был значительно обсеменен Clostridium ramosum и Clostridium perfringens. Из представителей УПМ, помимо клостридий, у большинства больных показатель обсемененности тонкого кишечника (кл/гх105) был повышен в отношении Pseudomonas aeruginosa (68,2%), Acinetobacter (63,6%), Bacillus cereus (63,6%). Кроме того, более чем в половине случаев (54,5%) пристеночный слой тонкого кишечника был заселен Flavobacterium, Por-phyromonas и Ruminicoccus, липидные маркеры которых в крови здоровых лиц не выявляются. Из представителей кокковой флоры практически у всех больных (95,4%) количественное содержание стафилококка и в 31,8% случаев — стрептококка было повышенным.
Значительные дисбиотические изменения в тонком кишечнике у больных перхотью и себорейным дерматитом имели место и в отношении количественного и качественного состава грибковой микрофлоры. У большинства больных выявлялось повышенное содержание лучистых грибов — актиномицетов и, в частности, рода Streptomyces (72,7%) и Nocardia, в том числе No-cardia asteroids (68,2%) — наиболее частых возбудителей атипического актиномикоза, в том числе протекающего и с поражением кожного покрова. Общее содержание актиномицетов, в том числе Actinomyc-etes 10Ме14 более чем в половине случаев (54,5%) было сниженным. Однако в группе больных (31,8%) с повышенным содержанием концентрация их в кишечнике увеличивалась в 11,2 раза. Характерным является также полное отсутствие в крови больных данной патологией маркеров Actinomadura.
Лучистые грибы актиномицеты содержат большое число различных ферментов: протеазы, кератиназы, хитиназы, липазы, амилазы, инвертазы и др. Участвуют во многих видах обмена, некоторые из них патогенные для человека, в частности род Нокроадия, многие их метаболиты относятся к биологически активным соединениям — антибиотикам, гормонам, витаминам, ферментам. Почти все они способны синтезировать витамин В-|2 и его аналоги, некоторые — В! и В>, биотин, пантотеновую и никотиновую кислоты и др. Некоторые являются продуцентами аминокислот — глутаминовой, аспарагиновой, валина, метионина, цистеина и др. Однако несмотря на обладание отдельными актиномицетами полезными свойствами, увеличение концентрации этих микроорганизмов следует рассматривать как патологические изменения микробиоценоза. Так, у иммунодефицитных больных актиномикоз приводит к серьезным нарушениям в иммунной системе, а при метастазировании актиноми-цетов в головной мозг и другие внутренние органы заболевание имеет летальный исход.
Практически у всех больных (95,4%) содержание микрогрибов, ситостерол было сниженным, а эргосте-рол — в 63,6% случаев повышенным, количество ко-ринебактерий (Corineform) у всех больных снижалось в 2,3 раза и у большинства больных (77,3%) имело место снижение количества Propiobacterium acnes.
Таким образом, полученные данные показали, что при перхоти и себорейном дерматите имело место снижение количества бифидобактерий, энтерококков и лак-тобактерий, являющихся основным микробиологическим звеном колонизационной резистентности кишечника. Одновременно увеличивалась численность клостридий группы C. ramosum, С. perfringes, а также главных анаэробов — Eubacterim sp. и актинобактерий Sterptomyces.
Заключение
Полученные результаты исследований свидетельствуют о резком повышении в крови у больных перхотью и себорейным дерматитом маркеров многих представителей микробной флоры кишечника. Особенно значительно было повышение отдельных представителей рода Clostridium ( Clostridium ramosum — в 5,2 раза), актиномицетов (в 11,2 раза), эубактерий (в
1,8 раза), кроме того в крови у этих больных с высоким постоянством обнаруживалось относительно умеренное повышение маркеров фузобактерий, актино-бактеров, Bacillus cereus, стафилококков и стрептококков. Одновременно у этих больных было понижено содержание маркеров бифидо- и лактобактерий, бактероидов, Enterococcus faecaUs, некоторых представителей актиномицетов, кампилобактера при полном исчезновении Clostridium difficale, Actinomadura и ко-ринеформных бактерий.
Выявленные изменения, с одной стороны, свидетельствуют о глубоком дисбактериозе у больных десквамативными поражениями кожи, а с другой, эти данные не позволяют говорить об участии конкретного колониста кишечника в патогенезе заболевания. Очевидно, что патогенетическое значение имеет совокупность нарушений в микробном сообществе желудочно-кишечного тракта. Принципиально важно, что результатом дисбиотических нарушений является массовое поступление антигенов микробных клеток из кишечника в кровь с последующей их фиксацией, благодаря предполагаемому родству, на клетках волосистой части головы. Таким образом, вполне вероятно запускается механизм аутоиммунной агрессии.
В предыдущих наших исследованиях [11] были представлены фактические материалы о вовлечении кожи волосистой части головы у больных перхотью и себо-рейным дерматитом в иммунопатологический процесс.
Совокупность полученных нами результатов позволяет выделить следующие звенья патогенетической цепи у больных перхотью и себорейным дерматитом. Первичным скорее всего является предрасположенность к специфическим для данного заболевания нарушениям биоценоза кишечника, которые выражаются преобладанием в пристеночном слое кишечника одних и подавлении других представителей кишечной микрофлоры. Грубые нарушения в пристеночной флоре формируют условия для массового поступления в кровь антигенов условно-патогенной ассоциации с последующей их фиксацией в клетках кожи и волосистой части головы. формирующиеся в коже антигенные комплексы включают механизмы аутоиммунной агрессии, приводящие к характерной клинической картине заболевания.
С учетом выявленных микробных нарушений в лечении больных с десквамативными поражениями кожи необходимо предусмотреть назначение лекарственных средств прежде всего направленных на подавление отдельных нежелательных представителей микрофлоры желудочно-кишечного тракта, восстановление нормального биоценоза тонкой кишки, на снижение уровня в крови бактериальных антигенов, принимающих участие в создании патологического комплекса на уровне кожи волосистой части головы. При тяжелых формах заболевания оптимальная программа лечения должна включать селективные антибиотики, комбинированные бактерийные препараты, иммунокорректоры, средства подавления Т-кле-точного цитолиза.
Выводы:
1. У больных себорейным дерматитом методом хромато-масс-спектрометрии в крови выявляется резкое повышение маркеров анаэробных обитателей кишечника — Clostridium ramosum, С. perfringens и основных видов рода Eubacterium при одновременном снижении уровня лактобацилл и коринебактерий.
2. Высказывается предположение, что обнаруженные в большом количестве представители кишечной флоры, благодаря тропности к клеткам волосистой части головы, принимают участие в формировании патологических комплексов, что запускает аутоиммунный процесс при себорейном дерматите.
3. Результаты проведенных исследований позволяют патогенетически обосновать программу лечения больных себорейным дерматитом с использованием антибиотиков, бактериальных препаратов, иммуно-корректоров и средств для подавления реакций клеточного цитолиза.
Литература:
1. Bergbrant I. M. Seborrhoeic dermatitis and Pityrosporom ovale: cultural, immunologycal and clirucal studies // Acta Derm. Venereol. — 1991. — Suppl. 167. — P. 1—36.
2. Faergermann J. Seborrhoeic dermatitis and Pityrosporom or-biculare: treatment of seborrhoeic dermatitis of the scalp with miconazole—hydrocortisone (Daktacort), miconazole and hydrocortisone // Br. J. Dermatol. — 1986. — 114. — P. 695— 700.
3. Нобл У. К. Микробиология кожи человека — М.: «Медицина», 1986. — 493 с.
4. Allergy development and the intestinal microflora during the first year of life / В. Biorksten et al. // J. Allergy, Clin. Immunol. — 108(4). — P. 516—250.
5. Volkova L. A. Impact of the impaired microflora on the course of acne vulgaris // L. A. Volkova, I. L. Khalif, I. N. Kabanova // Klin. Med. — Moskva. — January 1, 2001. — 79(6). — P. 39—41.
6. Полеско И. В. Иммунный статус у больных себорейным дерматитом // И. В. Полеско, Ю. С. Бутов // Росс. журнал кожных и венерических болезней. — 2004. — № 6. — С. 16—22.
7. Chemical Methods in Bacterial Systematic / Eds. Goodfellow M. and Minnikin D. E. — Acad. Press, London-Toronto, 1985.
8. Осипов г. А. Сравнительное хромато-масс-спектрометри-ческие исследования состава химических маркеров микроорганизмов в крови и биоптатах слизистой оболочки кишечника // г. А. Осипов, А. И. Парфенов, П. О. Богомолов // Росс. гатроэнтерологический журнал. — 2001. — № 1. — С. 55—58.
9. Осипов г. А. Определение состава и количества микроорганизмов кишечной стенки методом хтомато-масс-спектро-метрии по клеточным жирным кислотам // В кн. Бондарен-ко В. М., грачева Н. М., Мацулевич Т. В. «Дисбактериозы кишечника у взрослых». — КМК Scientific Press, Москва, 2003. — С. 89—98.
10. Beloborodova N. V. Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relatiorishi p / N. V. Beloborodova, О. А. Osipov // Microb. Ecol. Heal. Dis. — SCUP. — 12. — P. 12—21.
11. Полеско И. В. Роль микрофлоры кожи волосистой части головы и кишечника у больных себорейным дерматитом / / И. В. Полеско, В. В. Малиновская // Детские инфекции. — 2005. — Том 4, № 1. — С. 39—44.
