Метаболические и мембранные эффекты аминотиоловых антигипоксантов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ПСИХОНЕЙРОФАРМАКОЛОГИЯ

Резюме______________

Изучали влияние антигипоксантов с тиомочевинной группировкой: гутимина, амтизола, бемитила, алмида, производных бензтиазола (соединение 1) и тиазоло[5,4-^индола (соединения 2 и 3), а также мексидола при внеклеточном приложении в концентрациях 1, 10, 100 мкмоль, 1 и 10 ммоль на трансмембранные кальциевый, натриевый, калиевый медленный и быстрый ионные токи. Изученные антигипоксанты обладают выраженной мембранотропной активностью, которая может быть одним из механизмов их действия в условиях целостного организма.

Ключевые слова

гипоксия; гутимин; амтизол; алмид; бемитил; тиомочевинная группа; 2-аминобензимидазол; мексидол; ионные токи ^+, Na+, Ca2+); нейрон; 1-утпаеа stagnalis

© П.Д. ШАБАНОВ, А.И. ВИСЛОБОКОВ, В.В. МАРЫШЕВА,

К.Н. МЕЛЬНИКОВ; 2005

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ И МЕМБРАННЫЕ ЭФФЕКТЫ АМИНОТИОЛОВЫХ АНТИГИПОКСАНТОВ

ВВЕДЕНИЕ

Действие фармакологических средств чаще всего связано с их прямым влиянием на потенциалоуправляемые ионные каналы [2, 29, 44, 45] и/или мембранные рецепторы [19, 22, 26], представляющие собой интегральные белки (гликопротеины), пронизывающие липидный бислой мембраны. Потенциалоуправляемые ионные каналы в возбудимых мембранах клеток нервной и мышечной систем обеспечивают генерацию биоэлектрических импульсов и их функциональную активность. Мембранотропный эффект характерен для многих классов и групп фармакологических препаратов: местных анестетиков, противоаритмических, вазоактивных, бронхолитических, нейротропных и многих других веществ. Не исключением являются и антигипоксические средства, для которых описан преимущественно метаболический тип действия.

В ряде работ нами было показано мембранотропное влияние на ионные каналы нервных клеток ряда антигипоксантов, производных аминотиола: амтизола [10, 21], алмида и бемитила [3, 4, 21]. На кафедре фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова синтезированы новые перспективные антигипоксанты, содержащие в своей структуре тиомочевинную группировку.

В связи с отсутствием данных об их мембранотропной активности в настоящей работе было изучено их влияние на кальциевые, натриевые и калиевые ионные токи изолированных нейронов [17]. В работе также рассмотрены и обобщены результаты исследований мембранотропной активности других антигипок-сантов, разных по химической структуре, что, несомненно, может способствовать пониманию механизмов их цитофармаколо-гического действия.

МЕТОДИКА

Исследование антигипоксической активности

Фармакологические исследования проведены на беспородных белых мышах-самцах массой 18—20 г и на белых беспородных кры-сах-самцах массой 180—200 г. Исследуемые препараты растворя-

ли в дистиллированной воде и вводили внутри-брюшинно в объеме 0,2 мл за 30 мин до гипоксии. В эксперименте использовали эквимолярные дозы соединений. Препаратом сравнения служил антигипоксант амтизол, рекомендованный как эталонное средство для такого рода исследований [16, 17].

Гипобарическую гипоксическую гипоксию моделировали в барокамере «подъемом» мышей на «высоту» 10 000 м со скоростью 50 м/сек и экспозицией на «плато» в течение 90 минут. Оценку защитного действия изучали по средней продолжительности жизни во время гипоксиче-ского эпизода и по выживаемости животных.

У крыс гипоксическую гипоксию моделировали также в проточной барокамере «подъемом» на «высоту» 11 000 м со скоростью 50 м/сек, время пребывания на «высоте» 30 мин. Регистрировали время жизни на «высоте», а также количество выживших животных.

Гипоксию с гиперкапнией [16, 17] моделировали помещением животных в стеклянные банки объемом 250 мл с герметичными крышками, которые опускали крышкой вниз в кювету с водой на 3 см для избежания подсоса воздуха.

Препараты вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл за 30 мин до гипоксии. Гемическую гипоксию [16, 17] моделировали внутрибрюшинным введением 2 %-го раствора нитрита натрия в дозе 200 мг/кг.

Исследование мембранотропной активности

При изучении влияния антигипоксантов на ионные каналы объектом исследования были нейро-

ны брюхоногого моллюска прудовика большого (Ьутпаеа stagnalis). Из тела моллюска вырезали окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое 1045 затем обрабатывали 0,25 %-м раствором трипсина в течение 40 мин [9]. После обработки ганглии помещали в раствор без фермента и через 15 мин подвергали механическому разделению под бинокулярным микроскопом при помощи вольфрамовых игл и полиэтиленовой пипетки.

Для измерения трансмембранных ионных токов применяли метод внутриклеточного диализа и фиксации мембранного потенциала изолированных нейронов [11, 38]. Перфузирующий раствор (табл. 1), в который добавляли исследуемые вещества, подавали в камеру, где находился нейрон на полиэтиленовой микропипетке, а диализирую-щий—внутрь этой пипетки.

Фармакологические средства

В разных сериях экспериментов были изучены: гутимин, амтизол, бемитил, алмид, мексидол, 2-аминобензтиазол (соединение 1), гидробромиды 2-амино-4-ацетил-8б-гидрокси-3а,8б — дигидротиазоло[5,4-Ь]индола (соединение 2) и 2-амино-4-ацетил-7-бром-8б-гидрокси-3а,8б — дигидротиазоло[5,4-Ь]индола (соединение 3)

[14, 15], строение которых отличается одним атомом в бензольном кольце (рис. 1). 2-Аминобенз-тиазол по антигипоксическому действию является аналогом плохо растворимого в воде 2-амино-4-ацетилтиазоло[5,4-Ь]индола [13].

Все вещества были взяты в виде субстанции и изучались в концентрациях: 1, 10, 100 мкмоль и 1 и 10 ммоль при внеклеточном приложении к нейрону, а амтизол — и при внутриклеточном.

Таблица 1

Ионный состав растворов (в ммоль) для нейронов прудовика

Регистрируемые токи Химические компоненты раствора рН

NaCl CsCl CaCli MgCli КС1 трис-ОН

Внеклеточные (перфузирующие) растворы

Суммарный входящий 100 — i l,5 s i 7,s

Кальциевый входящий — loo lo l,5 — i 7,s

Натриевый входящий 110 — — l,5 — i 7,s

Калиевые выходящие 100 — i l,5 s i 7,s

тр ну В иклеточные (диализирующие) растворы

Входящие — 120 — — — i 7,4

Калиевые выходящие — — — — lio i 7,4

H N-C-NH-C-NH

2

и и NH S

I

2

NH

h2n-

h3c^V

3N

'OH

C2H5

CH2-COOH

2

CH2-COOH

III

N

N

S

II

C2H5

■HBr

IV

CH2-CH=CH2 . HCl

NH

VI

VII VIII

Рис. 1

Структурные формулы исследованных веществ:

I — гутимин, II — амтизол, III — мексидол, IV — бемитил, V — алмид, VI — 2-аминобензтиазол, VII — гидробромид 2-амино-4-ацетил-8б-гидрокси-3а,8б-дигидротиазоло[5,4-Ь]индола, VIII — гидробромид 2-амино-4-ацетил-7-бром-8б-гидрокси-3а,8б-дигидротиазоло[5,4-Ь]индола

А

I ,нА I ,нА

Рис. 2

Влияние гутимина на ионные токи нейронов моллюска при рН 6,0 (А-В) и 9,0 (Г-Е):

А и Г — вольт-амперные характеристики, Б и Д — зависимости натриевого тока от поддерживаемого потенциала, В и Е инактивационные характеристики. 1 — контроль; 2 — при действии гутимина 10 ммоль; 3 — после 10 мин отмывания

8

Б

Д

4

0

В

Е

40 V ,мВ

Кривые ионных токов оценивали визуально на экране осциллографа, вводили в компьютер и распечатывали. На основании полученных данных с помощью компьютера были построены зависимости «концентрация-эффект». Результаты обрабатывали статистически с использованием /-критерия Стьюдента и статистического пакета Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эффекты гутимина

В совместной работе [23] было показано, что в условиях гипоксии головного мозга кошки гутимин (100 мг/кг внутривенно), предварительно введенный животному, задерживал развитие снижения рО2 в коре мозга. Если в контрольных опытах это снижение до 20 % от исходного уровня происходило за 95,0 ± 10с, то на фоне гутимина — за 164,2 ± 11,3 с (р < 0,01). Одновременно с этим гутимин задерживал появление характерных для гипоксии увеличения частоты и снижения амплитуды фоновой импульсной активности корковых нейронов. При растворении гутимин защелачивал среду и обладал буферными свойствами. Анализ мембранных механизмов действия антигипоксан-та гутимина в дальнейшем был проведен на изолированных нейронах моллюска.

Эти опыты с изучением влияния гутимина на натриевые токи были проведены на фоне разных рН наружных растворов. Так, при рН 7,5 в концентрации 1-10 ммоль он оказывал слабое действие на нейроны, но оно усиливалось при рН в наружном растворе 6,0 и 9,0. В кислой среде при действии на нейрон в концентрации 10 ммоль гу-тимин значительно подавлял натриевые токи (на 65-80 % от нормы) и на 3-5 мВ сдвигал максимум вольт-амперной характеристики мембраны вправо по оси потенциалов, что видно на вольт-амперной (рис. 2А) и инактивационной (рис. 2Б) характеристиках.

В щелочной среде гутимин не подавлял натриевые токи, но сильно (на 20-25 мВ) сдвигал инак-тивационные характеристики этого тока влево по оси потенциалов (рис. 2Д и 2Е), что может указывать на увеличение отрицательного потенциала фиксированных на мембране зарядов под влиянием гутимина (возможно, из-за наличия некомпенсированных зарядов в молекуле гутимина). Подобные изменения наблюдаются при снижении ионов кальция в наружной среде.

Поскольку рКа гутимина равен 6,0, то при этом рН (то есть 6,0) 50 % молекул гутимина находится в катионной форме и 50 % — в нейтральной, а при

рН 9,0 — они полностью в нейтральной. Катионная форма гутимина, вероятно, и блокирует натриевые каналы, а нейтральная — только изменяет 1047 распределение фиксированных на мембране зарядов. В реальных условиях организма могут иметь значение и буферные свойства гутимина, препятствующие закислению среды при гипоксии. Ввиду влияния гутимина на потенциал поверхностного заряда и смещения потенциалозависимых характеристик мембраны влево по оси потенциалов его влияние на клетку эквивалентно гиперполяризации.

Эффекты амтизола

Влияние амтизола (3,5-диамино-1-тиа-2,4-диа-зола), циклического производного гутимина, на электрическую активность и трансмембранные ионные токи нейронов моллюсков было изучено в концентрациях 0,1-3 ммоль [10]. Опыты проведены на интактных идентифицированных нейронах правого париетального ганглия ППа1 и ППа7 виноградной улитки Helix pomatia в режиме фиксации тока и регистрации потенциалов внутриклеточными микроэлектродами, а также на изолированных нейронах виноградной улитки и прудовика Lymnaea stagnalis в режиме фиксации мембранного потенциала в условиях внутриклеточной перфузии. В нейроне ППа7 с ритмической генерацией потенциала действия (ПД) амтизол в концентрации 3 ммоль вызывал небольшую деполяризацию (3-6 мВ) и повышение частоты ПД. В нейроне ППа1 с пачечной импульсной активностью амтизол увеличивал частоту и количество ПД в пачке и уменьшал их амплитуду. При этом, увеличивалась и длительность волны деполяризации в пачке ПД в 3-10 раз. Изменения были обратимы и воспроизводились многократно. Характер влияния амтизола в концентрации 0,1 ммоль был сходным, но менее выраженным.

В концентрациях до 5 ммоль амтизол практически не влиял на амплитуду и кинетику натриевых и кальциевых и амплитуду калиевых ионных токов, но в концентрации 3-5 ммоль обратимо, хотя и труднообратимо, устранял инактивацию медленных калиевых токов. При внутриклеточном приложении амтизола эффект также воспроизводился.

Этот эффект напоминает влияние на инактивацию натриевых каналов фермента проназы, отщепляющей их «инактивационную частицу». Медленная обратимость эффекта амтизола, по-видимому, свидетельствует о том, что участок взаимодействия с амтизолом находится в толще липидного матрикса. Под влиянием амтизола иногда проис-

Таблица 2

Исследование соединений 1—3 на различных моделях гипоксии

Группа животных , мг/ , внутрибрюшинно Число животных Выживаемость , % Продолжительность , Продолжительность , % по отношению к контролю Кз

Гипобарическая гипоксия

. — 10 20,0 14,04 ± 7,02 — —

Амтизол 25,0 9 77,8 22,21 ± 8,07 158 1,48

1 32,5 6 66,7 22,61 ± 4,87 161 1,39

. — 10 — 3,92 ± 2,12 — —

Амтизол 25,0 9 89,0** 10,16 ± 2,03** 259 1,89

2 71,4 9 89,0** 10,58 ± 2,24** 270 1,89

3 88,5 8 62,5* 4,83 ± 1,01 123 1,63

Гипоксия с гиперкапнией

. — 6 — 27,95 ± 5,92 — —

Амтизол 25,0 7 — 44,90 ± 8,57** 161 —

1 32,5 6 — 61,63 ± 14,24*** 182 —

3 88,5 6 — 22,07 ± 4,01 79 —

. — 9 — 21,78 ± 6,88 — —

Амтизол 25,0 8 — 42,05 ± 9,42 193 —

2 71,4 10 — 27,32 ± 7,90 125 —

Гемическая гипоксия

. — 7 — 29,83 ± 10,09 — —

Амтизол 25,0 6 — 43,07 ± 7,21* 144 —

1 32,5 6 16,7 57,17 ± 12,21** 192 1,17

3 88,5 6 — 35,61 ± 16,57 119 —

. — 9 — 24,67 ± 7,82 — —

Амтизол 25,0 9 — 44,94 ± 10,53 182 —

2 71,4 10 — 19,63 ± 2,96 80 —

Примечание: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 в сравнении с группой контрольных животных.

ходило также нарушение инактивации кальциевых токов, но оно было обусловлено избирательным подавлением выходящего водородного тока, что также является вторым (помимо устранения инактивации калиевого тока) уникальным эффектом для этого соединения. Блокированием протонного тока, вероятно, объясняется влияние амтизола на импульсную и залповую активность нейронов.

Антигипоксические свойства амтизола и новых соединений

Изучение антигипоксической активности исследуемых соединений на различных моделях гипоксии (табл. 2) показало, что все они в той или иной степени обладают данным видом активности. На модели гипобарической гипоксии все соединения

проявляют антигипоксическую активность: соединение 2 проявляет свойства на уровне эталонного препарата (амтизол) как по продолжительности жизни, так и по выживаемости животных; соединение 1 несколько уступает эталону по показателю выживаемости (66,7 % против 77,8 %); соединение 3 уступает эталону по обоим показателям, однако защищает от гибели 62,5 % мышей при гибели всех животных в контроле. По активности на этой модели соединения можно расположить в следующем порядке: соединение 2 = амтизол > соединение 1 > соединение 3 (вещества расположены в порядке убывания активности).

На модели гипоксии с гиперкапнией соединение 1 превосходит амтизол по показателю продолжительности жизни опытных животных и увеличивает срок жизни в 1,82 раза против 1,61 раза соответственно; соединение 2 — на 25 % (не достоверно по отношению к контролю); соединение 3 — не изменяет продолжительность жизни. По активности на этой модели соединения можно расположить в таком порядке: соединение 1 > амтизол > соединение 2 > соединение 3.

На модели гемической гипоксии соединение 1 увеличивает время жизни животных в 1,92 раза, а амтизол — в 1,44 раза. Кроме того, соединение 1 еще и защищает от гибели 16,7 % мышей. Соединение 3 имеет тенденцию к увеличению продолжительности жизни в 1,19 раза (не достоверно), а соединение 2 ее не изменяет. По активности на этой модели соединения можно расположить таким образом: соединение 1 > амтизо-л > соединение 3 > соединение 2.

Таким образом, суммируя все полученные результаты по антигипоксической активности на трех моделях, исследованные соединения можно выстроить в следующий ряд: соединение 1 > амтизол > соединение 2 > соединение 3 (вещества расположены в порядке убывания активности).

Влияние антигипоксантов на калиевые ионные токи

A

^9 140

И V 100

0 б0

0 20

1 2 3 амтизол

140

100

1 10

гаи îstai

0

-б -5 -4 -З C, 1*10n, M

1 2 З амтизол

50

30

10

-10

1 и амтизол 10 мМ

Рис. З

Влияние антигипоксантов на калиевый медленный ионный ток нейронов прудовика :

А — зависимости «концентрация-эффект»; по оси абсцисс — концентрация, по оси ординат — калиевый ионный ток (отношение I — контроля к 10 — придействии, %),

поддерживаемый потенциал-------100 мВ, тестирующий —

30 мВ. Доверительные интервалы при р = 95%;

Б — влияние антигипоксантов в концентрациях 1 и 10 ммоль; В — влияние амтизола на инактивацию калиевых медленных токов нейронов прудовика, поддерживаемый

потенциал-----60 мВ, сдвиги деполяризации — цифры

справа возле кривых токов. Контроль (а — кривые токов и б — вольт-амперные характеристики для пиковых значений токов — 1 и достигаемых в конце 6-с смещения потенциала — 2), влияние амтизола в концентрации 3 ммоль (соответственно в и г); Г — сравнение влияния антигипоксантов на кинетику инактивации калиевого медленного тока: 1 — амтизол; 2 — контроль;

3 — отмывание; 4 — соединение 1

Б

В

a

б

Г

Исходные средние величины калиевого медленного тока нейронов были около 75 нА, а калиевого быстрого — около 30 нА, что свидетельствует об их хорошем функциональном состоянии. Результаты влияния антигипоксантов на медленные калиевые токи представлены на рис. 3. Видно, что существенных различий в характере действия этих четырех веществ не наблюдается (рис. 3А). Все вещества в концентра-

циях 1—1000 мкмоль незначительно и примерно в одинаковой степени увеличивают ток. При повышении же концентрации до 10 ммоль проявляется подавляющее действие на каналы (рис. 3Б). При этом по силе подавления токов их можно расположить в ряд: соединение 2 >соединение 1 > сое-динение 3 > амтизол. Эффекты увеличения и подавления токов развивались быстро (за десятки секунд) и снимались при отмывании так

же быстро (за 1—2 мин), что указывает, с одной стороны, на высокую их способность подводиться к структурам ионных каналов и, с другой, — на невысокую степень связывания. После действия антигипоксантов наблюдалось увеличение калиевого тока до 110—120 % от исходных значений. Следует отметить, что в отличие от соединений 1—3, после действия амтизола такого увеличения токов практически не наблюдалось.

Под влиянием всех препаратов в концентрациях 1 — 100 мкмоль кинетика развития ионного тока не изменялась, что указывает на отсутствие взаимодействия их молекул с воротными структурами каналов. Характер изменения кинетики медленного калиевого тока при более высоких концентрациях показан на рис. 3В — для амтизола и на рис. 3Г — для других соединений. Обращает на себя внимание, что амтизол в концентрациях 1 — 10 ммоль практически полностью и труднообратимо устранял инактивацию калиевого медленного тока.

Шрушение инактивации наблюдали и при внутриклеточном приложении амтизола. Оно не зависело от ионов кальция в наружном растворе и сохранялось при удалении ионов кальция из наружного раствора, при добавлении в наружный раствор кальциевых антагонистов (раствора Д-600, ионов кадмия) или внутрь клетки этилендиаминтетрааце-тата (ЭДТА).

Еще одной интересной особенностью в действии на калиевый медленный ток обладает соединение 1. В противоположность амтизолу, только под его влиянием наблюдалось обратимое ускорение процесса инактивации тока (рис. 3Г, кривая 4).

^специфические токи утечки мембраны под влиянием всех веществ незначительно возрастали, что указывает на стабилизацию мембраны. Под влиянием амтизола в концентрации 1 — 10 мкмоль неспецифические токи утечки в большинстве случаев незначительно повышались, что указывает на увеличение дестабилизации мембраны, но при более высоких концентрациях антигипоксанта также происходило снижение токов утечки.

Влияние антигипоксантов на быстрые калиевые токи представлено на рис. 4. Характер их действия на амплитуду быстрого калиевого тока, кроме соединения 1, внешне напоминал влияние на медленный калиевый (рис. 4А, кривая 2). Отмывание нейронов также быстро приводило к полному восстановлению токов. Кинетика развития быстрого калиевого тока при действии антигипок-сантов практически не изменялась. Специфичес-

100 < 50 0

-50

-100

C, 1*10n, M

F

1 — 10 мМ

t = 200 ms

100

< 50 Н

с

<2 0 -50 -100-

Рис. 4

Р

амтизол 10 мМ

t = 200 ms

I

Влияние антигипоксантов на калиевый быстрый ионный ток нейронов прудовика:

А — зависимости «концентрация-эффект»; по оси абсцисс — концентрация, по оси ординат — ионный ток (отношение I — контроля к 10 — при действии, %);

Б — влияние соединения 1 в концентрации 10 ммоль:

1 — контроль; 2 — соединение 1; 3 — отмывание; Поддерживаемый потенциал — -80 мВ, тестирующий — 30 мВ; В — влияние амтизола в концентрации 10 мМ.

В — отсутствие влияния амтизола [2] на кинетику тока (1 — контроль; 3 — отмывание)

кое, более избирательное, подавляющее действие соединения 1, сходное с избирательным действием 4-аминопиридина на эти токи, видно на рис. 4А на кривой зависимости «концентрация-эффект» (кривая 2) и рис. 4Б, кривая 2, где часть быстрого тока была обратимо подавлена. Амтизол и другие исследованные соединения подобным действием не обладали (рис. 4В).

В

A

130

S' 120

<e

C

sf 110 100 90 80

□ 1 □ 2 □ 3

10

100

1000

мкМ

Рис. 5

Влияние антигипоксантов на кальциевый ток нейронов прудовика :

А — зависимости «концентрация-эффект»; по оси абсцисс — концентрация, по оси ординат — ионный ток (отношение I — контроля к 10 — при действии,%);

Б — влияние соединения 1 в концентрации 1000 мкмоль: 1 — контроль; 2 — ускорение инактивации под влиянием соединения 1; 3 — отмывание. Поддерживающий потенциал------100 мВ, тестирующий — 10 мВ

Б

Влияние антигипоксантов

на кальциевые токи

Результаты представлены на рис. 5. Видно, что достоверных различий в характере действия соединений не наблюдается. Следует отметить, что в концентрациях 1-100 мкмоль все вещества незначительно и примерно в одинаковой степени увеличивают кальциевый ток, а при повышении концентрации до 1000 мкмоль — проявляют подавляющее действие на каналы, в то время как калиевые токи подавлялись в концентрации 10 ммоль.

По силе подавления токов их можно расположить в ряд: соединение 3 > соединение 1 > соединение 2. Эффекты увеличения и подавления токов развивались быстро, как и при действии на калиевые токи.

Под влиянием всех препаратов в концентрациях 1-100 мкмоль кинетика развития ионного тока не изменялась, а при более высоких концентрациях (1000 мкмоль) под влиянием только соединения 1 происходило обратимое ускорение инактивации кальциевого тока (рис. 5Б, кривая 2).

В противоположность ему амтизол замедлял процесс инактивации. Сдвига вольт-амперных характеристик кальциевых каналов по оси потенциалов, то есть изменения потенциала фиксированных зарядов на мембране, не происходило. Неспецифические токи утечки мембраны под влиянием всех веществ незначительно снижались, что указывает на стабилизацию мембраны.

Влияние антигипоксантов на натриевые токи

Результаты представлены на рис. 6. Видно, что достоверных различий в действии всех исследован-

A

120

80

40

ña

й

i

□ 1 □ 2 □ 3

I

1 10 100 1000

мкМ

Влияние антигипоксантов на натриевый ток нейронов:

А — зависимости «концентрация-эффект»; по оси абсцисс — концентрация, по оси ординат — ионный ток (отношение I — контроля к 10 — при действии, %); Б — влияние соединения 3 в концентрации 1000 мкмоль: 1 — контроль; 2 — соединение 3;

3 — отмывание. Поддерживающий потенциал — -100 мВ, тестирующий — 0 мВ

0

Б

ных соединений на натриевые токи не наблюдается. При сравнении с данными о влиянии на кали-1052 евые и кальциевые токи можно отметить, что в концентрациях 1 — 100 мкмоль все вещества не увеличивают натриевый ток, а при повышении концентрации до 1000 мкмоль — подавляют его, причем в большей степени, чем подавлялись кальциевые токи. По силе подавления токов их можно расположить в ряд: соединение 1 > соединение -3 > соединение 2. Эффекты увеличения и подавления токов развивались быстро, как и при действии на калиевые и кальциевые токи. Под влиянием всех препаратов кинетика развития ионного тока не изменялась (рис. 6Б, кривая 2) и сдвига вольт-амперных характеристик натриевых каналов по оси потенциалов не происходило. Изменения токов также были обратимыми.

Полученные результаты о влиянии амтизола и соединений 1 — 3 на ионные каналы нейронов свидетельствуют, что все они являются активными мембранотропными веществами, способными менять проводимость ионных каналов нервных клеток [1—3, 16, 18]. Доказательством этому служат обратимые активация и подавление ионных токов в концентрациях 1 — 100 мкмоль и 1 — 10 ммоль, а для соединения 1 вплоть до полного подавления калиевых быстрых токов в концентрации 10 ммоль. При этом по силе подавления калиевых ионных токов их можно расположить в ряд: соединение 2 > соединение 1 > соединение 3 > амтизол. Весьма интересной является активация токов при действии антигипоксантов в малых концентрациях 1 — 100 мкмоль и при их отмывании после действия (кроме амтизола). В основе подобных эффектов может лежать активация процессов фосфорилирования-дефос-форилирования канальных белков, стабилизация мембран, способствующая более быстрым кон-формационным взаимопереходам ионных каналов [7, 18, 24] между состояниями (закрытое — открытое — инактивированное). H исключается также влияние на экспрессию ионных каналов и встраивание их в плазматическую мембрану [20]. По способности активировать ионные токи вещества можно расположить в иной ряд: соединение 2 > соединение 1 = соединение 3 > амтизол. Быстрое восстановление ионных токов при отмывании свидетельствует о слабой степени связывания со структурами мембраны. Кроме того, обращает на себя внимание и то, что все соединения изменяли неспецифические токи утечки мембраны, то есть обладали стабилизирующе-дестабилизирующей активностью. Следует отметить также, что в целом мембранотропная активность всех препаратов

была примерно равноэффективной, хотя имеются определенные различия в действии на отдельные ионные токи. Вместе с тем это не дает основания сделать заключение о корреляции между мембранотропной и антигипоксической активностью исследованных соединений. Эффекты амти-зола можно связать с еще одним механизмом — способностью блокировать так называемый выходящий потенциалозависимый протонный ток, что было показано ранее [6, 8]. В условиях исключения протонного тока (когда в нейроне рH поддерживался на уровне 8,2 и протонный ток отсутствовал) амтизол не вызывал замедления инактивации кальциевого тока. H устранении инактивации калиевого медленного тока блокирование протонного тока не сказывалось. Поэтому, можно считать, что эффекты амтизола на импульсную активность нейронов, скорее всего, связаны с его способностью блокировать протонный ток. Амтизол и другие ан-тигипоксанты не сдвигали максимума вольт-ампер-ных и инактивационных характеристик мембраны нейронов по оси потенциалов, то есть не влияли на потенциал фиксированных зарядов мембраны.

Анализируя результаты исследованой мембра-нотропной активности всех изученных антигипоксантов, можно предположить, что их защитные реакции на системном уровне организма, вероятно, могут быть связаны с тем, что в малых концентрациях они способны гиперполяризовать мембрану клеток и активировать работу ионных каналов, стабилизировать генерацию потенциалов действия в гипоксических условиях, а в более высоких концентрациях — блокировать ионные токи, снижать возбудимость клеток и оказывать при этом защитное от перегрузок действие. Так, блокирование калиевых ионных каналов может приводить к увеличению длительности потенциалов действия нейронов и усиленному выбросу медиаторов в синаптических структурах и активации межнейронных отношений, повышая надежность работы и способствуя сохранению и закреплению следов активности. Активация натриевых и кальциевых каналов может приводить к увеличению амплитуды ПД возбудимых мембран и повышать надежность их функционирования, блокирование же натриевых и кальциевых токов, напротив, — к снижению амплитуды ПД, снижению возбудимости, к защите клеток от перегрузок. Амтизол, блокируя протонный ток и влияя через него на инактивацию кальциевого тока, устраняет инактивацию калиевых медленных каналов, а соединение 1 преимущественно блокирует быстрый калиевый ток, что можно рассматривать как по-

Рис. 7

Влияние антигипоксантов на кальциевый ионный ток нейронов прудовика:

А — зависимости «концентрация-эффект»; по оси абсцисс — концентрация, по оси ординат — ионный ток;

Б — изменения ионного тока под влиянием мексидола; 1 — контроль; 2 — мексидол — 1000 мкмоль; 3 — отмывание.

Поддерживаемый потенциал------80 мВ (Т0, Т3, Т4), тестирующий----10 мВ (Т1, Т2). Т1 — 5 мс, Т2 — 20 мс, Т3 — 10 мс,

Т4 — 100 мс

A

лезное свойство для изучения мембранных механизмов деятельности нервных клеток.

Эффекты алмида, бемитила и мексидола

Основные данные об изменениях кальциевого тока под влиянием антигипоксантов в различных концентрациях представлены на рис. 7А в виде зависимостей «концентрация-эффект». Исходные

A

Рис. S

средние величины кальциевого тока нейронов были около 15 нА.

Видно, что алмид, бемитил и мексидол дозозависимо, но примерно в одинаковой степени, подавляли ток в области концентраций 100 и 1000 мкмоль. При этом по силе подавления токов в концентрации 1000 мкМ их можно расположить в ряд: алмид (40 %) > бемитил = мексидол (30 %).

При этом эффект развивался быстро (за десятки секунд) и снимался при отмывании также быстро (за 1-2 мин), что указывает, с одной стороны,

Влияние антигипоксантов на натриевый ионный ток нейронов прудовика:

А — зависимости «концентрация-эффект»: по оси абсцисс — концентрация, по оси ординат — ионный ток; Б — влияние мексидола: 1 — контроль, 2 — мексидол 100 мкмоль, 3 — отмывание.

Поддерживаемый потенциал------80 мВ, Т = 20 мс

Б

на высокую способность подводиться к структурам ионных каналов, а с другой, — на невысокую степень связывания.

Обратимость эффектов подавления кальциевого тока после 2—3 мин отмывания — до 100—110 % от исходных значений, а увеличение тока в последействии не наблюдалось только для алмида. Сразу же можно сказать, что такой же характер последействия относится к натриевому и калиевому ионным токам.

Под влиянием всех препаратов кинетика развития кальциевого ионного тока не менялась (рис.-7Б), что указывает на отсутствие взаимодействия их молекул с воротными структурами каналов. Регистрация вольт-амперных характеристик кальциевого тока при действии антигипоксантов позволила установить, что его максимум не смещался по оси потенциалов, что указывает на отсутствие изменений потенциала фиксированных зарядов мембраны. ^специфические токи утечки мембраны под влиянием алмида и бемитила при регистрации кальциевого и медленного калиевого токов практически не менялись и незначительно возрастали при регистрации натриевого тока (что указывает на дестабилизацию мембраны), когда в растворе отсутствовали ионы кальция. Под влиянием мек-сидола неспецифические токи утечки в большинстве случаев незначительно понижались, что указывает увеличение стабильности мембраны.

Влияние антигипоксантов на натриевый ток нейронов показано на рис. 8. Исходные величины натриевого тока нейронов были 10—15 нА. Из зави-

симости «концентрация-эффект» (рис. 8А) можно сделать вывод, что алмид, бемитил и мексидол примерно в одинаковой степени подавляют натриевый ток. В концентрации 1000 мкмоль алмид подавлял натриевый ток до 50 %, бемитил — 65 % и мексидол — до 70 % от исходных амплитуд. Восстановление тока после действия антигипоксантов происходило до 100—105 % от их исходных величин. Характер изменения натриевого тока под влиянием мексидола показан на рис. 8Б, где видно снижение амплитуды и неизменность кинетики, свойственные также действию алмида и бемитила.

Вольт-амперные характеристики мембраны для натриевого тока при действии антигипоксантов не смещались по оси потенциалов.

Результаты о влиянии алмида, бемитила и мексидола на выходящий медленный калиевый ток представлены на рис. 9. Исходные значения величины тока были около 40 нА. Из зависимостей «концентрация-эффект» (рис. 9А) видно, что различия в характере действия незначительны. При этом по силе подавления калиевого тока исследованные антигипоксанты можно расположить в ряд: алмид > бемитил > мексидол (сходно с влиянием на кальциевый и натриевый токи).

H основании представленных данных можно заключить, что влияние антигипоксантов на медленный калиевый ток сходно с их действием на кальциевый и натриевый токи. Восстановление калиевого тока в процессе отмывания нейронов происходило так же, как в случаях для кальциевого и натриевого токов — до 100—108 %. Харак-

Б

Рис. 9

Влияние антигипоксантов на калиевый медленный ионный ток нейронов прудовика:

А — зависимости «концентрация-эффект»: по оси абсцисс — концентрация, по оси ординат — ионный ток;

Б — влияние мексидола: 1 — контроль; 2 — мексидол 500 мкмоль; 3 — мексидол 1000 мкмоль; 4 — отмывание. Поддерживаемый потенциал------80 мВ (T0, T3, T4), тестирующий — 20 мВ (T1, T2). Т1 — 50 мс, Т2 — 3 с, Т3 — 100 мс, Т4 — 1с

тер изменения медленного калиевого тока показан на рис. 9Б. Видно снижение амплитуды тока и неизменность кинетики.

Влияние антигипоксантов на быстрые калиевые токи подробно не изучалось, но несколько наблюдений на 2-3 нейронах получено. Характер их действия на быстрый калиевый ток внешне напоминал влияние на медленный калиевый. Отмывание нейронов так же быстро приводило к полному восстановлению токов. Кинетика развития быстрого калиевого тока при действии антигипоксан-тов практически не изменялась.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Известно, что в основе фармакологического действия лекарств лежит их физико-химическое или химическое взаимодействие с определенными «мишенями» в биологическом субстрате. Возможность же взаимодействия лекарства с биологическим субстратом зависит в первую очередь от химического строения каждого из них. Последовательность расположения атомов, пространственная конфигурация молекулы, величина и расположение зарядов, подвижность фрагментов молекулы относительно друг друга влияют на прочность связи и, тем самым, на силу и продолжительность фармакологического действия. Молекула лекарственного вещества в большинстве случаев имеет очень маленький размер по сравнению с биологическими субстратами, поэтому она может соединяться только с небольшим фрагментом макромолекулы рецептора. При любой реакции между лекарством и биологическим субстратом образуется химическая связь.

Известно также, что связь между двумя различными веществами может быть обратимой или необратимой, временной или прочной. Она образуется благодаря электростатическим и ван-дер-ва-альсовым силам, водородным и гидрофобным взаимодействиям. Прочные ковалентные связи между лекарством и биологическим субстратом встречаются редко. ^пример, некоторые противоопухолевые средства за счет ковалентного взаимодействия «сшивают» соседние спирали ДHK, являющейся в данном случае субстратом, и необратимо повреждают ее, вызывая гибель опухолевой клетки.

Взаимодействие с субстратом может быть по типу конкурентного действия (вызывая блокирующий, литический эффект, антагонизм) или не-

конкурентного взаимодействия. В первом случае лекарственное средство по структуре частично похоже на сигнальную молекулу, что позволяет вза- 1055 имодействовать с рецептором, образуя над ним экран. Возникает конкурентная борьба за рецептор, в которой лекарственное средство имеет «преимущество». Поэтому, естественный медиатор или гормон вытесняется, и реакция не «запускается». Во втором случае молекула лекарственного средства связывается с рецепторной макромолекулой не в месте ее взаимодействия с медиатором, а на другом участке. При этом изменяется пространственная структура рецептора, что облегчает или затрудняет его контакт с естественным медиатором [5, 12, 26].

Показано [11, 25, 28], что многие из исследованных мембраноактивных соединений изменяют кинетику ионных токов, что свидетельствует о непосредственном их взаимодействии с воротными частицами каналов. Вероятно, существует также и их неспецифическое липоидотропное действие за счет изменения жидкостно-мозаичных свойств би-липидного слоя нейрональной мембраны и неселективного снижения ее ионной проницаемости.

В наших экспериментах антигипоксические средства уменьшали неспецифические токи утечки мембраны, то есть увеличивали ее стабильность, а параллельно снижали или иногда увеличивали амплитуду ионных токов. В случаях преимущественных эффектов на те или иные каналы можно говорить об избирательном взаимодействии мембраноактивных препаратов со структурами ионных каналов. Данные литературы подтверждают, что потенциалозависимые каналы различных типов имеют в целом сходную молекулярную ультраструктуру в силу общности их эволюционно-генетического становления [12]. Особенно наглядно это выступает при сравнении их величин ЕС50 [2, 18, 27], свидетельствующих о том, что строгой избирательности действия исследованных веществ на те или иные токи не обнаружено. Так, среди наиболее активных блокаторов ионных каналов находятся и анестетики (тетракаин, леокаин, бупивакаин), и про-тивоаритмические средства (верапамил, этацизин), и опиатные аналгетики (буторфанол, промедол). Наиболее слабыми блокаторами могут также выступать и некоторые анестетики (лидокаин), и про-тивоаритмические средства (этмозин), и аналгети-ки (клофелин, гуанфацин, морфин и трамадол).

Особый интерес представляет влияние многих фармакологических средств в малых и сверхмалых дозах (менее 1 мкмоль) [2, 36] и низкоинтенсивное лазерное излучение [7, 8], вызывающее активацию

(увеличение амплитуды) ионных токов и снижение неспецифических токов утечки (стабилизацию) 1056 мембраны. Такие эффекты, не совсем еще понятные на молекулярном уровне, но вызывающие улучшение функционального состояния клеток, заслуживают более тщательного исследования. Возможно, что данные об увеличении ионных токов при действии на нейроны в малых концентрациях антигипоксантов, тетракаина и леокаина, афобазола, брадизола, амиодарона и лазерного излучения [1, 2, 7, 8, 18, 37, 47, 51] также могут интерпретироваться как активирующие воздействия.

Следовательно, в основе многостороннего мем-бранотропного действия лекарственных средств на электровозбудимую соматическую мембрану нейронов могут лежать различные механизмы: увеличение (активация) или снижение (подавление) ионных токов потенциалоуправляемых каналов, что приводит к изменениям мембранного потенциала покоя, потенциала действия (ПД) и синаптических потенциалов и межклеточных связей; взаимодействие с воротными структурами ионных каналов, приводящее к ускорению или замедлению кинетики их активации или инактивации; мембраностабилизирующие эффекты, выражающиеся в снижении или увеличении неспецифических токов утечки мембраны; изменение потенциала поверхностного заряда мембраны вблизи ионных каналов, модулирующее возбудимость; инактивационное и противоинактиваци-онное действия и другие.

В микроэлектродных исследованиях при регистрации потенциала покоя (ПП) нейронов как интегрированного показателя функционального состояния клетки получают сведения о деятельности неспецифических систем клетки: результирующую пассивных ионных проницаемостей мембраны для отдельных ионов (калия, натрия, кальция и др. ) и о деятельности ионных насосов. С помощью определенных методических приемов можно оценить вклад отдельных пассивных ионных проводимостей в величину ПП и вклад электрогенной компоненты ионных насосов [1 1, 43, 46]. Под влиянием фармакологического воздействия может быть как увеличение (гипер-), так и снижение ПП (деполяризация) [35]. При этом фармакологическое воздействие может привести к изменениям как одного, так и нескольких компонентов механизмов поддержания ПП — проницаемости для каких-либо ионов и/или к активации или ингибированию электрогенного транспорта ионов. В силу потенци-алозависимости механизмов инициации ПД (синаптических хемозависимых и пейсмекерных зон)

или механизмов генерации ПД (потенциалозависимых ионных каналов) последние также могут претерпеть изменения, которые будут опосредованными. Если же фармакологическое воздействие будет направлено прямо на механизмы инициации или генерации ПД, то тогда надо вычленять эти компоненты. При регистрации отдельных ионных токов (как в наших экспериментах) вклад определенных ионных каналов и роль этого ионного механизма в клеточных эффектах оценивается непосредственно. Если регистрировать синаптические токи [39, 40, 49], то можно оценить вклад синаптических рецепторов и связанных с ними каналов в эффектах препаратов на клетке. Следовательно, фармакологическое воздействие может быть направлено на многие компоненты ионных механизмов генерации потенциалов клеток и в различной степени. Выяснение всех этих составляющих клеточных ответов (ионных механизмов действия) является довольно трудной, но многообещающей работой.

Таким образом, результаты исследований по изучению ионных механизмов действия и влияния на потенциалоуправляемые ионные каналы фармакологических средств разных групп позволяют учитывать и использовать клеточные механизмы регуляции состояния для управления на уровне организма. Известно, что местно-анестезирующие средства должны обратимо снизить или прекратить восприятие и проведение болевой импульсации на определенное время. С точки зрения рассматриваемой концепции и с учетом клеточных механизмов функционирования прекратить проведение ПД можно изменением ПП — глубокой гиперполяризацией или деполяризацией, но можно и непосредственным блокированием ионных каналов [28, 30, 33, 48, 50]. Местные анестетики эффективно блокируют не только преимущественно натриевые, но и кальциевые ионные каналы и, следовательно, могут обеспечить прекращение проведения ПД, то есть местную анестезию. Влияние местных анестетиков на неспецифические токи утечки мембраны, на потенциал поверхностных фиксированных зарядов мембраны вблизи ионных каналов или кинетику ионных токов является важным дополнением для понимания мембранотропных механизмов их действия [44, 45].

Противоаритмические средства в зависимости от природы нарушений сердечной деятельности на уровне возбудимого кардиомиоцита или нервных элементов, участвующих в генерации и проведении возбуждения, должны нормализовать нарушенные функции генерации или проведения ПД и

сокращения, изменить возбудимость, чувствительность к естественным рецепторным кардиотроп-ным регуляторам, нормализовать ритм. С одной стороны, очень важен уровень ПП, определяющий в значительной степени все эти процессы, а с другой, — состояние ионных каналов, участвующих в генерации ритмоводящих потенциалов или ПД. Противоаритмические средства обладают выраженным каналоблокирующим влиянием на кальциевые и натриевые каналы [27, 31, 32, 41, 50] и, следовательно, способны регулировать состояние и деятельность кардиомиоцитов. Они же способны регулировать уровень ПП через влияние на ионную проницаемость (влияние на неспецифические токи утечки) и в некоторых случаях — на потенциал поверхностного заряда мембраны.

Центральные адренопозитивные и опиатные болеутоляющие средства должны снижать или прекращать болевую чувствительность на уровне ЦНС организма, исходящую от тех или иных органов или участков тела организма. К сожалению, механизмы боли детально не изучены, но в самых общих чертах можно говорить о том, что для осуществления срочных антиноцицептивных лекарственных воздействий, с точки зрения клеточных механизмов деятельности, необходимо снижать межклеточные взаимодействия, возбудимость и проведение в клетках, обеспечивающих ноцицептивную чувствительность в ЦНС. Для эффективного длительного устранения болевых ощущений необходимо нормализовать функции того или иного органа, ставшего источником болевых ощущений, для чего используются не только болеутоляющие средства [1, 7]. Болеутоляющие средства, механизм действия которых связывался, прежде всего, с их влиянием на соответствующие мембранные рецепторы, оказывают блокирующее действие и на ионные каналы нейронов [35, 42]. В этом смысле они напоминают действие местно-анестезирующих и противоаритмических средств, хотя это действие менее выражено. Болеутоляющие средства — морфин и клофелин — оказывают свое влияние на ионные каналы рецептор-независимо, налоксон и идазоксан не снимают этих эффектов. Поэтому, можно считать, что в механизмах действия болеутоляющих средств их прямое влияние на ионные каналы должно занимать существенное место. Кроме того, болеутоляющие средства влияют на неспецифические токи утечки мембраны, потенциал поверхностного заряда мембраны и на кинетику развития некоторых ионных токов. Эти стороны их действия могут оказаться значимыми при осуществлении своих эффектов на уровне ЦНС. Это до-

полнение является новым для понимания механизмов действия центральных болеутоляющих средств

[1, 31, 34].

Нейротропные средства на уровне периферической и центральной нервной систем (в зависимости от нарушения функций) должны нормализовать такие свойства нервных клеток или синаптических контактов, как возбудимость (чувствительность), проводимость (лабильность), эффективность связи в синапсах (восстановить, усилить или ослабить). Коррекцию функционального состояния клеток (деятельности их мембранных молекулярных структур) можно осуществить неспецифически фармакологическими средствами, влияющими на уровень ПП и в силу потенциалозависимости — на параметры ПД и синаптических потенциалов. Но можно и специфически — избирательно блокируя определенные рецепторы или ионные каналы. Имеется также возможность модуляции функционирования рецепторов и каналов мембран при действии препаратов, влияющих на липиды мембран, потенциал фиксированных зарядов и, следовательно, на конформационные переходы белковых макромолекул. Детальное знание мембранных механизмов действия конкретных нейротропных средств на мембрану клеток поможет выбрать необходимое терапевтическое средство или подобрать его дозу.

Представленные результаты свидетельствуют, что изученные антигипоксические средства гути-мин, амтизол, его производные, алмид, бемитил и мексидол являются активными мембранотропны-ми соединениями, способными менять проводимость натриевых, кальциевых и калиевых ионных каналов нервных клеток [3, 6, 21]. Доказательством этому служит обратимое неизбирательное подавление ионных токов при концентрациях 100 и 1000 мкмоль, а для алмида и бемитила вплоть до полного подавления токов в концентрации 10 ммоль [3]. Весьма интересной является активация токов при действии антигипоксантов в малых концентрациях 1 или 10 мкмоль и при их отмывании после действия в концентрациях 100 и 1000 мкмоль (кроме алмида и амтизола). Быстрое восстановление ионных токов при отмывании свидетельствует о слабой степени связывания со структурами мембраны. Кроме того, обращает на себя внимание и то, что многие антигипоксанты изменяли неспецифические токи утечки мембраны, то есть обладали стабилизирующе-дестабили-зирующей активностью. Следует еще отметить, что в целом мембранотропная активность всех препаратов была ниже, чем для анестетиков и про-тивоаритмических средств. Правда, на этом осно-

вании пока еще нельзя в полной мере оценить вклад мембранотропной активности исследован-1058 ных антигипоксантов собственно в их антигипок-сическое действие.

Вместе с тем, анализируя результаты о мемб-ранотропной активности исследованных антиги-поксантов, можно предположить, что вызываемые ими антигипоксические защитные реакции на системном уровне организма, вероятно, могут быть связаны с тем, что в малых концентрациях они способны гиперполяризовать мембрану клеток и активировать работу ионных каналов, стабилизировать генерацию потенциалов действия в гипоксических условиях, а в более высоких концентрациях — блокировать ионные токи, снижать возбудимость клеток и оказывать при этом защитное от перегрузок действие. Блокирование калиевых ионных каналов может приводить к увеличению длительности потенциалов действия нейронов и усиленному выбросу медиаторов в синаптических структурах и активации межнейронных отношений, повышая надежность работы и способствуя сохранению и закреплению следов активности.

ЛИТЕРАТУРА

1.Вислобоков А.И., Зайцев A.A., Игнатов Ю.Д. и др. Мембранные механизмы действия на нервные клетки анестетиков, анал-гетиков и противоаритмических средств II Мед. акад. журн. — 2001. — Т. 1, № 1. — С. 25-33.

2. Вислобоков A.^, Игнатов Ю.Д. Цитофар-макологическое исследование механизмов действия мембранотропных средств II Обз. клин. фармакол. лек. тер. — 2003. — Т. 2, № 1. — С. 14-22.

3. Вислобоков A.^, Марышева В.В., Шабанов П.Д. Мембранные механизмы действия антигипоксантов бемитила и алмида на нейроны моллюсков II Эксперим. и клин. фармакол. — 2003. — Т. 66, № 6. — С. 9-11.

4. Вислобоков A.^, Мельников К.Н., Мары-шева В.В. и др. Мембранотропные эффекты антигипоксантов с тиомочевинной группировкой II Психофармакол. биол. нар-кол. — 2003. — Т. 3, № 1-2. — С. 522-525.

5. Говырин ВА, Жоров Б.С. Лиганд-рецеп-торные взаимодействия в молекулярной физиологии. — СПб.: Наука, 1994. — 240 с.

6. Зарубина И.В., Шабанов П.Д. Молекулярная фармакология антигипоксантов. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2004. — 36В с.

7. Колпакова М.Э., Вислобоков A^., Власов Т.Д. и др. Влияние He-Ne лазерного из-

лучения на калиевые ионные токи мембраны прудовика // Мед. акад. журн. — 2003. — Т. 3, № 1. — С. 31-40.

8. Колпакова М.Э., Власов Т.Д., Петрищев Н.Н. и др. Влияние излучения He-Ne лазера на устойчивость изолированного сердца к ишемическому и реперфузионному повреждению // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. — 2003. — Т. 89, № 12. — С. 1496-1502.

9. Костенко М.А. Выделение одиночных клеток моллюска (Lymnaea stagnalis) для дальнейшего культивирования // Цитология. — 1972. — Т. 4, № 28. — С. 1274-1278.

10. Костюк П.Г., Вислобоков А.И., Дорошенко П.А. и др. Действие 3,5-диамино-1-тиа-2,4-ди-азола на электровозбудимую мембрану нервных клеток моллюсков // Биол. мембраны. — 1988. — Т. 5, № 12. — С. 1297-1303.

11. Костюк П.Г., Крышталь О.А. Механизмы электрической возбудимости нервной клетки. — М., 1981. — С. 497-500.

12. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Курилова Л.С. Механизмы внутриклеточной сигнализации. — СПб., 2003. — 208 с.

13.Марышева В.В., Торкунов П.А., Земляной А.В. и др. 2-Амино-4-ацетилтиа-золо [5,4-Ь]индол, защищающий организм от воздействия гипоксии и токсического отека легкого // Патент РФ на изобр. № 2188824. Бюл. изобр. — 2002. — № 25. — С. 382.

14. Марышева В.В., Шабанов П.Д. Гидробромид 2-амино-4-ацетил-7-бром-8б-гидрокси--

3а,8б-дигидротиазоло[5,4-Ь]индола, защищающий от гипоксии и отравления четыреххлористым углеродом // Заявка на патент № 2004128102.

15. Марышева В.В., Шабанов П.Д. Гидробромид 2-амино-4-ацетил-8б-гидрокси-3а,8б-дигидротиазоло[5,4-Ь]индола, защищающий от гипоксии // Заявка на патент № 2003135558.

16. Марышева В.В., Шабанов П.Д. Исследование антигипоксических свойств в гомологическом ряду 2-аминотиазола // Эксперим. и клин. фармакол. — 2005. — Т. 68, № 1. — С. 67-70.

17. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению лекарственных средств. — М., 2000. — С. 153-158.

18. Савоськин А.Л., Вислобоков А.И. Влияние клофелина, гуанфацина и соединения SHA-9 на трансмембранные ионные токи нейронов прудовика // Эксперим. и клин. фармакол. — 1999. — Т. 62, № 6. — С. 20-22.

19. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы физиологически активных веществ. — М.: Медицина, 1987. — 400 с.

20. Ткачук В.А., Авакян А.Э. Молекулярные

механизмы сопряжения G-белков с мембранными рецепторами и системами вторичных посредников // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. — 2003. — Т. 89, № 12. — С. 1478-1490.

21.Шабанов П.Д. Концепция адаптогенов: истоки, современное состояние, перспективы: Акт. речь на вторых Лазаревских чтениях. — СПб., 2002. — 72 с.

22. Шабанов П.Д. Гипоксия и антигипоксан-ты // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. — 2003. — №1 [9]. — С. 111-121.

23.Январева И.Н., Копылов А.Г., Кузьмина Т.Р. и др. Динамика изменений функционального состояния нейронов центральной нервной системы при длительных раздражениях // Физиол. журн. СССР. — 1984. — Т. 70, № 10. — С. 1394-1401.

24.Armstrong C.M., Bezanilla F. Charge movement associated with the opening and closing of the activation gates of the Na channels // J. Gen. Physiol. — 1974. — Vol. 63. — P. 533-552.

25. Barry D.M. Nerbonne J.M. Myocardial potassium channels: Electrophysiological and molecular diversity // Annu. Rev. Physiol. — 1996. — Vol. 58. — P. 363-394.

26. Brown D. A., London E. Functions of lipid rafts in biological membranes // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. — 1998. — Vol. 14. — P. 111-136.

27. Budas G. R., Jovanovic S., Crawford R. M. et al. Hypoxia-induced preconditioning in adult stimulated cardiomyocytes is mediated by the opening and trafficking of sarcolemmal KATP channels // FASEB J. — 2004. — Vol. 18. — P. 1046-1048.

28. Carmeliet E. Cardiac ionic currents and acute ischemia: from channels to arrhythmias // Physiol. Rev. — 1999. —Vol. 79. — P. 917-1017.

29. Decher N., Pirard B., Bundis F. et al. Molecular Basis for Kv1.5 Channel Block: Conservation of drugs binding sites among voltage-gated K+ -channels // J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 279, N 1. — P. 394-400.

30. De^n E., Valenzuela C., Tamargo J. Blockade of cardiac potassium and other channels by antihistamines // Drug Safety. —

1999. — Vol. 21, Suppl. 1. — P. 11-18.

31. Doyle D.A., Morais-Cabral J., Pfuetzner R.A. et al. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity // Science. — 1998. — Vol. 280. — P. 69-77.

32. Duprat F., Lesage F., Fink M. et al. TASK, a human background K+ channel to sense external pH variations near physiological pH // EMBO J. — 1997. — Vol. 16. — P. 5464-5471.

33. Edwards G. Potassium channel modulation: What next? // Curr. Res. Ion Channel.

Modulators. — 1998. — Vol. 3. — P. 163-164.

34. Foell J.D., Balijepalli R.C., Delisle B.P. et al. Molecular heterogeneity of calcium channel betaSubunits in canine and human heart: evidence for differential subcellular localization // Physiol. Genomics. — 2004. — Vol. 17. — P. 183-200.

35. Kaczorowski G.J., Garcia M.L. Pharmacology of voltage-gated and calcium-activated potassium channels // Curr. Opin. Chem. Biol. — 1999. — Vol. 3. —P. 448-458.

36. Kamp T.J., Hell J.W. Regulation of cardiac L-type calcium channels by protein kinase A and protein kinase C // Circulation Research. — 2000. — Vol. 87. — P. 1095-1102.

37. Kodama I., Kamiya K. Toyama J. Amioda-rone: Ionic and cellular mechanisms of action of the most promising class III agent // Am. J. Cardiol. — 1999. — Vol. 84. — P. 20R-28R.

38. Lee K.S., Akaike N., Brown A.M. Properties of internally perfused, voltage-clamped, isolated nerve cell bodies // J. Gen. Physiol. — 1978. — Vol. 71. — P. 489-507.

39. Lehmann-Horn F., Rudel R. Channelo-pathies: Their contribution to our knowledge about voltage-gated ion channels // News Physiol. Sci. — 1997. — Vol. 12. — P. 105-112.

40. Lehmann-Horn F., Jurkat-Rott K. Voltage-gated ion channels and hereditary disease // Physiol. Rev. — 1999. — Vol. 79, N 4. — P. 1317-1372.

41. Lukas A., Antzelevitch C. Differences in the electrophysiological response of canine ventricular epicardium and endocardium to ischemia. Role of the transient outward current // Circulation. — 1993. — Vol. 88. — P. 29032915.

42. Main M.J., Cryan J.E., Dupere Jr.B. et al. Modulation of KCNQ2/3 potassium channels by the novel anticonvulsant retigabine // Mol. Pharmacol. — 2000. — Vol. 58. — P. 253-262.

43. Mitcheson J. S., Chen J., Lin M., Culberson C. and Sanguinetti M.C. A structural basis for drug-induced long QT syndrome // PNAS. —

2000. — Vol. 97, N 22. — P. 12329-12333.

44. Nilsson J., Madeja M., Arhem P. Local anesthetic block of Kv channels: Role of the S6 Helix and the S5-S6 linker for bupivacaine action // Mol. Pharmacol. — 2003. — Vol. 63. — P. 1417-1429.

45. Paul A.A., Witchel H.J., Hancox J.C. Inhibition of the current of heterologously expressed HERG potassium channels by flecainide and comparison with quinidine, propafenone and lignocaine // Brit. J. Pharmacol. — 2002. — Vol. 136, N 5. — P. 717-729.

46. Pellegrini-Giampietro D.E., Moroni F. Voltage-sensitive ion channels: Modulation by neurotransmitters and drugs. — Berlin: Springer Verlag, 1988.

47. Rampe D., Murawsky M.K., Grau J., Lewis E.W. The antipsychotic agent sertindole is a high affinity antagonist of the human cardiac potassium channel HERG // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1998. — Vol. 286. — P. 788-793.

48. Sanguinetti M.C., Spector P.S. Potassium channelopathies // Neuropharmacol. — 1997. —

Vol. 36. — P. 755-762.

49.Shieh C.C., Klemic K.G., Kirsch G.E. Role of transmembrane segment S5 on gating of voltage-dependent K+ channels // J. Gen. Physiol. — 1997. — Vol. 109. — P. 767-778.

50. Snyders D.J. Structure and function of cardiac potassium channels // Cardiovasc. Res. — 1999. — Vol. 42. — P. 377-390.

51.Wappl E., Mitterdorfer J., Glossmann H., Striessnig J. Mechanism of dihydropyridine interaction with critical binding residues of L-type Ca2+-channel alpha-1 subunits // J. Biol. Chem.— 2001. — Vol. 276. — P. 12730-12735.

Шабанов П.Д., Вислобоков А.И., Марышева В.В., Мельников К.Н. Метаболические и мембранные эффекты ами-нотиоловых антигипоксантов // Психофармакол. биол. наркол. — 2005. — Т. 5, № 4. — С. 1044-1060.

Shabanov P.D., Vislobokov A.I., Marysheva V.V., Melnikov

K.N. Metabolic and membrane effects of aminothiol antihypoxants // Psychopharmacol. Biol. Narcol. — 2005. — Vol. 5, N 4. — C. 1044-1060. Military Medical Academy, Saint-Petersburg 194044, Lebedeva str., 6; Pavlov State Medical University, Saint-Petersburg, 197022, L. Tolstoy str., 6/8

Summary: The effects of antihypoxants with thiourea group: gutimine, amthizol, bemithyl, almid, derivatives of benzthiazol (compound 1) and thiazolo[5,4-b]indole (compounds 2 and 3) as well as mexidol in concentrations 1, 10, 100 pM, 1 and 10 mM on transmembrane calcium, sodium and both potassium slow and quick ionic currents were studied in isolated neurons of Lymnaea stagnalis mollusk using method of intracellular dialysis and fixed membrane potential. All antihypoxants acted in a dose dependent manner biphasically and reversibly. As a rule, in the first phase (1-100 pM) a slight increase of currents was observed, whereas in the second phase (1-10 mM) an inhibition of them was registered. Some antihypoxants changed the kinetics of ionic currents formation and acted selectively on one or other current. They reduced nonspecific efflux currents and produced membrane stabilizing effect. Therefore, all antihypoxants studied possess high membranotropic activity, which can be qualified as a possible mechanism of antihypoxic action.

Key words: hypoxia; gutimine; amthizol; almid; bemithyl; isothiourea group; 2-aminobenzimidazol; mexidol; ionic currents (K+, Na+, Ca2+); neuron; Lymnaea stagnalis