Механізми регенерації тканини печінки у щурів на тлі її хронічного алкогольного ушкодження та медикаментозній корекції Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧШ ПИТАННЯ БЮЛОГП ТА МЕДИЦИНИ

УДК 616.36-08:599.323.4

Н .А. Рикало, Л .О. Яровенко

МЕХАН1ЗМИ РЕГЕНЕРАЦП ТКАНИНИ ПЕЧ1НКИ У ЩУР1В НА ТЛ1 II ХРОН1ЧНОГО АЛКОГОЛЬНОГО УШКОДЖЕННЯ ТА МЕДИКАМЕНТОЗН1Й КОРЕКЦП

Вiнницький нацiональний медичний унiверситет iM. М. I. Пирогова, Украша

Summary. Rykalo N. A., Yarovenko L. А. MECHANISMS OF REGENERATION OF LIVER TISSUE IN RATS ON THE BACKGROUND OF ITS CHRONIC ALCOHOLIC DAMAGE AND MEDICATION CORRECTION. - N. I. Pirogov Vinnitsa National Medical University, Ukraine; e-mail: [email protected]. The article is devoted to the study and investigation of the influence of chronic alcohol intoxication on the processes of liver tissue proliferation in sexually mature rats. A feature of reparative liver regeneration in rats on the background of prolonged alcohol intoxication is the polyploidy of the hepatocyte nuclei. The effect of L-arginine-L-glutamate and quercetin on the cellular mechanisms of regeneration of the liver parenchyma was also studied. The results of cytofluorometric and morphometric studies showed that under chronic alcohol intoxication, the percentage of injured hepatocytes in the sexually mature rats increased and the percentage of double-nuclear hepatocytes decreased. Polyploidization of nuclear DNA was also observed due to a decrease in the number of 2c and (2cx2) hepatocytes and an increase in tetra- and octaploid hepatocyte nuclei, which are atypical for control animals of the same age. The introduction of L-arginine-L-glutamate and quercetin led to partial regeneration of liver tissue by proliferation, as evidenced by a significant increase in the percentage of binuclear hepatocytes and normalization of the percentage of di- and tetraploid nuclei of liver cells. L-arginine-L-glutamate showed a more pronounced hepatoprotective effect because it significantly increased the percentage of diploid nuclei of liver cells by 26.3% (p <0.001) compared to quercetin, which indicates activation of reparative liver tissue regeneration by proliferation.

Key words: polyploidization, nuclei, hepatocytes, ethanol, L-arginine-L-glutamate, quercetin.

Реферат. Рыкало Н. А., Яровенко Л. А.МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНИ ПЕЧЕНИ У КРЫС НА ФОНЕ ЕЁ ХРОНИЧЕСКОГО АЛКОГОЛЬНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ И МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ КОРРЕКЦИИ. Статья посвящена изучению и исследованию влияния хронической алкогольной интоксикации на процессы пролиферации ткани печени у половозрелых крыс. Особенностью репаративной регенерации печени у крыс на фоне длительной алкогольной интоксикации является полиплоидия ядер гепатоцитов. Также исследовано влияние L-аргинин-L-глyтамата и кверцетина на клеточные механизмы регенерации паренхимы печени. Результаты цитофлуориметрических и морфометрических исследований показали, что на фоне хронической алкогольной интоксикации у половозрелых крыс увеличивался процент поврежденных гепатоцитов и уменьшался процент двухядерных гепатоцитов. Также наблюдалось полиплоидизация ядерной ДНК за счет уменьшения количества 2с- и (2сх2) -гепатоцитив и увеличение тетра- и октаплоидних ядер гепатоцитов, которые являются нетипичными для контрольных животных идентичного возраста. Введение L-аргинин-L-глутамата и кверцетина привело к частичной регенерации ткани печени путем пролиферации, о чем свидетельствует достоверное увеличение процента двухядерных

© Рикало Н .А., Яровенко Л .О.

гепатоцитов и нормализация процента ди- и тетраплоидных ядер клеток печени. L-аргинин-Ь-глутамат проявлял более выраженный гепатопротекторный эффект, поскольку достоверно увеличивал процент диплоидных ядер клеток печени на 26,3% (р <0,001) по сравнению с кверцетином, что свидетельствует об активации репаративной регенерации ткани печени путем пролиферации.

Ключевые слова: полиплоидизация, ядра, гепатоциты, этанол, L-аргинин-L-глутамат, кверцетин.

Реферат. Рикало Н А., Яровенко Л О. МЕХАН1ЗМИ РЕГЕНЕРАЦП ТКАНИНИ ПЕЧ1НКИ У ЩУР1В НА ТЛ1 II ХРОН1ЧНОГО АЛКОГОЛЬНОГО УШКОДЖЕННЯ ТА МЕДИКАМЕНТОЗН1Й КОРЕКЦП Стаття присвячена вивченню та дослiдженню впливу хрошчно! алкогольно! штоксикацп на процеси пролГферацп тканини печшки у статевозрiлих щурiв. Особливостями репаративно! регенерацп печiнки у щурiв на тлi тривало! алкогольно! штоксикацп е полiпло!дизацiя ядер гепатоцитiв. Також дослщжено вплив L-аргiнiн-L-глутамату та кверцетину на клiтиннi механiзми регенерацi! паренхiми печiнки. Результати цитофлуориметричних i морфометричних дослiджень показали, що на тлi хронiчно! алкогольно! iнтоксикацi! у статевозрших щурiв збiльшувався вiдсоток ушкоджених гепатоципв та зменшувався вiдсоток двоядерних гепатоципв. Також спостерiгалось полiпло!дизацiя ядерно! ДНК за рахунок зменшення кiлькостi 2с- i (2сх2)-гепатоцитiв та збшьшення тетра- та октапло!дних ядер гепатоципв, яш е нетиповими для контрольних тварин iдентичного вiку. Введения Ь-арпнш-Ь-глутамату та кверцетину призводило до частково! регенерацi! тканини печiнки шляхом пролiферацi!, про що свiдчить достовiрне зростання вiдсотка двоядерних гепатоцитiв та нормалiзацiя вiдсотка ди- та тетрапло!дних ядер клгшн печiнки. L-аргiнiн-L-глутамат проявляв бшьш виражений гепатопротекторний ефект, оск1льки достовiрно збiльшував вiдсоток дипло!дних ядер клгшн печiнки на 26,3 % (р<0,001) порiвняно iз кверцетином, що свщчить про активацiю репаративно! регенерацi! тканини печшки шляхом пролiферацi!.

Ключовi слова: полшло!дизащя, ядра, гепатоцити, етанол, L-аргiнiн-L-глутамат, кверцетин.

Вступ. Однiею з актуальних проблем сучасно! бiологi! та медициш е вивчення процесiв регенерацi! оргашв i тканин. В даний час особлива увага выводиться дослiджениям клгшнно! пролiферацi! i апоптозу, взаемовiдношенню та обумовлешстю цих двох фiзiологiчних процеав, як1 мають важливе значення при багатьох хрошчних патологiях [1]. Вшомо, що альтерацiя активуе пролiферацiю клгшн. Збiльшуеться к1льк1сть мiтотично активних клгшн у к1стковому мозку та печшщ [2]. Можливе явище полiпло!дi! (стан клгшни, коли в нш в результата ендомiтозiв виявляеться бiльше двох гапло!дних наборiв хромосом). Полiпло!дизацiя на вшмГну вш мпозу, здiйснюеться без зниження специфiчних функцш клгшни Г властива для полiфункцiональних елементiв, в тому числГ клiтинам печшки. Полшло!дш клгшни вщрГзняються пгантськими розмГрами, тому призводить до регенерацшно! гшертрофп органу. В процеа репаративно! регенерацп вшбуваеться чергування аштотичних Г мпотичних подшв гепатоципв Г полшло!дизащя !х ядер (змша клгшнно! Г внутрГшньоклГтинно! регенерацп). Аштоз е першою реакщею, характеризуеться збшьшенням поверхш контакту мгж ядром Г цитоплазмою, що свщчить про функцюнальну актившсть клгшни. Ампотичний подш приводить до появи двоядерних гепатоципв, однак може завершуватись й подшом клгшни. В регенеруючш тканиш печшки вшмГчаеться збшьшення числа темних клгшн. Вшомо, що значно часпше шж мпоз в тканиш печшки виявляють у великих к1лькостях двоядерш Г полшло!дш гепатоцити [3, 4]. Недостатньо вивченими е типи подГлу (мпоз, аштоз) характерш для розмноження гепатоципв печшки, а також не виявлено тип регенерацп (клгшнний чи внутрГшньоклгганний) при окремих патолопях печшки. Також невшомий вплив L-аргiнiну-L-глутамату Г кверцетину на процеси пролГферацп та полшло!дизацп ядер клгшн печшки на тлГ хрошчного алкогольного ушкодження (ХАУП).

Мета роботи: дослщження токсичного впливу етанолу та гепатопротекторних властивостей L-аргiнiну-L-глутамату Г кверцетину на штенсившсть процеав регенерацп печшки у статевозрших тварин.

Mamepimu та методи до^дження. Експеримент було проведено на 48 бших нелшшних щурах-самках (вжом 6 мю iз початковою масою тiла 180-200 г). Bti експерименти виконано з дотриманням норм Конвенцй' Ради Свропи про захист хребетних тварин, що використовуються для дослiджень та iнших наукових цшей (Страсбург, 1986 р.), Ухвали Першого нацiонального конгресу з бюетики (Кшв, 2001) i наказу МОЗ Украни № 690 вiд 23.09.2009 р. Комгаею з питань бюетики Вшницького нацiонального медичного yнiверситетy iменi M. I. Пирогова (протокол № 11 вщ 19.11.2015 р.).

Тварин було розподшено на 4 групи по 12 у кожнiй: 1) контрольш тварини; 2) тварини з ХАУП, яким протягом перших двох тижтв для моделювання ХАУП за методикою Г. А. Ковальова та А. Ю. Петренка (2004), протягом цього перюду тварини отримували 5 % та 15 % етанол, починаючи iз третього тижня - щоденно, per os вводили 96,0 % розчин етанолу в дозi 16 г/кг маси тша на добу протягом 12 тижшв [5]; 3) тварини з ХАУП, яким через 1 год. тсля введення етанолу per os вводили ангюпротектор кверцетин ("Кверцетин", ЗАТ НВЦ "Борщапвський хiмiко-фармацевтичний завод", Украша) у дозi 100 мг/кг маси тiла тварин; 4) тварини з ХАУП, яким через 1 год. тсля введення етанолу per os вводили гепатопротектор L-аргiнiн-L-глyтамат ("Глутарпн", ТОВ Фармацевтична компанiя "Здоров'я", Украша) у дозi 35 мг/кг маси тша тварин. Введення кверцетину i глутарпну на моделi ХАУП проводили через 2 тижш ввд початку експерименту щоденно 1 раз на добу через годину тсля введення етилового спирту. Июля зашнчення термiнy експерименту проводили евтаназiю тварин тд тiопенталовим наркозом (40 мг/кг) шляхом декаштацп.

Для визначення площносп ядерно1' ДНК клiтин печiнки шсля розтину черевно1' порожнини негайно вилучали печiнкy у тварин yсiх дослщних груп. У стерильних умовах тд капсулою з лiвоï велико1' частки зi свiжого матерiалy вирiзали шматочок тканини розмiром 0,5 см3, який промивали 0,9 % розчином NaCl i занурювали у фосфатно-сольовий буфер рН 7,4 (Sigma) для подальшого цитофлуориметричного аналiзy, який проводили на багатофункцюнальному проточному цитометрi "Partee PAS" фiрми Partec (Hiмеччина). Сyспензiï ядер видели за допомогою набору CyStain DNA фiрми Рartec (Hiмеччина), вадповадно до протоколy-iнстрyкцiï виробника. До подрiбненоï печiнки додавали розчин дiамiдинофенiлiндолом, що дозволяе швидко й одночасно екстрагувати ядра i мiчення ядерно1' ДНК. Фрагментацш ядерно1' ДНК дослiджyвали шляхом видшення Sub-G1 % дiлянки на ДНК-пстограмах (iнтервал RN1). Mорфометричнi дослщження тканини печiнки експериментальних тварин проводили вадповадно [6, 7]. Статистичний аналiз отриманих резyльтатiв у ходi виконання дисертацiйноï роботи здiйснений згiдно з комп'ютерною програмою "Statistica 6.1" (лщензшний номер BXXR901E246022FA), iз використанням непараметричного U-критерiю Mана-Уiтнi.

Обговорення результат!в до^дження. Застосування нами цитофлуори- та морфометричних методiв дослiдження дозволило iдентифiкyвати ознаки руйнування гепатоцитiв та розрiзнити пристосувально-регенераторш процеси, як1 компенсують таку деструктивну активацiю. У роботi дослiджено вадносний об'ем ушкоджених гепатоцитiв, вiдносний об'ем двоядерних гепатоцитiв, а також вадсоток диплощних, тетраплощних та полiплоïдних ядер клггин печiнки.

Biдносний об'ем ушкоджених гепатоципв у контрольних статевозрiлих щyрiв дорiвнював 3,07+0,32 %, а вадносний об'ем двоядерних гепатоцитiв - 8,21+0,30 % (табл. 1). У щyрiв iз ХАУП вiдбyвалось достовiрне збшьшення вiдносного об'ему пошкоджених гепатоцитiв, яке становило 86,74+1,67 % (p<0,001) порiвняно iз контролем (див. табл. 1). Проте регенераторна актившсть збiльшyвалась, про що свщчить збiльшення на 70,3 % (p<0,001) вiдносного об'ему двоядерних гепатоцилв у порiвняннi iз контролем, що може вказувати на компенсаторно-пристосувальш реакцп при токсичнiй дiï етанолу.

На rai введення кверцетину у статевозрших щyрiв спостерiгалося зменшення вщносного об'ему пошкоджених гепатоцитiв на 48,3 % (p<0,001), що свiдчить про посилення регенераторно1' активностi та протекторш властивостi кверцетину. При застосyваннi L-аргiнiн-L-глyтаматy у статевозрiлих щyрiв встановлено, що вщносний об'ем пошкоджених гепатоцитiв залишався високим та становив 27,82+0,67 %, однак у порiвняннi iз показниками ХАУП вш зменшувався на 67,9 % (p<0,001). Biдносний об'ем двоядерних гепатоципв теж збiльшyвався на 33,7 % (p<0,001) порiвняно iз ХАУП (табл. 1), що вказуе на високу цитопротекторну дш препарату, осшльки активуються процеси регенерацiï

тканини печшки.

Таблиця 1

Оцшка ввдносного об'ему ушкоджених гепатоцитiв та ввдносного об'ему двоядерних гепатоцитiв у щурiв з ХАУП та при корекцИ

Показник контроль ХАУП ХАУП Гз застосуванням глутарпну ХАУП Гз застосуванням кверцетину

ВОУГ, % 3,07+0,32 86,74+1,67 р1<0,001 27,82+0,67 р2<0,001 44,83+3,01 р2<0,001

ВОДЯГ, % 8,21+0,30 13,98+0,48 р1<0,001 18,69+0,53 р2<0,001 14,14+0,70

Приметка. ВОУГ - вщносний об'ем ушкоджених гепатоципв, ВОДЯГ - вщносний об'ем двоядерних гепатоципв, р1 - достовГршсть вщмшностей у порГвнянш з контрольною групою; р2 - достовГршсть ввдмшностей у порГвнянш з показниками щурГв з ХАУП.

Оцшка аналГзу пло!дносп ядерно! ДНК клгган печшки показала, що на тлГ ХАУП у вах статевозрших тварин вщсоток дипло!дних ядер гепатоципв у порГвнянш Гз контролем достовГрно був меншим на 8,3 % (табл. 2). При цьому збшьшувався вщсоток полшло!дних ядер Гз набором ядерно! ДНК понад 8с, що, на нашу думку свщчить про загибель гепатоципв у вадповда на токсичну дш етанолу при ХАУП, оск1льки зменшувався вщсоток гепатоципв Гз набором ядерно! ДНК 2с, а варГантом регенерацп печшки при ХАУП може бути полшло!дизащя ядерно! ДНК гепатоципв.

Таблиця 2

Аналiз плоТдност ядер гепатоципв у статевозрiлих щурiв на тлi ХАУП та корекцп L-аргiнiн-L-глутаматом i кверцетином

Показник Контроль ХАУП ХАУП Гз застосуванням L-аргiнiн-L- глутамату ХАУП Гз застосуванням кверцетину

2с, % 81,78±0,72 75,00±1,65 р:<0,001 82,15±0,92 р2<0,01 81,51±0,92 р2<0,01

4с, % 15,30±0,10 19,45±0,80 р:<0,001 15,86±1,16 р2<0,001 17,89±0,90

Приметка. 2с - вщсоток ядер гепатоципв з дипло!дним набором ядерно! ДНК; 4с -вщсоток ядер гепатоципв з тетрапло!дним набором ядерно! ДНК; р1 - достовГршсть вщмшностей у порГвнянш з контрольною групою; р2 - достовГршсть вщмшностей у порГвнянш з показниками щурГв з ХАУП.

Встановлено, що у статевозрших щурГв вшсоток ядер клгган печшки з тетрапло!дним набором ДНК на 27,1 % (р<0,05) у порГвнянш Гз контролем (табл. 2). Також, встановлено, що у щурГв на тлГ хрошчного введення етанолу спостерГгалося зменшення сшввшношення мГж 2с та 4с на 28,8 % та становило 3,89±0,24 проти 5,46±0,43 порГвняно Гз контролем, що вказуе на зниження процеав регенерацп ушкодженого органу, а саме процеав пролГферацп.

Таким чином, регенеращя тканини печшки при ХАУП може вшбуватися шляхом полшло!дизацп ядер гепатоципв за рахунок збшьшення вшсотку ядер з пло!дшстю ДНК > 8с та появою нетипових для контрольних тварин ядер гепатоципв з пло!дшстю клгган печшки 64с, 128с та навиъ 256с, на нашу думку, це е адаптацшною реакщею та даш гепатоцити е бшьш стшкими до дп етанолу, однак вони втрачають сво! специфГчш функцп.

При застосуванш кверцетину у тварин вах вжових категорГях вшмГчено збшьшення вшсотка гепатоципв Гз дипло!дним набором ДНК у порГвнянш Гз ХАУП на 8,9 % (р<0,05). Таким чином, кверцетин проявляе позитивний ефект, про що свщчить нормалГзащя вшсотка дипло!дних ядер гепатоципв. За умов уведення L-аргiнiн-L-глутамату встановлено, що вшсоток клгган печшки Гз дипло!дним набором ядерно! ДНК у порГвнянш Гз ХАУП був бшьшим на 9,5 % (р<0,05) та навить перевищував контрольш показники. Встановлено, що вшсоток полшло!дних клгган печшки, яш мГстили ядерну ДНК 4с та >8с зменшувався та

був максимально близьким до контролю. Встановлено, що вiдсоток гепатоцитiв i3 ядерним ДНК 4с був достовiрно меншим на 18,5 %, 8с на 29,8 %, 16с на 10,0 %, 32с на 58,0 % (p<0,05) порiвняно i3 ХАУП. Використання L-аргiнiн-L-глутамату, порiвняно i3 кверцетином нормалiзувало й спiввiдношення 2c/4c за рахунок збiльшення вiдсотку дипло1дних та зменшення вiдсотку тетрапло1дних ядер гепатоцитiв у порiвняннi i3 щурами з ХАУП та наближав !х вiдсоток до аналопчних показник1в контрольних тварин вщповщного вiку. Отриманi данi, можуть бути ознакою тдвищення процесiв регенерацп паренхiми печiнки. Спiввiдношення 2с/4с при застосувант L-аргiнiн-L-глутамату було меншим за показники ХАУП на 26,3 % та дорiвнювало 5,28±0,35 при введеннi L-аргiнiн-L-глутамату та вiдрiзнявся вiд показник1в при введент кверцетину (4,61±0,26). Отриманi дат ще раз вказують на активацш процесiв пролГфераци клiтин печiнки за рахунок збшьшення дипло1дних ядер гепатоципв на тлi застосування саме L-аргiнiн-L-глутамату. Оск1льки саме дипло1дт клiтини активтше вступають у мiтоз в клггинному циклi та сприяють вiдновленню маси, структури печiнки та li функцюнування.

Висновки:

1. Встановлено, що на rai ХАУП у статевозрiлих щурiв збiльшувався вiдсоток ушкоджених гепатоцитiв та зменшувався вiдсоток двоядерних гепатоцитiв. Також спостерiгалось полшло1дизащя ядерно! ДНК за рахунок зменшення шлькосп 2с- i (2сх2)-гепатоцитiв та збiльшення тетра- та октапло1дних ядер гепатоцитiв, яш е нетиповими для контрольних тварин щентичного вiку.

2. Введення L-аргiнiн-L-глутамату та кверцетину призводило до частково! регенерацп тканини печiнки шляхом пролГферацп, про що сввдчить достовiрне зростання вiдсотка двоядерних гепатоцитiв та нормалiзацiя вiдсотка ди- та тетрапловдних ядер клгган печiнки. L-аргiнiн-L-глутамат проявляв бшьш виражений гепатопротекторний ефект, оск1льки достовiрно збiльшував вiдсоток дипло!дних ядер клгшн печiнки на 26,3 % (р<0,001) порiвняно Гз кверцетином, що сввдчить про активацiю репаративно! регенерацп тканини печшки шляхом пролГферацп.

References

1. Shmarov DA, Pogorelov VM, Kozinets GI. Modern aspects otsenki proliferation and apoptosis in clinical and laboratory diagnosis (review of literature). Hematology. Clinical diagnosis laboratornaya 2013; 1: 36-39.( Rus.)

2. Berezovsky VY, Janko RV, Litovka IG. Effect of nutritional derivation physiological regeneration of liver parenchyma young and adult rats. Physiological magazine 2008; 6: 66-71. (Ukr.)

3. Rykalo NA, Androshchuk AV. Current views on the mechanisms of reparative regeneration of liver and kidney. Achievements Clinical Experimental Medicine 2012; 2: 110-113. (Ukr.)

4. Rykalo NA. Pathogenesis of chronic viral hepatitis B and C in children age characteristics, pathogenetic therapy (experimentally-clinical research). Abstract. Dis. on competition sciences. Degree dock. honey. Sciences specials. 14.03.04 "Pathologic Physiology" 2011; Р. 36. (Ukr.)

5. Kovalev GA, Petrenko АУ. Experimental model of alcoholic liver injury in female rats. Visn. Hark. Nat. Univ. 2004; 617: 15-18. (Rus.)

6. Avtandilov GG. Fundamentals of quantitative pathological anatomy. Medicine 2002; 240. (Rus.

7. Sorochinnikov AG, Dorosevich AE. Histological and microscopic machinery. Medicine 1997, 448. (Rus.)

Работа поступила в редакцию 24.04.2017 года.

Рекомендована к печати на заседании редакционной коллегии после рецензирования