CC BY
27
УДК 576.33.04
Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2006, вып. 3
Н. В. Кулева, А. П. Миронова
КАЛЬЦИЙ РЕГУЛИРУЕТ АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ МЕРЦАТЕЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ НА ЭТАНОЛ
Участие биологических мембран в восприятии температурных и осмотических сигналов через белки-сенсоры является в настоящее время общепринятым фактом, расширяющим наши представления о механизмах адаптации к меняющимся условиям окружающей среды [2]. Особенно актуальна эта концепция для морских беспозвоночных, ведущих сидячий образ жизни, таких как мидии или устрицы. Примером может служить исследование, проведенное на морском гребешке (Placopecten magellanicus), которое показало, что в процессе температурной адаптации моллюска наблюдается взаимосвязь между упорядоченностью структуры клеточных мембран и изменением содержания в них полиненасыщенной эйкозапентаноевой жирной кислоты [7].
Известно, что этанол увеличивает текучесть биологических мембран, уменьшая упорядоченность их липидной структуры [5, 9]. При этом возрастает подвижность связанных с мембраной белков, что влияет на процессы мембранного транспорта и активность связанных с мембраной ферментов. Так, после потребления человеком в течение четырех недель этанола активность Na+, К+" и Са2+-АТФазы мембран эритроцитов увеличивалась соответственно на 150 и 200 % [3].
При изучении динамики показателей устойчивости к этанолу жаберного эпителия беломорских мидий было показано, что они различаются для мидий из разных мест обитания [4]. Если рассматривать воздействие повреждающей концентрации этанола как тест на упорядоченность липидной структуры мембран, то эти данные можно интепретировать как изменение липидной структуры мембран и связанных с ней белков, ферментов, ионных каналов в зависимости от условий обитания.
Непосредственное влияние физического состояния мембран на восприятие или передачу сигналов об изменении параметров окружающей среды было продемонстрировано на примерах активации генов десатураз, некоторых белков теплового шока и осмосенсоров [2, 12]. На самом деле мембраны могут участвовать в значительно большем числе путей восприятия и передачи сигналов в клетках. Изменение текучести мембран приводит к изменению активности связанной с рецептором фосфолипазы С в кардиомиопитах. Активность зависящей от концентрации кальция протеинкиназы С, участвующей в термоадаптации дрожжей, также регулируется через текучесть мембран. Кроме того, показано, что физические свойства мембраны определяют регуляцию входа и мобилизацию ионов кальция в кардиомиоцитах лягушки и концентрацию цАМФ в культивируемых человеческих клетках [2,12].
При воздействии этанола концентрации 1-10 % на клетки, содержащие различные изо-формы Са2+-АТФазы плазматической мембраны, была обнаружена значительная активация этого фермента, степень которой зависела от изоформы АТФазы [6]. Активирующее воздействие этанола на Са2+-насос плазматической мембраны может быть механизмом краткосрочного адаптивного ответа, так как известно, что уменьшение концентрации внутриклеточного кальция в токсических условиях может уменьшать повреждение клеток, замедлять его начальные этапы и в ряде случаев предотвращать гибель клетки [11].
В связи с вышеизложенным в настоящей работе на мерцательном эпителии жабр беломорских мидий произведено сравнение эффектов 2%-ного этанола, вызывающего, как было показано ранее [1], кратковременный адаптивный ответ, хелатора кальция 1мМ этиленгликольтет-раацетата (ЭГТА) и совместного действия 1 мМ ЭГТА и 2 %-ного этанола на время сохранения
© Н. В. Кулева, А. П. Миронова, 2006
мерцательной активности в 11 %-ном этаноле, тестирующем устойчивость плазматической мембраны клетки [1].
Материалы и методы. Была исследована выборка беломорских мидий, собранных на литорали вблизи о-ва Средний (п =18). Длина раковин составляла 3,0-3,7 см. Для исследования использовали краевой участок жаберного эпителия. Перед опытом жабры вырезали, слой мерцательного эпителия делили на кусочки шириной 2-3 мм и выдерживали в морской воде не менее 30 мин. Для кусочков, взятых от одной мидии, определяли время сохранения биения ресничек в 11 %-ном этаноле, приготовленном на морской воде (исходный уровень устойчивости), а также уровни устойчивости после преинкубации в течение 5 или 30 мин с 2 %-ным этанолом, или 1мМ ЭГТА, или с морской водой, содержащей 2 %-ный этанол и 1 мМ ЭГТА. За мерцанием ресничек наблюдали с помощью светового микроскопа (ув. 150 раз).
Статистическую обработку результатов производили с помощью критерия Стьюдента -Фишера, для построения линий регрессии использовали метод наименьших квадратов.
Результаты и обсуждение. Данные по корреляции исходного уровня устойчивости и уровней устойчивости, полученных через 5 и 30 мин преинкубации с 2 %-ным этанолом (прямая 1), с 1 мМ ЭГТА (прямая 2) и с обоими веществами (прямая 3), приведены на рисунке (Л и В, соответственно). Были рассчитаны параметры прямых, описывающих полученные закономерности. Для этанола прямая на рис. В описывается уравнением г/=-2,28+1,24г, коэффициент корреляции равен 0,955. Для ЭГТА прямая описывается уравнением у=-5,43+1,26* и коэффициент корреляции равен 0,968. Совместному действию ЭГТА и этанола соответствует уравнение у=5,31+1,36х, а коэффициент корреляции равен 0,919. Таким образом, полученные данные с большой степенью вероятности свидетельствуют о том, что адаптивный ответ, вызываемый 2 %-ным этанолом, сравним с ответом, вызываемым 1мМ ЭГТА, а при добавлении обоих реагентов наблюдается усиление адаптивного ответа. Так как ЭГТА является хелатором ионов кальция, то полученные данные можно рассматривать как доказательство Са2+-зависимости адаптивного ответа, вызываемого 2%-ным этанолом. Как известно из данных литературы, этанол в концентрации 1-5 % может вызывать значительную стимуляцию активности Са2+-насоса плазматической мембраны эритроцитов и других клеток [6]. Связывание свободного кальция посредством ЭГТА приводит к такому же адаптивному ответу, что и 2%-ный этанол.
Эффект 2 %-ного этанола зависит от времени. На рисунке А видно, что после 5 мин инкубации адаптивный ответ проявляется слабее, особенно в случае низкого исходного уровня устойчивости к 11 %-ному этанолу(ось абсцисс на рисунке). Можно полагать, что нарушение упорядоченности мембраны, вызываемое этанолом, развивается во времени, увеличивая ее проницаемость для ЭГТА. Это, по-видимому, потенцирует эффект ЭГТА в смеси с этанолом после 30 мин преинкубации.
Следует отметить, что эффект этанола является адаптивным в течение небольшого промежутка времени. Показано, что этанол, даже в низкой концентрации (менее 1 %), вызывает изменение структуры клеточной мембраны и увеличивает ее проницаемость, в том числе и к ионам кальция [5, 9]. На первом этапе повреждения клетки повышение концентрации внутриклеточного кальция легко обратимо, если устранить действие агента, его вызывающего, посредством использования бескальциевой среды или вне- и внутриклеточных хелаторов кальция [11]. Именно так удалось усилить адаптивный ответ на 2 %-ный этанол в нашей работе - при добавлении 1мМ ЭГТА (см. рисунок).
Ранее на мерцательном эпителии мидии мы показали, что адаптивный ответ на этанол может зависеть от продукции N0 [1]. Добавление в среду инкубации ингибитора ЫО-синтазы -аминогуанидина или продуцента N0 - нитропруссида Иа ингибировало или усиливало соответственно адаптивный ответ на этанол. Эти данные согласуются с данными литературы о стимуляции этанолом в концентрации менее одного процента частоты биения ресничек эпителиальных клеток трахеи быка [10]. Они показывают, что этанол влияет на активность еще одного связанного с мембраной фермента - МО-синтазы, возможно, посредством модификации липид-белковых взаимодействий или непосредственно.
1-'-1-'-1--1-'-Т-'- !-1 -_1Г"-1-'-Г——'-1-'-I----1-»
О 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Зависимость индивидуального ответа жаберного эпителия мидии на 2 %-ный этанол (1), 1 мМ ЭГТА (2) и смесь 2 %-ного этанола и 1мМ ЭГТА (5).
По оси абсцисс: исходный уровень устойчивости к 11 %-ному этанолу (мин); по оси ординат: уровень устойчивости к 11 %-ному этанолу (мин) после инкубации в средах (7), (2) и (3) в течение 5 мин (А) и 30 мин (В). Условные обозначения: квадратики - среда № 1, треугольники - среда № 2, кружки -среда № 3.
При хроническом потреблении этанола человеком в его клеточных мембранах изменяется жирнокислотный состав липидов - уменьшается степень ненасыщенности жирных кислот, увеличивается содержание холестерина, уменьшается количество связанных с мембраной ами-ногликанов. Эти физико-химические изменения позволяют компенсировать увеличение текучести мембран, вызванное этанолом, и лежат в основе развития толерантности к этанолу при хроническом потреблении [5]. Таким образом, длительное воздействие этанола на мембраны аналогично воздействию высокотемпературного или низкоосмотического стресса. Как уже было отмечено, сенсоры, находящиеся в мембранах, сигнализируют о такого рода изменениях в геном, что приводит к изменению синтеза ферментов десатураз и белков теплового шока [2]. На культивируемых клетках дрозофилы было показано, что введение 0,5-2,0 %-ного этанола перед индукцией стрессорного ответа на тепловой шок уменьшает синтез белков теплового шока на уровне мРНК и активного фактора теплового шока, т. е. тормозит инициацию транскрипции генов теплового шока [8]. Это показывает, что этанол может влиять на функционирование находящихся в плазматической мембране сенсоров.
В нашей работе исследовано кратковременное воздействие 2 %-ного этанола, которое вызывает быстрые изменения в функционировании плазматической мембраны мерцательного эпителия мидии. Увеличение устойчивости клетки к 11 %-ному этанолу, рассматриваемое в настоящей работе как адаптивный ответ, развивающийся на определенной стадии взаимодействия мембраны с этанолом, по-видимому, определяется уменьшением концентрации внутриклеточного кальция, происходящем при активации этанолом Са2+-насоса плазматической мембраны.
Summary
Kuleva N. V., Mironova A. P. Calcium regulates ciliary epithelium adaptive response for ethanol.
Samples of ciliary epithelium of White sea mussel revealed the same increase of resistance to 11% ethanol after laying in 2% ethanol or 1 mM EGTA for 30 min. It may mean that ethanol acts by calcium-dependent mechanism.
Литература
1. Кулева H. В., Миронова А. П. Участие NO-зависимого механизма в адаптивном ответе мерцательного эпителия беломорской мидии // Вестн. С-Петерб. ун-та. Сер. 3.2005. Вып. 4. С. 129132. 2. Лось Д. А. Десатуразы жирных кислот: Адаптивная экспрессия и принципы регуляции // Физиология растений. 1997. Т. 44. С. 528-540.3. Миронова А. П. Динамика статистических показателей при тестировании функциональной активности мышц химическим воздействием: Авто-реф. канд. дис. СПб., 2003. 25 с. 4. Миронова А. П., Матвеев В. В., Кулева Н. В. Динамика показателей устойчивости жаберного эпителия беломорских мидий из разных мест обитания // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2004. Вып. 4 . С. 88-92. 5. Сторожок С. А., Панченко Л. Ф., Филиппович Ю. Д., Глушков В. С. Изменение физико-химических свойств биологических мембран при развитии толерантности к этанолу // Вопр. мед. химии. 2001. № 2. С. 33-40. 6. Cervino V., Benaim G., Carafoli E., Guerini D. The effect of ethanol on plasma membrane calcium pump is isoform-specific // J. Biol. Chem.1998. Vol. 273. № 45. P. 29811-29815. 7. Hall J. M., Parrish С. C., Thompson R.J. Eicosapentaenoic acid regulates scallop (Placopecten magellanicus) membrane fluidity in response to cold // 2002. Biol. Bull. Vol. 202. N 3. P. 201-203. 8. Munks R.J., Turner В. M. Suppression of heat-shock protein synthesis by short-chain fatty acids and alcohols // 1994. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1223. N 1. P. 23-28. 9. Patra M., Salonen E., Terama E. Under the influence of alcohol: the effect of ethanol and methanol on lipid bilayers // Biophys. J. 2006. Vol. 90. P. 1121-1135. 10. Sisson J. H. Ethanol stimulated apparent nitric oxide-dependent ciliary beat frequency in bovine airway epithelial cells//Am. J. Physiol. 1995. Vol. 268. P. L596-L600.11. Smith M. W., Phelps P. C., Trump В. Т. Cytosolic Ca-deregulation and blebbing after HgCl2 injury to cultured rabbit proximal tubule cells as determined by digital imige microscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 4926-4930. 12.Vigh L„ Maresca В., HartwoodJ. L. Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes // Trends Biochem. Sci. 1998. Vol. 23. P. 369-374.
Статья поступила в редакцию 15 мая 2006 г.
