CC BY
39
2003 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3. Вып. 3 (№ 19)
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1
И. В. Маркова, Е.А.Румянцева, И. А. Гетман, Г.А.Романов, С.С. Медведев
ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНОЙ РОЛИ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ЦИТОКИНИН-ЗАВИСИМЫХ РЕАКЦИЯХ AMARANTHUS CAUDATUS L.*
В гормональной системе растений наряду с ауксином важнейшая роль отводится цитокининам, которые оказывают влияние на разнообразные аспекты процессов развития, участвуя в регуляции многих физиологических реакций в течение всего онтогенеза. Цитокинины регулируют процессы клеточного деления, прррастания семян, контролируют взаимодействие растения с патогеном, совместно с ауксином участвуют в индукции апикального доминирования и ряде других процессов [1, 5, 7, 11, 16].
Развитие методов молекулярной биологии, генетики и биохимии позволило по-новому взглянуть на процессы биосинтеза, метаболизма и распада цитокининов, перцепции и сигнальной трансдукции. Как известно, место синтеза и место действия фито-гормонов в растительном организме пространственно разделены. Подходы к проблеме идентификации гормон-связывающих белков разрабатываются достаточно давно [6, 8]. Первым был охарактеризован ауксин-связывающий белок (АВР1). Попытки выявления цитокинин-евязывающих белков ведутся с начала 70-х годов. Работы проводились на многих растительных объектах (зародыши пшеницы, листья ячменя и табака, проростки моркови, кукурузы и пшеницы). Долгое время перед учеными стояла задача выявления рецептора цитокининов. Первоначально на эту роль выдвинули рецептор, сопряженный с G-белками, но позже это представление было отвергнуто. Рецептор цитокининов открыли сравнительно недавно [8, И, 14, 18]. В 1996 г. Т.Какимото была описана предполагаемая киназа (CKI1), идентифицированная по ее способности обеспечивать цитокинин-подобные эффекты в тканях трансгенных растений арабидопсиса [13]. Сверхэкспрессия гена CKI1 приводила к цитокинин-независимому росту клеток каллуса. Позже было обнаружено, что рецептором цитокининов является гистидинки-наза, но не CKI1. Возможно существование двухкомпонентной системы сигнализации, состоящей из гистидинкиназы и белка-регулятора ответа [14, 18]. С помощью методов генетического анализа был выявлен ген CREI у растений Arabidopsis thaliana, кодирующий гистидинкиназу. Уже определен аминокислотный состав белка CREI, идентифицирован участок связывания лиганда и показана локализация этого белка в составе плазматической мембраны [8, 11, 18]. На данном этапе разработана гипотетическая схема передачи цитокининового сигнала, включающая множество белковых компонентов.
* Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (грант 99-04-49665, 02-04-49171); INTAS (грант №01-0602).
© И.В. Маркова, Б. А. Румянцева, И. А. Гетман, Г. А. Романов, С. С. Медведев, 2003
Таким образом, цитокининовый ответ крайне сложен и многостадиен, регуляция его осуществляется на всех уровнях клеточной трансдукции. Обнаружено, что в процессе цитокининовой сигнализации участвует ряд вторичных посредников [16], среди которых одно из центральных мест занимает ионизированный кальций. Накопленные за последнее десятилетие данные позволяют рассматривать ионы Са2+ в качестве универсального вторичного мессенджера [3, 15, 17, 20]. Показано, что при воздействии многих экзогенных и эндогенных стимулов происходит быстрое изменение цитоплаз-матической концентрации ионов кальция. Широко обсуждается роль ионов кальция в механизмах действия таких важных фитогормонов, как ауксин, абсцизовая кислота и этилен. Работы по изучению участия Са2+ в трансдукции цитокининового сигнала единичны, при этом практически не исследована роль Са-транспортирующих систем клетки. Цель данной работы заключалась в выяснении механизмов функционирования ионов Са2+ как вторичного посредника в процессе цитокининовой сигнализации у растений АтагагйНиэ саийаЫв, а также участия Са-транспортирующих систем в трансдукции гормонального сигнала.
Материалы и методы. Среди большого разнообразия моделей для исследоваг ния механизмов действия цитокининов в растениях значительные преимущества имеет амарантовый бибтест на цитокинины. Данный биотест основан на накоплении красного пигмента амарантина в семядолях, и гипокотилях у этиолированных проростков Ата-гапШиз саийаЫэ под действием цитокининов. Эта модельная система отвечает требованиям специфичности, высокой чувствительности, не требует стерильности. Эффект цитокининов проявляется быстро и эффективно, что, несомненно, также является преимуществом амарантового биотеста [7, 16].
В данной работе в качестве объекта исследования были использованы 3-дневные проростки амаранта. Семена АтагапИгив саийаЫз проращивались на разбавленном в 10 раз питательном растворе В. А. Чеснокова в течение 3 дней в темноте при 24±1°С. Затем при рассеянном свете у проростков отделяли корешки, а семядоли и апикальную часть гипокотилей раскладывали в миниатюрные чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную фосфатным буфером (12 ммоль/л К2НРО4- КаНгРО^ рН 6,4). Буфер содержал Ь-тирозин в концентрации 1 мг/мл. Тирозин является предшественником амарантина. Затем в чашки Петри при рассеянном свете добавляли Са-агонисты или Са-антагонисты. Отсутствие прямого света необходимо для предотвращения заметного фото-индуцированного синтеза амарантина. Через 15 мин после добавления исследуемых веществ в каждую чашку Петри добавляли цитокинин в форме 6-бензиладенина (БАП) до конечной концентрации 5-10-6 моль/л. Контрольные варианты содержали вместо гормона воду. После добавления БАП или воды проростки инкубировались в течение 18 ч в темноте при 24±1 °С. После завершения инкубации образовавшийся ама-рантин экстрагировали охлажденной 0,1 н соляной кислотой, для этого проростки помещали в 1,4 мл раствора охлажденной НС1. Для более полного извлечения пигмента проростки .трижды замораживали и оттаивали в кислоте, затем определяли оптическую плотность экстрактов при длине волны (Л) 540 нм на спектрофотометре.
Опыты проводились в 3-7-кратной биологической повторности, результаты обработаны статистически. На рисунках приведены средние арифметические значения и указаны средние квадратические ошибки среднего.
Результаты и обсуждение. До настоящего времени исследования по изучению роли ионов кальция в' цитокинин-зависимых реакциях немногочисленны и достаточно противоречивы. Ранее было изучено влияние хелатора ионов кальция ЭГТА (этиленгликоль-бис-(/?-аминоэтилэстер)-^Ы,]М,К-тетрауксусная кислота) на
цитокинин-индуцированный синтез амарантина в проростках АтпагатйНиэ [9, 16]. При действии хелатора в концентрации 10_3 моль/л происходило значительное увеличение синтеза пигмента (на 30-50%) [9]. Г. А. Романов с соавторами при использовании ЭГТА в концентрации 5-10"3 моль/л наблюдали уменьшение уровня синтеза амарантина по сравнению с контролем [16].
В данной работе мы проводили исследование влияния Са-агонистов и Са-анта-гонистов в различных концентрациях на цитокинин-индуцированный синтез амарантина. В качестве Са-агонистов часто применяют экзогенный хлорид кальция и ЭГТА [12], Са-антагонистами являются ингибиторы Са-АТФаз и блокаторы Са-каналов [17,19, 20]. Необходимо отметить, что в предыдущих исследованиях изучали роль ионов кальция, а также других веществ исключительно на цитокинин-зависимый синтез амарантина [7, 9, 16]. Тем не менее оказалось, что пигмент в значимых количествах синтезируется и в отсутствие экзогенного гормона в среде инкубации, хотя эндогенный синтез амарантина почти в 3 раза ниже цитокинин-индуцированного (табл. 1, контроль). Поэтому в дальнейших исследованиях мы изучали влияние Са-агонистов и антагонистов как на синтез амарантина в отсутствие экзогенного цитокинина, так и на синтез пигмента в ответ на добавку гормона в инкубационную среду.
Таблица 1. Влияние ЭГТА на синтез пигмента проростками АтагапИгив саийаЬиз
Вариант (-) БАП (+) БАП
Контроль ЭГТА, 510~4 моль/л 0,046±0,001 0;057±0,002 0,228±0,006 0,224±0,006
Контроль ЭГТА, 5-Ю-5 моль/л (),049±0,001 0,046±0,001 0,220±0,003 0,222±0,005
Проявление эффекта некоторых гормонов зависит от концентрации кальция в ткани растения [3, 12]. Изменение уровня кальция в ткани можно осуществить посредством введения хелатора ионов кальция ЭГТА в инкубационную среду или добавления экзогенного СаСЬ- Обнаружено, что ЭГТА или ионы кальция в высоких концентрациях (10_3 моль/л и выше) подавляют ростовые процессы [2]. Применение этих веществ в более низких концентрациях (Ю-4 моль/л ЭГТА, 10~4-5-10~5 моль/л СаСЬ) часто вызывает стимуляцию роста и одновременно транспорта ауксина [2, 10]. Известно, что фаза клеточных стенок содержит около Ю-4 моль/л Са2+ [12], поэтому в данной работе в качестве хелатора ионов кальция мы использовали ЭГТА в концентрациях 5-10~4 и 5-10~5 моль/л, которые можно считать физиологически корректными.
В табл. 1 представлены данные о влиянии ЭГТА в концентрации 5Т0-4 моль/л как на БАП-индуцированный синтез амарантина, так и на синтез пигмента в отсутствие экзогенного гормона в среде инкубации. Хелатор ионов кальция в концентрации 5-10"-4 моль/л оказывал незначительный ингибирующий эффект на синтез пигмента в присутствие экзогенного гормона в среде, при отсутствии такового в среде ЭГТА оказывала заметный стимулирующий эффект. При снижении концентрации ЭГТА на порядок характер ответной реакции был ино^.- При внесении экзогенного цитокинина ЭГТА вызывала незначительное увеличение синтеза амарантина, в отсутствие БАП синтез пигмента уменьшался. Можно заметить, что уровень синтеза амарантина в контрольных вариантах (+/- БАП) изменялся от опыта к опыту (см. табл. 1). По-видимому, это связано с присутствием определенного уровня эндогенного цитокинина в проростках амаранта.
На рис. 1 эти данные представлены в процентном отношении: за 100% принят синтез
: 130
120
^ 110 й
ё 100
§ 90
8 и
80 70 60 50
Контроль ЭГТА, 510 моль/л ЭГТА, 5-10 моль/л
Рис. 1. Влияние ЭГТА (5-Ю"4, 5-Ю"5 моль/л) на синтез пигмента проростками амаранта. Светлые столбики — контроль; темные — цитокинин-индуцированный синтез пигмента (то же для рис. 2-5).
пигмента как в контрольном варианте в присутствии экзогенного БАП в среде инкубации, так и в его отсутствие. Стоит заметить, что характер ответа на ЭГТА меняется в зависимости от наличия или отсутствия экзогенного цитокинина в инкубационной среде. Возможно, эффекты ЭГТА связаны со значительной буферной кальциевой емкостью апопласта.
Помимо Са-хелатора ЭГТА кальциевый статус растительной ткани можно модифицировать и с помощью внесения экзогенного кальция в инкубационную среду. Ранее было показано, что ионы Са2+ в концентрации 5-10-3 моль/л оказывают стимулирующее действие на цитокинин-индуцированные реакции в семядолях фасоли. Под влиянием кальция в данной концентрации происходила задержка старения семядолей ХапИгтт, в более высоких концентрациях (3-10-2 моль/л) ионы Са2+ не оказывали стимулирующе-, го действия [9]. При обработке меристематической зоны гипокотилей сои цитокининами происходило увеличение АТФазной активности на плазмалемме. На основе полученных данных было высказано предположение о том, что существует связь между ионами кальция и цитокйнинами. В нашей работе мы использовали спектр концентраций хлорида кальция (рис. 2). При добавлении в инкубационную среду 10~3 моль/л СаСЬ происходило некоторое уменьшение цитокинин-зависимого синтеза, однако в среде без гормона синтез пигмента увеличивался. Ионы Са2+ в концентрации 5-Ю""5 моль/л практически не влияли на накопление амарантина как в присутствии экзогенного БАП в среде инкубации, так и в отсутствие гдрмона, синтез пигмента не изменялся по сравнению с уровнем контроля. Наиболее оптимальная концентрация Са2+ в среде, при которой наблюдали значительный синтез амарантина, составила около Ю-6 моль/л. Хлорид кальция в концентрации 10_6 моль/л оказывал стимулирующий эффект как на цитокинин-индуцированный синтез, так и на синтез в отсутствие гормона. Таким образом, ионы Са2+ действуют во всем спектре изученных концентраций.
Полученные данные свидетельствуют о том, что ионы кальция имеют важное зна-
110
Рис. 2. Влияние экзогенного кальция (10 3, 5-10 5, 10 6 моль/л) на синтез пигмента проростками амаранта. ;
чение в процессе синтеза амарантина. Можно предположить, что внесение экзогенного СаС12 или хелатора двухвалентных ионов ЭГТА в первую очередь влияет на соотношение свободного и связанного кальция в апопласте. В настоящее время фаза клеточной стенки рассматривается как мишень, которая первой подвергается действию множества внешних стимулов и некоторых вторичных посредников. Возникающие при этом сигналы действуют на находящиеся в апопласте регуляторные белки, в результате происходит изменение структуры этих белков и, как следствие, активности ферментных систем клетки. Изменение уровня апопластного Са2+ в первую очередь влияет на Са-связывающие белки плазматической мембраны, в том числе на Са-активируемые К-и Са-каналы, что может изменить параметры трансмембранных ионных потоков [17].
Локальные изменения [Са2+]цих в примембранной зоне могут приводить к развитию специфичных каскадов сигнальных реакций, при этом изменяется функционирование всех транспортных систем клетки, происходит изменение проводимости и селективности ионных каналов плазмалеммы и эндомембран [15, 17]. Это, в свою очередь, приводит к смещению цитоплазматических концентраций таких важных ионов, как Са2+, К+ и С1~. Наша дальнейшая работа была направлена на изучение участия Са-транспортирующих систем клетки в ходе цитокинин-зависимых реакций. Для этого были использованы блокаторы Са-каналов плазматической мембраны верапамил и ли-докаин, а также ингибитор Са-АТФаз пддзмалеммы эритрозин Б [19, 21].
На рис. 3 представлены данные о действии верапамила и лидокаина на цитокинин-индуцированный синтез амарантина. Эффект двух блокаторов сходен: в присутствии экзогенного БАП в инкубационной среде происходит значительное уменьшение синтеза амарантина. В среде без гормона и верапамил, и особенно лидокаин оказывали стимулирующий эффект. Полученные результаты позволяют предположить, что в цитокинин-зависимых реакциях необходимо функционирование Са-каналов плазма-
120 110
Контроль Верапамил, . Лидокаин,
-5 -4
5-10 моль/л 10 моль/л
Рис. 3. Влияние блокаторов кальциевых каналов на синтез пигмента проростками амаранта.
леммы. Возможно, в данных процессах также принимают участие Са-АТФазы плазматической мембраны. При добавлении в инкубационную среду эритрозина Б, специфичного ингибитора Са-АТФаз, развивался более яркий ответ. Эритрозин Б в концентрации 2-Ю-5 моль/л оказывал значительный Ингибирующий эффект (более 40%) на БАП-зависимый синтез амарантина, в отсутствие в среде инкубации ингибитора происходило существенное возрастание синтеза пигмента (рис. 4). При уменьшении концентрации эритрозина Б на порядок характер ответной реакции сохранялся. На основе полученных результатов можно предположить, что работа систем мембранного транспорта (Са-АТФаз и Са-каналов) необходима в цитокинин-индуцированных реакциях. Можно заметить, что характер ответной реакции зависел от наличия или отсутствия цитокинина в инкубационной среде: в присутствии цитокинина блокирование мембранного транспорта ионов кальция оказывало ингибирующий эффект; если же в среде гормон отсутствовал, ингибирование Са-каналов и Са АТФаз приводило к увеличению синтеза пигмента проростками амаранта.
Известно, что в растительных клетках существует большое разнообразие кальций-связывающих белков, к числу которых относятся кальмодулин и кальмодулин-связывающие белки, кальретикулин, протеинкиназы, фосфатазы. В настоящее время интенсивно изучается роль этих белков в сигнальных процессах клетки. Основной Са-связывающий белок кальмодулин, он является мишенью для кальциевого сигнала. Этот белок относится к семейству EF-белко^имеет 4 сайта связывания с кальцием, показана высоко консервативная структура этого белка [4]. Изучение роли Са-связывающих белков проводилось в работе Д. С. Эллиот [9]. Для этого был использован ряд ингибиторов кальмодулина. Было показано, что ингибиторы подавляют цитокинин-индуцированный синтез окрашенного пигмента бетацианина в проростках Amaranthus tricolor. Наибольший ингибирующий эффект оказывали трифторперазин и хлорпромазин. На основе полученных данных было высказано предположение о том, что цитокинины изменяют
4= о4
вГ
15!
и
Контроль
Эритрозин Б, 2-10 моль/л
Эритрозин Б,.
-б
2-10 моль/л
Рис. 4- Влияние эритрозина Б (2Ю~5, 2-Ю-6 моль/л) • на синтез пигмента прорёстками амаранта.
ионные потоки, в том числе и ионов кальция, и при этом происходит активация АТФаз плазмалеммы [9], но дальнейших разработок этой гипотезы до сих пор не осуществлялось.
В данной работе мы изучали влияние трифторперазина (ТФП) на цитокинин-индуцированные реакции (рис.5). При внесении ингибитора в концентрации Ю-4 моль/л происходило значительное уменьшение БАП-индуцированного синтеза
в4
и
Контроль ТФП, 10 моль/л Рис. 5. Влияние трифторперазина (Ю-4
ТФП, 10 моль/л
, 10~б моль/л)
на синтез пигмента проростками амаранта.
пигмента, в отсутствие экзогенного гормона в инкубационной среде действие ТФП было в 3 раза слабее. При уменьшении концентрации ингибитора на порядок'характер ответной реакции был иной. В присутствии экзогенного БАП синтез амарантина подавлялся в меньшей степени, чем в среде без гормона. Полученные данные свидетельствуют о том, что в процессе передачи цитокининового сигнала необходимо участие кальмодулина. Возможно, действие этого белка не прямое, а опосредованное. Происходит изменение функционирования многих кальмодулин-зависимых белков, таких как глутаматдекарбоксилаза, КАБ-киназы, Са-АТФазы плазмалеммы и тонопласта, ионные вакуолярные каналы [15]. Вероятно, в процессе цитокининовой сигнализации принимают участие Са-зависимые, Са-кальмодулин-зависимые и Са-липид-зависимые протеинкиназы, а также белковые фосфатазы.
Таким образом, на основании полученных результатов можно заметить, что агенты, модифицирующие мембранный транспорт кальция в клетке, оказывают более выраженное влияние на цитокинин-индуцированные реакции, чем хелатор ионов кальция ЭГТА и экзогенный кальций (табл. 2). Вероятно, в процессе передачи гормонального сигнала необходимо функционирование систем мембранного транспорта кальция, как Са-каналов плазмалеммы, так и Са-АТФаз. Очевидно, что при модификации работы транспортных систем клетки происходит смещение концентрации цитоплазматического кальция. Изменение [Са2+]цит оказывает влияние на разнообразные Са-связывающие белки, среди которых значительную роль играет кальмодулин. Можно предположить, что определенное значение в процессах трансдукции гормонального сигнала имеет также соотношение связанного и свободного кальция в фазе апопласта. Скорее всего," ионы кальция необходимы, на всех этапах передачи цитокининового сигнала в клетке.
Таблица 2. Эффект Са-агонистов и Са-антагонистов на синтез бетацианина проростками АтатагЛКия саийаЬиз Ь, %
Агент, mo ль/л (-) БАП . (+) БАП
ЭГТА, 5-lO"4 -7,7 -1,7
ЭГТА, 5-Ю"5 +25,0 +0,9 .
СаСЬДО"3 +4,0 -4,9
СаС12, 5Ю~5 -4,3 +1,8
1 СаС12, Ю-6 +4,2 . +7,1
Верапамил, 5-Ю-5 +1,5 -27,9
Лидокаин, 10~4 +10,7 -22,1
Эритрозин Б, 2-Ю-5 +19,0 _ —41,0
Эритрозин Б, 2-10-6 +14,3 -15,7
ТФП, 1СГ4 -12,2 -35,7 "
ТФП, ю-5 -25,6 -12,9
Примечание. «-» — ингибирование синтеза пигмента по сравнению с контролем; «+»—стимуляция синтеза амарантина по сравнению с контрольным уровнем.
Summary
Markoval. V., Rumjantseva E. A., Getmanl. A., Romanov G. A., MedvedevS. S Investigation of signal role of calcium ions in cytokinin-dependent reactions Amaranthus caudatus L.
The aim of our work is to elucidate the mechanisms of functioning of calcium ions as an important signaling molecule in the process of cytokinin transduction in plant cells. The standard Amaranthus bioassay has been used. The results obtained allow to assume that Ca-transporting systems (Ca-channels and Ca-ATPases) of plant cells take an important role in transduction of cytokinin signals. Probably, Ca-binding protein calmodulin is necessary in cytokinin signalization.
Литература
1. Кулаева О. Н. Цитокинины, их структура и функция. М., 1973. 2. Медведев С. С., Маркова И.В., Батов А.Ю., Максимов Г.Б. Полярные потоки ионов кальция и рост растительных тканей // Физиол. раст. 1989. Т. 36. Вып. 5. С. 900-908. 3. Медведев С. С. Физиологические основы полярности растений. СПб., 1996. 4. Пермяков Е. А. Парвальбумин и родственные кальцийсвязывающие белки растений. М., 1985. 5. Полевой В. В. Фитогормоны. Л., 1982. 6. Романов Г. А. Гормонсвязывающие белки растений и проблема рецепции фитогормонов // Физиол. раст. 1989. Т. 36. Вып. 1. С. 166-177. 7. Романов Г. А., Гетман И. А., Шмюллинг Т. Быстрая активация транскрипции ядерных генов необходима для индуцированного цитокининами образования бетацианина в проростках амаранта // Докл. АН. 1999. Т. 365, №6. С. 832-835. 8. Романов Г. А. Рецепторы фитогормонов // Физиол. растений. 2002. Т. 49. Вып. 4. С. 615-625. 9. Elliot D. С. Inhibition of cytokinin-regulated responses by calmodulin-binding compounds // Plant Physiol. 1983. Vol. 72. P. 215-218. 10. Fuente R.K., dela. Role of calcium in the polar secretion of indoleacetic acid // Plant Physiol. 1984. Vol.76. P. 342-356. 11. Haberer G., Kieber J. J. Cytokinins. New insights into a classic phytohormone // Plant Physiol. 2002. . Vol. 128. P. 354-362. 12. Hepler P. K., Wayne R. O. Calcium and plant development // Annu. Rev. Plant Physiol. Stanford., 1985. Vol.36. P.397-439. 13. Kakimoto Т. CKI1, a histidine kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction // Science. 1996. Vol. 274. P. 982-985. 14. Lohrmann J., Harter К. Plant two-component signaling systems and the role of response regulators // Plant Physiol. 2002. Vol. 128. P. 363-369. 15. Pandey S., Tiwari S. В., Upad-hyaya K.C., Sopory S.K. Calcium signaling: linking environmental signals to cellular functions // Crit. Rev. Plant Sei. 2000. Vol.19. P.291-318. 16. Romanov G.A., Getman I.A., Schmulling T. Investigation of early cytokinin effects in a rapid Amaranthus seedling test // Plant Growth Regulation. 2000. Vol. 32. P. 337-344. 17. --Sanders D., Brownlee C., Harper J. F. Communication with calcium // Plant Cell. 1999. Vol.11. P. 691-706. 18. Schmulling T. CREam of cytokinin signalling: receptor identified // Trends Plant Sei. 2001. Vol. 6. P. 281-284. 19. Sze H., Liang F., Hwang I., Curran A. C., Harper J.F. Diversity and regulation of plant Ca2+ pums: insights from expression in yeast // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. Vol. 51. P. 433-462. 20. Trewavas A. J., Malho R. Ca2+ signalling in plant cells: the big network! 11 Curr. Opin. Plant Biol. 1998. Vol. 1. P. 428-433. 21. White P.J. Calcium channel in higher plants // Biochem. et Biophys. Acta. 2000. Vol. 1465. P. 17РЧ89.
Статья поступила в редакцию 17 марта 2003 г.
