CC BY
17
2005 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3. Вып. 3
БИОХИМИЯ
УДК 577.352
Н. В. Кулева, А. Г1. Миронова
УЧАСТИЕ ГчО-ЗЛВИСИМОГО МЕХАНИЗМА В АДАПТИВНОМ ОТВЕТЕ МЕРЦАТЕЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ БЕЛОМОРСКОЙ МИДИИ
Токсический эффект этанола на клетки и ткани связывают в первую очередь с продуктом его окисления адетальдегидом, который может нарушать электромеханическое сопряжение в сердечной мьпице и освобождение кальция саркоплазматическим ретикулумом [5]. Ацеталъдегид в концентрации 100 мкМ вызывал генерацию свободных радикалов и развитие апоптоза, которые сопровождались активацией стрессорных сигнальных: молекул: регулируемой внеклеточным сигналом ЕКК 1/2 киназы и р38 митоген-активируемой проте-инкиназы. Интересно, что эти эффекты блокировал антиоксидант а-токоферол, уменьшающий перекисное окисление липидов мембран.
Адаптивный ответ на этанол заключается в том, что предварительное воздействие в малых дозах (0,4-0,6 М) увеличивает устойчивость клеток к его повреждающим концентрациям (2,5-3.0 М). Адаптивное действие низких концентраций этанола было продемонстрировано на изолированных мышцах лягушки [1]. Можно предположить, что описанные для изолированных мышц лягушки и клеток мерцательного эпителия мидий защитные эффекты субтоксических концентраций этанола [1, 2] опосредованы через антиоксидантный эффект, генерируемый при действии 0,6 М этанола.
На эпителиальных клетках трахеи быка было показано, что этанол концентрации 0,01-1,00 М увеличивает частоту биения ресничек, и этот эффект зависит от продукции
Отлтхлп оолто ГСП ГТлатлхлг олои/лмлиллтг т^олтгтст \Юот>ттлтхи»1 тл/ »/огоиг/оияг\т> р оггоптгл>или*
ответе на этанол весьма вероятна. Попытка проверить это предположение на мерцательном эпителии беломорских мидий была предпринята в настоящей работе.
В работе использовали препараты мерцательного эпителия жабр мидий МуШм ес^иНз, собранных на литорали мыса Картеш Чупинской губы Белого моря. Длина раковин мидий составляла 3,0-4,0 см. Препараты представляли собой полоски клеток, окаймленных ресничками. Непосредственно после извлечения жабр из раковины их помещали в морскую воду на 30 мин. Затем их переносили в чашки Петри, содержащие либо растворенный в морской воде этанол в субтоксической концентрации 0,6 М, либо вместе с этанолом ингибитор ЬЮ-синтазы аминогуанидин в концентрации 0,4 мМ, либо вместе с этанолом и аминогуанидином, продуцент N0 - нитропруссид натрия в концентрации 0,01 мМ. Предварительно было показано, что преинкубация жабр с аминогуанидином концентрации 0,4 мМ уменьшает время сохранения функциональной активности клеток в морской воде, содержащей 3,0 М этанола, а преинкубация с нитропруссидом концентрации 0,01 мМ увеличивает этот показатель.
© Н. В. Кулева, А. П. Миронова, 2005
Через 15 мин полоски клеток переносили в другие чашки Петри, содержащие этанол в токсической концентрации 3,0 М, и с помощью светового микроскопа следили за двигательной активностью краевых ресничек.
Данные о времени сохранения этой активности в средах различного состава показывают, что в ряде опытов преинкубация клеток с 0,6 М этанолом и ингибитором N0-0интазы приводит к уменьшению времени сохранения функциональной активности клеток в 3,0 М этаноле, а добавление в эту пробу продуцента N0 - нитропруссида - приводит к увеличению этого показателя. Таким образом, можно полагать, что адаптивный ответ опосредован функционированием фермента ЫО-синтазы. Однако, как уже было отмечено в диссертации А. П. Мироновой [1], и как следует из представленного рисунка, возможен и другой вариант ответа мерцательного эпителия на этанол: уменьшение времени сохранения функциональной активности до уровня, который практически не меняется в присутствии ингибитора и последующее восстановление его до контрольного в присутствие донора N0. Если сравнить контрольный уровень сохранения функциональной активности в двух вариантах ответа, то оказывается, что он различается примерно в два раза: первый вариант 51 мин, второй - 98 мин, т. е. наблюдается обратная зависимость эффекта от контрольного уровня, также отмеченная в диссертации Мироновой [1] для изолированных мышц лягушки.
Концентрации этанола, которые при предварительном выдерживании вызывали изменение времени сохранения функциональной активности изолированных мышц лягушки [1] и мерцательного эпителия беломорских мидий [2] лежат в пределах 0,1-1,0 М. Именно этот ряд концентраций этанола вызывал активацию различных изоформ Са2+-АТФазы плазматической мембраны [3] основного фермента, регулирующего активность ЫО-синтазы [7]. Как известно, активность ИО-синтазы определяется уровнем кальция, который образует комплекс с кальмодулином в активном центре. Поэтому увеличение активности АТФазы плазматической мембраны означает уменьшение концентрации кальция и соответственно уменьшение уровня активности Ж)-синтазы, т. е. второй вариант ответа на этанол.
С другой стороны, известно, что отличительной особенностью нейрональной изофор-мы Ж)-синтазы является очень короткое время полужизни (около 30 мин), которое регулируется уровнем активности активируемой кальцием протеиназы кальпаина [4]. Высокий уровень активности кальпаина при дистрофии Дюшенна значительно уменьшает активность N0-синтазы при этом заболевании мышц. Уменьшение концентрации кальция, вызванное активацией Са2+-АТФазы плазматической мембраны под действием этанола, может уменьшить активность кальпаина и таким образом увеличить количество функционирующего фермента
250-,
200-
Два варианта ответа мерцательного эпителия мидии на этанол (2), этанол + аминогуанидин, ингибитор ЫО-синтазы (3), этанол + аминогуанидин + нитроприссид, продуцент N0 (4).
По оси ординат: время сохранения двигательной активности ресничек, в % к контрольному уровню; уровень, соответствующий 51 ± 10 мин принят за 100% б лезой группе показателей; уровень 98 ± 15 мин принят за 100% в правой группе показателей.
ЫО-синтазы. Отражением этой ситуации может являться первый из рассмотренных нами вариантов ответа на этанол. Можно полагать, что в клетке имеет место комбинация обоих механизмов. На это указывают результаты шести опытов, приведенные в таблице.
Влияние а миногу анидина и нитропруссида на время (мин) сохранения двигательной активности ресничек мерцательного эпителия в 3 М этаноле
№ опыта Морская вода Морская вода + 0,6 М этанол Морская вода + 0,6 М этанол + 0,4 М аминогуанидин Морская рода + 0,6 М этанол + 0,4 М аминогуанидин + . 0,01 мМ нитропруссид
1 112 71 48 -
2 . 32 88 19 -
3 45 103 60 230
4 41 42 35 37
5 83 65 56 70
6 88 132 110 200
Как уже было отмечено, аналогичные эффекты этанола были получены для изолированных скелетных мышц, у которых экспериментально доказано присутствие в сарколемме нейрональной изоформы NO-синтазы [8]. Главным следствием эффектов малых концентраций N0 является активация гуанилатциклазы и улучшение механических и метаболических свойств мышцы, подобное переходу от медленного типа мышцы к быстрому [6]. Предположительно, активация гуанилатциклазы при действии этанола на эпителий трахеи быка также приводит к увеличению частоты биения ресничек посредством активации динеино-вой АТФазы аксонемы [9]. На какие структурные элементы действует повышение концентрации ц-ГМФ, пока не ясно. Это могут быть ионные каналы или протеинкиназы, фосфори-лирующие специфические бе лжи.
Поскольку в конечном итоге уровень NO-синтазы и, возможно, зависящий от него ответ клетки на низкие концентрации этанола, определяются концентрацией кальция, актуально исследовать зависимость ответа на этанол от концентрации кальция.
Опыты, проведенные на изолированных мышцах лягушки, показывают, что не только этанол, но и ряд других веществ увеличивают время сохранения функциональной активности клетки, т. е. эффект является результатом повышения неспецифической резистентности клетки, поэтому также актуально выяснить, являются ли неспецифическими механизмы активации NO-синтазы. Для этого нужно определить уровень NO-синтазной активности в присутствии различных веществ, вызывающих повышение резистентности клеток.
Summary
Kuleva N. К, Mir опт а А. P. Nitric oxide-dependent mechanism participation in adaptive response of ciliary epithelium of White sea molluskMy//j)7MS edulis.
Adaptive response of isolated ciliary epithelium of White sea mollusk Mythilus edulis on 0,6 M etha-nol was shown to occur by NO-dependent mechanism. Key words: adaptive response, ciliary epithelium, NO, ethanol.
Литература
1. Миронова А. П. Динамика статистических показателей при тестировании функциональной активности мышц химическим воздействием: Автореф. канд. дис. СПб., 2003. 25 с. 2. Миронова А. П., Матвеев В. В., Кулева Н. В. Динамика показателей устойчивости жаберного эпителия беломорских мидий из разных мест обитания // Вестн. С.-Петерб. ун-та. 2004. Сер. 3. Вып. 4. С. 88-92. 3. Cervino V., BenaimG., Carafoli Е., Guerini D. The effect of ethanol on plasma membrane calcium pump in isoform-
specific // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 29811-29815. 4. Laine R., de Montellano P. R. O. Neuronal nitric oxide synthase isoforms a and ¡x are closely related calpain-sensitive proteins // Molec. Pharmacol. 1998. Vol. 54. P. 305-312. 5. Li S., GomelskyM., DuanF., ZhangZ., GomelskyL., ZhangX., Epstein P. N.. Ren J. Overexpression of aldehyde dehydrogenase. 2. Transgene prevents acetaldehyde-induced cell injury in human umbilical vein endothelial cells // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 11244-11252. 6.MarechalG., GaillyP. Effects of nitric oxide on contraction of skeletal muscle// Cell. Mol. Life Sci. 1999. Vol. 55. P. 1088-1102. l.SchuhK., UldrijanS., TelkampM, Rothelein N.. NeysesL. The plasma membrane calmo-dulin-dependent calcium pump: a major regulator of nitric oxide syntase I // J. Cell. Biol. 2001. Vol. 155. P. 201-205. 8. Silvagno F., XiaH., BredlD.S. Neuronal nitric oxide synthase-mu, an alternatively spliced isoform expressed in differentiated skeletal muscle // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 11204-11208. 9.SissonJ. H. Ethanol stimulated apparent nitric oxide-dependent ciliary beat frequency in bovine airway epithelial cells // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 268. L596-L600.
Статья поступила в редакцию 5 мая 2005 г.
