Изучение комбинированного действия циклофосфана и экстракта мицелия вешенки на меланому b16-f0 мышей, экспрессирующей зеленый флюоресцирующий белок Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.277+582.28]:616-006.81-092.9:577.112

Ir. G. Meerovich1, М. Yang2, P. Jiang2, R.-M. Hoffman2, V. P. Gerasimenya3, A. E. Orlov3, A. P. Savitsky1, V. O. Popov1

STUDYING OF COMBINED ACTION OF CYCLOPHOSPHAMIDE AND EXTRACT OF PLEUROTUS OSTREATUS ON MICE MELANOMA B16-F0 EXPRESSING GREEN FLUORESCENT

PROTEIN

1 A. N. Bach Institute of biochemistry of RAS, Moscow, Russia 2 AntiCancer, Inc., San Diego, USA 3 JSVPulmomed, Moscow, Russia

ABSTRACT

In this work we studied the combined action of cyclophosphamide and the extract of micellium of Pleurotus ostrea-tus on mice bearing melanoma B16-F0, expressing green fluorescent protein (GFP) in vivo.

This model allows to recognize primary small-size tumors and métastasés, unrecognizable by other methods.

It was found that in case of combined administration of cyclophosphamide (300 mg/kg) and the extract of micellium of Pleurotus ostreatus (100 mg/kg), administered for 10 days after cyclophosphamide injection, the amount of leucocytes in peripheral blood of mice with melanoma B16-F0 reduced to 51 % of its initial value, while the administration of cyclophosphamide alone — 27 %.

It was shown that the administration of the extract of micellium of Pleurotus ostreatus leads to the inhibition of tumor growth about 61 %.

Key words: fluorescent protein, tumor, extract of micellium of Pleurotus ostreatus, cyclophosphamide, melanoma.

Ир. Г. Меерович1, М. Янг2, П. Джианг2, Р.-М. Хоффман2, В. П. Герасименя3, А. Е. Орлов3, А. П. Савицкий1, В. О. Попов1

ИЗУЧЕНИЕ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ЦИКЛОФОСФАНА И ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ НА МЕЛАНОМУ B16-F0 МЫШЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ ЗЕЛЕНЫЙ ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИЙ БЕЛОК

1 Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН, Москва, Россия 2 AntiCancer, Inc., Сан-Диего, США 3 ЗАО «Пулъмомед», Москва, Россия

РЕЗЮМЕ

В работе изучалось сочетанное действие циклофосфана и экстракта мицелия Pleurotus ostreatus (вешенки) на мышах с меланомой B16-F0, экспрессирующей зеленый флюоресцирующий белок.

Такая модель позволяет в реальном времени регистрировать опухоли и метастазы малых размеров, которые невозможно зарегистрировать обычными методами.

Установлено, что при сочетанном использовании циклофосфана (300 мг/кг однократно) и экстракта мицелия вешенки (100 мг/кг), применяемого в течение 10 сут после введения циклофосфана, количество лейкоцитов в периферической крови мышей с меланомой B16-F0 на 3-й день после начала эксперимента составляет 51 % от исходного показателя, в то время как при использовании циклофосфана — 27 %.

Показано, что экстракт мицелия вешенки в 10-кратной дозе по 100 мг/кг тормозит рост меланомы B16-F0 на 61 %, циклофосфан в дозе 300 мг/кг (однократно) и комбинация циклофосфана с экстрактом мицелия вешенки — на 97 %.

Ключевые слова: флюоресцирующий белок, опухоль, экстракт мицелия вешенки, циклофосфан, меланома.

ВВЕДЕНИЕ

Цветные флюоресцирующие белки (fluorescent proteins — FP) являются уникальными генетическими маркерами для изучения молекулярных процессов в живых, постоянно развивающихся клетках и организмах. Они могут быть гетерологически экспрессированы в любых клетках, а для появления флюоресцентного сигнала от этих белков не требуется дополнительных ферментов или кофакторов.

Одной из наиболее перспективных областей применения клеточных сенсоров на основе цветных флюоресцирующих белков является экспериментальная онкология. Экспрессия таких белков опухолевыми клетками, трансфицированными соответствующими генами, стабильна в течение неограниченного времени. Использование FP-меченных опухолей позволяет исследовать развитие первичных опухолевых узлов и метастазов в режиме реального времени, не прибегая к умерщвлению животных и сложным препаративным процедурам, а также без анестезии или обездвиживания животных [3]. Высокая чувствительность детекции, обусловленная сильной прижизненной флюоресценцией цветных белков, и хорошее пространственное разрешение изображений позволяют визуализировать ранний ответ опухоли на лекарственную терапию.Метод визуализации опухолевых очагов был опробован на ряде моделей, в частности раке поджелудочной железы, карциноме Льюиса и других опухолях легкого, раке молочной железы, раке простаты, меланоме, опухолях мозга [6]. Он использовался также для исследования развития первичной опухоли, мета-стазирования, ангиогенеза и ответа на лекарственную терапию. При моделировании опухоли яичников путем ортотопической имплантации СНО-К1, экспрессирующей зеленый флюоресцирующий белок (GFP), развившиеся опухоли демонстрировали интенсивную флюоресценцию, которая позволяла наблюдать последовательное распространение опухоли в брюшной полости, включая кишечник, селезенку, стенку брюшной полости, выявлять многочисленные микрометастазы в легких, печени, почках, плевральной мембране, а также визуализировать единичные флюоресцирующие клетки, которые не могут быть определены с помощью стандартных методик [4].

При использовании в качестве моделей человеческих опухолей поджелудочной железы BxPC-3-GFP и MiaPaCa-2-GFP, ортотопически имплантированных в поджелудочную железу бестимусных мышей, флюоресцентное изображение всего животного («whole-body imaging») позволило в реальном времени наблюдать рост первичной опухоли и образование метастатических узлов в селезенке, печени и других органах. Прижизненные изображения были использованы для количественной оценки роста микрометастазов в печени и желудке. На этих же моделях изучалась противоопухолевая и антиметастатическая эффективность аналога амптотецина DX-8951f. Показана эффективность лечения опухолей, а также антиметастатическая активность в модели «запущенного рака»: препарат

существенно снижал вероятность возникновения метастазов лимфатических узлов и уничтожал легочные метастазы. На модели опухоли поджелудочной железы, экспрессирующей GFP, было проведено сравнительное изучение препарата DX-8951f и гемцитаби-на — стандартного препарата для терапии этого вида опухолей. DX-8951f проявил умеренную эффективность при лечении первичной опухоли и был неэффективен при лечении метастазов в области лимфатических узлов и легких [10].

Использование подобной модели позволяет также изучать ангиогенез опухолей. В частности, изучалась неоваскуляризация [7] ортотопически имплантированной бестимусным мышам человеческой опухоли NUGC и ее ингибирование. При использовании флюоресцирующих опухолей новообразованные сосуды определяются в виде темной сетки на светящемся фоне.

Одним из принципиальных отличий используемой модели визуализации опухоли и несомненным ее достоинством является отсутствие необходимости дополнительного введения контрастирующих агентов, ферментов или субстратов. За счет этого на достоверность визуализации не влияют особенности распределения этих агентов в организме, а также снимаются ограничения, связанные с их возможной токсичностью и взаимодействием с терапевтическими агентами.

Цель данной работы — изучение сочетанного воздействия на флюоресцирующую опухоль (меланому B16-F0, экспрессирующую GFP) химиотерапевтического препарата циклофосфана и экстракта мицелия Pleurotus ostreatus (вешенки). Было показано, что экстракт мицелия вешенки обладает защитным эффектом в отношении токсических проявлений циклофосфана, доксорубицина, 5-фторурацила, метотрексата, таксола, снижает гематологическую токсичность, а также эффективен при лечении асцитного рака молочной железы (карцинома Эрлиха) у мышей [5]. Другие исследователи указывали на потенциальную противоопухолевую активность экстракта плодового тела, мицелия вешенки, а также отдельных компонентов этого экстракта, в частности полисахаридов, лектинов и т. д. [И].

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Клеточная линия и модель мышиной меланомы B16-F0-GFP

Культура опухолевых клеток, экспрессирующих флюоресцирующий белок, была получена по методике, описанной R.-M. Hoffman [6]. К клеткам-мишеням добавляли супернатант клеток PT67-GFP [8] (содержащих ретровирусную конструкцию, кодирующую биосинтез GFP) в присутствии полибрена (для увеличения проницаемости клеточной стенки), инкубировали в течение 18 ч, затем среду заменяли обычной, еще через 24 ч смесь трансфицированных клеток подвергали селекции и клонированию. Для селекции использовали методику, основанную на пошаговом увеличении концентрации антибиотиков в культуральной среде (конструкция содержала ген устойчивости к антибиотику G418), при клонировании — метод предельных

разведений либо методику с клонирующими цилиндрами [12].

В исследованиях использовали мышей линии C57BL/6 в возрасте 8 нед с массой тела 23-30 г. Клетки B16-F0-GFP были выращены на среде RPMI с 10 % фетальной сыворотки, собраны путем трипсинизации, отмыты трижды средой, ресуспендированы в охлажденном до 4 °С фосфатно-солевом буфере PBS и хранились на льду (время хранения не превышало 30 мин). Опухоль перевивали подкожно в область спины по 30 мкл суспензии, содержащей 10б клеток. На 5-е сутки после перевивки из числа животных, показывающих стабильный рост опухолей, были сформированы 4 группы:

1-я группа — циклофосфан + экстракт мицелия вешенки;

2-я группа — циклофосфан;

3-я группа — экстракт мицелия вешенки;

4-я группа — контроль.

Циклофосфан вводили однократно внутрибрю-шинно в дозе 300 мг/кг. Экстракт мицелия вешенки «ОВО-Д» (гель) («Пульмомед», Россия) вводили внут-рибрюшинно в дозе 100 мг/кг ежедневно в течение 10 дней (суммарная доза 1 г/кг). Животным 1-й группы вводили экстракт мицелия вешенки через 2 ч после введения циклофосфана. В контрольной группе животные не получали ни одного препарата.

В ходе эксперимента измеряли массу тела (ежедневно), размер опухоли (перед введением циклофосфана и на 14-е и 21-е сутки после введения циклофосфана) и количество лейкоцитов в периферической крови (перед введением циклофосфана, на 3-и и 7-е сутки после введения циклофосфана), а также регистрировали флюоресцентное изображение опухолей (2-3 раза в неделю).

Количество лейкоцитов измерялось по стандартной методике [2].

Регистрацию флюоресцентных изображений проводили при облучении светом с длиной волны 470 нм в световом боксе, освещаемом ламповым источником света через 2 световода (Lightools Research, Encinitas, USA). Флюоресценцию регистрировали через фильтр GG475 (Chroma Technology, Brattleboro, USA) цветной CCD-камерой Hamamatsu C5810 (Hamamatsu Photonics, Bridgewater, USA). Изображения обрабатывались и анализировались с использованием программного обеспечения IMAGE PRO PLUS 3.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, USA), при этом автоматически вычислялась также площадь флюоресцирующей опухоли. Для оценки результатов рассчитывали показатель торможения роста опухоли (ТРО) и параметр Sn/S0, также характеризующий рост изучаемых опухолей (Sn — среднее значение площади опухоли в данной группе на и-ный день после начала введения препаратов, S0 — среднее значение площади опухоли в данной группе до начала введения препаратов).

Торможение роста опухоли рассчитывали по формуле:

ТРО(%) = V‘~v--«ioo,

где У0 — среднее значение объема опухоли в опытных группах,

Ук — среднее значение объема опухоли в контрольной группе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Использование моделей опухолей, экспрессирующих цветные флюоресцирующие белки, является перспективным направлением экспериментальной онкологии. С помощью данного метода возможно прижизненное наблюдение за развитием опухоли и ее ответом на введение противоопухолевых препаратов.

Регистрация флюоресцентных изображений меланомы В16-Р0-СРР позволила проанализировать динамику роста опухолей в контроле и после проведения терапии циклофосфаном и экстрактом мицелия вешенки, а также оценить эффективность лечения. Характерные изображения для каждой из групп приведены на рис. 1, а усредненные по каждой группе данные о площади опухолей, полученные при обработке этих флюоресцентных изображений, — на рис. 2.

Перед введением препаратов j 14 день 21 день

а

б ■ ■ ■

в ■ ■ D

г и ■ и

д ■

Рис. 1. Флюоресцентное изображение мышей с опухолями В16-РО-ОРР в разные дни эксперимента: а — контроль; б—циклофосфан (300 мг/кг) + экстракт мицелия вешенки (100 мг/кг) в течение 10 дней; в — циклофосфан; г — экстракт мицелия вешенки; д — 2-й день после перевивки опухоли (за 3 сут до введения препаратов)

У мышей контрольной группы наблюдался постоянный рост меланомы В16-РО-ОРР. Помимо увеличения площади опухоли (на рисунке зона ярко-зеленого свечения) можно видеть развитие некроза, который проявляется в виде небольшого участка на 14-й день,

(8п/80)*100%

1000-

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Время после начала введения препаратов, дни

Рис. 2. Площадь меланомы В16-Р0-СРР в разные сроки после начала комбинированной терапии цикло-фосфаном и экстрактом мицелия вешенки. Различия между группами 1 и 4, 2 и 4 статистически достоверны. Различия между группами 3 и 4 статистически достоверны для точек, соответствующих 18-му и 21-му дню эксперимента:

1 — циклофосфан (300 мг/кг) + экстракт мицел-лия вешенки (100 мг/кг) в течение 10 дней; 2 — циклофосфан; 3 — экстракт мицелия вешенки; 4 — контроль

а на 21-й день занимает всю центральную зону опухоли (см. рис. 1, а). Средняя площадь опухолей у мышей этой группы через 3 нед эксперимента увеличивалась в 11 раз по сравнению с исходной (см. рис. 2).

При лечении мышей с меланомой В16-Р0-СРР комбинацией циклофосфана и экстракта мицелия вешенки был выявлен высокий терапевтический эффект (ТРО = 94 %) на 4-й день после окончания лечения (табл. 1). Эффект сохранялся до 21-го дня эксперимента и не отличался от противоопухолевого действия одного циклофосфана (ТРО = 97 %).

В группе животных, получавших только экстракт мицелия вешенки, наблюдался постоянный рост опухолей (см. рис. 1, г), однако с меньшей скоростью, чем в контрольной группе. Максимальный терапевтический эффект экстракта мицелия вешенки определялся через 11 дней после окончания лечения (ТРО = 61 %, см. табл. 1). В эти же сроки средняя площадь опухоли превышала исходную в 6,9 раз (см. рис. 2), а на флюоресцентном изображении определялась зона некроза.

Используя общепринятый в экспериментальной онкологии пальпаторный метод для оценки размеров опухолей, можно зарегистрировать уже достаточно развившиеся подкожные опухолевые узлы, а при использовании модельных опухолей, экспрессирующих РР, — опухоли очень малых размеров. В нашем исследовании мы определяли меланому В16-РО-ОРР флюоресцентным способом уже через 2 сут после перевивки опухолевых клеток (рис. 1, д). На этом сроке опухолевые узлы пальпированием не определялись.

В табл. 2 и на рис. 3 представлены данные, показывающие изменение количества лейкоцитов в периферической крови мышей с меланомой В16-Р0-СРР на

3-й и 7-й день после начала терапии циклофосфаном и экстрактом мицелия вешенки.

Таблица 2

Количество лейкоцитов в периферической крови мышей с меланомой В16-Р0-СРР на фоне лечения циклофосфаном и экстрактом мицелия вешенки

\ Препарат Количество лейкоцитов, %"

День огтытк Циклофосфан + экстракт мицелия вешенки*** Циклофосфан Экстракт мицелия вешенки Контроль

0-й 100,0 100,0 100,0 100,0

3-й 50,8115,7" 27,4110,2" 107,0120,7 116,113,2

7-й 102,9±35,8 108,0116,3 91,6114,9 89,7114,7

Таблица 1

Терапевтическая эффективность циклофосфана и экстракта мицелия вешенки на мышиной меланоме В16-Р0-СРР

Препарат ТРО,%

День после начала введения препаратов

14-й 21-й

Циклофосфан + экстракт мицелия вешенки 94,3* 96,5*

Циклофосфан, 300 мг/кг, 1 раз 92,з" 97,3"

Экстракт мицелия вешенки, 100 мг/кг, 10 раз 19,7 60,6*

* /КО,05 по сравнению с контролем.

При анализе флюоресцентных изображений было показано, что площадь опухолей после комбинированной терапии и терапии циклофосфаном уменьшалась по сравнению с исходным размером и на 14-й день опыта составляла 0,87 и 0,76 от исходной величины соответственно.

* Количество лейкоцитов определялось в процентах от количества лейкоцитов в крови мышей до начала лечения.

** р<0,05 по сравнению с исходным количеством лейкоцитов; различия между значениями, соответствующими 3-му дню после начала введения препаратов, между группами 1и4,2и4,1и2 статистически достоверны.

*** Циклофосфан — 300 мг/кг 1 раз; экстракт мицелия вешенки — по 100 мг/кг 10 раз.

У мышей, получавших циклофосфан и экстракт мицелия вешенки, количество лейкоцитов на 3-й день после введения циклофосфана и на фоне введения экстракта мицелия вешенки уменьшилось в 1,97 раз и составило 51 % от исходного значения. В то же время у мышей, получавших только циклофосфан, количество лейкоцитов в периферической крови значительно снизилось (в 3,7 раз) и составило на 3-е сутки 27 % от количества лейкоцитов в крови до начала лечения. На 7-й день количество лейкоцитов у мышей этих групп нормализовалось.

Рис. 3. Показатели количества лейкоцитов в периферической крови мышей с меланомой В16-Р0-СРР после введения циклофосфана и экстракта мицелия вешенки. Для точек, соответствующих 3-му дню после начала введения препаратов, различия между группами 1и4, 2и4, 1и2 статистически достоверны:

1 — циклофосфан (300 мг/кг) + экстракт мицелия вешенки (100 мг/кг в течение 10 дней); 2 — циклофосфан; 3 — экстракт мицелия вешенки; 4 — контроль

При лечении экстрактом мицелия вешенки количество лейкоцитов в периферической крови мышей не изменялось на 3-й и 7-й день терапии и не отличалось от такового у контрольных мышей.

Эти результаты согласуются с выводами авторов [5], показавших, что применение экстракта мицелия вешенки снижает выраженность и продолжительность лейкопении, вызванной циклофосфаном.

Полученные результаты, иллюстрирующие изменение массы животных с меланомой Шб-БО после терапии циклофосфаном и экстрактом мицелия вешенки, представлены на рис. 4.

В контрольной группе отмечалось увеличение массы тела животных с меланомой В1 б-БО-ОРР с 11 -го дня эксперимента. У животных, получавших экстракт мицелия вешенки, наблюдалась тенденция к увеличению массы тела с 14-го дня эксперимента, однако со скоростью меньшей, чем в контрольной группе. У животных, получавших циклофосфан либо комбинацию циклофосфана и экстракта мицелия вешенки, масса тела животных снижалась к 5-му дню эксперимента, затем восстанавливалась. В группе, получавшей циклофосфан, масса тела животных начала быстро расти на 4-й неделе опыта.

Полученные результаты сходны с результатами авторов [11], которые показали, что при внутрибрюшин-ном введении мышам с перевитой саркомой Н180 димерного лектина, выделенного из плодового тела вешенки, в дозе 1,5 мг/кг в течение 20 дней наблюдалось торможение роста опухоли, а также замедление роста массы тела, вызванного развитием опухоли.

(Wn/W0)*100%

Время после начала введения препаратов, дни

Рис. 4. Изменение массы тела мышей с меланомой В16-Р0-СРР после лечения циклофосфаном и экстрактом мицелия вешенки. Различия между группами 1 и 4, 2 и 4, 1 и 3 статистически достоверны. Различия между группами 1 и 2 статистически достоверны на 18-24-й день эксперимента. Различия между группами 3 и 4 достоверны на 21-24-й день эксперимента (р<0,05):

Ж0 и ¡¥п — средняя масса тела животного в группе соответственно до начала введения препаратов и на и-ный день после начала введения препаратов; 1 — циклофосфан (300 мг/кг) и экстракт мицелия вешенки (100 мг/кг) в течение 10 дней; 2 — циклофосфан; 3 — экстракт мицелия вешенки; 4 — контроль

Аналогичные результаты получили исследователи [1] при изучении противоопухолевого действия экстракта мицелия гриба Ganoderma lucidum на лимфому EL6, перевитую мышам B6D2F1. Масса тела мышей в группе, получавшей экстракт, была достоверно меньше, чем в контрольной группе. Авторы также указывают на достоверное увеличение продолжительности жизни мышей, получавших экстракт мицелия Ganoderma lucidum, по сравнению с мышами из контрольной группы.

Противоопухолевые свойства экстракта Pleurotus ostreatus и его отдельных компонентов обсуждались в ряде работ [9, 13]. Было показано, что противоопухолевое действие оказывают содержащиеся в экстракте полисахариды, в частности, вследствие их иммуномодулирующего действия. Некоторые из этих полисахаридов в настоящее время проходят клинические испытания как препараты для адъювантной терапии некоторых форм рака в сочетании с химио- и радиотерапией [9].

Сходным действием обладает также димерный лектин, полученный из плодового тела вешенки. Известно, что лектины, выделенные из различных медицинских грибов, демонстрируют антипролифера-тивное действие in vitro и ингибируют рост опухоли in vivo, в частности вызывая апоптоз опухолевых клеток [13].

ВЫВОДЫ

На модели флюоресцирующей меланомы B16-F0-GFP продемонстрирована возможность прижизненного наблюдения за развитием опухоли и ее ответом на противоопухолевую терапию.

С помощью флюоресцентных изображений через

2 сут после перевивки клеток меланомы B16-F0-GFP были визуализированы опухоли, которые'не определялись пальпаторно.

Отмечен высокий терапевтический эффект комбинации циклофосфана и экстракта мицелия вешенки на

4-й день после окончания лечения (ТРО = 94 %). Эффект сохраняется 7 дней и не превышает противоопухолевого эффекта циклофосфана.

Экстракт мицелия вешенки в дозе 100 мг/кг при внутрибрюшинном введении в течение 10 дней тормозит рост меланомы B16-F0-GFP на 61 %.

Показано, что при терапии циклофосфаном и экстрактом мицелия вешенки количество лейкоцитов в периферической крови мышей с меланомой B16-F0 снижается в 1,97 раза на 3-и сутки после начала введения препаратов, тогда как после терапии только циклофосфаном — в 3,7 раза.

Работа частично финансировалась по гранту INTAS 0554.

Авторы благодарят за финансовую поддержку программу РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Ир. Г. Мгерович также благодарит за поддержку программу Президиума РАН «Поддержка молодых ученых».

ЛИТЕРАТУРА

1. Бухман В. М., Исакова Е. Б., Антимонова А. В. и др. Изучение противоопухолевых свойств мицелия лекарственного гриба Ganoderma lucidum в опытах in vivo // Успехи медицинской микологии. — 2003. — Т.

1. —С. 245-247.

2. Кост Е. А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. — М.: Медицина, 1975.

3. Bouvet M., WangJ., Nardin R. S. R. et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in pancreatic cancer orthotopic model // Cancer Res. — 2002. — Vol. 62. — P. 1534-1540.

4. Chishima T„ Miyagi Y., WangX. et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression // Cancer Res. — 1997. — Vol. 57. — P. 2042-2047.

5. Gerasimenya V. P., Efremenkova O. E., Kamzolkina O. L. et al. Antimicrobial and antitoxical action of edible and medicinal mushroom Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. Extracts. // Int. J. Med. Mushrooms. — 2002. — Vol. 4. —P. 127-132.

6. Hoffman R.-M. GFP Imaging of tumor cells in mice // Lab. Animals. — 2002. — Vol. 31. — P. 34-41.

7. Kamiyama M., Ichikawa Y, Ishikawa T. et al. VEGF receptor antisense therapy inhibits angiogenesis and peritoneal dissemination of human gastric in nude mice // Cancer Gene Therapy. — 2002. — Vol. 9. — P. 197-201.

8. Retroviral gene transfer and expression user manual. — CLONTECH Laboratories, Inc. Palo Alto, USA, 1999.

9. Smith J. E., Rowan N. J., Sullivan R. Medicinal mushrooms: a rapidly developing area of biotechnology for cancer therapy and other bioactivities // Biotechnology Letters. — 2002. — Vol. 22. — P. 1839-1845.

10. Sun F.-X., Tohgp A., Bouvet M. et al. Efficiacy of Camptothcin analog DX-8951f (Exatecan Mesylate) on human pancreatic cancer in an orthotopic metastatic model // Cancer Res. — 2003. — Vol. 63. —P. 80-85.

11. Wang H., Gao J., Ng T. B. A new lectin with highly potent antihepatoma and antisarcoma activities from the oyster mushroom Pleurotus Ostreatu // Biochem. Biophys. Res. Com. — 2000. — Vol. 275. — P. 810-816.

12. Yang M., Jiang P., Baranov E. et al. Genetically fluorescent melanoma bone and organ metastasis Models // Clin. Cancer Res. — 1999. — Vol. 5. — P. 3549-3559.

13. Zhao C., Sun H., Tong X. et al. An antitumour lectin from the edible mushroom Agrocybe aegerita // Biochem. J. — 2003 — Vol. 374. — P. 321-327.