CC BY
299
DOI: 10.24411/0235-2990-2019-10025
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Изучение эффективности Ларифана® при экспериментальной форме тяжёлого острого респираторного синдрома
С. Я. ЛОГИНОВА', В. Н. ЩУКИНА', *С. В. БОРИСЕВИЧ', Р. А. ХАМИТОВ2, В. А. МАКСИМОВ'
' 48 Центральный НИИ МО РФ, Сергиев Посад 2 Международный биотехнологический центр «Генериум», Москва
Studying the Effectiveness of Lariphan® in the Experimental Form Severe Acute Respiratory Syndrome
S. YA. LOGINOVA', V. N. SHCHUKINA', *S. V. BORISEVICH', R. A. HAMITOV2, V. A. MAKSIMOV'
' Federative State Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of Russia, Sergiev Posad 2 International Biotechnology Center «Generium», Moscow
Проведены исследования по изучению эффективности высокомолекулярного индуктора интерферона Ларифана® в отношении экспериментальной формы тяжёлого острого респираторного синдрома у сирийских хомяков. Показано, что Лари-фан® эффективен при применении его по профилактической схеме и схеме экстренной профилактики. Коэффициент лечебного действия по вирусологическим, гематологическим и биохимическим показателям составил 57,5 и 65,0%, соответственно (р<0,05 и р<0,01).
Ключевые слова: Ларифантяжёлый острый респираторный синдром, профилактика, коэффициент лечебного дейст-
Studies have been carried out to study the effectiveness of the high-molecular inducer of interferon Larifan® in relation to the experimental form of severe acute respiratory syndrome in Syrian hamsters. It is shown that Lariphan® is effective when applied in a preventive scheme, and the scheme of emergency prevention. The coefficient of therapeutic action for virological, hematological and biochemical parameters was 57.5 and 65.0%, respectively (р<0.05 and р<0.01).
Keywords: Lariphan®, severe acute respiratory syndrome, prevention, coefficient of therapeutic action.
Введение
В современном мире постоянно меняется спектр вирусной патологии: появляются новые и выходят из-под контроля хорошо и давно изученные заболевания. Заболевание тяжёлого острого респираторного синдрома (ТОРС) впервые возникло в ноябре 2002 г. в Южном Китае [1—6]. В результате проведённых исследований обнаружен очень узкий круг эффективных лекарственных препаратов в отношении ТОРС, при оценке их эффективности in vitro [7—14]. В последние годы выявили новый ка-ронавирус — возбудитель заболевания ближневосточного респираторного синдрома (MERS) [15].
Цель работы — оценка противовирусной эффективности Ларифана® в отношении возбудителя тяжёлого острого респираторного синдрома.
Материал и методы
Вирусы. В работе использовали вирус тяжёлого острого респираторного синдрома, штамм СоД, выделенный специа-
© Коллектив авторов, 2019
*Адрес для корреспонденции: 141306, г. Сергиев Посад-6. 48 ЦНИИ
листами ВЦ НИИМ из носоглоточного смыва больного ТОРС из Благовещенска [16]. Хранился при температуре минус 70±10,0°С в лиофилизированном виде.
Культура клеток. Использована перевиваемая культура клеток почек зелёных мартышек — Vero E6. В качестве среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 2% сыворотки крупного рогатого скота, соответственно.
Исследуемый препарат. Ларифан® (инъекционный) — дс РНК фага f2 E.coli производства Института микробиологии им. Кирхенштейна, Латвия. Перед применением препарат растворяли в физиологическом растворе. Индуктор интерферона вводили внутримышечно по схемам профилактики и экстренной профилактики.
Лабораторные животные. Использованы сирийские хомяки массой 40—60 г. Животных заражали перорально в дозе 5,0 lgÁOE. сразу после инфицирования животным всех групп вводили линкомицин в дозе 103 ед. внутримышечно [12]. Наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 21 сут., контролировали клинические признаки заболевания, гибель животных. На 2-, 4-, 6- и 10-е сутки у инфицированных животных тотально отбирали кровь для проведения гематологических и биохимических исследований.
Токсичность исследуемых препаратов оценивали на не-инфицированных сирийских хомяках.
Оценка противовирусной эффективности Ларифана® осуществлена в соответствии с требованиями [17, 18].
Основными критериями оценки эффективности являлись показатели снижения уровня накопления вируса в лёгких (Alg) и уровня лейкоцитоза, нормализация биохимических
показателей крови (АлАТ, АсАТ, КФК, ЛДГ, мочевины и кре-атинина) и лейкограммы [19].
Результаты и обсуждение
Изучение чувствительности лабораторных животных к вирусу тяжёлого респираторного синдрома при различных способах заражения показало, что инфекция у них не вызывает летального исхода. В связи с этим оценку эффективности препаратов проводили по комплексу клини-ко-вирусологических показателей.
Результаты исследования показывают, что высокомолекулярный индуктор интерферона (ИИФ) Ларифан® эффективно подавляет репродукцию вируса в лёгких на пике инфекции (4-е сутки после инфицирования сирийских хомяков) при применении как по профилактической схеме, так и экстренной профилактики. Применение ИИФ по профилактической схеме и схеме экстренной профилактики обеспечило снижение уровня накопления вируса в лёгких на 2,3 и 2,1 ^ на 4-е сутки и на 3,3 ^ — на 10-е сутки после инфицирования, соответственно (табл. 1). Коэффициент ингибирования вируса ТОРС при введении Ларифана® составил 99,4%.
Патологоанатомическое обследование инфицированных и леченных сирийских хомяков показало, что на 2-е сутки после инфицирования все внутренние органы остаются без видимых изменений. Ларифан® снижал тяжесть поражения лёгких возбудителем ТОРС (при визуальной оценке). Обширность кровоизлияний и отёчность ткани лёгкого на 4- и 6-е сутки была выражена в меньшей степени (50%), чем у животных, инфицированных вирусом ТОРС. На 10-е сутки после инфицирования у животных, которым вводили внутримышечно Ларифан®, отёки в лёгких отсутствовали, точечные кровоизлияния отмечали в единичных случаях в области лёгких, расположенной ближе к входам в бронхи.
Чаще всего спутниками инфекционных болезней и воспалительных процессов являются истинные лейкоцитозы. Изучение влияния Лари-фана® на динамику изменения суммарного пула лейкоцитов и лейкоцитарной формулы показало, что применение препарата по изученным схемам сопровождается в начальный период наблюдения
выраженным лейкоцитозом с последующей нормализацией к 6—10-м суткам (5,9—6,2)х109/л). Для интактных животных этот показатель составил (6,0—6,5)х109/л, инфицированных (не принимавших препарат) — 12,8х109/л.
Отмечено появление на пике инфекции молодых форм нейтрофилов. Индекс сдвига (ИС) для интактных сирийских хомяков составил 0,11, для инфицированных (на пике инфекции) — 0,24. Таким образом, происходит изменение лейкограммы влево, что характерно для многих тяжёлых инфекций, когда увеличение количества нейтрофилов происходит в основном за счёт увеличения количества палочкоядерных и юных форм. Кроме того, отмечали с 4-х суток снижение относительного количества лимфоцитов.
Анализ лейкоцитарной формулы показал, что профилактическое применение Ларифана® сопровождалось угнетением гранулопоэза и увеличением количества лимфоцитов (ИС=0,36) с нарастанием лимфоцитоза к 10-м суткам наблюдения. На более поздних стадиях заболевания отмечены лимфоцитоз, увеличение количества моноцитов, что свидетельствует о наступлении фазы выздоровления и благоприятном исходе заболевания.
При экстренной профилактике ТОРС у сирийских хомяков Ларифаном® отмечена активизация гранулоцитарной фракции лейкоцитов с увеличением как палочкоядерных, так и сегмен-тоядерных нейтрофилов, при этом значение ИС составляло 0,82—1,43 (на 4-е сутки после инфицирования). На 6— 10-е сутки этот показатель несколько снизился, но был достоверно выше значения у группы интактных животных.
Исследования по изучению влияния Ларифа-на® на биохимические показатели крови инфицированных сирийских хомяков показали, что наибольшую активность в процессе нормализации показателей КФК и ЛДГ выявил препарат, вводимый по профилактической схеме (см. табл. 1).
Высокий уровень КФК, по-видимому, связан с повреждением ткани лёгких. Ларифан® по профилактической схеме значительно снижал воспалительные и некротические повреждения в лёгких и, соответственно, снижался уровень КФК. Начиная с 6-х суток после инфицирования, был отмечен процесс нормализации показателей ЛДГ
Таблица 1. Влияние Ларифана® на динамику изменения активности креaтинфосфокиназы и лактатдегидро-геназы в сыворотке крови сирийских хомяков, перорально инфицированных вирусом ТОРС, штамм СоД
Схема введения препарата Показатель Активность, сутки после инфицирования _ 2-е 4-е 6-е 10-е
-24, -1 ч_Креатинфосфокиназа,_0,67+0,02 0,79+0,02 0,68+0,06 0,53+0,05
+2,+72, + 144,+216 ч_Х±е„ мккат/л_0,92+0,03 0,83+0,02 0,70+0,04 0,49+0,01
Контроль (инфицированные)_1,27+0,04 2,12+0,03 1,16+0,05 1,22+0,02
Контроль (интактные)_0,44+0,03 0,39+0,02 0,48+0,01 0,50+0,04
-24, -1 ч_Лактатдегидрогеназа,_474+12_765+5_575+5_501+9
+2,+72, + 144,+216 ч_Х±о„ МЕ/л_521 + 11_772+6_672+8_665+15
Контроль (инфицированные) 1915+56 1447+54 1805+55 1803+15
Контроль (интактные) 405+32 402+15 409+13 399+18
Таблица 2. Влияние Ларифана® на динамику изменения активности аланинаминотрансферазы и аспартатами-нотрансферазы в сыворотке крови сирийских хомяков, перорально инфицированных вирусом ТОРС, штамм СоД
Схема введения препарата Показатель Активность, сутки после инфицирования
2-е 4-е 6-е 10-е
-24,-1ч Аланинаминотрансфераза, 0,89+0,02 1,02+0,02 0,86+0,03 0,88+0,10
+2,+72, + 144,+216 ч Х±ох, мкМ/(ч*л) 0,87+0,03 1,27+0,03 1,22+0,07 0,98+0,04
Контроль (инфицированные) 1,44+0,18 2,53+0,05 2,01+0,03 2,32+0,04
Контроль (интактные) 0,65+0,08 0,66+0,08 0,69+0,05 0,70+0,02
-24, -1 ч Аспартатаминотрансфераза, 0,75+0,05 0,70+0,04 0,93+0,06 1,00+0,08
+2,+72, + 144,+216 ч Х±ах, мкМ/(ч*л) 0,69+0,07 0,84+0,04 1,34+0,06 1,08+0,02
Контроль (инфицированные) 2,14+0,09 2,62+0,04 1,85+0,06 2,23+0,07
Контроль (интактные) 0,71+0,09 0,73+0,09 0,71+0,06 0,74+0,02
Таблица 3. Влияние Ларифана® на динамику изменения креатинина и мочевины в сыворотке крови сирий-
ских хомяков, перорально инфицированных вирусом ТОРС, штамм СоД
Схема введения препарата Показатель Активность, сутки после инфицирования
2-е 4-е 6-е 10-е
-24, -1 ч Креатинин, 151,0+1,00 152,2+1,20 138,6+0,60 177,6+0,40
+2,+72,+144,+216 ч Х±сх, мМ/л 165,2+1,20 146,1+0,90 126,3+0,60 135,5+0,60
Контроль (инфицированные) 210,0+1,00 255,7+1,00 247,9+0,30 213,5+0,5
Контроль (интактные) 181,2+0,80 184,5+0,40 180,2+0,20 180,5+0,5
-24, -1 ч Мочевина, 3,8+0,2 6,8+0,2 4,8+0,4 7,1+0,3
+2,+72,+144,+216 ч Х±сх, мМ/л 5,8+0,1 7,8+0,2 6,9+0,3 7,5+0,5
Контроль (инфицированные) 8,5+0,2 9,1+0,6 10,8+0,3 11,8+0,4
Контроль (интактные) 5,9+0,1 5,4+0,3 5,6+0,1 5,7+0,1
и КФК у всех животныгх, получавших препарат. У животных, которым вводили Ларифан®, уровень КФК оставался достоверно ниже, чем у инфицированных животных, не получавших препараты на протяжении всего срока наблюдения.
Аминоацплтрансферазы широко представлены в тканях сердца, печени, почках, меньше — в селезенке, лёгких, поджелудочной железе. В норме сыворотка крови содержит только цитозоль-ные ферменты. При различных заболеваниях происходит повышение ферментативной активности. Таким образом, аспартат- и аланинамино-трансферазы являются индикаторными ферментами, характеризующими появление синдрома цитолиза гепатоцитов. Как указывалось выше, для больных ТОРС характерно повышение уровня аминотрансфераз (АсАТ, АлАТ) в ранние сроки заболевания. Важным диагностическим показателем является соотношение АсАТ и АлАТ (коэффициент де Ритиса).
Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что у сирийских хомяков, перорально инфицированныгх вирусом ТОРС, на протяжении всего срока наблюдения после заражения наблюдается повышение активности как АсАТ, так и АлАТ, в 2—4 раза по сравнению с неинфициро-ванными животными. Коэффициент де Ритиса для интактных сирийских хомяков составил в среднем 1,07.
Применение Ларифана® по профилактической схеме снижает активность аминотрансфераз более чем в 1,4 раза по сравнению с группой животныгх, не получавших препарат. Уровень АлАТ после повышения на 2-е сутки уже на 4—6 сутки не отличался от уровня у интактных животных.
На пике инфекции (4-е сутки) коэффициент де Ритиса при применении Ларифана® составлял 0,66—0,69.
Проведены так же исследования по изучению динамики изменения уровня креатинина и мочевины в сыворотке крови сирийских хомяков, пе-рорально инфицированных вирусом ТОРС, под воздействием Ларифана® (табл. 3).
Уровень креатинина в сыворотке крови сирийских хомяков, перорально инфицированных вирусом ТОРС, увеличивался незначительно по сравнению с интактными животными. Кратность увеличения этого показателя на пике инфекции составила 1,4 раза. При применении Ларифана® по всем изученным схемам и дозам не отмечено сколько-нибудь значительного увеличения концентрации креатинина в сышоротке крови сирийских хомяков по сравнению с интактными животными.
Введение по профилактической схеме Ларифана® также способствовало нормализации уровня мочевины в крови экспериментальных животных на 6—10-е сутки после инфицирования, в то же время по схеме экстренной профилактики такой эффект не наблюдался — уровень мочевины оставался достоверно выше по сравнению с ин-тактными животными.
Для анализа влияния исследуемого препарата на тяжесть течения заболевания ТОРС у экспериментальных животных провели рейтинговую оценку степени выраженности следующих показателей: уровень накопления вируса в лёгких; степень патологоанатомических изменений внутренних органов; количество лейкоцитов; изменения в лейкоцитарной формуле крови; изменение фер-
Таблица 4. Влияние Ларифана® на тяжесть течения инфекционного процесса у сирийских хомяков, перо-рально инфицированных вирусом ТОРС, штамм СоД
Препарат Схема применения Анализ тяжести течения инфекционного процесса
препарата на пике инфекции в течении всего срока наблюдения
сумма индекс коэффициент значение уровень значимости
баллов тяжести лечебного критерия лeчeбнoñ эффективности
заболевания дeñcтвия, % знаков препарата, p
Ларифан, -24 ч, - 1ч 17 0,425 57,5 9I10 0,05
5 мг!кг +2,+72,+144,+216 ч 13 0,325 67,5 10I10 0,01
Контроль — 40 1,000 — 0I10 —
(инфицированные)
ментативной активности КФК, ЛДГ, АсАТ, АлАТ; изменение концентрации мочевины и креатини-на. Максимальная выраженность каждого из указанных признаков на пике инфекции (4—6-е сутки) оценивалась в 4 балла.
По указанным признакам рассчитывали значения критерия знаков и соответствующие уровни значимости влияния исследуемых препаратов на течение инфекционного процесса в течение всего срока наблюдения (табл. 4).
Высокомолекулярный ИИФ Ларифан® эффективно снижает тяжесть заболевания у сирийских хомяков, перорально инфицированных ви-
ЛИТЕРАТУРА
1. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Максимов В.А. и др. Выделение и идентификация возбудителя тяжёлого острого респираторного заболевания от больного атипичной пневмонией. ЖМЭИ. — 2003. — № 5. — С. 109—112. / Onishhenko G.G., VasilevN.T., Maksimov V.A. i dr. Vy'delenie i identifikaciya vozbuditelya tyazhelogo ostrogo respira-tornogo zabolevaniya ot bol'nogo atipichnoj pnevmoniej. ZhME'I 2003; 5:109—112. [in Russian]
2. Синопальников А.И., Воробьев А.В., Белоцерковская Ю.Г., Андреева ИВ. Тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС, SARS). Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. —
2003. — № 5 (3). — С. 225—242. / Sinopalnikov A.I, Vorobev A.V., Belocerkovskaya Yu.G, Andreeva I.V. Tyazhely'j ostry'j respiratorny'j sindrom (TORS, SARS). Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrob-naya ximioterapiya 2003; 5 (3): 225—242. [in Russian]
3. Ksiazek T.G., Erdman D, Goldsmith C.S. et al. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. New Engl J Med 2003; 348 (20): 1947—1958.
4. Lee N, Hui D, Wu A., Chan P. et al. A major otbreak of severe acute respiratory syndrome on Hong Kong. New Engl Med 2003,348 (20): 1986—1994.
5. Peiris J.S., Lai S.T., Poon L.L. et al. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet 2003; 361: 1319—1325.
6. World Health Organization: http:// www.who.int/csr/sars/en/ index.html.
7. Hensley L, Fritz E, Jahrling P. Karp C.,Huggins J.W., Geisbert T.W. Interferon-/? 1a and SARS coronavirus replication. Emerg Infect Dis
2004, 10 (2): 317—319. doi: 10.3201/eid1002.030482.
8. Koren G, King S., Knowles S, Phillips E. Ribavirin in treatment of SARS: A new Trick for an old drug? Can Med Ass J 2003; 168 (10): 1231.
9. Liu Z.Y., Li T.S., Wang Z., et al. Clinical features and therapy of 106 cases of severe acute respiratory syndrome Zhonghua Nei Ke Za Zhi 2003; 42: 373—377.
10. Pak C., Lam C., Li A. et al. Inflammatory cytokine profile in children with severe acute respiratory syndrome. Pediatrics 2004; 13 (1): 7—14.
11. Tan E.L.C, Ooi E.E., Tan H.C. et al. Inhibition of SARS Coronovirus infection in vitro with clinical approved antiviral drugs. Emerg Infect Dis [serial online] 2004; Apr [cited 2004 February 24]. Available from: URL: http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol10no4/03-0458.htm
12. Zhao Z, Zhang F, Xu M. et al. Description and clinical treatment of an early outbreak of severe acute respiratory syndrome (SARS) in Guangzhou, PR Chine J Med Microbiol 2003; 52: 715—720.
русом ТОРС в дозе 5,0 ^ БОЕ, при введении его по профилактической схеме и схеме экстренной профилактики. Коэффициент лечебного действия составил 57,5 и 67,5%, соответственно.
При этом был отмечен статистически высокий уровень достоверных отличий тяжести течения заболевания у леченных и контрольных животных (р<0,05 и р<0,01).
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
13. Zhaori G. Antiviral treatment of SARS: Can we draw any conclusions? CMAJ 2003; 169 (11): 1165—1166.
14. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. М.: Мед, 1996. — 239 с. I Ershov F.I. Sistema interferona v nome i pri patologii. M.: Med, 1996; 239.
15. Жyмamов K.X., Kыдырмaнов A.È. Ближневосточный респираторный синдром (mers-middleeastrespiratorysyndrome): новая корона-вирусная инфекция человека и животных. Biotechnology. Theory and Practice|Биoтexнoлoгия. Теория и практика. — 2015. — № 3. — С. 4—10. I Zhumatov K.X., Ky'dy'rmanov A.I. Blizhnevostochny'j respiratorny'j sindrom (mers-middleeastrespiratorysyndrome): novaya koronavirusnaya infekciya cheloveka i zhivotny'x. Biotechnology. Theory and PracticeIBiotexnologiya. Teoriya i praktika 2015; 3: 4—10. [in Russian]
16. Cыромяmнuковa C.H., ПшцовM.H., CmеnaновH.H., Боршевт C.B., Меркулов B.A., Maрков B.H., Oнuщенко F.F., Baсuльев Н.Т., Ma^u-мов B.A. Штамм СоД вируса тяжёлого острого респираторного синдрома рода Coronavirus, предназначенный для разработки средств и методов биологической защиты. Патент РФ № 2263144, 27.10.2005. I Syromyatnikova S.I., Pisczov M.N., Stepanov N.N., Borisevich S.V., Merkulov V.A., Markov V.I., Onishhenko G.G., Vasil'ev N.T., Maksimov V.A. Shtamm SoD virusa tyazhelogo ostrogo respira-tornogo sindroma roda Coronavirus, prednaznachenny'j dlya razrabotki sredstv i metodov biologicheskoj zashhity'. Patent RF № 2263144, 27.10.2005. [in Russian]
17. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Минздрав РФ, 2005. I Rukovodstvo po experimental'nomu (doklinicheskomu) izucheniyu novy'x farmakologicheskix veshhestv. M.: Minzdrav RF, 2005. [in Russian]
18. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 2. М.: Минздрав РФ, 2013. I Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskix issledovanij lekarstvenny'x sredstv. Chast' 2. M.: Minzdrav RF, 2013. [in Russian]
19. Логuновa C.ß., Фaлдuнa B.H., Cыромяmнuковa C.H., Боршевт C.B., Xaмumов P.A., Maксuмов B.A. Способ моделирования тяжёлого острого респираторного синдрома у экспериментальных животных. Патент РФ №2280288, 20.07.2006. I Loginova S.Ya, Faldina V.N, Sy'romyatnikova S.I., Borisevich S.V., Xamitov R.A., Maksimov V.A. Sposob modelirovaniya tyazhelogo ostrogo respiratornogo sindroma u e'ksperimental'ny'x zhivotny'x. Patent RF №2280288, 20.07.2006. [in Russian]
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Логинова Светлана Яковлевна — д. б. н., ведущий научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад
Щукина Вероника Николаевна — к. б. н., научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад
Борисевич Сергей Владимирович — д. б. н., профессор, член-корр. РАН РФ, начальник института, Федеральное
государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад Хамитов Равиль Авгатович — д. м. н., профессор, генеральный директор, Общество с ограниченной ответственностью «Международный биотехнологический центр «Генериум», Москва
Максимов Владимир Алексеевич — д. м. н., профессор, ведущий научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад
