CC BY
51
УДК 616.24-002.5-078:57.083.33:615.322
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСТРАКТА СШСША МРОМСА (СНОШУ) ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА
МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА
В.М.Катола, Н.Ю.Леусова
Институт геологии и природопользования Дальневосточного отделения РАН, 675000, г. Благовещенск,
пер. Релочный, 1
РЕЗЮМЕ
Продемонстрировано влияние водного экстракта повилики японской (Cuscuta japottica) на скорость роста Mycobacterium tuberculosis. Для ускорения роста микобактерий сухие стандартные питательные среды ФАСТ-ЗЛ и
Левенштейна-Иенсена смешивали с водным экстрактом Cuscuta japonica. Установлено, что сложный химический состав водного экстракта, приготовленного из сухих семян либо сухих вегетативных стеблей растения-паразита Cuscuta japonica, оказывает выраженное биологическое действие на Мус. tuberculosis. При смешивании стандартных питательных сред ФАСТ-ЗЛ и Левенштейна-Иен-сена с водным экстрактом Cuscuta japonica, микобактерии произрастают гораздо быстрее, сохраняя при этом типичные R-формы колоний. При этом Мус. tuberculosis на первой среде вырастают на 5 сутки (в 2,8 раза быстрее, чем на стандартной питательной среде), на второй среде - на 18 сутки (в 1,5 раза быстрее, чем на стандартной питательной среде). Механизм ускорения роста Мус. tuberculosis требует дальнейшего изучения. Наиболее вероятно, что химические вещества водного экстракта Cuscuta japonica прямо или косвенно воздействуют либо на синтез компонентов клеточной стенки (пептидогликан), либо изменяют ее химический состав. Тем самым увеличивается доступ в клетку трофических ресурсов.
Ключевые слова: микобактерии туберкутеза, стандартные питательные среды, экстракт повилики японской.
SUMMARY
USE OF EXTRACT CUSCUTA JAPONICA (CHOISY) TO STIMULATE THE GROWTH OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
V.M.Katola, N.Yu.Leusova
Institute of Geology and Nature Management of Far Eastern Branch RAS, 1 Relochniy Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation
The influence of the aqueous extract of Japanese Dodder (Cuscuta japonica) on the velocity of Mycobacterium tuberculosis growth has been shown. To accelerate the growth of Мус. tuberculosis, dry culture media of FAST-3L and of Lowenstein Jensen were mixed with the aqueous extract of Cuscuta japonica. It was found out that the complex chemical composition of the aqueous extract made of dry seeds or dry vegetative stems of the plant parasite Cuscuta japonica has a biological
effect on Мус. tuberculosis. At mixing of standard culture media of FAST-3L and of Lowenstein Jensen with the aqueous extract of Cuscuta japonica, Мус. tuberculosis grow much faster preserving typical R-forms colonies. The mycobacterium in the first medium grow at the fifth day (2.8 times faster than in the standard culture medium), and in the second medium they grow at the 18th day (1.5 times faster than in the standard culture medium). The mechanism of Мус. tuberculosis growth acceleration demands a further study. The most probable is the fact that chemical substances of the aqueous extract of Cuscuta japonica directly or indirectly affect either the synthesis of cell wall components (peptidoglycan) or change its chemical composition. This leads to the access enhancement into the cell of trophic resources.
Key words: Mycobacterium tuberculosis, the standard culture media, extract of Cuscuta japonica.
Своевременное обнаружение и предупреждение распространения туберкулеза во многом зависят от качества лабораторной диагностики. Для повышения ее результативности во фтизиатрии начали применять наиболее перспективный метод полимеразной цепной реакции [6, 7]. Он удобен, точен, универсален и позволяет быстро детектировать бактерии, микроскопические грибы и вирусы. Однако данный метод не различает «живого» и «мертвого» возбудителя, не определяет формы его морфологической и генетической изменчивости, к тому же, недоступен для большинства бактериологических лабораторий. По-прежнему для выделения чистых культур клинических штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ), их последующей идентификации и определения лекарственной устойчивости используются стандартные питательные среды на яичной основе -Левенштейна-Иенсена, Финн-2, «Новая» и др. К сожалению, они низко чувствительны, и МБТ, обладающие медленным размножением (одно деление в течение 1824 часов) и длительным инкубационным периодом (от недель до нескольких лет), произрастают на этих средах медленно и не всегда надежно. Более того, в процессе интенсивной химиотерапии происходит повреждение разных метаболических систем и МБТ могут утрачивать способность к нормальному развитию. Выделение МБТ несколько улучшается, если обрабатывать патологический материал детергентами (лаурисульфат натрия, родолан, цетавлон и др.) или одновременно применять несколько отличающихся по составу сред и проводить многократные исследования материала. В настоящее время трудности в бактериологической диагностике туберкулеза могут изменить
автоматизированные системы культивирования МБТ с последующей радиометрической (ВАСТЕС 460), колориметрической (МВ/ВасТ, ВайАЬЕКГ) и люминесцентной детекцией роста, среди которых наиболее эффективной является система ВАСТЕС М01Т 960В ГЗ [1]. Этот автоматизированный комплекс содержит набор флаконов с жидкой питательной средой и флуоресцентным индикатором роста на дне, рассчитан на загрузку 960 образцов и заметно сокращает сроки культивирования. Но стоимость комплекса и флаконов чрезвычайно высока. В связи со сказанным возрастает потребность в усовершенствовании как традиционных питательных сред, так и конструировании новых. При этом желательно использовать дешевые виды сырья с высокой биологической ценностью (содержанием полноценных белков, углеводов, витаминов и прочих биостимуляторов). Таким условиям соответствует именно растительное сырье.
Поэтому было обращено внимание на растущее в Амурской области однолетнее покрытосеменное паразитическое растение - повилику японскую (Си.\си/а ]аротса) из рода СивсШа семейства Повиликовые (Стайасеае Г)ит.) [3]. Она встречается также в Приморье, Хабаровском крае и отнесена к категории карантинных сорняков. Ее проросток, по мере выхода на поверхность из почвы, совершает нутационные движения, находя будущую жертву, спиралеобразно тянется к ней, обвивает длинным, тонким, красноватым или желтоватым стеблем и внедряет в его сосудистые элементы специальные выросты-присоски (гаустории). Повилика паразитирует на луговых, полевых, огородных и садовых культурах, кустарниках, деревьях, задерживает их рост и развитие и нередко вызывает гибель. В отличие от растения-хозяина, в стеблях повилики больше воды, общего и белкового азота, фосфора, сахаров, триацилглицеринов и гликолипидов. Однако меньше стеринов, свободных жирных кислот и других веществ. Используя воду, диоксид углерода и минеральные элементы, повилика синтезируют разнообразные органические вещества, включая гидролитические ферменты, позволяющие ей размягчать ткани хозяина. Химический состав Си8СчШ1|ароп-гса полностью не выяснен, но уже установлено, что в стебле содержатся кумарины (умбеллиферон), флаво-ноиды (кемпферол, 3-гликозид кверцетина), фенолкар-боновые кислоты и их производные (хлорогеновая, п-кумаровая, коричная кислоты), в семенах - сапонины, сахара, смолы и пр. Кроме того, в сухих стеблях депонируются Се, Гс. У. N1 и Юз, меньше Са, Со,
Мп и Ъ\л. а в зрелых семенах больше, чем в стебле, Сё, и Мп [4]. Повилики ядовиты и в официальной медицине не используются. В китайской и корейской народной медицине из них готовят чай, отвар, сок, пилюли и применяют как укрепляющие, тонизирующие, обезболивающие и вяжущие средства, назначают при заболеваниях печени, желудка, легких, простуде, лихорадке, стенокардии, сахарном диабете, нервных и психических нарушениях, головных и зубных болях, алкоголизме и др. [2]. Воздействие же этих растительных средств на биологические свойства микроорганиз-
мов практически не исследовано.
Учитывая использование лекарственных препаратов СиясШа ]аротса (Оннву) при различной патологии и отчасти их химический состав, цель настоящей работы
- показать влияние ее водного экстракта на скорость роста МБТ.
Материалы и методы исследования
Промытые в проточной воде сухие семена и стебли СиясШа ]аротса (Окнву) просушивали в термостате, заливали дистиллированной водой в раздельных стеклянных колбах и вновь помещали в термостат. Полученный таким образом экстракт фильтровали, стерилизовали в автоклаве и вносили в герметически укупоренные градуированные флаконы с сухими питательными средами для выращивания МБТ, а именно, ФАСТ-ЗЛ и Левенштейна-Иенсена. Обе среды приготовлены на яично-солевой основе, но в составе первой среды дополнительно содержатся картофель, молоко обезжиренное, пептон и гексадекан, в составе второй
- Е-аспарагин. В определенных соотношениях экс-
тракт и питательные среды (каждая отдельно) перемешивали, разливали в стерильные пробирки, свертывали, выдерживали в термостате при температуре 37°С и повторно свертывали. Этот процесс подробно описан ранее [5]. Диагностическая
эффективность модифицированных питательных сред апробирована путем посевов на них: а) культуры музейного («классического») вирулентного штамма МБТ Н37Я\'; б) болтушки из почвы, в которую инокулиро-вали культуру Н37Я\'; в) центрифугата мокроты, взятой от больных фиброзно-кавернозным туберкулезом и обработанной 4% раствором едкого натрия и нейтрализованной 2 каплями соляной кислоты. Всего выполнено 98 опытов.
Результаты исследования и их обсуждение
Нужно отметить, что среди цветковых растений род Сихси/а представляет наиболее высокоорганизованные паразитные растения. Полагают даже, что они участвуют в регуляции численности популяции своих хозяев и влияют на формирование и стабильность природных биоценозов. Переход к паразитическому образу жизни существенно сказался на их морфологии: во-первых, у них редуцировались листья и корневая система; во-вторых, появились гаустории, глубоко внедряющиеся в ткань растения-хозяина; в-третьих, изменилась внутренняя структура, что лишило паразита способности синтезировать питательные вещества на свету. То есть, не имеется присущих нормальным растительным клеткам хлоропластов, в которых формируются тилакоиды, содержащие хлорофилл, каротиноиды, ферменты и мелкие рибосомы [8]. Плоды СиясШа]аротса в виде коробочек густо покрывают разветвленный мясистый стебель диаметром до 2 мм и содержат 2-5 мелких (1-3 мм) округлых или яйцевидных семян с двумя плоскими сторонами, толстой стенкой и шершавой поверхностью. Впечатляет способность семян сохранять всхожесть более 40 лет, а упавших в почву - 10 лет. Внешний вид цветов, стеб-
лей и семян СиясШа]аротса показаны на рисунке 1 А, Б. Особое внимание заслуживает проросток. У всех представителей СиясШа он растет за счет апикального полюса, тогда как базальная часть (корешок) отмирает на ранних стадиях развития. При этом в их ультраструктуре (рис. 2 А, Б), наряду с отсутствием фотосин-
тетического аппарата, наблюдается большое количество вакуолей, необходимых растительным клеткам для регуляции водно-солевого обмена и поддержания тургора растущих клеток, а в цитоплазме корешковых клеток - пустот.
А Б
Рис. 1. А - отмеченный стрелками стебель и цветки СшсШа]аротса\ Б - внешний вид семени СиясМа]аротса (сканирующая электронная микроскопия, х24).
А Б
Рис. 2. А - ультратонкие срезы апикального полюса проростка СиясМа]аротеа: 1 - клеточная стенка; 2 -плазматическая мембрана; 3 - цитоплазма; 4 - ядро; 5 - вакуоль; 6 - пустоты цитоплазмы (х7000); Б - колонии культуры Н37Я\'. выросшей на стандартной среде ФАСТ-ЗЛ (средняя пробирка) и на среде, модифицированной экстрактами из сухих семян (№1) или стеблей (№2) СиясМа ]аротса.
Поэтому неудивительно, что экстракт СшсШа ]аротса может иметь сложный специфический комплекс химических веществ и обладать биологической активностью. Как видно из таблиц 1 и 2, при посеве чистой культуры Н37Я\' и инфицированного материала (почва, мокрота) на плотные питательные среды ФАСТ-ЗЛ или Левенштейна-Иенсена, модифицированные таким экстрактом, рост и развитие МБТ проявляется гораздо быстрее, чем на лабораторных средах. Обычно на стандартных питательных средах МБТ вырастают чаще всего через 3-4 недели либо
через 2-3 месяца, нередко даже больше. Их колонии грубые, сухие, шероховатые (R-тип) со сморщенной поверхностью, утолщенным центром и неровными краями. Рост этих форм происходит также и на модифицированных средах (рис. 2 Б). Предполагается, что на таких средах ускоренно могут развиваться и близкородственные виды, идентичные по последовательностям 16S рРНК, а именно М. africanum, М. eovis, М. canettii, М. microti, М. pinnipedii и М. саргае, входящие в комплекс Mycobacterium tuberculosis и вызывающие туберкулез у человека и ряда животных.
Таблица 1
Время роста (в сутках) МБТ на питательной среде ФАСТ-ЗЛ, смешанной с водным экстрактом из сухих
семян или сухих стеблей СтсШа /арапка
А Б Контроль (п=7)
Кп=7) II (п=7) III (п=7) Кп=7) II (п=7) III (п=7)
4 4 4 5 5 6 14
5 4 4 6 5 5 14
4 4 4 6 6 7 15
4 5 6 5 7 7 15
5 5 6 5 6 6 14
5 6 5 5 5 5 14
4 4 4 5 5 5 15
4,4±0,2* 4,5±0,3* 4,7±0,3* 5,3±0,2* 5,5±0,3* 5,8±0,4* 14,3±0,2
Примечание. Здесь и в следующей таблице: А - время роста МБТ на питательной среде, смешанной с водным экстрактом из сухих семян; Б - время роста МБТ на питательной среде, смешанной с водным экстрактом из сухих стеблей; I - время роста коллекционной культуры Н37Яу; II - время роста МБТ при высеве почвенной болтушки, инфицированной культурой Н37Яу; III - время роста МБТ при посеве мокроты от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких; контроль - время роста коллекционного штамма Н37Я\' на стандартной питательной среде; п - объем выборок (количество опытов); * - уровень значимости различий по сравнению с контролем
Таблица 2
Время роста (в сутках) МБТ на питательной среде Левенштейна-Иенсена, смешанной с водным экстрактом из сухих семян или сухих стеблей СтсШа /арапка
А Б Контроль (п=7)
Кп=7) II (п=7) III (п=7) Кп=7) II (п=7) III (п=7)
17 17 20 16 18 21 25
18 20 21 17 19 22 28
16 18 19 18 20 20 29
16 19 20 16 21 19 35
17 17 20 19 20 21 30
16 20 18 17 16 18 24
18 17 17 19 17 19 28
16,8±0,34* 18,3±0,53* 19,3±0,52* 17,0±0,43* 18,7±0,68* 19,5±0,53* 28,43±1,39
Таким образом, проведенными исследованиями установлено, что при добавке водного экстракта из сухих семян или стеблей СиясМа ]аротса рост МБТ на среде ФАСТ-ЗЛ проявляется в среднем на 5-е сутки (в контроле на 14-е сутки) или ускоряется в 2,8 раза, а на среде Левенштейна-Иенсена - в среднем на 18-е сутки (в контроле на 28-е сутки) или ускоряется в 1,5 раза. Это означает, что ускоренный рост МБТ обеспечивается одними и теми же веществами, которые концентрируются как в семенах, так и стеблях растения. Механизм стимуляции ими развития МБТ пока не изучен. Однако известно, что медленное размножение МБТ обусловлено недостаточным поступлением в
клетку питательных веществ из-за низкой проницаемости клеточной стенки, содержащей до 20-40% липидов (воски, нейтральные жиры, фосфолипиды, миколовые кислоты). Поэтому наиболее вероятно, что химические вещества водного экстракта повилики японской прямо или косвенно воздействуют либо на синтез компонентов клеточной стенки (пептидогли-кан), либо изменяют ее химический состав. Тем самым увеличивается доступ в клетку трофических ресурсов.
Выводы
1. Сложный химический состав водного экстракта, приготовленного из сухих семян либо сухих вегетатив-
ных стеблей растения-паразита Cuscuta jciponicci оказывает выраженное биологическое действие на Mycobacterium tuberculosis.
2. При смешении стандартных питательных сред ФАСТ-ЗЛ и Левенштейна-Иенсена с водным экстрактом Cuscuta japonica микобактерии туберкулеза произрастают гораздо быстрее, сохраняя при этом типичные R-формы колоний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Использование автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 в диагностике лекарственной устойчивости к резервным препаратам в г. Самаре / Я.М.Балабанова [и др.] // Туб. и бол. легких. 2009. №10. С.63-70.
2. Леусова Н.Ю., Некрасов Э.В. Использование видов рода повилика (Cuscuta L.) в медицине и биотехнологии // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2004. Вып. 19. С.87-93.
3. Леусова Н.Ю. Особенности экологии растений-паразитов на примере повилики японской (Cuscuta japonica Choisy): автореф. дис. ... канд. биол. наук. Благовещенск, 2006. 23 с.
4. Содержание минеральных элементов у растения-паразита CUSCUTA YAPONICA / Н.Ю.Леусова [и др.] // Пробл. региональной экологии. 2008. №3. С.68-71.
5. Питательная среда, ускоряющая рост микобактерий туберкулеза: пат. 2385926 МПК C12N 1/20 / авторы и заявители В.М.Катола, Н.Ю.Леусова; патентообладатель ИГиП ДВО РАН (RU).-№2007132045/13; заявл. 23.08.2007; опубл. 10.04. 2010, Бюл. №10.
6. Скотникова О.И. Молекулярно-биологические методы во фтизиатрии // Пробл. туб. и бол. легких. 2005. №8. С.5-10.
7. Роль ПЦР-анализа в комплексных бактериологических исследованиях во фтизиатрии / Л.Н.Черноусова
[и др.] //Пробл. туб. и бол. легких. 2001. № 3. С.58-60.
8. Яковлев ПП., Челомбитько В.А. Ботаника. Учебник для вузов. СПб: СпецЛит, СПХФА, 2001. 680 с.
REFERENCES
1. Balabanova Ya.M., Fedorin I.M., Malomanova N.A., Drobnievskiy F., Nikolaevskiy V.V., Sun Kh., Mashkova Yu.A., Simak T.E., Kontsevaya I.S., Ignat'eva O.A., Mironova S.A. Tiiberkulez i bolezni legkikh 2009; 10:63— 70.
2. Leusova N.Yu., Nekrasov E.V. Bfilleten'fiziologii i patologii dyhaniyd 2004; 19:87-93.
3. Leusova N.Yu. Osobennosti ekologii rasteniy-paraz-itov na primere poviliki yaponskoy (Cuscuta japonica Choisy): avtoreferat dissertatsii kandidata biologicheskikh панк [The particularities of plants-parasite ecology at the example of Japanese dodder (Cuscuta japonica Choisy): abstract of thesis...candidate of biological sciences]. Blagoveshchensk; 2006.
4. Leusova N.Yu., Katola V.M., Radomskaya V.I., Radomskiy S.M. Problemy regionaVnoi ekologii 2008; 3:68-71.
5. Katola V.M., Leusova N.L. Patent 2385926 RF. Pi-tatel’naya sreda, uskoryayushchaya rost mikobakteriy tu-berkuleza (Patent 2385926 RF. The medium, accelerating the growth of Mycobacterium tuberculosis)', published 10.04. 2010.
6. Skotnikova O.I. Problemy tuberkuleza i bolezney legkikh 2005; 8:5-10.
7. Chemousova L.N., Larionova E. E., Sevast'yanova E.V., Golyshevskaya V.I. Problemy tuberkuleza i bolezney legkikh 2001; 3:58-60.
8. Yakovlev G.P, Chelombit'ko V.A. Bolanika. Ucheb-nik dlya vuzov [Botany. The textbook for high schools]. St. Petersburg: SpetsLit, SPHFA; 2001.
Поступила 29.10.2012
Контактная информация
Виктор Моисеевич Катола, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, Институт геологии и природопользования Дальневосточного отделения РАН,
675000, г. Благовещенск, пер. Релочный, 1.
E-mai: [email protected] Correspondence should be addressed to
Viktor V. Katola, MD, PhD, Leading staff scientist, Institute of Geologу and Nature Management of Far Eastern Branch RAS, 1 Relochniy Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mai: [email protected]
