CC BY
16
УДК 619:576.8.078:616-025
Власенко В.В., д.б.н., професор
Войцщька О.М., acnipaHT © E-mail: [email protected] Втницъкий нацюналъний аграрнийутеерситет, м. Втниця
КОНСТРУЮВАННЯ НОВОГО ЖИВИЛЬНОГО СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ ПРИСКОРБНОГО ВИД1ЛЕННЯ ЗБУДНИКА ТУБЕРКУЛБОЗУ
Вважаетъся, що одним з найбыъш чутливих Memodie видыення збудника туберкулъозу з матер1алу е кулътуралъний, тому що дае можливктъ отримати результат навтъ при малт тлъкостг MiKOÔaKmepiù у дослгджуваному Mamepi^i.
Термт появи росту кулътури збудника на класичних середовищах становитъ eid 3-х тижшв до 3-х мгсяцгв. Тому створення нових поживних середовищ, якг б дозволили скоротити mepMin ткубацп, являетъся актуалъним завданням, тому що прискорюе ктцеву постановку дгагнозу шляхом видыення збудника, що надзвичаино важливо для подалъших diu стосовно профмактики та лшування хвороби.
Наведено резулътати розробки нового щыъного середовища та пор1внялъного дослгдження ростових якостеи розробленого поживного середовища зг стимулятором росту та традицтного середовища Левенштеина-Снсена. Встановлено, що швидтстъ росту мтобактерш на розробленому середовищ! вища пор1вняно з традицшними середовищами, що дае змогу скоротити mepMin ткубацп матер1алу у 30-90 pasie. Кулътури мтобактерш nid час кулътивування на запропонованому cepeдoвuщi збер^аютъ тинкториалът, кулътуралът та патогенш влacmuвocmi.
Розроблене нами середовище застосовуютъ для прискореного виявлення мтобактерш туберкулъозу. Додатково до нъого у rnôopi додаетъся стимулятор росту мтобактерш, який являе собою стерилъну, прозору , 6e36apenypiduHy, щомктитъ макро- тамтроелементи.
Ключов{ слова: мтобактерп, поживт середовища, бактерюскотя, прискорет методи виявлення мтобактерш, кулътуралъна diasHOcmurn, конструювання поживних середовищ, прискорений picm збудника туберкулъозу, mepMÎHU ткубацп, pocmoei влacmuвocmi.
УДК 619:576.8.078:616-025
Власенко В.В., д.б.н., профессор Войцицкая О.М., аспирантка Винницкий национальный аграрныйуниверситет, г. Винница
КОНСТРУИРОВАНИЕ НОВОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ УСКОРЕННОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗ
Считается, что одним из наиболее чувствительных методов выделения возбудителя туберкулеза из материала является кулътуралъный, так как дает
© Власенко В.В., Войцщька О.М., 2014
10
возможность получить результат даже при малом количестве микобактерий в исследуемом материале.
Срок появления роста культуры возбудителя на классических средах составляет от 3- х недель до 3- х месяцев. Поэтому создание новых питательных сред, позволяющих сократить срок инкубации, является актуальной задачей , так как ускоряет конечную постановку диагноза путем выделения возбудителя, что чрезвычайно важно для дальнейших действий в отношении профилактики и лечения болезни.
Приведены результаты разработки новой плотной среды и сравнительного исследования ростовых качеств разработанной питательной среды со стимулятором роста и традиционной среды Левенштейна - Йенсена. Установлено, что скорость роста микобактерий на разработанной среде выше по сравнению с традиционными средами, что позволяет сократить срок инкубации материала в 30-90 раз. Культуры микобактерий при культивировании на предложенном среде сохраняют тинкториальные, культуральные и патогенные свойства.
Разработанную нами среду применяют для ускоренного выявления микобактерий туберкулеза. Дополнительно к ней в наборе прилагается стимулятор роста микобактерий , представляющий собой стерильную, прозрачную, бесцветную жидкость, содержащуюмакро - имикроэлементы.
Ключевые слова: микобактерии, питательные среды , бактериоскопия, ускоренные методы выявления микобактерий , культуральная диагностика, конструирование питательных сред, ускоренный рост возбудителя туберкулеза, сроки инкубации, ростовые свойства.
UDC 619:576.8.078:616-025
Vlasenko V.V., Doctorof Biological Sciences , Professor
Voitsitskaya O.M., graduate student Vinnytsia National Agrarian University, Vinnitsa, Ukraine
DEVELOPMENT OF A NEW BREEDING GROUND FOR RAPID RELEASE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
It is believed that one of the most sensitive methods for the isolation of Mycobacterium tuberculosis material is cultural, as well as an opportunity to get results even with a small number of mycobacteria in the test material. Release date culture growth of the pathogen in classical environments ranging from 3 weeks to 3 months. The creation of new culture media that would allow shorten the incubation is an urgent task because the faster the final diagnosis by isolating the pathogen, which is extremely important for further action in relation to the prevention and treatment of disease.
The results of developing a new dense medium and a comparative study of growth characteristics developed culture medium with growth promoters and conventional Lowenstein- Jensen medium . It was established that the rate of growth of mycobacteria in developed environment is higher in comparison to traditional media, so you can shorten the incubation material in 30-90 times. Culture of mycobacteria during cultivation on the proposed store tynktoryalni environment , cultural and pathogenic properties.
11
We have developed an environment is used for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis. In addition to it enclosed in a set of mycobacterial growth stimulator , which is a sterile , clear, colorless fluid containing macro and micronutrients.
Key words: mycobacteria, culture media, bacterioscopy, accelerated methods for detection of mycobacteria culture diagnosis, construction of culture media, rapid growth of Mycobacterium tuberculosis, the timing of incubation, growth properties.
Вступ.На сьогодшшнш день ¿снуе велика кшьюсть бактерюлопчних прийом1в для виявлення мжобактерш туберкульозу в бюлопчному MaTepiani. Однак мжробюлопчна д1агностика займае одне з головних мкць i е основою для подальших методик в процес1 постановки д1агнозу [1].
Вважаеться, що одним з найбшьш чутливих метод1в видшення збудника туберкульозу з матер1алу е культуральний, бо дае можливкть отримати результат нав1ть при малш кшькоси мжобактерш в дослщжуваному MaTepiani.
Деяю дослщники [2] висказали гшотезу, вщповщно до яко! швидккть росту збудника туберкульозу залежить ввд його генотипу i його прискорення можливе тшьки при його штучнш змш, що мало ймов1рно. Перспективним напрямом в данш ситуацп може бути конструювання нових поживних середовищ, яю б завдяки своему складу давали можливють прискорити picT збудника.
Терм1н появи росту культури збудника на класичних середовищах становить вщ 3-х тижшв до 3-х мюящв. Тому створення нових поживних середовищ, яю б дозволили скоротити термш шкубацп, е актуальним завданням, бо прискорюе юнцеву постановку д1агнозу шляхом видшення збудника, що надзвичайно важливо для подальших дш стосовно профшактики та лжування хвороби.
Також одшею з причин низько! ефективност1 боротьби з захворюванням тварин та людей е застарше уявлення про бюлогш збудника туберкульозу, оскшьки останшм часом Bci науково-дослщш розробки з проблем туберкульозу проводились на мшобактер1ях, що знаходились на заключит стадп бюлопчного розвитку, яка е найбшьш захищеною i стшкою до р1зних фактор1в впливу.
Протягом тривалого перюду вивчення збудник1в туберкульозу ссавщв були накопиченш даш про значний пол1морф1зм мжобактерш. Однак через складност1 культивування i виявлення змшених форм збудника туберкульозу, щ даш не знайшли достойного практичного застосування. Завдяки дослщженням В.В. Власенко (1998) i розробщ поживного середовища ВКГ з'явилась можливкть культивування i виявлення збудника туберкульозу 3i зниженою життездатшстю i ферментативного актившстю [3]. Встановлено, що на поживному середовищ! ВКГ мжобактери туберкульозу проходять декшька морфолопчно вщмшних стадш розвитку - фшьтрувальш форми, шаропод1бш, амебопод1бш утворення, коки i пол1морфш палички, як1 не фарбуються за Цшь-Ншьсеном [4,5].
12
Матер1ал i методи. Дослщження проведен! у проблемнш лаборатори з вивчення туберкульозу Вшницького национального аграрного ушверситету.
Основними методичними прийомами постановки дослвдв були niflöip р1зних поживних компонента в оптимальних концентрациях, яю б за допомогою свого складу давали можливкть прискорити picT колонш збудника на новому експериментальному середовищг Окр1м вивчення х1м1чного складу експериментальних компонента, також брали до уваги ix органолептичш показники, а саме: дослщжували як кожен з компонента розчиняеться у дистильованш вод1, який вигляд мае середовище теля змшування Bcix компонента у сухому вигляд^ pH середовища теля розчиненняу вод1, його прозор1сть.
Основним критер1ем була оцшка ростових якостей середовища теля внесения нового компоненту пор1вняно i3 контрольним середовищем. Контрольним слугувало середовище Левенштейна-Снсена.
Для досл1дження ростових якостей розробленого середовища використовували тест-культури M. tuberculosisH37Rv ( колекц1я РИСК ¿м. Л. А.Тарасевича), M. bovis 8, M. BOvisBCG, M. avium 2282 ( колекщя ВГНКИ ), яю вис1вали з л1оф1л1зованого стану спочатку на середовище Левенштейна -Снсена. EioMacy досл1джуваних штам1в м1кобактер1й з поверхн1 середовища Павловського зн1мали в кшькост1 1 мг за загальноприйнятою методикою i вносили i'x в 1 мл стимулятора росту.
Отриману суспензш гoмoгeнiзyвaли eлeктpoмaгнiтнoю мiшaлкoю протягом 15 хв. У такий cnoci6 отримували po6o4i cycneH3Ü, якi в подальшому розводили в cтимyлятopi росту у сшввщношенш 1:10, ставили на 48 год. у термостат при TeMnepaTypi 36-37 С, а поим у кшькоси 1,0 мл зашвали газоном на розроблене середовище. Контролем служило середовище Левенштейна -Снсена, noeiß на яке проводили загальноприйнятою методикою. Для контролю якоси середовищ використовували тест-культуру Staphylococcusepidermidis 1225.
Розроблене нами середовище застосовують для прискореного виявлення MiKOÖaKTepift туберкульозу. Додатково до нього у Ha6opi додаеться стимулятор росту мжобактерш, який представляв собою стерильну, прозору , безбарвну piflHHy, що MicTHTb макро- та мiкpoeлeмeнти. Для приготування запропонованого середовища брали наважку сухого середовища у кiлькocтi 90 г, вносили в 1 л стерильно! дистильовано! води, кип'ятили 2-3 хв. До повного розчинення агару, фшьтрували через ватно-марлевий фiльтp, розливали у флакони i cтepилiзyвaли при 121 ±1.0 Спротягом 15 хв. в автоклавг
Готове середовище мало жовте забарвлення з pH 7,2±0.2. Перед використанням середовище розплавляли на водянш 6aHi й розливали по 18-20 мл у стерильш чашки neTpi fliaMeTpoM 90 мм.
KpiM TecT-MiKpoopraHi3MiB для дocлiджeння якocтi середовищ використовували бюлопчний мaтepiaл Bifl гвшейських свинок з експериментальною мiкoбaктepiaльнoю шфекщею. 3a6ip i niflr0T0BKy
13
бюлопчного матер1алу для бактерюлопчних дослщжень здшснювали за загальноприйнятими методами.
Пщготовлений до nocißy бюлопчний Marepian у кшькосп 1,0 мл за допомогою стерильного шприца вносили у стимулятор росту, шкубували у термостат! за температури 37,0 ±1,0 С протягом 24-48 год. Шсля цього 1,0 мл наносили на поверхню поживного середовища, розлитого у чашки Петрг PiBHOMipHO розподшяли по И площ1, чашки помщали в пол1етиленов1 пакети i не перевертаючи шкубували при 37,0 ±1,0 С впродовж 10 д1б. Паралельно зазначену юльюсть бюлопчного матер1алу виавали на середовище Левенштейна - Снсена. Чашки з поавами продивлялись щоденно, в1зуально визначали i пщраховували характерш для мжобактерш колони. 3 отриманих культур готували препарати i фарбували ix за методом Цшь - Ншьсена.
Для вщтворення морфолопчно! картини туберкульозу проводили модельт дослщи на морських свинках i кролях методом внутршньочеревного введения культур мжобактерш, видшених з бюлопчного матер1алу i вирощених на розробленому середовищг Контрольних тварин заражали cycnemiero культур M. tuberculosisH37Rv, M. bovis 8, яю вирощували на запропонованому середовищг
Через 41 добу теля заражения виводили тварин з досл1ду i виконували im патологоанатом1чний розтин. 1з серця вщбирали проби кров1 у стерильш проб1рки з гепарином, додавали р1вний об'ем стимулятора росту i помщали в термостат при 37-38 С на 24 год., пот1м виавали на розроблене поживне середовище, МПА i МПБ. 3 культур, що виросли на розробленому середовищ^ готували препарати для мшроскопи та фарбували i'x за Цшь - Ншьсеном.
Для подальшого дослщження вщ морських свинок вщбирали naxoei лАмфовузли, печшку, селезшку й легет, а вщ кролАв - лише печшку, селезшку i легеш. Патолопчний матерАал обробляли за А. Алжаевою i суспензш кожного органа виЫвали на середовище Левенштейна - Снсена. Також суспензш кожного органа обробляли стимулятором росту, теля чого виавали на запропоноване середовище. Облж якосп i швидкоси росту культур на середовищах проводили щодня протягом перших 5 д1б, flani - з штервалом 5 д1б до заюнчення термшу шкубацп. 3 отриманих культур готували препарати для MiKpocKonii' i фарбували i'x по методу Цшь - Ншьсена.
Мкробюлопчш дослщження проводили вщповщно Наказу №45 МОЗ Украши.
Результати дослщження. Вивчення ростових якостей запропонованого середовища проводили порАвняно з яечним середовищем Левенштейна -Снсена. Результати дослщжень приведено у табл. 1.
Як видно з табл.. 1, на розробленому середовищА на 2-4 добу культивування почали рееструвати picT культур референтних штамАв M. tuberculosisH37Rv, M. bovis, M. avium 2282, M. BovisBCG, яю дали picT у виглядА натвпрозорих колонш cipo-бшого кольору, iHOfli з жовтуватим
14
Таблиця 1
По|Мвняльна кшьккна характеристика ростових якостей середовища _Левенштейна - Снсена i розробленого середовища._
Тест-мжрооргашзм Кшьшсть проб Термш реестраци росту мжобактерш на середовищах, доба
Левенштейна-Снсена Розроблене р
M. tuberculosis H37Rv 10 42±0,4 3±0,58 <0,001
M. bovis 8 15 40±0,93 4±0,88 <0,001
M. avium 2282 10 41±0,49 2±0,58 <0,001
M. bovis BCG 12 35±0,9 2±0,56 <0,001
S. epidermidis 10 PicT ввдсутшй PicT ввдсуттй
Колони зливалися ¿до 5 - 6 доби давали суцшьний picT на поверхш агаризованого середовища. При nepecißi отриманих на даному середовищ1 культур середовище Левенштейна-Снсена без малах1тового зеленого дослщжуваш штами мжобактерш збер1гали тинкториальш та морфолопчш ознаки.
Слщ зазначити, що на запропонованому середовищ1 темии росту дослщжуваних штам1в мжобактерш перевищували таю на традицшному середовищ1 Левенштейна-Снсена у 10-20 раз1в. При MiKpocKonii' препарата, виготовлених з культур M. TuberculosisH37Rv, M. bovis 8, M. BovisBCG, M. avium 2282, яю виросли на цьому середовищ1 протягом 2-4 д1б, пофарбованих за Цшь-Ншьсеном, спостер1гали характерш для мжобактерш коки, овощи, амебопод1бш форми з порожшм центром i зернистютю рожевого або червоно-фюлетового кольору.
У забарвлених препаратах цих самих культур, яю культивували на розробленому середовищ1, виявляли коки, диплококи, тетракоки, овощи. Велику юльюсть паличок р1зно! величини i3 зернистктю, що засвщчуе 1хню здатшсть до трансформаци у морфолопчш форми кл1тин, яю спостер1гали також за тривалого культивування дослщжуваних штам1в на класичному середовищг
Таким чином, результата вивчення тинктор1альних i морфолопчних ознак мкобактерш, яю росли на дослщжуваних середовищах, вказують на придатшсть розробленого середовища для культивування мжобактерш. KpiM того, можливють реестраци росту дослщжуваних мкрооргашзм1в вже на 2-4 добу культивування на даному середовищ1 може бути використано для виршення питания можливо! прискорено! д1агностики туберкульозу.
Встановлення щентичност1 за чинниками патогенност1 мшобактерш, вирощених на розробленому i традицшному середовищах, проводили invivo при вщтворюванш шфекцшного процесу при зараженш лабораторних тварин. В яких, при подальшому патолого-анатом1чному розтиш, виявляли характерш для туберкульозу змши в органах, а при бактерюлопчному дослщженш видшяли збудника туберкульозу.
15
Таким чином, иоиередне оброблення патолопчного матер1алу у стимулятор! росту, а також сукупшсть ycix складових запроионованого середовища дае змогу отримати позитивний результат, а саме: скоротити термш бактерюлопчних дослщжень на туберкульоз.
Висновки.
1. Запропоноване середовище просте у приготуванш, що дае змогу заощадити час на пщготовщ до дослщження.
2. PicT тест-культур збудниюв туберкульозу людського, бичачого вид1в як референтних штам1в, так i з патолопчного матер1алу на запропонованому середовищ1 3i стимулятором росту спостер1гаеться на 2-4 добу.
Прискорене виявлення мжобактерш туберкульозу е перспективним напрямом покращення бактер1олог1чно! д1агностики туберкульозу.
Л1тература
1. Голышевская В.И., Корнеев A.A., Черноусова Л.Н., Селина Л.Г., Казарова Т.А., Гришина Т.Д., Сафонова С.Г., Пузанов В.А., Николаева Г.М, Фадеева H.H. Применение нових микробиологическихтехнологий в диагностикетуберкулеза // Проблемытуберкулеза. - 1996. - №6. - С. 45 - 47.
2. ГолышевскаяВ.И., Фадеева НИ. Совершенствование методов микробиологической диагностики туберкулеза // Сб. науч. Тр. ЦНИИ туберкулеза. - М., 1987. - Т. 45. - С. 77 - 82.
3. Власенко В.В. Микробиологиятуберкулеза в фокусепроблем современности. - Винница: «Гипанис». - 1998 - 224 с.
4. Власенко В.В. Сучасш пщходи до д1агностики туберкульозу (методичш рекомендаци) / В.В. Власенко, 1.Г. Власенко, I.B. Березовський, та iH. - Ки1в: МОЗ Украши, 2006. - 39 с.
5. Власенко В.В. М1кроб1олог1чна експрес-д1агностика туберкульозу / В.В. Власенко, 1.Г. Конопко, С. П. Василенко. - Вшниця, 2000. - С. 41-45.
Рецензент - д.б.н., професор Куртяк Б.М.
16
