CC BY
33
КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ... 81
УДК 616-006.448:615.277.3.015.46:616-092.4
А.Н. Иншаков1, Н.А. Оборотова1, А.Ю. Барышников1, Е.В. Трифонова2, Е.В. Катаева2, А.К. Голенков2 ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ САРКОЛИЗИНА IN VITRO И ЕГО КЛИНИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ РЕЗИСТЕНТНЫХ ФОРМАХ ММ 'РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2МОнИкИ им. М.Ф. Владимирского, Москва
Контактная информация:
Иншаков Андрей Николаевич, научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей.
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(926)179-04-20 e-mail: [email protected]
Статья поступила: 02.06.2009 г., принята к печати: 23.09.2009 г.
Резюме
DiSC-методом определяли чувствительность миеломных клеток in vitro к 5 химиопрепаратам, входящим в схемы М-2 и ЦСВП, у 10 резистентных больных множественной миеломой. Обнаружили, что наиболее эффективные препараты в этой группе - сарколизин и алкеран (100 % чувствительных больных). Однако скрининговая концентрация сарколизина (0,69 0,13 мкг/мл), при которой гибнет 70 % опухолевых клеток, была достоверно в 2,3 раза меньше по сравнению с концентрацией алкерана (1,61±0,82; р<0,05). По результатам DiSC-метода, десяти клинически резистентным больным провели монотерапию сарколизином и получили положительный клинический ответ в 6 случаях.
Ключевые слова: множественная миелома, DiSC-метод, резистентность, сарколизин.
A.N. Inshakov1, N.A. Oborotova1, A.Yu. Baryshnikov1, E.V. Trifonova2, E.V. Kataeva2, A.K. Golenkov2 THE EFFECT OF SARCOLIZINE IN VITRO
ON PATIENTS WITH RESISTANT FORM OF MULTIPLE MYELOMA
'N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
2M.F. Vladimirsky Clinical Institute of Moscow Region, Moscow
Abstract
We have examined the sensitivity of myelocytic cells of patients with resistant form of multiple myeloma to five anticancer drugs including Russian anticancer drug sarcolizine by DiSK-method in vitro. In this small group of anticancer drugs, sarcolizine and alkeran were most effective drugs. The concentration of sarcolizine (0,69±0,13 mkg/ml) which include 70 % of cells death was 2,3-fold less than the concentration of alkeran induced the same effect. Based on data of DiSK-method, treatment of 10 patients with resistant form of multiple myeloma was performed. The positive effect was observed in 6 of cases.
Key words: multiple mieloma, DiSC-assay, resistance, sarcolysin.
Введение
Множественная миелома - системное злокачественное В-лимфопролиферативное заболевание, морфологическим субстратом которого являются плазматические клетки, продуцирующие моноклональный па-ропротеин (Р^). В структуре всех злокачественных новообразований ММ составляет 10-15 % [1].
Важной клинической проблемой является первичная или вторичная устойчивость клеток больных ММ к проводимым курсам ХТ. Как показали наблюдения, первичная резистентность к стандартным режимам ХТ при ММ встречается в 20 % случаев, и этот процент увеличивается практически до абсолютных значений по мере проведения цитостатического лечения [1; 2].
В настоящее время определены подходы к лечению устойчивых форм ММ, которые заключаются в последовательном использовании нескольких программ химиотерапии. Существенным фактором этих подходов является эмпирический принцип, проявляющийся как в подборе противоопухолевых препаратов, входящих в химиотерапевтические комбинации, так и в смене этих программ. Однако этот прин-
цип далеко не всегда дает желаемый клинический результат. Довольно часто предложенные комбинации цитостатиков суммируют миелотоксический эффект каждого препарата и таким образом несколько увеличивают противоопухолевую эффективность в целом, но это не является результатом искомого повышения избирательности противоопухолевого действия.
Определение чувствительности опухолевых клеток при лейкозах к цитостатическим препаратам in vitro [4] может стать актуальным направлением и в преодолении резистентности миеломных клеток к противоопухолевым препаратам. Причем функция этого подхода достаточно широкая и заключатся в скрининговом поиске новых противоопухолевых препаратов с высокой активностью против ММ. [5]. С клинической точки зрения при возникновении рецидива или устойчивости клеток больного к ранее проводимому цитостатическому лечению важно тестировать опухолевые клетки больного in vitro к препаратам, входящим в применяемые курсы ПХТ, и удалять из них малоэффективные препараты. Таким образом можно по-новому формировать комбинацию ХТ, меняя доминирующий препарат и учитывая результаты in vitro, то есть осуществлять индивидуальный подход к каждому пациенту.
Материалы и методы
В исследовании представлены результаты лечения 10 больных ММ, возраст которых варьировал от 43 до 78 лет (ср. 58,4 года). Всем больным проводилось предшествующее лечение программной ПХТ, вследствие чего у них развилась резистентность к проводимой ранее терапии. Резистентными считались больные, не отвечающие на 2 и более курса ХТ.
Исследование чувствительности миеломных клеток к химиопрепаратам проводили не менее чем через 2 мес. после последнего курса.
Определение чувствительности опухолевых клеток к препаратам DiSC-методом (differential staining cytotoxicity)
Клетки костного мозга больных ММ получали при стернальной пункции в стерильные пробирки с раствором гепарина (500 U/мл). Гепаринизиро-ванный костный мозг смешивали с 10% раствором желатина до конечной концентрации 1 % и помещали на 30-45 мин в термостат при 37 °С. После расслаивания верхний слой осторожно переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 мин при скорости 1000 об/мин. Для полного удаления эритроцитов осадок ресуспензировали в 1мл раствора для лизиса эритроцитов и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, затем клетки дважды промывали средой 199 в указанных условиях. Подсчет клеток проводили в камере Горяева общепринятым методом. Выделенные из костного мозга клетки раскапывали в концентрации
0,5-2*105 в 180 мкл полной среды RPMI-1640 в 96-луночные круглодонные планшеты (Costar, USA). Добавляли по 20 мкл в лунку каждого исследуемого препарата. Каждый препарат исследовали в 5 концентрациях (табл. 1). В контрольные лунки с клетками добавляли по 20 мкл чистой среды RPMI-1640. Планшеты с клетками инкубировали в течение 96 ч при 37 С в атмосфере 5% CO2.
Алкеран (Glaxo Wellcome, UK): флакон, содержащий 50 мг лиофилизированного препарата. Разводили прилагающемся растворителем до конечной стоковой концентрации 1,25 мг/мл. Препарат готовили непосредственно перед постановкой тестов, разведенный препарат не хранили.
Сарколизин (ООО Фирма ГЛЕС): флакон, содержащий 20 мг лиофилизированного препарата. Разводили NaCl 0,9% до конечной стоковой концентрации 1,25 мг/мл. Препарат готовили непосредственно перед постановкой тестов, разведенный препарат не хранили.
Через 96 ч планшет с клетками центрифугировали при 500 оборотах в минуту 5 мин на центрифуге (Backman, USA). Автоматической пипеткой из каждой лунки отбирали 100 мкл среды, добавляли 100 мкл 2%-ного раствора Fast green-nigrosin и ресуспен-дировали. Через 10 мин 100 мкл клеточной суспензии добавляли в камеру цитоцентрифуги (Hettich Zentri-fugen, Германия) и осаждали при 1200 оборотах в минуту 10 мин на предметное стекло (25*75*1,0) через фильтр (Hettich Zentrifugen, Германия). Стекла с осажденными клетками фиксировали в метиловом спирте 20-30 с и высушивали. Фиксированные стекла окрашивали по Романовскому.
Подсчет клеток производили на световом микроскопе («Zeiss», Германия), при оптическом увеличении *400 или *1000 с использованием иммерсионного масла («Zeiss», Германия). В каждом отпечатке подсчитывали 100 клеток. «Мертвые» клетки окрашивались раствором Fast green-nigrosin
в темно-зеленый или почти черный цвет. «Живые» опухолевые и нормальные клетки окрашивались стандартно.
Процент живых опухолевых клеток вычисляли по формуле:
No=Nj/( Nj+ N2+ N3) X100 %, где
No - процент живых опухолевых клеток;
N1 - число живых опухолевых клеток;
N2 - число мертвых клеток;
N3 - число живых нормальных клеток.
Для каждого препарата строили график зависимости «доза - эффект» и определяли LD70 (концентрацию, которая вызывала гибель 70 % клеток). Клетки опухоли считали чувствительными к химиопрепаратам, если значение LD70 было меньше терапевтической концентрации в плазме.
Противоопухолевый ответ оценивали по критериям эффективности SWOG (1972 г.), характеризующим соотношение степени снижения парапротеина в сыворотке и моче с клиническими проявлениями.
Полный ответ регистрировали при снижении сывороточного парапротеина на 75 % и более, снижении мочевого парапротеина на 90 % и более. ЧО регистрировали при снижении сывороточного парапротеина на 50-75 %, снижении мочевого парапротеина на 50-90 %. ОбО регистрировали при снижении сывороточного парапротеина на 25-50 %, снижении мочевого парапротеина на 25-50 %.
ОО - регрессия парапротеина менее чем на 25 % или прогрессирование. ПЗ отмечали при нарастании экскреции или появление белка Бенс-Джонса, появлении новых очагов остеодеструкций, снижении показателей Hb и эритроцитов без признаков крово-потери и гемолиза, развитии гиперкальциемии.
Результаты и обсуждение
Была исследована чувствительность in vitro опухолевых плазмоцитов костного мозга 10 клинически резистентных больных ММ к препаратам, входящим в индукционные схемы М-2 и ЦСВП: винкристину, алкерану, сарколизину, преднизоло-ну, белустину. Чувствительность миеломных клеток in vitro не определяли к циклофосфану, так как этот препарат превращается в цитотоксический метаболит благодаря системе оксидаз цитохрома Р-450, локализованного в печени [3]. На рис. 1 показана чувствительность опухолевых клеток 10 резистентных больных ММ к преднизолону, винкристину, белустину, алкерану, сарколизину.
Оценивая результаты проведенного исследования in vitro, можно сделать вывод, что противоопухолевая активность в схемах лечения сохранилась только у алкерана и сарколизина (100 % чувствительных к ним больных). Таким образом, изученная фармакодинамическая модель схем ПХТ М2 и ЦСВП в культуре миеломных клеток резистентных больных MM представляет собой комбинацию препаратов, обладающих различной противоопухолевой активностью. При эмпирическом назначении такой комбинации резистентным больным с вероятностью 100 % активностью будут обладать только алкеран и сарколизин. Остальные препараты в 40 и 43 % случаев активны не будут.
Кроме того, остается неизученной противоопухолевая активность комбинации препаратов, входящих в схему в целом, которая может обладать потенцирующим, ингибирующим или нейтральным действием. В связи с этим в той или иной степени может нарастать суммированная токсичность без усиления противоопухолевого эффекта.
КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕМОДЕЛИРОВАНИЕ... 83
Таблица 1
Концентрации используемых препаратов
Препарат Концсток. мг/мл Vсток.. мл Конц^ в лунке. мг/мл Шаг разведения
Винкристин 1 0.8 0.05 4
Преднизолон 25 0.4 0.25 8
Белустин 40 0.4 0.04 3
Алкеран 1.25 - 0.0125 2
Сарколизин 1.25 - 0.0125 2
Таблица 2
Клинический эффект сарколизина у резистентных больных ММ (n=10)___________________________________
Группы Клинический ответ Общий %
Ответившие (n=6) 1 ПО (10 %)+2 ЧО (20 %)+3 ОбО (30 %) 60
Не ответившие (n=4) 1 ОО (10 %)+3 ПЗ (30 %) 40
Рис. 1. Чувствительность опухолевых клеток резистентных больных ММ in vitro к химиопрепаратам. входящим в схемы М-2 и ЦСВП.
Рис. 2. Сравнение значений LD70 алкерана и сарколизина. полученных DiSC-методом у больных ММ in vitro (n=10).
На основании вышесказанного можно предположить. что выделение из комбинаций М-2 или ЦСВП сарколизина и применение его в режиме монотерапии резистентным больных ММ позволит создать дозовое преимущество и исключить вероятное ингибирование противоопухолевого эффекта комбинации в целом.
Сарколизин взят для клинического исследования в связи с тем. что его «удельная» противоопухолевая активность in vitro. отнесенная к концентрации. выше. чем алкерана. Частота чувствительности опухолевых плазмоцитов резистентных больных MM in vitro к сарколизину и алкерану одинакова (100 %).
Однако скрининговая концентрация сарколизина. при которой гибнет 70 % опухолевых клеток. в 2.3 раза достоверно меньше по сравнению с таковой алкерана (р<0.05). (рис. 2). Итак. 10 резистентным к программным схемам М-2 и ЦСВП больным ММ было проведено в среднем 6 (от 1 до 14) курсов терапии сарколизином. курсовая доза составила 70 мг (от 60 до 100). что на 43 % превышает суммарную дозу аналога сарколизина алкера-на в индукционных схемах. Сарколизин вводили внутривенно. в РД доза составляла 20 мг.
Литература
1.
После лечения 10 резистентных больных ММ с учетом результатов чувствительности in vitro получен положительный клинический ответ в 60 % случаев: у 2 (20 %) - ЧО. у 3 (30 %) - ОбО. у 1 (10 %) - ПО. Длительность ответа составила в среднем 11 мес. Отсутствие ответа - 4 случая. причем в 3 из них болезнь. несмотря на проводимую терапию. прогрессировала (табл. 2).
Заключение
Использование сарколизина в качестве базисной терапии резистентной ММ сопровождается клиническим ответом. При этом сложилась отличная от эмпирического подхода ситуация. когда в качестве противоопухолевого агента использовали препарат. чувствительность миеломных клеток к которому определена лабораторным путем. Отсутствие или достижение минимального противоопухолевого ответа на проводимые эмпирические курсы ПХТ у резистентных больных ММ можно объяснить ингибирующим противоопухолевый эффект действием цитостатических препаратов. входящих в индукционные химиотерапевтические схемы. приводящим к усилению миелотоксичности схемы и повышению риска развития инфекционных осложнений.
2.
3.
4.
5.
Андреева Н.Е., Балакирева Т.В. Парапротеинемические гемобластозы: Множественная миелома. макроглобулинемия Вальденстрема. болезни тяжелых цепей. - Руководство по гематологии под ред. Воробьева А.И. - Тверь: ООО Издательство «Триада». 2003. - С. 88.
Голенков А.К., Шабалин В.Н. Множественная миелома. - СПб: Гиппократ. 1995. - С. 144.
Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. - М.: Мир. 1989. - С. 264-265.
Kaspers G.J.L., Pieters R., Veerman A.J.P. Glucocorticoid sensitivity and resistance in childhood leukemia. - Drug resistance in leukemia and lymphoma II. Edited by Pieters R.. Kaspers G.J.L.. Veerman A.J.P.. Netherlands. 1997. - P. 95-103.
Yasui H. Anti-tumor activiti of a novel immunosupperressant FTY-720 in multiple mieloma // Blood. -2004. - Vol. 104. - P. 941-a.
алкеран
сарколизин
□ алкеран
□ белустин
винкр
ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ СТАТЕЙ ДЛЯ ПУБЛИКАЦИИ В «РОССИЙСКОМ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОМ ЖУРНАЛЕ»
Работа может быть статьей экспериментального или клинического характера, теоретической или концептуальной, обзором по материалам литературы, рецензией, сообщением дискуссионного, исторического или хроникального характера, рефератом зарубежных работ.
Статьи экспериментального или клинического характера имеют разделы: Резюме; Введение; Материалы и методы; Результаты и обсуждение; Выводы (Заключение); Литература.
Обзоры литературы, статьи теоретического и концептуального характера имеют разделы: Резюме; Введение; Разделы по отдельным обсуждаемым вопросам; Выводы; Литература.
Статья должна быть представлена в виде файла формата RTF на дискете или CD и распечатана в 2 экземплярах. На внешней стороне дискеты или коробке CD должны быть указаны фамилия первого автора, названия статьи и файлов.
В основном файле должен содержаться текст статьи, таблицы, подписи и надписи к рисункам, список литературы. Кроме того, на дискете или CD должны быть записаны рисунки (каждый в виде отдельного файла). Штриховые и тоновые рисунки (фотографии, рентгенограммы и т.д.), то есть растровая графика, должны быть сохранены в виде файлов формата TIF или JPEG, графики и диаграммы (векторная графика) - в виде файла Microsoft Excel 5.0/95 с обязательным приложением в виде таблицы, по которой данный график построен.
Обзорные статьи не должны превышать 17 страниц, оригинальные статьи - 12 страниц.
Весь текст должен быть набран шрифтом Times New Roman 12 через полуторный интервал. Текст должен быть выровнен по левому краю. Все страницы должны быть пронумерованы. Номер страницы должен быть расположен внизу справа, начиная со второй. Каждый абзац должен начинаться с красной строки, которая устанавливается меню «Абзац». Не следует использовать для красной строки клавишу Tab. Десятичные дроби следует писать через запятую. При наборе текста следует различать дефис и тире. Последнее вводится одновременным нажатием клавиш Ctrl+Alt+дефис с дополнительной клавиатуры при горящем указателе Num Lock.
Набирая заголовки, названия разделов, таблиц, подписи и надписи на рисунках, точку в конце ставить не нужно. Выравнивать по центру и устанавливать красную строку для всего перечисленного также не нужно.
В начале статьи следует указать имя, отчество и фамилии авторов полностью, НАЗВАНИЕ СТАТЬИ, место работы в именительном падеже (если авторы работают в разных учреждениях, уточнить это дополнительно), должность и контактную информацию для каждого автора (почтовый адрес, e-mail). Авторы несут ответственность за точность предоставляемой ими информации о себе и месте своей работы.
В начале статьи должно быть приведено Резюме. В нем должны быть кратко без рубрикации указаны цель исследования, материалы и методы, полученные автором результаты и основные выводы. В конце резюме автор приводит Ключевые слова работы (не более 5). Рекомендуемый объем реферата - 500-1000 печатных знаков. Отступление от этой схемы допустимо только в отношении обзорных статей.
Далее необходимо на английском языке дать фамилии авторов и их инициалы, название статьи, название учреждений, резюме (Abstract) и ключевые слова (Key words).
Статья должна быть написана ясно, четко, лаконично, тщательно выверена авторами, не содержать повторов и исправлений. Сокращения допустимы только в отношении часто встречающихся в статье терминов. Сокращение вводится при первом вхождении в круглых скобках и в дальнейшем используется по всему тексту. Не следует параллельно использовать термин и его сокращение. Если сокращений больше 10, следует вводить список сокращений. В статьях должна использоваться система СИ. В тексте должны быть указаны ссылки на таблицы и рисунки, например, (табл. 1), (рис. 1) или на рис. 1 представлены... Они должны быть размещены в соответствующих по смыслу абзацах и последовательно пронумерованы. Рисунки и таблицы нумеруются отдельно.
Таблицы должны быть компактными, иметь название, не повторять графики, не должны содержать пустых ячеек (отсутствие данных должно отмечаться тире, «нет данных» или специальным примечанием). Все уточнения и локальные сокращения выносятся в примечания. Таблицы набираются тем же шрифтом, что и основной текст статьи с выравниванием по левому краю, без переносов и красных строк. Точку после последнего слова в ячейке ставить не нужно. Примечания к таблицам выносятся в последней строке таблицы тем же шрифтом. Каждое примечание должно располагаться с новой строки, помечено надстрочной цифрой, которая отделяется от текста примечания пробелом. В конце каждого примечания ставится точка. Примечания нумеруются в соответствии с их появлением в таблице: сверху вниз и слева направо.
Размер каждого рисунка (даже если они смакетированы вместе) должен быть не менее 10 х 15 см. Рентгенограммы должны быть представлены в негативном изображении. Иллюстрации сканируют в масштабе 100 % с разрешением 300 dpi. Рентгенограммы, сонограммы, фотографии сканируют в режиме «Gray». Если под одной подписью планируется несколько рисунков, каждый должен быть прислан отдельно и соответствовать указанным выше требованиям по качеству. Графики и схемы нельзя перегружать надписями. Подпись к рисунку должна быть лаконичной, точно соответствовать его содержанию. Если несколько рисунков идут под общей надписью, то сначала приводят ее, а затем названия отдельных рисунков под русскими буквами.
(окончание на стр. 92)
