CC BY
21ФШка живого, Т. 21, No1-2, 2014. С.29-32. © Малина А.Е., ЛожкоД.М., КозловО.В., Корнелюк О.1.
Pliviiics nTllie Alive
УДК577.217.5
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ВЗАеМОДП ЦИТОК1НА ЕМАР II З БЕТА-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ ТА Г1ДРОКСИПРОПИЛ-БЕТА-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ ПРИ П1ДВИЩЕНН1
ТЕМПЕРАТУРИ
Малина А.Е., Ложко Д.М., Козлов О.В., Корнелюк O.I.
1нститут молекулярног бгологИта генетики НАН Украгни e-mail: malinaalona@gmail. com
Надшшла до редакци 15.08.2014
ЕМАР II - ендотелiальний та моноцит-активуючий полшептид II, попередником якого е бiлок AMP1/p43 - компонент високомолекулярного комплексу амшоацил-тРНК-синтетаз вищих евкарiот. Р-циклодекстрин - олггомер залишюв а-D-глюкози, який штенсивно використовуеться при створеннi лiкaрських препарата в якосп допомiжного агента, здатного знижувати рiвень агрегаци бiлкового компонента, пщвищувати його стiйкiсть до Д11 протеолггичних ферменпв кров1/шлунково-кищкового тракту (КШТ) та збшьшувати розчиннiсть. В данiй робот! дослщжено взаемодто ЕМАР II з Р-циклодекстрином, а також ЕМАР II з пдроксипропил-Р-циклодекстрин при пiдвищеннi температури.
Ключовi слова: ЕМАР II, Р-циклодекстрин, гщроксипропил-Р-циклодекстрин, спектроскопiя. ВСТУП
Юлькють лжарських препарат1в, створених на основ1 сучасних методiв бютехнологи, стрiмко зростае на фармаиевтичних ринках всiх кра!н свпу. Для профилактики i лжування багатьох захворювань все частте використовують рекомбшантн бтки, нукдеiHовi кислоти та rnrni генно-iнженsрнi продукти.
ЕМАР II - ендотелiальний та моноцит активуючий полшептид II, попередником якого е биток А1МР1/р43 - компонент высокомолекулярного комплексу амшоцид-тРНК-синтетаз вищих еукарiот. Вщомо, що цей пептид здатен модулювати ряд властивостей ендогелiадьних кдпин моноцит1в та лейкоцитв in vitro [1, 2]. Також досл^джено гадьмування росту ксенографтв раку простати людини, iмпдантованих гад капсулу нирки мишей при обробц !х препаратом ЕМАР II [3, 4]. Здатнсть ЕМАР II шлбувати неоангiогенез та стимулювати апоптоз ракових кдiтин е основою для досл^дження питання про те, чи може цей бшок бути використаний у якост протипухдинного лiкарського засобу.
Створення лкарсько! форми препарату передбачае застосування допом1жних речовин i для цого, на сьогодншнм день, використовують багато полiмерiв. Серед полiмерiв ефективним е гептаметр залишюв a-D-глюкози - Р-циклодекстрин (ЦД) (рис.1), як успiшно застосовуеться у фармакологи. Такий допом1жний агент здатний знизити рiвень агрегавд
бтково! компоненти, щдвищити стйкксть до до
Рис. 1. Стрижнева (лiворуч) та х1м1чна (праворуч) модел1 будови молекули ß-циклодекстрину.
протволпичних ферменпв кровi/ШКТ та збтьшити розчиншсть [5, 6]. При створенн лжарських препарат1в на основi рекомбшантних бiлкiв також
Малина А.Е., Ложко Д.М., Козлов О.В., Корнелюк О.1.
використовують похйднй ß-циклодекстрину -гйдроксипропил^-циклодекстрин. Це обумовлено його високим ступенем розчинност у водй.
Метою дано! роботи е дослйдження взаемодй' рекомбйнантного бйлка ЕМАР II з ß-ЦД i пдроксипропвд^-циклодекстришм (ГПЦД) при пйдвищеннй температури з подальшою можливйстю використання кнк комплексйв для створення лйкарсько! форми препарату.
МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ
Експресйя, видйлення та очистка рекомбiнатного бйлка ЕМАР II з клйтин E.coli. Для експресй' ЕМАР II було використано штам-продуцент, отриманий на основ! рещтента Escherichia coli BL21(DE3)pLysE. Штам клiтин трансформовано плазмiдним вектором pET-30a-EMAP II, у якого гад контролем промотера фага Т7 мiститься ген цiльового бiлка. Генетичним маркером плазмiди рЕТ-30а е ген kan, який забезпечуе стiйкiсть трансформованих клiтин до антибiотику канамйцину.
Експресйю рекомбшантного бiлка ЕМАР II проводили на поживному середовищi LB з додаванням канамйцину до кйнцгво! концентраций 30 мкг/мл. Iндукдiю експресй' ЕМАР II з промотера lacUV5 здййснювали шляхом додавання до культурального середовища iзопропил-ß-тiогалактопiранозиду (InTr) до кйнцево! концентравд 1,25 мМ [7]. Очистку цйльового рекомбйнантного бiлка ЕМАР II проводили методом металхелатуючо! хроматографй! на колонцй з Ni-NTA агарозою (Qiagen, USA).
Концентрац1ю очищеного бiлка визначали на спектрофотометрi BioМate-5 з урахуванням коефiцiенту молярно! екстинцй на довжинй хвилй 280 нм, що складав 8730 см-1М-1. Цей коефiцiент молярно! екстинцп визначали за даними амйнокислотного складу бiлка за допомогою програми ProtParam
(web.expasy.org/protparam/). Аналiз отриманого препарату проводили за допомогою гель-електрофорезу за Лемлi в денатуруючих умовах, використовуючи 15% роздйляючий
полiакриламiдний гель йз 0,1 % додецилсульфату натрию.
Методика флуоресцентних вимйрювань.
Бета- i гйдроксипропил^-циклодекстрин розчиняли у буферй, який мйстив 50 мМ Na-фосфат, 150 мМ NaCl з рН=7,5 i протягом 2 год интенсивно перемйшували при кймнатнйй температурй. Спектри флуоресценвд ЕМАР II реестрували на спектрофлуориметрй Hitachi M850 (Япония), який був обладнаний термостатованим кюветотримачем.
Вимйрювання проводили у кварцовйй кювет з довжиною оптичного шляху 0,5 см. Спектральна ширина щйлин для монохроматорйв збуджуючого свйтла та рееструючо! системи становила 5—10 нм. Довжина хвилй збудження дорйвнювала 280 нм, интервал довжин хвиль для спектрйв флуоресценвд становив 300 - 400 нм, реестрацйю флуоресценцii проводили пйд кутом 900 до напрямку пучка збуджуючого свйтла при температурах вйд 25 до 600С ± 0,20С.
Аналйз експонованост амйнокислотних залишкйв проводили за допомогою програми PyMol (http://www.pymol.org/).
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
Видйлення та очистка рекомбйнантного бйлка ЕМАР II з клйтин E. сoli. Препарат ЕМАР II, видйленого за описаною вище методикою, було дослйджено на чистоту, використовуючи SDS-гель-електрофорез за Леммлй (рис. 2). Чистоту отриманого препарату оцйнювали бйльшою за 95%. На високу ступйнь чистоти препарату вказують також значення оптичного поглинання на довжинах хвиль 260 i 280 нм (0D260 та 0D280 вйдповйдно), величина вйдношення яких (0D280/0D260) е йндикатором вйдсутност домйшок нукле!нових кислот у отриманому розчинй цйльового бйлка. У нашому випадку вона становила 1,86.
116,0 кДа 66,2 кДа 45,0 кДа 35,0 кДа
25,0 кДа
18,0 кДа
Рис. 2. Денатуруючий гель-електрофорез за Лемлй рекомбйнантного бйлка ЕМАР II: 1-ЕМАР II; 2- маркерна сумйш бйлкйв.
Дослйдження взаемодй! мйж ЕМАР II, ß- та гйдроксипропил^-циклодекстришм методом
флуоресцентно! спектроскопа При реестравд спектрйв флуоресценвд EMAP II (рис. 3) максимум флуоресценвд фйксували при 330 нм. Що стосуеться дослйдйв, проведених при 600С, максимум флуоресценвд ЕМАР II змйстився до ЕМ=350 нм (рис. 4), що вйдповйдае максимуму флуоресценвд вйльно! амйнокислоти триптофану. Це обумовлено тим, що при нагрйваннй розчину ЕМАР II до 600С бйлок денатуруе, що може впливати на змйну оточення триптофану у складй ЕМАР II. При пйдвищеннй температури вйд 25 до 60оС в цитокйнй ЕМАР II спостерйгаеться
18,3 ->
ДО СЛ1ДЖЕННЯ ВЗАЕМОДН ЦИТО К1НА ЕМАР II З БЕТА-ЦИКЛО ДЕКСТРИНОМ ТА Г1ДРО КСИПРОПИЛ-БЕТА-Ц ИКЛОДЕКС ТРИНОМ ПРИ ШДВИЩЕНШ ТЕМПЕРАТУРИ
локальний конформацййний перехйд, пов'язаний з експонуванням залишка Тгр128 на поверхнй бйлка.
При дослйдженй впливу Р-циклодекстрину на стабйльнйсть бйлковой' глобули встановлено, що максимум емйсйй' флуоресценвд ЕМАР II зсуваеться до 336 нм при пйдвищеннй температури до 60оС. Це свйдчить про блокування локального конформацййного переходу та стабйлйзацйю бйлковой' глобули.
При дослйдженй впливу гйдроксипропил-Р-циклодекстрину на стабтьнють бйлковой' глобули встановлено, що максимум емюи флуоресценвд ЕМАР II зсуваеться до 334 нм при пйдвищеннй температури до 60оС. Це, свйдчить про блокування локального конформацййного переходу та стабйлйзацйю бйлковой' глобули, як й в випадку з Р-циклодекстрином.
■ -М41М
с ,:МЛГ Щ -1Д
I) А ■мл I1- 1ч п-г: ,1
И-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1
'■:■'! :■"'■■') МО М Зч" ЗМ1' -1.-Д-.
Л1г|1;ьим.1.-:имГ'и> 11 '.1
Ж -
510
Л ..*-
Т-1-1-
;; и
""-1-1-1-1-г
1Е 5"
I ¿м т.ти I урн,' (":
Рис.3. Спекгри флуоресценцп ЕМАР II при Рис. 4. Зсу в максимуму (^оресценцпЕМАР II при пщвищенш температури.
пщвищенш температур. ЕМАР II розчинений у 50 мМ натрий-фосфатному, 150 мМ №С1, рН 7,5.
Рис. 5 Аналйз експонованостй залишку триптофану 128 у складй бйлка ЕМАР II.
При дослйдженй впливу гйдроксипропил-Р-циклодекстрину на стабйльнйсть бйлковой' глобули встановлено, що максимум емюи флуоресценвд ЕМАР II зсуваеться до 334 нм при пвдвищенш температури до 60оС. Це, свйдчить про блокування локального конформащйного переходу та
стабйлйзацйю бйлковой' глобули, як й в випадку з Р-циклодекстрином.
Проведений аналйз експонованост! ароматичих амйнокислотних залишкйв в структурй рекомбйнантного цигокйну ЕМАР II показав, що бйлок мйстить у своему складй шйсть ароматичних амйнокислот:Тгр128, Туг32, Phe110, Туг145, РЬе113, Phe150.
Залишок Тгр128 е частково експонованим, однак цей залишок знаходиться у кйшенй, бйля активного центру протейну (рис.5). За лйтературними даними вйдомо, що
циклодекстрини в першу чергу зв'язуються з ароматичними амйнокислотними залишками, тому саме Тгр128 е вйрогйдним сайтом зв'язування з Р- та гйдроксипропиг-Р-циклодекстрином.
ВИСНОВКИ
При пйдвищеннй температури вйд 25 до 60оС в цигокйнй ЕМАР II спостерйгаеться локальний конформацйний перехйд, пов'язаний з експонуванням залишка Тгр128 на поверхнй бйлка.
При взаемодйй' ЕМАР II з гйдроксипропил-Р-циклодекстрином спостерйгаеться блокування локального конформацййного переходу й стабйлйзацйю бйлковой' глобули, як й в випадку з Р-циклодекстрином.
Малина А.Е., Ложко Д.М., КозловО.В., КорнелюкО.1.
Л^ература
1. KaoJ., Rayan J., Brett G., Chen J., Shen H., Fan Y., GodmanG., Familetti P. C., Wang F., Pan Y.E., Stern D., ClaussM. Endothelial monocyte-activating polypeptide II. A novel tumor-derived polypeptide that activates host-response mechanisms // J. Biol. Chem. - 1992. -267. - P.20239-20247.
2. TasM.P., Murray J.C. Endothelial monocyte-activating polypeptide II // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 1996. -28. - P.837-841.
3. Reznikov A.G., Chaykovskaya L.V., Polyakova L.I., Kornelyuk A.I. Antitumor effect of endothelial monocyte-activating polypeptide-II on human prostate adenocarcinoma in mouse xenograft model // Exper. Oncol. - 2007. - 29. - №4. - P.267-271.
4. Возианов А.Ф., Резников А.Г., Корнелюк А.И., Романенко А.М., Чайковская Л.В., Полякова Л.И., Григоренко В.Н. Влияние препаратов рекомбинантного белка ЕМАР II на рост,
гистологические и гистохимические характеристики гетеротрансплантатов рака простаты человека // Коротю повщомлення. - 2008. - Т.14. № 4. - С.719-729.
5. Клочков С.В., Компанцева Е.В., Бердник Е.Н., Ботезат-Белiй Ю.К., Бабилев Ф.В. Исследование клатрообразования ß-циклодекстрина с метапрогеролом // Хим.-фарм. Журнал. -1991. -Т. 25. - № 11. - С.67-69.
6. Беликов В.Г., Компанцева Е.В.,Гаврилин М.В., Умнова Э.Ф. Использование возможности бета-циклодекстрина для совершенствования процесса получения преднизалона // Хим.-фарм. Журнал. — 1991. № 2. - С.48-49.
7. Бабенко Л А., Скоробогатов О.Ю., Дубровський О. Л., Корнелюк О. I. Оптимгзащя бактерiальноï експресп протипухлинного цитоюна ЕМАР II в клтинах Esherichia coli BL21(DE3)pLysE // Мжробюлопя i бютехнолопя. - 2010. - № 3. - C. 21-31.
INTERACTION OF CYTOKINE EMAP II WITH BETA-CYCLODEXTRIN AND HYDROXYPROPYL-BETA-CYCLODEXTRIN AT INCREASING TEMPERATURE
Malyna A., Lozhko D., Kozlov O., Kornelyuk O.
EMAP II -endothelial monocyte-activating polypeptide II, which is a predecessor of protein AIMP1/P43 - a component of a high molecular complex of aminoacyl-tRNA synthetases of higher eukaryotes. ß-Cyclodextrin - oligomer of a-D-glucose residues, intensively used in production of drugs as an auxiliary agent capable of reducing the level of aggregation of the protein components that increase resistance to proteolytic enzymes, blood and increase solubility. In this paper we investigate the interaction of EMAP II with ß-cyclodextrin and with hydroxypropyl-ß-cyclodextrin as the temperature rises.
Key words: EMAP II, ß-cyclodextrin, hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, spectroscopy.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЦИТОКИНА ЕМАР II С БЕТА-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ И ГВДРОКСИПРОПИЛ-БЕТА-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ ПРИ ПОВЫШЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ
Малина А.Э., Ложко Д.Н., Котлов А.В., Корнелюк А.И.
ЕМАР II - эндотелиальный и моноцит-активирующий полипептид II, предшественником которого является белок AIMP1/р43 - компонент высокомолекулярного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз высших эукариот. В фармакологической практике на сегодняшний день широко применяют ß-циклодекстрин. ß-циклодекстрин - олигомер остатков a-D-глюкозы, интенсивно используется при производстве лекарственных препаратов в качестве вспомогательного агента, способного снизить уровень агрегации белковой компоненты, повысить ее устойчивость к действию протеолитических ферментов крови / желудочно-кишечного тракта и увеличить ее растворимость. В данной работе исследовано взаимодействие ЕМАР II с ß-циклодекстрином и гидроксипропил^-циклодекстрин при повышении температуры.
Ключевые слова: ЕМАР II, ß-циклодекстрин, гидроксипропил^-циклодекстрин, спектроскопия.
