Оптимизация бактериальных питательных сред экстрактом Ungernia victoris Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

BIOTECHNOLOGY

VOL. 4, N4, 2ÖH

BIMONTHLY

Редакцшна колегiя

Комiсаренко С. В. (головний редактор) Стойка Р. С.

(заст. головного редактора) Колибо Д. В.

(заст. головного редактора)

Виноградова О. С.

(вЬдповЬдальний секретар)

Гончар М. В.

Дзядевич С. В.

Дробот Л. Б.

Карпов О. В.

Кунах В. А.

Кучук М. В.

Левицький С. Л.

Лукаш Л. Л.

Матишевська О. П.

Мельничук М. Д.

Мшченко О. Г.

Сандомирський Б. П.

Солдаткш О. П.

Товкач Ф. I.

Фшоненко В. В.

Адреса редакцп:

Редакщя журналу «Бютехнолопя», вул. Леонтовича, 9, 01601, Кшв, Украша Телефон: (044) 235-14-72; E-mail: [email protected]

Свiдоцтво про державну реестращю друкованого засобу масовоъ тформаци

серiя КВ №10391 eid 14.09.2005

Постановою Президи ВАК Украши вщ 27.05.2009 №1-05/2 журнал внесено до Перелшу наукових фахових видань для публшаци матерiалiв дисертацшних робгг за спещальностями «Бiохiмiя» та «Бютехноло^я»

Науковий редактор G. Л. Левицький Комп'ютерний набiр Л. П. Бабенко

Лггературний редактор Г. М. Шевченко Комп'ютерна верстка О. В. Мележик

Подписано до друку 23.08.2011. Формат 210x297. Пашр крейд. 115 г/м2. Гарн. SchoolBookC. Друк — цифровий. Обл.-вид. арк.11,86. Наклад 200 прим. Замовлення 4/6. Оригiнал-макет подготовлено в Iнститутi бiохiмii iм. О.В. Палладша НАН Украши;

друк — фОп Шамарiн О.М.

Редакцшна рада

Комiсаренко С. В. (голова) Блюм Я. Б. Сгоров О. М. (Ро^я) Сльська Г. В. Кордюм В. А. Кухар В. П.

Мiрошников А. 1.(РоС.я) Пастернак Ч. (Великобританiя) Шдгорський В. С. Северин С. С. (Ротя) Сибiрний А. А. Сидоров В. А. (США) Скрябш К. Г. (Ротя) Созiнов О. О. Широбоков В. П.

НАЦ1ОНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ

1НСТИТУТ БЮХ1МП iм. О. В. ПАЛЛАД1НА

Б1ОТЕХНОЛОГ1Я

Науковий журнал

Виходить один раз на два мЬсяцЬ

БИОТЕХНОЛОГИЯ / БЮТЕСН^ЬООУ

Том 4, №4, 2011

ОГЛЯДИ

Демченко О. П. Канюк М. I.

Шатурський О. Я.

ЗМ1СТ

Кластери з декшькох атомiв срiбла у флуоресцентних сенсорних технологах

Закономiрностi утворення i функцiонування iонпровiдних каналiв цитолiтичних проте!шв при реконструкци у штучних лшвдних бiшарах

.20

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬН1 СТАТТ1

Туров В. В. БарвЬнченко В. М. Крупська Т. В. Гунько В. М. Чехун В. Ф.

1скра Р. Я. Гончар М. В. Нечай Г. I. Максимович I. Я.

Гщратш властивоста композитного матерiалу на основi високодисперсного кремнезему та ДНК .

. .34

Метаболiчнi показники кровi поросят за умов згодовування !м культурально! рщини дрiжджiв Басскаготусев сегеиЬвЬае, яка метить бiокомплекси хрому.......................................50

Перерва Т. П. Мирюта Г. Ю. Дворник А. С. Можилевська Л. П. Кунах В. А.

Оптимiзацiя бактерiальних живильних середовищ екстрактом иицегта иШопв....................59

9

© 1нститут б1ох1мИ 1м. О. В. Палладша НАН Укра!ни, 2008

Коршун Л. М.

Мойса Л. М. Суперсинтез розчинного протешу — продукту

Ковтонюк Г. В. експреси гена, що метить iмунодомiнантнi

Ганова Л. О. дшянки глшопротешу G вiрусу герпесу 2-го типу,

Кисельова О. К. у бактершнш системi Escherichia coli............64

СпЬвак М. Я.

Слета I. В.

Чиж М. О. Моделювання некрозу мюкарда

Гальченко С. G. за допомогою крютехнологи ...................73

Сандомирський Б. П.

Шульга С. М.

ТЬгунова О. О. _ . ,...........

m л Вплив лiофiлiзацil на життeздатнiсть

Ткаченко А. Ф. . . , . ,

„ „ __ „ дрiжджiв Pichia anomala......................80

Бейко Н. G.

Хоменко А. I.

Сергеева Л. €. Вм^т вшьного пролшу як показник життeдiяльностi

Броншкова Л. I. клггинно! культури Nicotiana tabacum L.

Тищенко О. М. тд час стресу................................87

Полщук Г. G.

Гулак О. В. Мшробюлопчш показники рослинних екстрактав

Згурський А. В. для виробництва морозива.....................95

Антонюк М. М.

КОРОТК1 ПОВ1ДОМЛЕННЯ Жуковський Ю. Г.

Жуковська В. А. „ . ...-

К^зн, ова Л П Спотб щентифшаци бутирилхолшестерази

тт- • • z^n iз сироватки кровi коня......................101

Нгттша О. Р. ^ ^

Сочилта О. О. РЕЦЕНЗП

Рецензiя на книгу «Advanced Fluorescence Reporters

„ n „ in Chemistry and Biology III» за редакщею

Пивоваренко В. Г. „ „ „ . 0 . „

^ О. П. Демченка (Springer Series of Fluorescence,

V. 10, Springer, 2011)........................105

НОВИНИ ........................................................107

НОВ1 ПУБЛ1КАЦП З БЮТЕХНОЛОГП

ТА СУМ1ЖНИХ ДИСЦИПЛ1Н....................................125

КОНФЕРЕНЦИЙ З'1ЗДИ, СИМПОЗ1УМИ, ВИСТАВКИ.............133

Доповнення до Правил для авторЬв...................................147

ОБЗОРЫ

Демченко А. П. Канюк М. И.

СОДЕРЖАНИЕ

Кластеры из нескольких атомов серебра во флуоресцентных сенсорных технологиях

.9

Шатурский О. Я.

Закономерности образования и функционирования ионпроводящих каналов цитолитических протеинов при реконструкции в искусственных липидных бислоях............................20

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Туров В. В. Барвинченко В. Н. Крупская Т. В. Гунько В. М. Чехун В. Ф.

Гидратные свойства композитного материала на основе высокодисперсного кремнезема и ДНК

.34

Искра Р. Я. Гончар М. В. Нечай Г. И. Максимович И. Я.

Метаболические показатели крови поросят при скармливании им культуральной жидкости дрожжей Басскаготусев сегеи1в1ае, содержащей биокомплексы хрома ...........

50

Перерва Т. П. Мирюта А. Ю. Дворник А. С. Можилевская Л. П. Кунах В. А.

Оптимизация бактериальных питательных сред экстрактом Ungernia victoris....................59

Коршун Л. Н. Мойса Л. Н. Ковтонюк Г. В. Ганова Л. А. Киселева Е. К. Спивак Н. Я.

Суперсинтез растворимого протеина — продукта экспрессии гена, содержащего иммунодоминантные участки гликопротеина G вируса герпеса 2-го типа, в бактериальной системе Escherichia coli..........64

Слета И. В. Чиж Н. А. Гальченко С. Е. Сандомирский Б. П.

Моделирование некроза миокарда с помощью криотехнологии......

73

Шульга С. М. Тигунова Е. А. Ткаченко А. Ф. Бейко Н. Е. Хоменко А. И.

Влияние лиофилизации на жизнеспособность дрожжей Pichia anómala..................

.80

Сергеева Л. Е. Бронникова Л. И. Тищенко Е. Н.

Полищук Г. Е. Гулак Е. В. Згурский А. В. Антонюк М. Н.

Содержание свободного пролина как показатель жизнедеятельности клеточной культуры ЫЬсоЫапа 1аЬасит L. при стрессе.............

.87

Микробиологические показатели растительных экстрактов для производства мороженого ..........................

.95

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

Жуковский Ю. Г. Жуковская В. А. Кузнецова Л. П. Никитина Е. Р. Сочилина Е. Е.

Способ идентификации бутирилхолинэстеразы из сыворотки крови лошади................

.101

РЕЦЕНЗИИ

Рецензия на книгу «Advanced Fluorescence

„ „ „ Reporters in Chemistry and Biology III»

Пивоваренко В. Г. „дттт; ,о • о-

^ под редакцией А. П. Демченко (Springer Series

of Fluorescence, V. 10, Springer, 2011)..........105

НОВОСТИ........................................................107

НОВЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО БИОТЕХНОЛОГИИ

И СМЕЖНЫМ ДИСЦИПЛИНАМ .................................125

КОНФЕРЕНЦИИ, СЪЕЗДЫ, СИМПОЗИУМЫ, ВЫСТАВКИ .......133

Дополнения к Правилам для авторов 147

CONTENTS

REVIEWS

Demchenko O. P. Kanyuk M. I.

Clusters from a few silver atoms in fluorescent sensory technologies ..................................9

Shatursky O. Ya.

The channel formation and functioning regularities for cytotoxic pore-forming proteins

at the reconstruction into artificial lipid bilayers . . . .20

EXPERIMENTAL ARTICLES

Turov V. V. Barvinchenko V. M. Krupska T. V. Gun'ko V. M. Chekhun V. F.

Iskra R. Ya. Gonchar M. V. Nechay H. I. Maksymovych I. Ya.

Pererva T. P. Miryuta A. Yu. Dvornik A. S. Mozhylevskaya L. P. Kunakh V. A.

Korshun L. M. Moysa L. M. Kovtonjuk G. V. Ganova L. O. Kiselyova O. K. Spivak M. J.

Sleta I. V. Chizh N. A. Galchenko S. Ye. Sandomirsky B. P.

Hydrated properties of composite material based on nanosilica and DNA ....................

.34

Metabolic indices of pigs blood at feeding of cultural liquid of the yeast Saccharomyces cerevisiae containing chromium biocomplexes ...............50

Optimization of bacterial nutrient media by Ungernia victoris extract ..........

.59

Supersyntes of product gene expression soluble protein, which includes immunodominant regions of glycoprotein G herpes simplex virus type 2 in the bacterial Escherichia coli system ............64

Myocardium necrosis modeling by criotecnology using ......

.73

Shulga S. M. Tigunova O. O. Tkachenko A. F. Beyko N. E. Khomenko A. I.

Sergeeva L. E. Bronnikova L. I. Tishchenko E. N.

Polischuk G. E. Gulak O. V. Zgurskiy A. V. Antonyuk M. M.

Lyophilization effect to Pichia anómala yeasts viability...................

.80

The free proline content as the viability index of Nicotiana tabacum L. cell culture under stress conditions..................................87

Microbiological characteristics of plant extracts

for ice cream production.......................95

SHORT MESSAGE

Zhukovskii Yu. G. Zhukovskaya V. A. Kuznetsova L. P. Nikitina O. R. Sochilina O. O.

The method for identification of horse serum butyrylcholinesterase...................

.101

REVIEWS

Review on the book «Advanced Fluorescence

Pivovarenko V G Reporters in Chemistry and Biology III»

* * Volume Editor A. P. Demchenko (Springer Series

of Fluorescence, V. 10, Springer, 2011)..........105

NEWS ...........................................................107

NEW PUBLICATIONS ON BIOTECHNOLOGY

AND ADJOINING BRANCHES OF SCIENCE.......................125

CONFERENCES, CONGRESSES, SYMPOSIA, EXHIBITIONS......133

Amendments to Author rules.....................................147

УДК 577 (087.1 + 112.4)

ОГЛЯДИ

КЛАСТЕРЫ З ДЕК1ЛЬКОХ АТОМ1В СР1БЛА У ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ СЕНСОРНЫХ ТЕХНОЛОГ1ЯХ

О. П. ДЕМЧЕНКО, М. I. КАНЮК 1нститут бюх1мп iM. О. В. Палладша НАН Украши, Ки'в E-mail: [email protected]; [email protected]

Кластеры з дешлькох атом1в ср1бла мають уншальш оптичш властивост1, що дозволяе розгляда-ти ix як ефективну замшу оргашчним барвникам у р1зних флуоресцентных сенсорных технолопях. Описано ixнi властивост1 i приклади застосування, техшку створення i стаб1л1зацй за допомогою р1зних високомолекулярних та низькомолекулярних матриць. Зокрема, дуже простими е методи одержання кластерiв iз використанням xiмiчниx вiдновникiв, а також вщновлення пiд дiею свггла.

Продемонстровано застосування кластерiв срiбла для мiчення ДНК та створення ДНК-сенсорiв на основi ix гiбридизацii з наступним детектуванням флуоресценцй кластерiв. Надзвичайно швидко роз-виваються iншi перспективш напрями, зокрема детектування iонiв та мiчення живих клiтин, як у плаш фундаментальних дослiджень, так i з огляду на широкi можливоси практичного застосування.

Ключовi слова: флуоресценщя, кластери атомiв срiбла, сенсорнi технологи.

У бюсенсорних та сенсорних технолопях тривае пошук метод1в з якомога ширшим колом застосування i з найвищою абсолютною чутлив1стю. Йде невпинне вдосконалення методу, який найб1льшою м1рою в1дпов1дае цим вимогам, — методу флуоресценцй. В минул1 часи його розвиток та впровадження були пов'язаш з орган1чними барвниками. Чималий наб1р цих барвник1в з р1зними спектроскоп1чними параметрами i практично невичерпними можливостями ковалентно' модифшацп та функщонал1зацп в б1олог1ч-них системах забезпечили широке застосу-вання 'х у молекулярних та клш1чних досль дженнях. Проте виявились i ''хш суттев1 недол1ки, передуйм низька фотох1м1чна стшшсть, тобто здатн1сть до вицв1тання (фо-тодеградацп). 1снують принципов1 обмежен-ня й щодо 'хньо'' яскравост1, часу випромь нювання тощо.

В останн1й час дослщники звернули ува-гу на уншальш спектроскоп1чн1 властивост кластер1в ср1бла, що складаються з дешль-кох атом1в — Agn, де n = 2- 8 [1, 2]. Маючи оптичш характеристики, под1бш до ор-ган1чних барвник1в, вони перевершують ''х за величиною молярного поглинання та фо-тостаб1льн1стю [3]. Водночас кластери значно менш1 за розм1ром пор1вняно з нашвпровщ-

никовими наноматер1алами (квантовими точками), як1 токсичш на р1вн1 кл1тини та оргашзму. В1дсутн1сть цих недол1к1в у поед-нанн1 з1 значними перевагами в оптичних властивостях (таблиця) робить кластери ср1бла г1дними уваги в р1зномаштних сферах застосування. Щкав1 та обнад1йлив1 ре-зультати одержано на р1вш одиничних молекул для розвитку молекулярно-оптичних i електронних пристро'в майбутнього [4]. Багатообщяльним е ''х використання в молекулярних сенсорах та бюсенсорах [5-7], а також у бюлогп клггини [8, 9]. Обговорен-ню цих питань присвячено цей огляд.

Властивостi ^acTepiB срiбла

Кластери з к1лькох (2-8) атом1в ср1бла мають ун1кальн1 властивость Це структури розм1ром менше 0,5 нм. 1хш властивост принципово в1др1зняються в1д добре вивче-них больших за розм1ром наночастинок ср1бла. Для останшх е характерним плаз-монне поглинання та розйювання [10]. Ло-кал1зован1 плазмони — це одночасш коли-вання електрон1в, що виникають унаслщок просторового обмеження ''х руху в наночас-тинках (деяких) метал1в. Оск1льки ''хшй розм1р значно менший, шж довжина хвил1

Порiвняльнi властивоси кластерiв срiбла, органiчних барвнишв та квантових точок

Властивосй Кластери ср1бла Орган1чн1 барвники Квантов1точки

Розмiр (нм) ~0,5 0,5-2 10-20

Молярна екстинщя (М-1 см-1) ~105 103-105 ~107

Час життя флуоресценцп (нс) 0,5-5 3-5 10-20

Сгоксiв зсув (нм) До 100 10-60 ~15

Чутлив^ть спекгрiв до оточення Помiрна Рiзна, часом значна Вiдсугня

Фогосгабiльнiсгь Сгабiльнi Вицв^ають Сгабiльнi

Токсичшсть Вщсутня Рiзна Потенцшно значна

св1тла, то виникають коливання густини електрон1в з частотою св1тла. Спектри екстин-цп м1стять значну компоненту розйювання, а також тк плазмонного резонансного по-глинання при 380-410 нм. Так1 частинки практично не випром1нюють свггла. 1хш властивост1 зазнають 1стотних змш з1 змен-шенням розм1ру до шлькох атом1в (рис. 1).

Змшюються спектральн1 характеристики кластер1в, передуйм зникае 1х плазмонне поглинання, осшльки колективних коли-вань електрон1в уже не 1снуе. Водночас виникають нов1 смуги поглинання у видимш та ближн1й ультраф1олетов1й (УФ) област завдяки зб1льшенню в1дстан1 м1ж енерге-тичними р1внями. Кластери ср1бла стають потужними випром1нювачами флуоресцен-ц11, 1 це випромшювання нагадуе флуорес-ценщю орган1чних молекул. Так1 зм1ни вщ-буваються тому, що в кластерах атом1в металу електрони вже не делокал1зоваш

й для них характерш дискретн1 електронн1 стани 1 електронш переходи м1ж цими станами. Щ електронн1 переходи в1дпов1дають енергп поглинання та випромшювання св1тла у видимш област спектра саме так, як 1 в орга-шчних барвник1в. Характерною м1рою роз-м1ру тут е Ферм1-довжина хвил1 електрона (довжина де Бройля електрона з енерпею Ферм1). Для ср1бла вона становить ~0,5 нм. Ф1зику цих процейв активно вивчають. Одна з моделей, запропонованих для Аgn, полягае в тому, що поглинання фотона переводить електрон з р1вня й до порожнього р1вня эр, вищого за енерг1ю в1д р1вня Фермь П1сля втрати енергп через релаксацп (механ1зм яких дос1 нев1домий) рекомбшащя електрона та «д1рки» призводить до випромшювання св1тла. Для електронних переход1в характерна значна сила осцилятора (що визначае ефектившсть поглинання св1тла) 1 високий квантовий вих1д випромшювання.

Металев1 атоми

Одновалент- Металев1 кластери ний електрон Дискретш р1вш матери

Металев1 наночастинки Локал1зований плазусний резонанс

4-

— ■

в

Суцшьний метал Вшьний рух електрошв

Г

Рис. 1. Властивоси матерiалiв срiбла залежно вiд 1хнього розмiру.

Зменшення розм1ру в1д наночасгинок до кластер1в з к1лькох агомiв призводить до радикальних зм1н ф1зичних власгивосгей

Досл1дження оптичних властивостей кластер1в ср1бла мають довгу 1стор1ю як в плат наукових дослщжень, так 1 розроб-лення та вдосконалення матер1ал1в для фотографа [11]. Дослщження в кр1огенних матрицях благородних газ1в (аргон, криптон) показали, що нав1ть двох атом1в дос-татньо для спостереження «молекулярного типу» випромшювання з часом життя в к1лька наносекунд [12]. Так, для кластер1в Аg2 характерн1 смуги поглинання при 384 нм 1 ем1сп — 479 нм. Для кластер1в Аg3 в спектрах збудження спостер1гаються в1дносно вузьк1 максимуми за 321, 386 та 492 нм, а в спектрах випромшювання — дв1 основш смуги за 374 та 622 нм, що вщсутш в спектрах димер1в. Що стосуеться кластер1в з б1ль-шим числом атом1в, то !хш властивост вивчено менше, 1 не 1снуе едино'! думки до-сл1дник1в щодо класифшацп !хтх спектр1в [13]. Проте простежуеться загальна тенден-ц1я зсуву спектр1в поглинання 1 випромшю-вання до великих довжин хвил1 з1 зб1льшен-ням числа атом1в Аg.

Створення та стабш1защя кластер1в

Наведен1 вище дан1 сл1д в1днести до перед-1сторп технолог1чних та, зокрема, бютехно-лог1чних застосувань. Справжня 1стор1я розпочалася тод1, коли було показано мож-лив1сть створення та стабШзацп Аgn-клас-тер1в за к1мнатних температур у водних роз-чинах дендритних пол1мер1в [14] 1 молекул ДНК [15-17], як1 правили за матриц1, тобто це молекули, як1 стаб1л1зують кластери 1 за-поб1гають росту !х до наночастинок.

Одержувати кластери ср1бла дуже просто. Увесь процес складаеться з одного етапу й не потребуе значних витрат часу чи кош-т1в. Тут 1снуе дек1лька метод1в з використан-ням розчинних солей ср1бла, зокрема Аg+NO3-. Досл1дник мае широкий наб1р ме-хан1зм1в в1дновлення 1он1в до атом1в, зокрема застосування х1м1чних в1дновлювач1в [17], фотов1дновлення [18, 19], радюлггичне [20] 1 нав1ть ультразвукове [21] вщновлення. Вщновлення тд д1ею св1тла в1дбуваеться за допомогою утворених у розчиннику фото-електрон1в 1 дозволяе контролювати процес у простор1 й чай, що дае значн1 переваги в бютехнолопчних застосуваннях.

Таким чином, складшсть в одержанш кластер1в полягае в застосуванш спещаль-них матриць, як1 обмежують розм1ри клас-тер1в ср1бла (Аg2-8), утримують, стабШзу-ють, а пот1м не дають !м можливост1 рости дал1 до наночастинок. Тому без матриць не-

можливо створити стаб1льш кластери. Такими матрицями можуть слугувати пол1мерн молекули, що м1стять багат1 на електрони атоми с1рки, азоту й кисню. Саме п1д час взаемодп з ними вщбуваеться стаб1л1зац1я кластер1в. На додаток до використаних вперше пол1ам1доамшових (ПАМАМ) денд-ример1в [14] 1 однонитчастих сегментав ДНК (ввДНК) [15-17] було запропоновано засто-совувати шш1 пол1мери, наприклад пол1ак-рилову [22] та пол1метакрилову [23] кислоти.

Низькомолекулярш речовини також можна використовувати як матриць Зокрема, це показано для барвника тюфлавшу Т [24], похщних тюл1в [5, 25, 26] та амш1в [19]. Для р1зних б1отехнолог1й е дуже щка-вим застосування пептид1в [27, 28] 1 проте'!-н1в [29].

Мехашзм взаемодп кластер1в з матрицею

Багато автор1в стверджують, що за наяв-ност1 певного типу стаб1л1затор1в та матриць утворюються кластери лише певного типу. Зокрема, з1 зб1льшенням часу опромшення спостер1гаеться зб1льшення 1нтенсивност1 поглинання та флуоресценцй в певних сму-гах, але не поява нових смуг (рис. 2). Щ спостереження дуже зручш та надшш, оск1ль-ки ан1 вих1дн1 1они ср1бла, ан1 наночастинки б1льшого розм1ру не флуоресщюють. Ус1 ма-тер1али, як1 мають здатн1сть стаб1л1зувати кластери, м1стять атоми с1рки, азоту та кисню, що вщом1 як атоми, багат1 на електрони 1 здатш бути 1хн1ми донорами в комплексах з перенесенням заряду [30]. Так1 центри ут-ворення кластер1в е в дендримерах [14], пептидах [28], протешах [29] та нуклешових кислотах [3, 31].

Варто вщзначити, що кластери утворю-ються п1д час взаемодИ з основами ДНК, а не 1з сахаридно-фосфатним остовом, як можна було б очшувати у раз1 первинно'! електро-статично'! взаемодИ з юнами ср1бла. Важли-во, що саме одноланцюгов1 сегменти ДНК е найкращими центрами утворення класте-р1в, 1 простежуються дуже р1зш спектроско-тчш ефекти при зв'язуванн1 з р1зними основами [15], зокрема значна р1зниця в кольор1 флуоресценцИ (рис. 3). Так1 незвичайн1 влас-тивоста привернули увагу теоретик1в [32]. Вони можуть бути корисними 1 в практичному плат, адже це уможливлюе щентифшу-вання однонуклеотидних мутацш [33].

Щкаво, що спостер1гаеться вщносно по-тужна флуоресценц1я кластер1в, утворених у водних розчинах, тобто в умовах, коли мае вщбуватися 11 гасшня за в1домим механ1змом

я ю а о о

ю <

25

20 4 ■

15 /А\ ■

10 05 /л\\ ■

■

с ч. '--

00 -„а...

400 500 600 700 800

Б

Довжина хвилi

Сгоксiв зсув — 100 нм

я н

ф я

о

и

а

о

^

л

в л

Ен О

ч—I

н в и

О

н

(В Ен

н

300 250 200 150 100 50 0

400 500 600 700 800 900

Довжина хвилi

Рис. 2. Спектри поглинання (А) та флуоресценцп (Б) водного розчину ПМАА (полiметакрилова кислота) i AgNO3 за рiзного часу опромiнювання довжиною хвилi 365 нм (у хв):

а — 0; Ь — 5; с — 10; й — 20; е — 40; / — 60; д — 90. Крива к у Б — спектр збудження, що ввдповвдае флуоресценцп при 620 нм [23]

100.

0.76

^ а

^ я 'Й™ т

¡^э.Я

300 350 4Й0 450 500 5&0 600 6^0 700

Довжина хвил1, нм

0.00

В

иоа.

§'§>.75-

т а

§1

цЦ»-»'

125-

Г

300 350460 4£0 6Й0 550 600 <Й0 700 7&0 8бо

Довжина хвил1, нм

Д

«Н—..............—'—1

360 400 490 500 560 КО ©5 700 750

Довжина хвил1, нм

13Я0.75

.а я

Я ^ и ^

0.50

-с ч

«©0.25

450 500 550 600 в» 700 750

Довжина хвил1, нм

0.00

Е

500 560 бЙО 650 700 750 ЯЙО ¡¿0 900

Довжина хвил1, нм

Рис. 3. Спектри поглинання i флуоресценцп для рiзних послiдовностей ввДНК,

що включають кластери срiбла:

А — кластери iз синiм випромiнюванням, створен на 5'-СССТТТААСССС-3'; Б — кластери iз зеленим випромiнюванням, сгворенi на 5'-СССТСТТААССС-3/; В — кластери з жовтим випромшюванням, сгворенi на 5'-СССТТААТСССС-3'; Г — кластери з червоним випромшюванням, створеш на 5'-ССТССТТССТСС-3'; Д — кластери з ближшм 1Ч-випромшюванням, сгворенi на 5'-СССТААСТСССС-3'; Е — фото випромшю-вальних розчинiв, що ввдповщають А-Г [15]

перенесення електрона на розчинник. Це свiдчить про екранування кластерiв вiд водного оточення. 1они срiбла е вщомими гайя-ми флуоресценцП, але наявшсть 1х у процес фотовiдновлення не впливае на флуоресцен-цiю вже утворених кластерiв. Вiдносно слаб-ка залежшсть спектрiв кластерiв, утворених на полiмерних носiях вiд розчинника (див. нижче), е ще одним свщченням цього. Та-

ким чином, взаемодiя кластера з матрицею мае бути основним чинником, що визначае спектроскотчш властивость

Найхарактершшою з цих властивостей е значний Стокйв зсув (зсув мiж спектрами поглинання i випромшювання), що досягае 2500-2700 см-1, тобто порядку 100 нм (рис. 2). Природа цього зсуву наразi невщома. Проте е тдстави вважати, що п природа пов'язана

1з взаемод1ею кластер1в 31 сво1м оточенням, а саме з утворенням комплекйв з перенесен-ням заряду в основному стань Сус1дш атоми с1рки, азоту чи кисню можуть переносити частково електронний заряд на кластери, як1 е його акцепторами, а утворення таких комплекйв припиняе подальший р1ст клас-тер1в до наночастинок.

Матриц з олiгонуклеотидiв.

Структурш та спектральнi вiдмiнностi

Найб1льш вивченими е кластери, створеш на основ1 ввДНК. Досл1дники, як1 викорис-товують ол1гонуклеотиди як матриц1 для кластер1в, пом1тили суттеву р1зницю в спектрах поглинання та флуоресценцп залежно в1д гетероцикл1чних основ нуклеотид1в, що видно з пор1вняння 12-членних ол1гонуклео-тидних матриць [15]. Для послщовностей, як1 складаються з основ А, С та G, спостерь гаються значн1 спектральн1 в1дм1нност1 в1д основи Т, що можна пояснити в термшах р1зно'1 стаб1льност1 комплекйв з перенесен-ням заряду. Як вважають, вона корелюе з1 спектроскоп1чними властивостями, 1 для ос-нови Т щ комплекси значно слабшь У цьому раз1 флуоресценц1я спостер1гаеться в синш д1лянц1 спектру, а в шших — значно змще-на в д1лянку великих довжин хвиль. Шдбо-ром коротких посл1довностей ввДНК можна вар1ювати кол1р флуоресценцп в широких межах (рис. 3). За вщсутноста прямих даних про розм1р кластер1в ще не з'ясовано, чи ця р1зниця може бути спричинена не тальки р1з-ною взаемод1ею з атомами оточення, а ще й вщ-м1нностями в розм1р1 та структур1 кластер1в.

Непрямим свщченням того, що розм1р

кластера вщпрае дуже важливу роль у спект-роскоп1чних властивостях, е досл1дження з ДНК-шпильками (рис. 4), як1 е штучними ол1гомерними молекулами. Вони складаються в структуру, в якш утворюеться дво-ланцюговий сегмент — «хв1ст» та однолан-цюгова «гол1вка». У даному випадку було синтезовано наб1р молекул типу 5'-ТАТС-CGT-Cn-ACGGATA-3/, де 7 пар основ утво-рювали «хв1ст», а посл1довн1сть з 3 до 12 ци-тозишв (-Сп-) — «гол1вки» р1зного розм1ру [34]. 1нкубац1я в розчин1 з AgNO3 в присут-ност1 вщновника NaBH4 призводила до утворення кластер1в, 1ммоб1л1зованих на «гол1в-ках». Як видно з рис. 4, в ус1х випадках за винятком С3 одночасно спостер1гаються два типи кластер1в з в1дм1нними властивостями, а пор1вняння шпильок з р1зною довжи-ною «гол1вок» дало змогу щентифшувати кластери чотирьох тип1в.

Така специфша зв'язування Аgn-клас-тер1в 1з ввДНК 1 залежн1сть спектр1в флуоресценцп в1д виду та послщовноста 11 основ стимулювала розробку нових та модифша-ц1ю 1снуючих аналггичних метод1в. Так, сенсорна посл1довн1сть ДНК 1з включенням ол1гоцитозиново1 петл1 може пбридизувати-ся з ланцюгом ДНК, який розтзнаеться (рис. 5), а сформований дуплекс слугувати-ме матрицею для утворення кластера ср1бла [33]. Флуоресценщя цього кластера може давати шформащю, що дозволяе селективно 1дентиф1кувати типову однонуклеотидну мутащю, зокрема серпопод1бно-кл1тинну анем1ю (рис. 6). Це св1дчить про можлив1сть широкого застосування даного явища в методах, як1 базуються на пбридизацп ДНК.

А г Б С С С с с с » I « Т»А А «Т Т*А 400 зс 138 X 4С ,39х 10.9 X 5С 33 9 ^ ) 72 Ж 60 «м 70 100.0^-,

8С 35вх { ,3.0 х 9С 377х 32 7 <ш 10С «И£ м X - - 11С 26 5- 12С зе 3. 48 2 * 1 '"С! Г -- *

500 700 500 700 500 _ 700 500

Х^пт)

700 500

700

Рис. 4. Властивост! кластерiв, iммобiлiзованих на «голiвках» ДНК-шпильок:

А — структура ДНК-шпильок типу 5'-ТАТССОТ-Сп-АСООАТА-3' з р1зною величиною шпильок (-Си-) з 3<п<12. Кластери ср1бла утворюються на одноланцюгових «гол1вках»; Б — двовим1рн1 д1аграми спектр1в поглинання 1 флуоресценцп для р1зних послвдовностей взДНК «гол1вок» р1зного розм1ру (С3-С12). «Зелен1» 1 «червон1» максимуми позначено «Х» 1 зазначено 1хню штенсившсть у в1дносних оди-ницях. С1р1 смуги вказують на умови поглинання 1 випромшювання, де сигнал флуоресценцп маскуеться св1тлорозс1янням [34]

Рис. 5. Використання сенсорно! ДНК з петлею олпо-С для ибридизацп з аналiзованою ДНК

з метою пошуку мутантних форм.

Прикладом слугуе мутащя, що призводить до серпоподiбно-клiгинноl анемп. Str-A — сегмент Р-ланцю-га гемоглобшу, Str В — його мутантно' форми, а Str-C — сенсорний ДНК-сегмент, що пбридизуеться з обома формами. Далi вiдбуваегься створення кластерiв срiбла на пеглi олшо-С. У разi пбридизацп з нормальною формою спостер^аеться iнгенсивна флуоресценщя, а з пагологiчною — н [33]

450 600 550 600 650 700

Дов&ина хвн/п (нм)

Б

0015

0.000

— з«-с

' ак авь-с Оир»«

В

Довжина ssa.li (нм)

Г

— 51Г-С

— $1г-АГЗ(г-С

— »1г-в

— ^г-М^-С 0ир»с«

550 «0 «0 700

Довжина хвил! (нм)

Рис. 6. Спектри збудження та флуоресценцп кластерiв срiбла, утворених на ибридизованш структур! в^-Б/в^-С (А). Фото цих флуоресцентних об'ектав (Б). Спектри поглинання (В) i флуоресценцп! (Г) за збудження 520 нм кластерiв, синтезованих на в^-С (чорний), дуплексi в^-А/в^-С (червоний), в^-В

(зелений) та дуплекс в^-Б/^г-С (синiй) [33]

Пол1мерш та дендримерш носп

Найбiльш активний пошук носив для формування кластерiв останшм часом здшс-нюеться серед водорозчинних штучних полiмерних молекул. Першими було описано флуоресцентш кластери, сформоваш на ПАМАМ-дендримерах (полiмерах, де розга-луженi гiлки однакового розмiру виходять з единого центра) з ОН-кшцевими групами. Для них характерний дуже широкий спектр флуоресценцп — вщ 533 до 648 нм [14]. Рiзнi полiмернi композити, що утворюють

частинки (220 нм) мiкрогелiв [35] та молеку-лярнi гiдрогелi [22], сформоваш полплще-ролом — блок-полiакриловою кислотою, вказують на необхщшсть наявностi -СООН-груп для утворення кластерiв. Шд час фото-хiмiчного вiдновлення тут утворюються кластери з випромшюванням у межах 600 нм.

Значно просташе та дешевше використо-вувати водн розчини широкодоступних полiмерiв, таких як полiметакрилова кислота [18]. За фотовщновлення при 365 нм тут утворюються кластери зi свiченням при 620 нм з квантовим виходом 18,6%.

Пептидш та протешовi матриц

Структури, що можуть бути створен1 лшш-ною комб1нац1ею ам1нокислотних залишк1в у пептидах та проте1нах, 1 просторова органь зац1я останн1х дають невичерпш можливост для створення матриць, як1 стаб1л1зують кластери. У л1тератур1 юнуе багато даних про спор1днен1сть деяких 1з цих залишк1в (зокрема пролшу й мет1он1ну) до 1он1в ср1бла, проте дос1 не зрозум1ло, чи 1снуе залежн1сть м1ж зв'язуванням юшв та формуванням в1дновлених кластер1в. Тому досл1дники 1дуть емп1ричним шляхом, але результат1в для певних узагальнень ще недостатньо.

Нещодавно було показано, що проте1н а-х1мотрипсин може слугувати матрицею [29] шд час х1м1чного в1дновлення 1он1в ср1бла. Даних про структуру та локал1защю цих кластер1в у молекул1 проте1ну немае. Проте спостер1гаеться 1х 1нтенсивна ем1с1я при 680 нм за збудження при 500 нм (рис. 7). Виявило-ся, що значний надлишок вщновлювального реагента NаВН4 в1дновлюе дисульф1дн1 зв'язки 1 призводить до частково! або повно1 денатурацп. Однак його видалення шляхом д1ал1зу в1дновлюе ензимну актившсть з1 збе-реженням 1нтенсивно1 флуоресценцп.

Поглинання Флуоресценция Ag-CHT ^^^ Флуоресценц1я

300 400 500 600 700 800

Довжина хвил1, нм

Приготування кластер1в у мiкроемульсiях

М1кроскоп1чн1 краплинки води можна стабШзувати в гщрофобних розчинниках за допомогою детергент1в. Вони можуть слугувати мшрореакторами для синтезу клас-тер1в ср1бла. В однш з таких роб1т детергентом був АОТ [синошми: bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate sodium salt, sulfosuccinic acid bis(2-ethylhexyl) ester sodium salt, docusate sodium], а вщновлювальним агентом — гшо-фосф1т натр1ю. При цьому утворюються кластери малого розм1ру — менше 10 ато-м1в [36].

Стабш1защя кластерiв

низькомолекулярними реагентами

Пошук низькомолекулярних стабШзато-р1в мае на мет1 дек1лька завдань. По-перше, зробити кластери гомогенними за розм1рами та композищею, що дозволило б уникнути ге-терогенност1 в спектральних властивостях. По-друге, зменшити розм1р нанокомпозита, що часто складаеться з шлькох кластер1в на одн1й матриц1, до одного стаб1л1зованого кластера. По-трете, використовувати в1льш реактивн1 групи стаб1л1затора з метою вклю-чення кластера в систему для сенсорики або ковалентного м1чення р1зних субстратав. На момент написання цього огляду опублшова-но пов1домлення про дешлька 1стотних роз-робок. Так, мезо-2,3-димеркаптосукцинат був використаний як в1домий двовалентний SH-реагент для стабШзацп х1м1чно вщнов-лених (за допомогою NaBH4) кластер1в. Авто-ри пов1домили про синтез гомогенно'' попу-ляцп Ag7-кластерiв [25]. В шшш робот1 було синтезовано, зi стабiлiзацiею меркаптосук-цинатом, кластери Ag7 i Ag8, що вiдрiзнялися свiченням у синьо-зеленiй та червонш д^ян-ках спектра [37]. Використання лшоево'1 кислоти, що разом з юнами срiбла вiдновлю-валась NaBH4 до дигiдролiпоевоi кислоти, дало змогу створити i стабiлiзувати спект-рально-гомогенш кластери невеликого розмiру [38].

Вартим уваги е використання у процес1 створення кластерiв срiбла фотохiмiчним вщновленням барвника тiофлавiну Т [24]. Вщомо, що багато гетероциклiчних сполук, включаючи барвники, хелатують iони срiбла. Проте невщомо, чи можуть вони бути матрицями для створення кластерiв та стабШзувати ''х.

Рис. 7. Спектри поглинання i флуоресценц11 (збудження за 500 нм) кластер1в Ag, сформова-них у присутност1 молекул а-х1мотрипсину.

Використовували метод хiмiчного вiдновлення [29]

Доойднишв цiкавив ядерний проте'н нуклеолш, який мае високу спорiдненiсть до юшв срiбла. Синтетичнi пептиди, що подiбнi до фрагмента цього протешу i мають у сво'й структурi залишки цисте'ну (С), глу-тамшово'' кислоти (Е), лiзину (К) та аспа-рагiновоi кислоти (D), можуть бути ефектив-ними матрицями [28], а за надлишку аргiнiну легко проникають у живi клiтини.

Кластери ср1бла як молекулярш сенсори

Нещодавно було одержано перспективы результати [5, 38, 39] для кластерiв срiбла, стабiлiзованих молекулами дигiдролiпоевоi кислоти при детекцп iонiв ртутi (Hg2+). Ц iони викликають селективне гасiння флуоресценцп. Для концентрацп кластерiв 10-5 М лiмiт детекцп Hg2+ сягае таких низьких зна-чень, як 10-10 М, а дiапазон концентрацш, що визначаються, — 10-5 М. Причиною такого специфiчного гасiння може бути вклю-чення Hg2+ в кластер срiбла iз перенесенням електрона з кластера на цей юн. Не виклю-чаеться, однак, й утворення за участю юшв ртут мiжкластерних асоцiатiв.

Флуоресценцiя кластерiв, сформованих на фрагментах ДНК, чутлива до 1х взаемодп з iонами мда, причому спостерiгаеться не гасiння, а навпаки, зб^ьшення яскравост флуоресценцп [6]. Виявляеться висока се-

Рис. 8. Селектившсть та чутливiсть кластера

DNA-Ag як сенсора на iони Си2+ (а). Концентрацiя iонiв мiдi — 0,2 мМ, а кожного iншого iона металу — 10 мМ. Графiк залежност1 вiдносного зростання флуоресценцп ввд концентрацп iонiв мiдi (б) [6]

лективнють до мiдi порiвняно з iншими iонами. Дiлянка детектування юшв Си2+ — 10-8-10-6М (рис. 8).

В шшому дослiдженнi [39] кластери срiбла, сформованi на матриц полiметакри-лово'1 кислоти, реагують на присутнють iонiв Си2+ в тому самому iнтервалi концентрацiй

гасiнням флуоресценцп. У цьому разi було показано, що зв'язування Си2+ е оборотним. Гасшня флуоресценцп цих кластерiв вщбу-ваеться також пiд впливом цисте'ну, що може бути використано для визначення ще'1 ме-таболiчно важливо'1 амiнокислоти [7] (рис. 9).

Рис. 9. Спектри флуоресценцп кластерiв ПMAA-Ag у присутностi рiзних концентрацш цистешу вiд 0 до 60-10 6 М (а-г).

На всгавцi залежшсть iнгенсивносгi флуорес-ценцii при 615 нм ввд конценграцii цисгеiну. Знизу — вщносна iнгенсивнiсгь флуоресценцii у присутноси рiзних a-амiнокислог [7]

Таким чином, у застосуванш кластерiв атомiв срiбла в сенсорних технологiях роб-ляться першi, але багатообiцяльнi кроки. Найпросташим методом реестрацii сенсорно! вщповвд е iнтенсивнiсть флуоресценцii, 11 змши, що й було використано в цитованих роботах.

Застосування кластер1в у клггинних досл1дженнях

Кластери, сформованi на ДНК-матри-цях, можуть бути ефективно використаш у дослiдженнi клiтини, чому сприяе висо-кий квантовий вихщ (до 30%) свiчення в червонш дiлянцi спектра, де автофлуоресцен-щя незначна [15, 16]. Так, олпо-С-кон'югат кластерiв срiбла, з'еднаний з авщином, доз-воляе одержати зображення фшсованих

бютишзованих клггин, тимчасом як жив1 клiтини захоплюють його за мехашзмом ен-доцитизу. Приеднання цих кон'югатав до ге-паринсульфату замiсть авщину дае змогу спостерiгати флуоресцентнi ядра клггин [40].

Виявляеться, iнкубацiею фшсованих клiтин з iонами срiбла можна досягти певно! ïx концентрацiï в клггиш, а потiм фотоопро-мшюванням створювати в нiй флуоресцентш кластери. Для таких кластерiв характерна флуоресценщя в широкому дiапазонi — вщ 500 до 700 нм [28]. Матрицею в цьому раз1 слугують невстановленi протеши чи пепти-ди самих клггин.

Цiкавим методичним прийомом може бути перенесення кластерiв вщ однiеï матриц до шшо!. Це вкрай важливо пiд час мiчення антитiл, оскiльки за xiмiчного вiдновлення ïxнi дисульфiднi зв'язки, що стабШзують структуру, також вiдновлюються, i це при-зводить до денатурацп. Тому було запропо-новано кон'югати антитiл з олiго-С мiтити, шкубуючи з полiмером, що мiстить вже створеш кластери. Такий прийом дае можливють вiзуалiзувати клiтиннi структури шляхом взаемодп з мiченими антиталами [40, 41].

Хоча з часу перших роби iз синтезу клас-терiв срiбла з декiлькоx атомiв у розчинах i демонстрацiï !х флуоресценцiï не минуло й 10 рошв, а цi кластери вже набули широ-

кого застосування. 1хш оптичш властивост схожi на й, що спостерiгаються для ор-гашчних барвникiв, оскiльки в основi 1х також е електроннi переходи мiж квантовими енергетичними рiвнями з енерпями, як1 вiдповiдають поглинанню i випромiненню у видимiй областi спектра. Вони надто май за розмiром, мають високу яскравiсть ви-промшення, не токсичнi й фотостабiльнi. 1х настiльки легко синтезувати, використову-ючи рiзнi фiзичнi та хiмiчнi чинники для вщновлення iонiв срiбла, що такий синтез можна легко здшснити нав^ь у шкiльних кабiнетах хiмii. Необхiднi для 1х стабiлiзацii матриц можуть бути рiзноi природи, проте ушверсального рецепту для синтезу не ю-нуе, i дослiдник мусить оптимiзувати умови синтезу залежно вщ типу використовувано'1 матрицi. Сенсорнi технологи на основi цих кластерiв мають широку перспективу застосування, осшльки i положення спектрiв, i 1хня iнтенсивнiсть демонструють помiтну залежнiсть вщ молекулярного оточення, яке може слугувати основою для сенсорно! вщповщь Специфша утворення кластерiв на певних матрицях може бути використана для селективного флуоресцентного мiчення в бiологiчних системах, включаючи жив1 клiтини. Першi усшхи надихають учених на подальшi дослщження та розроблення цих систем.

^ITEPATyPA

1. Xu H., Suslick K. S. Water-soluble fluorescent silver nanoclusters // Adv. Mater. — 2010. — V. 22. — P.1078-1082.

2. Diez I., Ras R. H. Few-Atom Silver Clusters as Fluorescent Reporters // A. P. Demchenko (ed.), Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology II: Molecular Constructions, Polymers and Nanoparticles, Springer Ser. Fluoresc. — 2010. — V. 9. — P. 307-332.

3. Vosch T., Antoku Y., Hsiang J. C. et al. Strongly emissive individual DNA-encapsu-lated Ag nanoclusters as single-molecule fluo-rophores // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 2007. — V. 104. — P. 12616-1221.

4. Lee T. H., Gonzalez J. I., Zheng J,, Dickson R. M. Single-molecule optoelectronics // Acc. Chem. Res. — 2005. — V. 38. — P. 534-541.

5. Guo W., Yuan J.,Wang E. Oligonucleotide-sta-bilized Ag nanoclusters as novel fluorescence probes for the highly selective and sensitive detection of the Hg2+ ion // Chem. Commun. (Camb). — 2009. — P. 3395-3397.

6. Lan G. Y., Huang C. C.,Chang H. T. Silver nanoclusters as fluorescent probes for selective and sensitive detection of copper ions // Ibid. — 2010. — V. 46. — P. 1257-1259.

7. Shang L., Dong S. Sensitive detection of cysteine based on fluorescent silver clusters // Biosens. Bioelectron. — 2009. — V. 24. — P. 1569-1573.

8. Antoku Y., Hotta J., Mizuno H. et al. Trans-fection of living HeLa cells with fluorescent poly-cytosine encapsulated Ag nanoclusters // Photochem. Photobiol. Sci. — 2010. — V. 9. — P. 716-721.

9. Lin C.-A. J., Lee C.-H., Hsieh J.-T. et al. Synthesis of fluorescent metallic nanoclus-ters toward biomedical application: Recent progress and present challenges // J. Med. Biol. Eng. — 2009. — V. 29. — P. 276-283.

10. Burda C., Chen X., Narayanan R,, El-Sayed M. A Chemistry and properties of nanocrystals of different shapes // Chem. Rev. — 2005. — V. 105. — P. 1025-1102.

11. Kreibig U. Electronic properties of small silver particles. — Optical constants and their temperature dependence //J. Phys. F. — Metal Phys. — 1974. — V. 4. — P. 999-1014.

12. Fedrigo S., Harbich W., Buttet J. Optical response of Ag2, Ag3, Au2 and Au3 in argon matrices // J. Chem. Phys. — 1993. — V. 99. — P. 5712-5717.

13. Conus F., Rodrigues V., Lecoultre S. et al. Matrix effects on the optical response of silver nanoclusters // Ibid. — 2006. — V. 125. — P. 24511-1-24511-4.

14. Zheng J., Dickson R. M. Individual water-soluble dendrimer-encapsulated silver nanodot fluorescence // J. Am. Chem. Soc. — 2002. — V. 124. — P.13982-13983.

15. Richards C. I., Choi S., Hsiang J. C. et al. Oligonucleotide-stabilized Ag nanocluster fluorophores // Ibid. — 2008. — V. 130. — P. 5038-5039.

16. Sengupta B., Ritchie C. M., Buckman J. G. et al. Base-directed formation of fluorescent silver clusters // J. Phys. Chem. C. — 2008. — V. 112. — P. 18776-18782.

17. Petty J. T., Zheng J., Hud N. V., Dickson R. M. DNA-templated Ag nanocluster formation // J. Am. Chem. Soc. — 2004. — V. 126. — P. 5207-5212.

18. Diez I., Pusa M., Kulmala S. et al. Color tun-ability and electrochemiluminescence of silver nanoclusters // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. — 2009. — V. 48. — P. 2122-2125.

19. Maretti L., Billone P. S., Liu Y., Scaiano J. C. Facile photochemical synthesis and characterization of highly fluorescent silver nano-particles // J. Am. Chem. Soc. — 2009. — V. 131. — P. 13972-13980.

20. Treguera M., Roccoa F., Lelonga G. et al. Fluorescent silver oligomeric clusters and colloidal particles // Solid. State Sci. — 2005. — V. 7. — P. 812-818.

21. Xu H., Suslick K. S. Sonochemical synthesis of highly fluorescent Ag nanoclusters // ACS Nano. — 2010. — V. 4. — P. 3209-3014.

22. Shen Z., Duan H., Frey H. Water-soluble fluorescent Ag nanoclusters obtained from multiarm star poly(acrylic acid) as «Molecular Hydrogel» templates // Adv. Mat. — 2007. — V. 19. — P. 349-352.

23. Shang L., Dong S. Facile preparation of water-soluble fluorescent silver nanoclusters using a polyelectrolyte template // Chem. Commun. (Camb). — 2008. — P. 1088-1090.

24. Makarova N., Parfenov A., Baskakov I. V. Water-soluble hybrid nanoclusters with extra bright and photostable emissions: a new tool for biological imaging // Biophys. J. — 2005. — V. 89. — P. 572-580.

25. Wu Z., Lanni E., Chen W. et al. High yield, large scale synthesis of thiolate-protected Ag7 clusters // J. Am. Chem. Soc. — 2009. — V. 131. — P. 16672-16674.

26. Cathcart N., Mistry P., Makra C. et al. Chiral thiol-stabilized silver nanoclusters with

well-resolved optical transitions synthesized by a facile etching procedure in aqueous solutions // Langmuir. — 2009. — V. 25. — P. 5840-5846.

27. Adhikari B., Banerjee A. Short-Peptide-Based Hydrogel: A Template for the In Situ Synthesis of Fluorescent Silver Nanoclusters by Using Sunlight // Chemistry — A European Journal. — 2010. — V. 16. — P. 13698-13705.

28. Yu J., Patel S. A., Dickson R. M. In vitro and intracellular production of peptide-encapsu-lated fluorescent silver nanoclusters // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. — 2007. — V. 46. — P. 2028-2030.

29. Narayanan S. S., Pal S. K. Structural and functional characterization of luminescent silver-protein manobioconjugates // J. Phys. Chem. C. — 2008. — V. 112. — P. 4874-4879.

30. Wilcoxon J. P., Abrams B. L. Synthesis, structure and properties of metal nanoclus-ters // Chem. Soc. Rev. — 2006. — V. 35. — P. 1162-1194.

31. Gwinn E. G., O'Neill P., Guerrero A. J. et al. Sequence-dependent fluorescence of DNAhosted silver nanoclusters // Adv. Mater. — 2008. — V. 20. — P. 279-283.

32. Soto-Verdugo V., Metiu H., Gwinn E. The properties of small Ag clusters bound to DNA bases // J. Chem. Phys. — V. 132. — 195102. (2010);doi:10.1063/1.34.19930 (10 pages).

33. Guo W., Yuan J., Dong Q., Wang E. Highly sequence-dependent formation of fluorescent silver nanoclusters in hybridized DNA duplexes for single nucleotide mutation identification // J. Am. Chem. Soc. — 2010. — V. 132. — P. 932-934.

34. O'Neill P. R., Velazquez L. R., Dunn D. G. et al. Hairpins with poly-C loops stabilize four types of fluorescent Ag:DNA // J. Phys. Chem. C. — 2009. — V. 113. — P. 4229-4233.

35. Zhang J., Xu S., Kumacheva E. Photogeneration of fluorescent silver nanoclusters in polymer microgels // Adv. Mater. — 2005. — V. 17. — P. 2336-2340.

36. Ledo A., Martinez F., Lopez-Quintela M. A., Rivas J. Synthesis of Ag clusters in micro-emulsions: a time-resolved UV-vis and fluorescence spectroscopy study // Phys. B Condens.Matter. — 2007. — V. 398. — P. 273-277.

37. Rao T. U. B., Pradeep T. Luminescent Ag7 and Ag8 clusters by interfacial synthesis // Angew. Chem. Int. Ed. — 2010. — V. 49. — P. 3925-3929.

38. Adhikari B., Banerjee A. Facile synthesis of water-soluble fluorescent silver nanoclusters and HgII sensing // Chem. Mater. — 2010. — V. 22. — P. 4364-4371.

39. Shang L., Dong S. Silver nanocluster-based fluorescent sensors for sensitive detection of Cu(II) // J. Mater. Chem. — 2008. — V. 18. — P.4636-4640.

40. Yu J., Choi S., Dickson R. M. Shuttle-based fluorogenic silver-cluster biolabels // Angew. Chem. Int. Ed. — 2009. — V. 48. — P. 318-320.

КЛАСТЕРЫ ИЗ НЕСКОЛЬКИХ АТОМОВ СЕРЕБРА ВО ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ СЕНСОРНЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ

А. П. Демченко М. И. Канюк

Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев

E-mail: [email protected]; [email protected]

Кластеры из нескольких атомов серебра имеют уникальные оптические свойства, позволяющие рассматривать их как эффективную замену органическим красителям в различных флуоресцентных сенсорных технологиях. Описаны их свойства и примеры использования, техника создания и стабилизации с помощью различных высокомолекулярных и низкомолекулярных матриц. В частности, очень простыми являются методы получения кластеров с применением химических восстановителей, а также восстановления под действием света.

Продемонстрировано применение кластеров серебра для мечения ДНК и создания ДНК-сенсоров на основе их гибридизации с последующим детектированием флуоресценции кластеров. Чрезвычайно быстро развиваются другие перспективные направления, в частности детектирование ионов и мечение живой клетки, как в плане фундаментальных исследований, так и учитывая широкие возможности практического применения.

Ключевые слова: флуоресценция, кластеры атомов серебра, сенсорные технологии.

41. Yu J., Choi S., Richards C. I. et al. Live cell surface labeling with fluorescent Ag nano-cluster conjugates // Photochem. Photobiol. — 2008. — V. 84. — P. 1435-1439.

CLUSTERS FROM A FEW SILVER ATOMS IN FLUORESCENT SENSORY TECHNOLOGIES

O. P. Demchenko M. I. Kanyuk

Palladian Biochemistry Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

E-mail: [email protected]; [email protected]

Clusters out of several silver atoms possess unique optical properties that allows considering them as efficient substitutes to organic dyes in different fluorescente sensor technologies. The properties of these clusters and examples of their applications, techniques of synthesis and stabilization in different macromolecular and low-molecular matrices were described. In particular, the methods of cluster obtaining with chemical reducing agents, as well as the recovery in response to light were very simple.

Application of silver clusters for DNA labeling and a DNA-sensors creating were demonstrated on the basis of their hybridization followed by cluster fluorescence detection. Other prospective areas of application developed extremely fast, including ion detection and living cell labeling, both in terms of basic research and in view of ample opportunities for practical application.

Key words: fluorescence, clusters of atoms of silver, sensory technologies.

УДК 577.352.4:577.164.1

ЗАКОНОМ1РНОСТ1 УТВОРЕННЯ I ФУНКЦ1ОНУВАННЯ 1ОНПРОВ1ДНИХ КАНАЛ1В ЦИТОЛ1ТИЧНИХ ПРОТЕ1ШВ ПРИ РЕКОНСТРУКЦП У ШТУЧНИХ Л1П1ДНИХ Б1ШАРАХ

О. Я. ШАТУРСЬКИЙ 1нститут 6ioxiMii' iM. О. В. Палладiна НАН Украши, Кт'в

E-mail: [email protected]

Особливу роль за патологш, якi виникають унаслiдок утворення цитолiтичними протешовими токсинами юнних каналiв у плазматичнiй мембраш уражених клiтин, вiдiгpаe пасивне транспорту-вання каналами токсинiв неоpганiчних юшв та оргашчних сполук, якi беруть участь в обмш речо-вин або е важливими складовими клгтини. Тому дослiдження процесу утворення i функцiонування iонних каналiв цитолiтичними токсинами е важливим для визначення будови канального олюоме-ра в плазматичнш мембраш клгтини-мшеш та механiзмiв лiзису клiтини.

Цитолiтична дiя розглянутих у робота протешових токсинiв pеалiзуеться шляхом збшьшення без-посереднього транспортування неоргашчних iонiв через нативнi мембрани уражених клгтин i вившь-нення iхнiх внутpiшнiх складових (пpотеiнiв, оpганiчних кислот тощо). Це пов'язано з утворенням токсинами юнпровщних олiгомеpiв — каналiв у лiпiдному бiшаpi плазматичноi мембрани. Рекон-стpукцiя iонних каналiв цитолгтичних пpотеiнiв у штучних бiшаpових лшщних мембранах i лшосо-мах дае можливють дослiджувати iх утворення i функцiонування, що важливо для визначення струк-тури iонпpовiдного олiгомеpа i механiзму його токсичноi дй для лшування токсичних уражень шляхом блокування струму юшв через канали токсишв. Основну увагу в оглядi придшено обговорен-ню закономipностей утворення i властивостей нещодавно реконструйованих iонпpовiдних олiгомеpiв нейро- i дерматоксичного ß-токсину бактерп Clostridium perfringens та гемолiтичних 6-токсину бактерп Clostridium perfringens i RTX-токсину актини Radianthus macrodactilus.

КлючовЬ слова: бшарова лiпiдна мембрана, îohhî канали, ß- i 6-токсин Clostridium perfringens, токсин RTX Radianthus macrodactilus.

Основну увагу в цьому оглядi прид^ено визначенню структури i властивостей юн-провiдних олiгомерiв цитолiтичних ß- i 6-токсинiв Clostridium perfringens та RTX-токсину актинп Radianthus macrodactilus

[1] методом ïx реконструкцп у штучних лшщних бшарах плоских бiмолекулярниx мембран (БЛМ) або лiпосом. Осшльки предметом дослiджень е юнпровщш канали, якi утворюються за олпомеризацп непровiдниx мономерiв цитотоксичних протеïнiв у лшщ-ному бiшарi, зазначений метод можна вва-жати типовим прикладом нанотехнологп

[2], призначено! для використання у фунда-ментальних бiологiчниx дослщженнях кла-сично! та медично! бiоxiмiï або бiофiзики.

Враховуючи те, що ß-токсин бактерп Clostridium perfringens pеалiзуе свiй токсичний ефект, впливаючи на епiтелiальнi тканини та нервову систему хребетних, що призво-дить до появи некpозiв [3, 4], шдвищення кров'яного тиску, зниження ритму серце-биття, спастичних судом та раптово'1 смеpтi жертви [5], а 6-токсин бактерп Clostridium perfringens е основним вipулентним чинни-ком, який спричиняе гангрену [6], вибip за-значених об'ектiв дослiджень також ви-даеться досить актуальним для прикладного розд^у бiомедичних наук.

В останш 10-piччя для реконструкцп де-далi ширше застосовують pекомбiнантнi форми цитол^ичних токсинiв, тому можна

вважати, що науковщ, зокрема бiоxiмiки, бiофiзики та молекулярнi бiологи, мають справу не лише з процесами, ям вщбувають-ся в просторових д^янках нанометрових розмiрiв, але й шляхом генетичного мутагенезу маншулюють окремими атомами i молекулами для побудови юнпровщних структур iз наперед заданими властивостями. Серед таких властивостей слщ зазначити ут-ворення олиомерних проте'шових структур з рiзними iонпровiдними характеристиками в штучних лшщних шарах завтовшки в двi молекул и, що певною мiрою вiдтворюе ре-альнi процеси в плазматичних мембранах уражених токсинами клггин.

Незважаючи на те, що технолопю рекон-струкци iонниx каналiв у лiпiдниx бшарах було в основному впроваджено й модифшо-вано в 60-80-х роках ХХ ст., сучасш науковщ дедалi частiше здiйснюють дослiдження канатв, якi утворенi окремими протешами в xодi складних лiпiдно-протеïновиx вза-емодш, адже ще й дотепер не з'ясовано низку ключових питань стосовно будови i функцiонування окремих канатв. До них можна вщнести питання про конформацiй-ну перебудову розчиненого у водному сере-довищi протешу в разi проникнення в лшщ-ний бiшар мембрани та формування юнного каналу, структуру водно! порожнини ка-налiв, вплив рiзниx природних i штучних чиннишв на утворення каналiв та ïxнi юн-провщш властивостi тощо. Окрiм цього, ви-користання БЛМ або лiпосом для рекон-струкцiï очищених каналоформерiв дае змогу створювати особливi умови проведен-ня наноекспериментiв з окремим типом ка-налiв, якi не завжди е можливими шд час роботи з бюлопчними мембранами, а саме: симетричшсть лiпiдного складу i водно-сольового оточення по обидва боки лшщного бiшару, заданий склад мембрани, постшний мембранний потенцiал, вiдсутнiсть шших iнтегральниx протеïнiв мембран тощо, чим досягаеться зменшення кiлькостi неврахо-ваних чиннишв впливу на об'екти досль дження й iндуковану ними провщшсть мембрани. Значення iонниx каналiв для бю-xiмiчниx процесiв, залежних вщ пасивного транспортування речовин in vivo, шдтверд-жуеться порiвняльним аналiзом властивостей каналiв у штучних лшщних бiшараx з безпосереднiм транспортуванням речовин та зв'язаними з ним процесами на рiзниx рiвняx структурно! оргашзаци живих орга-нiзмiв.

Загальнi властивосл RTX-токсину актина Radianthus macrodactilus та ß- i 6-токсинiв бактерп Clostridium perfringens

Токсин актини RTX належить до високо-молекулярних актинопоринiв Radianthus, яш виявляють цитолiтичну активнiсть. Показано, що мшенями для RTX та шших кана-лоформувальних цитотоксишв актинiй е ци-топлазматичнi мембрани кл^ин евкарiотiв [1]. Згiдно з подлом на основi лiпiдноi спе-цифiчностi та деяких фiзико-хiмiчних властивостей RTX належить до групи цитолiзи-шв актини, якi шпбуються сфiнгомiелiном (СМ). У даному разi гемолiтична активнiсть актинопоринiв цiеi групи шпбуеться преш-кубацiею з екзогенним СМ. RTX, подiбно до шших актинопоришв Í3 фракци отрути морськоi актини з високою гемолiтичною актившстю е полiпептидом з молекулярною масою близько 20 кДа. Для амшокислотного складу RTX характерний високий вмют ос-новних i гiдрофобних амшокислот, тирозину, а також наявшсть чотирьох залишкiв триптофану, як i для б^ьшост iнших актинопоришв. Вiдсутнiсть цистеiну в складi ви-сокомолекулярних Radianthus-цитолiзинiв вказуе на iх належнiсть до актинопоринiв. Серед токсишв цiеi групи тiльки Radianthus RTX мае N-кшцевий залишок аланiну, що зумовило наявшсть ще одше' назви (RTX-A) для цього токсину. Iншi Radianthus-токсини з високою гемолiтичною актившстю, на-приклад RTX-S або RTX-G, мали N-кiнцевi залишки серину чи глщину, вiдповiдно [1]. Амiнокислотнi послщовноста, визначенi для вивчених Radianthus-актинопоринiв, досить подiбнi. Iдентичнiсть послiдовностей RTX та шшого актинопорину RTX-S становить 89%, а з урахуванням консервативних замш — 95%. Такий самий високий стушнь гомологи було виявлено мiж послщовностями актинопоришв актини Radianthus macro-dactylus, Hetaractis magnifica i Stichodactila helianthus, що можна пояснити належшстю 'х до однiеi родини Stichodactylidae. Результата порiвняльного аналiзу стрiчкових дiа-грам просторових структур рiзних актино-поринiв також свщчать про високий ступiнь 'х подiбностi.

Показано, що молекула RTX складаеть-ся з жорстко сформованого ß-кору, утворе-ного за допомогою 12 антипаралельних лан-цюжкiв ß-складчастостей i двох коротких а-стралей, розташованих на протилежних боках ß-кору. На петл^ яка з'еднуе 6-й i 7-й ß-ланцюжки на С-кшцевш спiралi, розташована

д^янка, збагачена залишками триптофану i тирозину, що входить до складу сайту зв'я-зування актинопорину з мембраною. Основ-ш розбiжностi у вiзуалiзованиx просторових структурах актинопоринiв можна побачити в частково стратзованих N-кiнцевиx фрагментах молекул. Ушкальний меxанiзм токсично! дп актинопоринiв, спрямований на руйну-вання мембран клiтин-мiшеней через процес утворення каналiв, зумовлений специфiч-ною комбiнацiею структурних елементiв актинопоришв — N-кiнцевоï мелiтиноподiбноï амфiфiльноï а-спiралi та складки ß-сендвiча з ароматичним кластером [1].

Слщ зазначити, що до сьогодш процес утворення канального ол^омера актинопо-ринiв, включно з RTX, остаточно не встанов-лено i тому невiдомо, ям саме фрагменти мономера токсину беруть участь у процей олiгомеризацiï. Не юнуе також одностай-ностi серед дослщнишв стосовно кiлькостi мономерiв RTX, ям формують канальний олiгомер. Згщно з найбiльш прийнятними даними у формуванш актинопоринового каналу беруть участь щонайменше чотири ок-ремих мономери протешу [1, 7].

Токсична дiя актинопоришв базуеться на ïxнiй мембранол^ичнш активностi, в ос-новi яко! лежить здатнiсть RTX та шших цитолiзинiв Radianthus до специфiчного зв'язування з лшщним матриксом мембран, унаслщок чого формуються потенщалза-лежнi катюнселективш iоннi канали. Показано, що швидкють утворення RTX-каналiв у мембраш залежить вщ присутностi в ïï лiпiдному складi СМ. Навiть дуже висок концентрацп RTX та шших актинопоришв не спричинюють помiтного зб^ьшення про-никностi мембран, що не мають у своему складi СМ, тодi як введення лише 5% СМ до складу мембран значно тдсилюе спромож-нiсть RTX до утворення канатв, а вiдтак й юнну проникнiсть мембран. 1снуе багато рiзниx припущень щодо специфiчностi впливу СМ на швидкють утворення каналiв RTX та каналiв iншиx актинопоришв, серед яких можна окремо вид^ити два напрями: особливий вплив СМ на плиннють лшщного бiшару та специфiчне протешо-лшщне роз-пiзнавання у разi взаемодiï RTX з СМ.

Вихщ К+ iз лiпосом, модифшованих RTX, залежить вiд рН середовища. Зб^ь-шення виходу К+ iз лiпосом при рН вище 4 може бути пов'язано з протонуванням негативно заряджених карбоксильних груп у по-рожниш каналiв RTX та нейтратзащею позитивно заряджених залишшв лiзину й аргiнiну, якi також експоноваш всередину

сформовано! даним каналом водно! по-рожнини.

Зв'язування RTX та шших високомоле-кулярних актинопоришв з мембраною не-зворотне, на вщмшу вщ низькомолекуляр-них цитолiзинiв Radianthus, взаемодiя яких з мембраною мае зворотний характер, а ка-налформувальна активнiсть виявляеться за концентрацiй, у 100 раз вищих за дiючi концентрацп RTX та шших високомолекуляр-них актинопоринiв [1].

Отвори каналiв, якi формуе RTX в лшщ-ному бiшарi штучних мембран та мембран еритроцитав, мають дiаметр вiд 0,6 нм до 1,0 нм [8]. Серед шших фiзiологiчно важливих юшв так канали е проникними переважно для К+ та Na+. Варто зазначити, що окрiм лiпiдно-протеïновиx взаемодiй, якi призво-дять до утворення RTX-каналiв у мембранах, фармаколойчна дiя RTX та шших актинопоришв Radianthus може бути зумов-лена протеш-протешовими взаемодiями цих токсишв з компонентами бiологiчниx мембран i цитоскелета клггин-мшеней [1]. Мож-ливо, загальний меxанiзм формування канального ол^омера RTX, а також його структура неютотно вiдрiзняються вiд опи-саного ранiше для родини каналформуваль-них цитолiзинiв, до яких належить ß-токсин бактерiï Clostridium perfringens [9, 10], що робить RTX зручною моделлю для дослщжень утворення i функцюнування каналiв у мембраш.

Вщомо, що ß-токсин е основним леталь-ним фактором у штамiв типу С, який вражае б^ьшють сiльськогосподарськиx тварин на початкових стадiяx !хнього розвитку, хоча дорослi тварини також можуть бути шфшо-ванi. Вважають, що ß-токсин вражае кишечник молодих тварин на стадiяx розвитку, коли його мшрофлора ще остаточно не сфор-мувалась [5]. Порiвняльним аналiзом первин-них структур ß-токсину з iншими токсинами показано, що амшокислотна послiдовнiсть ß-токсину виявляе 28% гомолопчноста з такою а-токсину Staphylococcus aureus [11]. Беручи до уваги високу щентичнють пер-винних структур цих токсишв, деяш дослiд-ники вважають, що !хш мономери та олiго-мери також подiбнi мiж собою [3, 12]. Молекулярна маса мономера ß-токсину ста-новить 35-38 кДа [3, 13]. Функцюнальний олшомер ß-токсину, утворений у мембранах культури кл^ин HL 60 мае молекулярну ма-су 228 кДа i складаеться переважно iз семи субодиниць, хоча може також юнувати у формi гексамера (191 к Да) в рафтах клгтинних мембран [3].

За допомогою кристалографiчного аналь зу було показано, що олГгомер а-токсину складаеться iз чотирьох доменiв [10] i в поперечному перетиш нагадуе за формою гриб. Перший домен утворюе «капелюшок» гриба, складений iз семи ß-сендвiчiв та N-тер-мiнального регiону. Другий домен мГститься в «нiжцi» гриба, яка утворюе трансмембран-ний iонний канал. Третш домен формуе так званий общок, який звисае з «капелюшка» гриба i частково проникае у верхнш шар бГшарового лiпiдного матриксу мембрани з позаклГтинного боку. Четвертий домен ут-ворений трикутним регiоном, через який вщбуваеться зв'язування протомерiв, з яких сформовано канальний олГгомер протешу. Вщповщно до розташування консерватив-них амшокислотних послiдовностей, харак-терних для а- та ß-токсишв, ß-токсин також мае домени, тотожш за структурою i функ-цiями з тими, що ïx було описано для а-ток-сину [3].

Подiбно до токсишв родини холестерол-залежних цитолiзинiв (ХЗЦ), до яких належить 9-токсин бактерiï Clostridium perfrin-gens, ß-токсин також мае тГльки один цистешовий залишок у позицп 265 [14], хо-ча, на вщмшу вiд 9-токсину, замiна цього за-лишку не впливала на актившсть ß-токсину [15]. Бiльш того, послщовшсть амiнокислот первинно! структури ß-токсину в промiжку мiж позицiями 255-276, де мГститься цис-те'ш-265, гомологiчна консервативнш посль довностi амiнокислот а-токсину мiж залиш-ками в позицiяx 245-267, яка бере участь у зв'язуванш окремих протомерiв а- i ß-ток-синiв у олiгомерну структуру [3]. Показано, що тирозин-266 та лейцин-268, якi належать цiй дiлянцi, також беруть участь у зв'язуванш ß-токсину з рецептором. Рецептором ß-токсину виступае тахшшш НК1 [16]. Зв'язування ß-токсину iз цим рецептором може спричинити появу дерманекрозу дор-зально! шшри тварин.

Вважають, що основну роль в реалГзацп токсичностi ß-токсину, який ще недостатньо доойджений, вГдГграе його олiгомерна структура [3, 12]. ОлГгомери ß-токсину можуть утворюватися на нативних i штучних мембранах. Формування олiгомерiв ß-токсину на мембранах клГтин ендотелiю iнiцiюе вивГльнення араxiдоновоï кислоти та iнозитолу [12].

Беручи до уваги те, що дотепер ще дуже мало вщомо про меxанiзм формування олГго-мерiв ß-токсину та взаемозв'язок мiж ïx утво-ренням i бюлопчною активнiстю, можна при-пустити, що використання модельних систем

зi штучними лiпiдними мембранами для вив-чення олiгомеризацiï i можливого утворення каналiв та порiвняльний аналiз цих резуль-татiв з тими, яш вже наявнi в лiтературi, може дати важливу iнформацiю про зв'язок летально! активност токсину з утворенням канальних олiгомерiв у мембранах клГтин.

Попри те, що ß-токсин i 9-токсин проду-куються й видГляються назовнi однiею й таею самою бактерiею Clostridium perfrin-gens i належать до токсишв, здатних утво-рювати юнш канали у мембранах клГтин-мiшеней, !хня структура та меxанiзм токсично! дп вiдрiзняються. 9-токсин бак-терп Clostridium perfringens належить до родини холестеролзалежних цитолГзишв, якГ продукуються багатьма шшими грампози-тивними патогенними бактерiями. Первин-на структура ХЗЦ виявляе близько 40-70% гомологГчностГ, що свщчить про високий ступГнь iдентичностi члешв цiеï родини ток-синГВ. ВидГлеш бактерiями назовнi, ХЗЦ легко розчиняються у водних розчинах, де Гснують переважно у формГ мономерГв. Мономери ХЗЦ здатнГ швидко утворювати ве-ликГ гомоолГгомернГ асоцГати в матриксГ лГпГдного бГшару клГтин-мГшеней та штуч-них мембран. Токсини родини ХЗЦ е першо-рядним об'ектом структурних дослщжень, тому що ïx вже досить повно охарактеризовано за допомогою бюхГмГчних та молеку-лярнобюлопчних методГв. ОднГею з найваж-ливГших причин тако! уваги е те, що ХЗЦ видГляють таксономГчно рГзнГ види бакте-рГй, якГ можуть спричинити смертельш за-хворювання. Дотепер охарактеризовано близько 20 представникГв родини ХЗЦ [17]. НайбГльш дослГдженими з них е лютерю-лГзин О, суттевий вГрулентний фактор Listeria monocytogenes, який спричинюе меншпт i може призвести до передчасного припи-нення ваптностГ, 9-токсин, вГрулентний фактор Clostridium perfringens, що зумов-люе газову гангрену, та пневмолГзин, основ-ний вГрулентний фактор Streptococcus pneumoniae, який може викликати пневмошю i меншпт. Кожен Гз мономерГв токсишв складаеться з одного полшептидного ланцюжка з молекулярною масою вщ 50 кДа до 80 кДа. Високий ступГнь гомологГчностГ !хшх пер-винних структур дае пГдстави припустити, що всГ цГ протеши мають дуже подГбш три-вимГрнГ структури. 9-токсин Clostridium per-fringes е високомолекулярним полшепти-дом з молекулярною масою 53 кДа, який складаеться з 500 амшокислотних залишкГв [17]. За геометричною будовою 9-токсин е незвичайно видовженою молекулою

у виглядi палички. Мономер 6-токсину у водному розчиш збагачений ß-складчасти-ми структурами. У складi мономера 6-токси-ну також е дев'ять а-сшралей. Загалом, молекула цього токсину складаеться iз чо-тирьох доменiв. Перший домен мютить а- та ß-структури; другий домен мае чотири ß-структури; третiй домен, подiбно до пер-шого, складаеться з а-спiралей та ß-склад-частостей; четвертий домен складений у компактний сандвiч, який мае тальки лан-цюжки ß-структур.

Вщомо, що холестерол е високоспеци-фiчним рецептором для 6-токсину та шших ХЗЦ (Кдис = 10-9 М), дт якого пов'язують з концентруванням мономерiв токсину нав-коло збагачених на холестерол д^янок мембран клгтин-мшеней, що полегшуе процес взаемодп мономерiв та утворення канального ол^омера [18]. Це припущення шдтверджуеться тим, що ступiнь зв'язуван-ня мономерiв та кiлькiсть ïx в олшомернш структурi залежать вiд концентрацп холес-теролу в мембранi. Незважаючи на те, що дотепер серед дослщнишв юнують проти-лежнi точки зору щодо локалiзацiï в моле-кулi 6-токсину сайту, вiдповiдального за зв'язування з холестеролом, е досить пере-конливi докази того, що холестерол зв'язуе-ться зi збагаченою на триптофан консервативною поойдовшстю амшокислотних залишкiв четвертого домену. У четвертому домеш 6-токсину також мютиться единий на всю молекулу консервативний залишок цис-тешу в позицп 459, замiна або xiмiчна модифь кацiя якого викликае iнактивацiю токсину. Зйдно з результатами дослiджень крис-талiчноï структури мономера 6-токсину, цистеш-459 розташований мiж одним iз ß-стрендiв та збагаченою триптофаном петлею, що належить до четвертого домену. Замша або xiмiчна модифiкацiя цистешу-459 руйнуе укладку щiльно упакованих ß-струк-тур, серед яких вiн мютиться, що призво-дить до змши конформацп петлi, збагачено! триптофаном. Там змши ведуть до втрати здатноста ще! петлi взаемодiяти з холестеролом. Таким чином, мономер 6-токсину втра-чае можливють зв'язуватись iз холестеро-лом, що не дозволяе мономерам токсину концентруватись у збагачених на холестерол дiлянкаx мембран та формувати канальний олпомер. Той факт, що залишок цистешу та збагачена на триптофан С-термшальна по-слiдовнiсть е консервативними, свщчить про те, що аналопчш змiни вiдбуваються з уйма представниками родини ХЗЦ. Процес олпомеризацп 6-токсину передуе лiзису

кл^ин-мшеней i е його необxiдною перед-умовою. Багато олiгомерiв рiзниx ХЗЦ про-дукують подiбнi арко- та кiльцеподiбнi структури, якi близьк за розмiром i кiлькiстю субодиниць [18]. За результатами електрон-но-мшроскошчних дослiджень було запро-поновано уштарну модель каналу, утворено-го рiзними ХЗЦ. Згiдно з нею зовшшнш дiаметр вбудованого в мембрану олпомера лежить у межах вiд 30,0 нм до 45,0 нм за-лежно вщ кiлькостi мономерiв у структура яка може налiчувати 40-50 одиниць. Товщина станки олпомера становить близь-ко 6,5 нм. Олпомер мае два домени. Один iз них — це компактний внутршнш домен, у якому один мономер формуе контакти з вiдповiдними дiлянками шшого, а другий — видовжений зовшшнш домен зi знач-но меншою шльшстю контактiв мiж еквiва-лентними дiлянками сусiднix мономерiв. Внутршнш домен повторюеться кожнi 2,4 нм уздовж внутршньо! стiнки каналу. У поперечному розтиш олiгомер 6-токсину мае форму гриба заввишки 9,0-10,0 нм. Шжка гриба, до яко! належить четвертий домен з холестеролзв'язувальними структурами, пронизуе лшщний матрикс бшару i функцiонально вiдповiдае за процес лiзису клiтин. Перший домен кожного мономера утворюе контакт з аналопчним доменом суйднього мономера назовш мембрани та, разом з другим i четвертим доменами, розта-шовуеться у цилшдричнш нiжцi гриба, а третiй домен розмщений у капелюшку [19]. Показано, що 50 мономерiв 6-токсину утворюють гомоол^омерну iонпровiдну структуру з радiусом отвору 15,0 нм [17, 18]. Таким чином, утворення каналiв з великим розмiром отвору в плазматичнш мембранi клiтин-мiшеней, найiмовiрнiше, е основною причиною токсично! дп всix ХЗЦ.

Слщ зазначити, що iснують альтерна-тивнi припущення, згiдно з якими 6-токсин формуе отвори значно меншого внутршньо-го дiаметра — такого, як дiаметр каналiв, утворених полiеновими антибiотиками амфотерицином В, нiстатином i фШпшом, що становить близько 0,6-0,8 нм [19]. Бе-ручи до уваги те, що на електронних мшро-фотографiяx олiгомери 6-токсину та шших ХЗЦ окрiм замкнутих шльцевих структур також формують незамкненi аркоподiбнi утворення, можна припустити, що порож-нини каналiв 6-токсину вiдрiзняються вщ водних порожнин на зразок шДльного ß-ба-рильця, внутрiшня поверхня якого з уйх бокiв вистелена ланцюжками ß-складок проте'ну. Натомiсть, порожниною каналу

9-токсину може бути вузька щГлина мГж ß-складками, що пронизують клГтинну мембрану, та молекулами матриксу ïï лГпГдного бГшару.

Механiзми токсично!' дп актинопорину RTX та бактерiальних ß- i 9-токсинiв Clostridium perfringens

Для цитолГтичних токсинГв, до яких належать токсин актини Radianthus macrodac-tylus, а також ß- i 9-токсини бактерп Clostridium perfringens, цитотоксична функщя здГйснюеться переважно через зв'язування токсину з плазматичною мембраною клГтин-мГшеней i наступним формуванням трансмембранного канального олГгомера. ЛГзис клГтинно! мембрани i смерть клГтини вщбу-ваються завдяки протшанню ГонГв, води й Гнших фГзюлопчно важливих речовин всередину i назовш клГтини через воднГ по-рожнини канальних олГгомерГв, якГ утвори-лись у мембрань

Основними мГшенями для RTX е цито-плазматичнГ мембрани клГтин евкарюйв. НайбГльш специфГчне зв'язування з RTX вщбуваеться за присутностГ СМ у лГпГдному шарГ зовшшньо! мембрани клГтин-мГшеней [1]. ЗгГдно Гз сучасними поглядами на роль СМ у процесГ взаемодп RTX з лшщним бГша-ром мембран уведення цього лшщу до складу мембран, якГ мГстять холестерол (що характерно для евкарютав), мае призводити до щГльшшого упаковування лшвдв i формування лГпГдних мшродомешв, рафтГв, що сприяють роздГленню фаз у мембраш. 1снуе припущення, що утвореш при цьому дефек-ти лГтдного бГшару мембрани полегшують контакт токсину з лшщом, унаслГдок чого концентращя полГпептиду, необхГдна для формування канального олГгомера, може знижуватися. ОкрГм цього, за допомогою ка-лориметричних дослщжень було показано, що й СМ також здатен до специфГчного не-опосередкованого зв'язування з молекулою RTX. В експериментах з модифшацп тшей еритроцитГв людини i собаки шляхом оброб-лення з RTX показано, що крГм лГпГдГв цей токсин ще зв'язуеться з протешовими компонентами еритроцитарно! мембрани [20]. Залежна вщ процесу денатурацп певних мембранних проте!тв форма кривих, якГ було одержано на калориметрГ вГд препаратГв тГней еритроцитГв собак i людини, змшюва-лась тсля оброблення цих препаратГв цито-лГзином RTX. Одним з проте!тв, для якого було визначено денатуращю, е актин, струк-

турний проте'ш еритроцитарного цитоскеле-та. Можливо, локальнГ деформацп лГпГдного бГшару, якГ мають мГсце в процесГ утворення каналГв RTX у мембранах еритроцитГв, призводять до змш в оргашзацп !хнього лГпГдного матриксу, в результата чого вщбу-ваеться порушення зв'язку актину з мембраною. Не виключено, що вбудовування RTX в еритроцитарну мембрану прискорюе транс-мембранну мГгращю амшофосфолшадв Гз внутрГшнього шару в зовнГшнГй, що також призводить до порушення зв'язку актину з мембраною. Це порушення та поява ло-кальних дефектГв у матриксГ лГпГдного бГшару мембран е факторами, якГ доповню-ють деструкцГю мембран евкарютав, зумов-лену утворенням водних порожнин актино-порину, що е основою його токсично! дп. ЗгГдно з результатами, одержаними на штуч-них i нативних мембранах, канал RTX мае дГаметр близько 0,6-1,0 нм [1, 8]. Вольт-ам-перна характеристика одиничного каналу в асиметричних умовах, за яких вхГдний струм утворювали Гони калГю, а вихГдний — Гони натрГю, мае лГнГйний характер, що свщчить про близьку для К+ i Na+ селек-тившсть RTX-каналу.

Таким чином, пГсля зв'язування RTX з бюлопчною мембраною утворюються дов-гоживучГ ГонпровГднГ канали, що призводить до зникнення градГента К+ на мембранГ. НаслГдком цього процесу е те, що червона кров'яна клГтина-мГшень втрачае потенщал спокою i стае проникною для гемоглобшу, i це стае причиною деструкцп плазматично! мембрани.

9-токсин бактерГй Clostridium perfringens е шшим цитолГзином, який також вра-жае клГтини евкарютав. ПодГбно до актинопоришв основою токсично! дГ1 9-токсину е формування каналГв у плазматичнГй мембранГ клГтин-мГшеней [17]. СлГд зазначити, що холестерол, який виступае одшею з ос-новних характерних складових мембран ев-карютав, у випадку 9-токсину вГдГграе бага-тофункцГональну роль. ОкрГм того, що цей лшщ визнано високоспецифГчним рецептором для 9-токсину i всГх Гнших представникГв родини ХЗЦ, вГн ГнГцГюе олпомеризащю та вбудовування канального олГгомера в мембрану, а також стабШзуе структуру трансмембранного каналу, сформованого токсином. ВГдомо, що всГ ХЗЦ, до яких належить 9-токсин, мають схожГ механГзми токсично! дп. ПГсля взаемодп з холестеролом, що мГститься в плазмалемГ клГтин-мГшеней, вГдбуваеться олГгомеризацГя мономерГв токсину з наступним вбудовуванням сформованого

на мембраш канального олпомера в товщу матриксу ïï лшщного бiшару, супроводжу-ваним утворенням трансмембранного юн-провщного каналу, що призводить до ушко-дження мембрани. Первинне зв'язування мономерiв токсину з мембраною вщбуваеть-ся в збагачених на холестерол д^янках, що шщте процес зближення протомерiв i ïx взаемодiю з утворенням олюомерно! струк-тури на поверхш мембрани. Причому ступiнь взаемодiï мономерiв токсину та розмiр утво-реного ними олпомера залежить вiд концентрацп холестеролу в лшщному бiшарi мембрани [18, 19]. Отвори каналiв 6-токсину та iншиx ХЗЦ мають дiаметри, якi переви-щують 15 нм, що дозволяе широко викорис-товувати щ токсини як мембрано-пер-меалiзуючi агенти для потреб клгтинно! бюлогп [17].

Слiд зазначити, що дотепер не юнуе од-ностайност серед дослiдникiв стосовно структури водно! порожнини каналу 6-ток-сину та ïï розмiрiв. За даними електронно! мiкроскопiï внутрiшнiй дiаметр шльцепо-дiбниx структур, утворених олiгомером 6-токсину в мембранах лшосом, якi мютять холестерол, становить близько 20 нм [19], що шдтверджуеться високою юнною провщ-нiстю одиничних каналiв 6-токсину в плоских бшарових мембранах аналопчного лшщно-го складу [21]. Натомють, дiаметр провiдниx структур, утворених 6-токсином у мембранах фiбробластiв людини, не перевищуе той, що його було визначено для каналiв полiено-вих антибютишв, амфотерицину В та шста-тину, — 0,6-0,8 нм, що приблизно дорiвнюе розмiру молекули сахарози [19]. Беручи до уваги явну розбiжнiсть провщностей 6-ток-синових каналiв, визначену на нативних мембранах фiбробластiв i плоских бшаро-вих мембранах, а також наявшсть незамк-нених аркоподiбниx олiгомерiв, якi виявля-ються разом з кiльцевими на електронних мiкрофотографiяx, можна припустити, що окрiм великих водних порожнин, утворених цим токсином, юнуе й шший тип iонпровiд-них структур, у яких трансмембранний струм iонiв проходить через щДлини в мат-рикй лiпiдного бiшару на межi лшщу i ß-складчастостей трансмембранного домену 6-токсину.

Цитотоксичний меxанiзм ß-токсину, який також продукуе бактерiя Clostridium perfringens, дотепер остаточно не визначено. Б!льш того, незрозум^о, чи ß-токсин взагалi дiе як цитолiзин для вйх типiв бiологiчниx мембран, як вiн може модифiкувати. До 2003 р. юнувала лише одна публшащя,

в якiй висловлювалось припущення про те, що вплив ß-токсину на кл^ини 407 кишечника хребетних може бути результатом його цитолгтично! дп [12]. Деякi дослiдники вважають, що така дiя ß-токсину насправдi е результатом незначних домшок у його препа-ратi й не пов'язана iз самим токсином [5]. Думка про те, що ß-токсин, подiбно до ци-толiзинiв, здатен до каналоутворення, ви-словлювались на пiдставi досить слабко! 10%-ï iдентичностi його первинно! структури з такою, що була визначена для а- i у-ге-молiзину та лейкоцидину iз Stafilococcus aureus [10, 11].

Нещодавно було показано, що ß-токсин зумовлюе вив^ьнення арахщоново! кислоти та шозитолу iз клiтин ендотелiю людини, що супроводжуеться утворенням рiзного розмiру отворiв трансмембранних каналiв у плазматичнiй мембраш клгтин-мшеней [12]. Беручи до уваги невизначешсть бiль-шостi дослiдникiв щодо цитол^ично! актив-ностi ß-токсину, а також те, що iз впливом ß-токсину пов'язують некроз певних тканин людей i хребетних тварин, у шзшших роботах було дослщжено дт токсину на культуру кл^ин HL 60 [3]. Виявилось, що ß-токсин спричинюе набрякання i лiзис цих клгтин. Оброблення кл^ин ß-токсином призводило до витоку К+ назовнi, натомiсть iони Са2+, Na+ i Cl- надходили всередину клгтин. Зазна-ченi подiï досягали свого максимального розвитку перед лiзисом плазмалеми. За допомогою шкубацп кл^ин HL 60 з ß-токси-ном було доведено утворення двох тишв олi-гомерiв — гептамеру i гексамеру — в д^янках плазматичних мембран, яш за-довольняли критерiям рафтiв. Блокування зв'язування ß-токсину з мембранними рафтами з використанням метил^-циклоде-кстрану або холестеролоксидази унемож-ливлювало появу вхщного струму К+, iнду-кованого ß-токсином, i наступне розбухання та лiзис зовшшньо! мембрани клiтин HL 60. Таким чином, зв'язування ß-токсину з рафтами кл^инних мембран i вбудовування його канального олпомеру в плазматичну мембрану е необхщними умовами цитоль тично! дiï. Високоспецифiчна взаемодiя ß-токсину з нативною мембраною вщбуваеть-ся опосередковано через мехашзм, в якому задiяний таxiкiнiновий рецептор НК1 [16]. Зважаючи на те, що вхщний потiк Са2+ всередину клгтин-мшеней повнiстю блокував-ся молекулами полiетиленглiколю 600 i 1 000, було зроблено висновок, що дiаметр отвору каналу, утвореного ß-токсином у мембраш кл^ин HL 60, становить близько

1,3 нм. Показано, що з двох титв ол1гоме-р1в, як1 в-токсин утворюе в рафтах цих кль тин, т1льки гептамер здатен формувати функцюнальний 1онний канал у бюлопчнш мембран1 [3].

Дослiдження юнних каналiв природних

або рекомбiнантних цитолггичних токсинiв та 1хньо*1 можливо'1 ролi у лiзисi уражених токсинами кл^ин за допомогою реконструкцп в штучних лiпiдних бiшарах

Оск1льки д1я вс1х розглянутих в цьому огляд1 цитотоксишв може бути опосередко-ваною через утворення юнних канал1в у плазматичних мембранах кл1тин-м1ше-ней, для перев1рки цього припущення 1 виз-начення впливу низки ф1зюлог1чно важливих чиннишв на вбудовування та функцюнуван-ня юнпровщних канал1в зазначених токси-шв у л1п1дному б1шар1 мембрани досль джували 1хню взаемод1ю з1 штучними лшщними б1шарами БЛМ 1 лшосом. З огля-ду на те, що утворення катюнних канал1в у лшщному б1шар1 плазматично1 мембрани е одним з необхщних етап1в, як1 передують л1зису вражено1 токсинами кл1тини, особли-вий 1нтерес становлять дослщження юнселек-тивних властивостей канал1в, реконструйованих у плоску б1молекулярну л1п1дну мембрану, — БЛМ. Досл1дження юнпровщних властивостей модиф1кованих токсинами БЛМ е простим та шформативним методом визна-чення утворення 1 властивостей р1зних юн-пров1дних проте1нових ол1гомер1в. Для дослщження взаемодп плоского л1п1дного б1шару з очищеними каналоформерами часто використовують електронейтральш БЛМ, сформован1 з розчину фосфатидилхолшу в сум1ш1 з холестеролом у стввщношенш 2:1, вщповщно. Сум1ш л1п1д1в розчиняють у неполярному розчиннику, наприклад в де-кан1 або н-гепташ, а пот1м наносять на отв1р д1аметром 0,18-0,6 мм у тефлоновому або делриновому стаканчику, розм1щеному в ком1рщ з1 скла чи плексигласу. Окр1м за-значеного типу БЛМ дослщники також використовують так звану «суху» БЛМ, сфор-мовану 1з двох л1п1дних моношар1в по р1зн1 боки отвору стаканчика [22]. Для запобшан-ня ефекту поляризацп у водно-сольових роз-чинах провщнють мембрани вим1рюють хлороср1бними електродами, як1 занурен1 у водний розчин 2 М КС1 з агаровими мют-ками, розм1щеними з р1зних бок1в БЛМ. По-тенц1ал зовш тефлонового або делринового

стаканчика (цис-сторона) зазвичай задаеть-ся вщносно потенц1алу внутр1шнього об'ему (транс-сторона), який приймають р1вним в1ртуальному 0 мВ (рис.).

4

Рис. Схема експериментального приладу для визначення провщносп плоских бшарових мембран, модифжованих каналоформувальними сполуками:

1 — джерело напруги;

2 — електроди;

3 — бшарова мембрана у водно-сольовому роз-

чиш;

4 — прилад для електричних вимipiв;

5 — самописець

Для дослщжень будови зв'язаного з мембраною ол1гомера 6-токсину використовують також штучний б1шар л1посом, утворених обробленням ультразвуком або пропусканням сум1ш1 л1п1д1в через мемб-ранн1 ф1льтри з певним розм1ром пор, що зумовлюе ушфшований розм1р отриманих на ньому лшосом [18]. Враховуючи те, що в раз1 плоского б1шару БЛМ або шаропо-д1бного замкнутого б1шару л1посом молеку-ли цитол1тичних пpотеiнiв вбудовуються i пот1м функцюнують у нанопростор1 л1п1д-ного бшару, можна вважати, що модифiко-ваш олiгомеpами цитолiтичних токсинiв лiпосоми, як i БЛМ, е об'ектами поpiвнян-них методiв дослiджень.

Хоча б^ьшють дослiджень гемолiтично-го RTX-токсину проводили на препаратах токсину, iзольованих iз гомогенату тканин актинИ Radianthus macrodactylus [1, 7], у випадках ß- i 6-токсинiв бактерИ Clostridium perfringens досить часто дослщники послуговуються рекомбшантними формами цих пpотеiнiв. Так, у роботах [23-25] реком-бшантш ß- i 6-токсини бактерИ Clostridium perfringens отримували експрейею в елект-рокомпетентних клiтинах бактерИ Escherichia coli. Для цього у pазi дослщжень будови

зв'язаного з мембраною олГгомеру 9-токсину ген його безцистешового похГдного, в якому цистеш-459 було замГнено на аланш, клонува-ли у вектор експресп рТгеН1вА (Invitrogen, США) з використанням сайтГв BamHI та EcoRI. Похщш 9-токсину, у яких методом точ-кового мутагенезу дослГджувану амГнокислоту замшяли на цистеш, мГтили флуоресцентним барвником йодоацетамГд-^№-диметил^-(йодоацетил)-N/-(7-нiтробенз-2-oксо-1,3-дГазолГл)етилендГамГн — NBD (Molecular probes, Eugene, США), який утворював ко-валентш зв'язки з цистешом. Якщо пГсля вбудовування в бГшар лГпосом замГнена на цистеш амГнокислота мГченого барвником мутанта 9-токсину мГстилась поза лГпГдним оточенням, флуоресценщя барвника знижу-валась пГд дГею молекул водно-сольового оточення мембрани. У протилежному разГ, коли дослГджувана амГнокислота була в товщГ бГшару, флуоресценщя, навпаки, збГльшу-валась. Таким чином, метод точкового мутагенезу давав змогу визначати структурн пе-ретворення певних дГлянок розчиненого у водному середовищГ мономера рекомбь нантного 9-токсину тд час взаемодп з лшщ-ним бГшаром мембрани лГпосом.

Ще одним прикладом поеднаного вико-ристання точкового мутагенезу i БЛМ було розглянуте в робота дослГдження юнпровщ-них властивостей рекомбГнантного ß-токси-ну бактерп Clostridium perfringens, для яко-го зменшення здатноста до каналоутворення пюля замГни залишку аргГнГну-212 на аспар-тат супроводжувалось значним збГльшен-ням LD50, визначено! на мишах. У цьому разГ поеднання двох наукових методГв дослГдження допомогло дшти висновку про тГсний зв'язок юнпровщно! спроможностГ досль джуваного протешу з його токсичнютю [25].

Вбудовування юнних кана.мв цитолiтичних токсинiв у лшвдний бiшар i фактори впливу на каналоутворення

ОкрГм важливого значення для подаль-ших дослщжень будови i функцш каналу, факт реконструкцп е також досить шформа-тивним сам по собь Так, уперше проведена реконструкщя каналГв RTX-токсину актинп Radianthus macrodactilus та ß-токсину бактерп Clostridium perfringens у БЛМ довела здатшсть цих токсишв до утворення юнних каналГв у лшщному бГшарГ плазматичних мембран i дозволила припустити, що утво-рення каналГв може бути причиною токсично! дп цих протеИшв [8, 25]. Це припущення

дютало подальше шдтвердження у вже роз-глянутому вище випадку з реконструкщею рекомбГнантного ß-токсину в БЛМ, для яко-го замГна аргшшу 212 на аспартат в геш ß-токсину зумовила значне пГдвищення LD50 рекомбГнантного токсину в мишей i майже позбавляла його здатноста формувати канал [25]. Таким чином, хГмГчний склад ß-токси-ну е важливим чинником впливу на його каналоутворення i токсичну дГю.

Збп форми найбГльшого тку провщнос-тей гГстограми одиничних каналГв 9-токси-ну Clostridium perfringens з формою тку на денситометричнш трасГ розподГлу його олГгомерГв, одержанГй на SDS-агарозному гелГ, дае пГдстави вважати, що юнпровщним е саме олГгомер токсину, а не розчинеш у водГ мономери або невеликГ олГгомери на зразок димерГв [18]. Причому, з огляду на те, що олГгомер 9-токсину Clostridium perfringens збГльшував провщшсть БЛМ стриб-коподГбно, а не поступово, було зроблено висновок, що олпомеризащя цього токсину на поверхш мембрани передуе вбудовуван-ню готового олГгомеру через всю товщу бГшару, яке супроводжуеться появою мембранного струму.

Виходячи з одержаних результатав можна стверджувати, що двовалентш катюни значно прискорюють пГдвищення трансмембранного струму переважно через збГль-шення швидкоста вбудовування в БЛМ каналГв, утворених RTX- та ß-токсинами [8, 25]. ОскГльки юнпровГдш структури цих токсишв утвореш олпомерами, можна при-пустити, що двовалентнГ катюни сприяють змшам структури непровГдних мономерГв, якГ полегшують процес утворення четвер-тинно! структури в лГпГдному бГшарГ мембрани. Також можливо, що двовалентнГ катюни здатш Гндукувати або тдсилювати роздГлення фаз у лшщному бГшарГ. При цьому зростае шлькють динамГчних дефектГв, чим може полегшуватися вбудовування про-те!ну в мембрану. Враховуючи отримаш на БЛМ дат, активуючим впливом двовалент-них катюшв на утворення каналГв можна пояснити сприяння вивГльненню арахГдоно-во! кислоти з клГтин HUVEC, яке вщбува-лось пГд впливом ß-токсину в середовищГ з Са2+ [12], та активащю двовалентними катГонами гемолГзу еритроцитГв токсином RTX [25].

Ще одним чинником ютотного впливу на швидкГсть утворення RTX-каналГв е наяв-нГсть сфшгомГелшу (СМ) у лГпГдному складГ бГшару. ОскГльки вГдомо, що мембрани, якГ мГстять СМ, характеризуються вираженим

розд^енням фаз, то вважають, що в основi дп двовалентних катюшв i СМ на вбудову-вання RTX у мембрану лежать подiбнi про-цеси [8].

1ншим фактором, який впливав як на швидшсть вбудовування поодиноких ка-налiв цитол^ичних токсинiв, так i на !хню провiднiсть, був мембранний потенцiал. ß-Токсин значно iнтенсивнiше вбудовувався в мембрану за негативного потенщалу [25], що може свщчити про iснування в трансмембранному домеш цього протешу негативно заряджено! iоногенноï групи, яка стимулюе процес залежного вщ потенщалу утворення каналiв.

Рiст провiдностi БЛМ, шдуковано! утво-ренням каналiв RTX, вщбуваеться незалеж-но вiд знака потенщалу, хоча шльшсть ка-налiв, вбудованих в БЛМ за одиницю часу, зб^ьшувалась зi зниженням абсолютно! ве-личини потенцiалу [8].

Молекулярний мехашзм вбудовування в бiшарову мембрану i формування каналу для 6-токсину бактерп Clostridium perfringens досить детально було показано на лшо-сомах [17]. Для безпосереднього визначення оточення, в якому мютиться та чи шша амшокислота у зв'язаному з мембраною олiгомерi цього токсину, залишок дослщжу-вано! амiнокислоти було замщено на цистеш i ковалентно модифшовано, щоб з'еднати сульфгiдрильну групу цистешу з флуоресцент-ним барвником NBD [23]. Такий шдхщ ви-магав безцисте'шового мутанта 6-токсину. Тому в таких роботах використовували ре-комбшантний проте'ш — безцисте'шове поxiдне, у якому единий природний цис-теш-459 замiнено на аланiн, що не спричи-нило змiн у функщональному станi протешу. NBD було вибрано як флуоресцентний зонд тому, що штенсившсть його емюп i тривалють життя суттево зростали з переходом з водного оточення в гщрофобне сере-довище лшщного бiшару. Пiсля порiвняння iнтенсивностi флуоресценцп зв'язаних з мембраною i мiчениx NBD мутантiв 6-ток-сину i ïxrnx водорозчинних мономерiв було виявлено пал^ру значень iнтенсивностi, якi узгоджуються з розгортанням а-спiралi дiлянки у промiжку мiж залишками 288 i 311 в амфшатичну ß-шпильку в матрикй лiпiдного бiшару мембрани холестерол-вмюних лiпосом [24]. Отриманi результати дають шдстави вважати, що амiнокислоти зазначено! дiлянки утворюють у мембранi амфшатичну ß-складчастасть, один бiк яко! повернутий у водне середовище порожнини каналу, а другий — у лшщний бшар. Бiльш

того, цi результати збшалися з результатами аналогiчниx експерименйв, проведених ранiше з iншою д^янкою 6-токсину мiж серином-190 i аспарагшом-217 [23], що свiд-чить про участь обох цих д^янок у процей утворення трансмембранних шпильок. От-же, мономер 6-токсину розгортае двi пари а-спiрaлей у двi пари ß-складок при вбудову-вaннi в лiпiдний бiшaр мембрани, на вщмшу вiд вiдомиx дотепер каналоформувальних токсишв iншиx родин, у трансмембранному домеш яких мютиться лише одна пара амфь патичних а-сшралей [26] або одна ß-шпиль-ка [27]. Осшльки основнi влaстивостi, ха-рaктернi для aмфiпaтичноï ß-шпильки, е консервативними у вйх ХЗЦ зi встановле-ною первинною структурою, вiрогiдно, що нaявнiсть двох ß-шпильок, що пронизують бшар мембрани, буде показано для уйх предстaвникiв цiеï родини токсишв.

1онпроввдш властивост1

цитотоксинових KaHa.nÏB i чинники, як! на них впливають

Вiдомо, що меxaнiзм дп багатьох канало-формуальних токсинiв залежить вщ iонпро-вiдниx властивостей кaнaлiв, утворених ци-ми токсинами в плазматичнш мембрaнi клiтин-мiшеней. Тому наступним етапом дослщжень цитолiтичниx токсинiв шсля вбудовування було визначення iонпровiд-них властивостей утворених в лшщному бiшaрi кaнaлiв пiд дiею рiзниx фaкторiв се-редовища i штучних чиннишв впливу. Для з'ясування ролi токсинових кaнaлiв у бiоxi-мiчниx процесах, яш вiдбувaються на рiз-них рiвняx структурно! оргaнiзaцiï враже-ного токсином оргашзму, особливу увагу придьляли впливу змiн xiмiчного складу токсишв, що дослщжувалось за допомогою рекомбшантних форм токсинiв на модифi-кованих токсинами бюлопчних i штучних мембранах та тваринах.

Дослщження зaлежностi провщносй кaнaлiв RTX-токсину вiд температури нав-колишнього водно-сольового середовища показали, що енерпя aктивaцiï провiдностi ка-нaлiв RTX у БЛМ, оточенш розчином 100 мМ КС1, практично не залежала вщ спiввiдно-шення компонентав мембрани i були близьш до тако! для провiдностi кaнaлiв а-латро-iнсектотоксину iз отрути каракурта [28, 29]. Останнш факт може свщчити про сxожi розмiри отворiв кaнaлiв, утворених RTX та а-латрошсектотоксином в БЛМ, що дiстaло подальше шдтвердження при визнaченнi

впливу коркових блокаторГв метошевого ряду та новГтнього блокатора пасивного транспортування юшв — хлориду 3-децило-ксикарбошлметил-4-метил-5-^-гГдроксь етил)тГазолГю (ДМГТ) [28].

Безпосередне транспортування ГонГв каналами RTX- та ß-токсину залежало вГд мембранного потенцГалу та юнного складу середовища навколо модифшованого токсинами БЛМ. ГемолГтичний токсин актинп RTX утворював у мембраш катюнш канали, переважно селективнГ до К+ та Na+, що може мати наслГдком збГльшення пасивного транспортування цих юшв через плазма-тичн мембрани еритроцитГв у разГ вбудовування RTX-каналГв [8]. ДеякГ дослщники вважають, що вихГд ГонГв калГю з еритроцитГв каналами RTX-токсину спричинюе значне збГльшення осмотичного тиску на плазматичну мембрану уражено'1 клГтини, що призводить до ïï розриву i е основною причиною шдукованого RTX гемолГзу [1].

Безпосередне транспортування ГонГв ß-токсиновими каналами також е вибГрковим тГльки для одновалентних катюшв (Na+, К+), що може спровокувати незворотну деполяри-зацГю збудливо'1 мембрани автономних i пе-риферичних нервово-м'язових сполучень хребетних шсля утворення в них каналГв ß-токсину. Як i в разГ з RTX-токсином, утворення ß-токсинових каналГв у плазматичнш мембранГ клГтин культури HL 60 також збГльшувало трансмембраннГ потоки К+ i Na+ i призводило до набрякання та лГзису клГтини, що може бути причиною некротич-ного ентериту у свшських тварин [3].

Той факт, що на вщмшу вГд RTX та низки Гнших токсишв ß-токсиновий канал можна було заблокувати лише Гонами цинку [25], свГдчить про певну вщмшшсть структури катюнселективного сайту цього каналу вГд Гнших.

ОкрГм цього, причиною певних розбГж-ностей вибГрковостГ до Гонних блокаторГв i провщност токсинових каналГв у БЛМ можуть бути рГзш геометричн розмГри '1хшх водних порожнин. Тому важливу роль вщь гравали дослГдження впливу рГзних молекул неелектролтв (полГетиленглГколГ, сахароза тощо) на провщшсть каналГв цитолГтичних токсинГв з метою визначення i порГвняння розмГру отворГв ГонпровГдних олГгомерГв у мембранГ.

Препарати ß-токсину утворювали в БЛМ два основних шки провщност — при 110 i 60 пСм [25]. Було показано, що пасивне транспортування K+ через пори ß-токсино-вих каналГв з провщшстю 110 i 60 пСм най-

краще блокувалось молекулами полГетилен-глшолГв з приблизними гГдродинамГчними радГусами 1,27 i 1,11 нм [25] вГдповГдно або, згГдно з Гншими джерелами, 1,3 i 1,6 нм [3]. Це свГдчить про утворення двох титв ка-нальних олГгомерГв (гепта- i гексамерГв), ха-рактерних для цитолГтичних токсинГв на зразок а-гемолГзину. Причому, лише бГль-ший за розмГром гептамер з молекулярною масою 228 кДа вбудовуеться в лшГдний бГшар клГтин внутрГшнього епГтелГю хребетних HL 60, тодГ як менший за молекулярною масою i, ймовГрно, розмГром отвору каналу гексамер (191 кДа) не функцюнальний через те, що залишаеться в лГпГдному рафтГ клГтини [3]. Варто зазначити, що досить велит розмГри отворГв обох олГгомерГв ß-токсину дозволяють вщбуватись не лише деполяри-заци плазматично'1 мембрани вражених клГтин завдяки безпосередньому транспор-туванню ГонГв (К+, Na+), але також i вивГль-ненню з них вторинних посередникГв арахь доново'1 кислоти та шозитолу, що може впливати на змшу внутрГшньоклГтинно'! концентрацп Са2+ i внаслщок цього на нерво-ву передачу в автономнш i периферГйнГй нервових системах хребетних [5, 25]. Серед симптомГв враження ß-токсином нервово'1 системи хребетних, що пов'язаш з деполя-ризащею нервових тканин або дефГцитом шозитолу, — раптовГ передсмертнГ скоро-чення м'язГв у мишей, змГна артерГального тиску i ритму серцебиття. ОкрГм цього, нес-тача арахГдоново'! кислоти та шозитолу, що в змшеному виглядГ входять до складу фос-фолГпГдГв клГтинно'! мембрани, порушуе обмш лГпГдГв i може спричинити порушення щлюностГ епГтелГальних клГтин, викликаю-чи появу рГзних некрозГв.

РадГус вхщного отвору каналу RTX було визначено шляхом аплшацп блокаторГв ме-тошевого ряду на Гндукований токсином трансмембранний потш К+. ОскГльки з усьо-го ряду використаних алкГламонГ'1в тетрабу-тиламонГй з радГусом молекули 0,55 нм був найефектившшим, можна вважати, що внутрГшнш радГус каналу RTX такий самий [8]. Паралельно проведене визначення роз-мГрГв отвору а-латрошсектотоксинового каналу (0,53 нм) [28] шдтвердило зроблене ранГше припущення про те, що Гони калГю долають однаковий активацшний бар'ер у порожнинах каналГв а-латрошсектотокси-ну i RTX через подГбний розмГр '1хнього внутрГшнього дГаметра. З огляду на розмГр молекули гемоглобГну ефективний радГус отвору каналу, здатного забезпечити вихГд гемоглобГну з еритроцита через внутрГшню порож-

нину каналу, мае бути не меншим, шж 3,35 нм [8], що набагато перевищуе визначе-ний розмiр отвору каналу RTX. Даш про розмiр отвору каналу RTX тдтверджують гшотезу про те, що спричинений RTX лiзис еритроцитав, нaйiмовiрнiше, пов'язаний з осмотичним шоком внаслщок виходу К+ iз вражено! клiтини [1] або руйнуванням плаз-матично! мембрани в результата вбудовування багатьох кaнaлiв [8], що також порушуе цитоскелет клгтини [1].

Натомють, юнш канали ще одного гемо-л^ичного протешу — 6-токсину бaктерiï Clostridium perfringens утворювали в плос-кш фосфолiпiднiй мембрaнi з холестеролом майже не вибiрковi одиничнi канали дуже високо! провiдностi — 4-6 нСм [18, 21], що свiдчить про великий розмiр ïxнix отворiв. Останне припущення тдтверджувалось да-ними електронно! мiкроскопiï, згiдно з яки-ми рaдiус внутрiшнього отвору кiльцеподiб-но! гомоолiгомерноï iонпровiдноï структури становить приблизно 15 нм [17, 18]. Той факт, що канальний олпомер 6-токсину складений з багатьох (50) мономерiв, також свщчить про утворення цим токсином юнних кaнaлiв з великим розмiром отвору, який згщно з даними [17, 18] у 5 рaзiв б^ь-ший за розмiр молекули гемоглобiну. 1мо-

вiрно, значний розмiр отвору 6-токсинового каналу i е основною причиною його цитоль тично! дiï. Останне припущення тдтверд-жуеться тим, що цей проте'ш може значно ефектившше за гемол^ичш токсини з меншим розмiром отворiв каналу руйнувати еритроцити, спричинюючи порушення кро-вообiгу, внаслщок чого швидше утворюються глибокi некротичш змiни уражених тканин, якi можуть стати причиною xiрургiчного втручання [17].

Таким чином, реконструкщя або вщтво-рення процейв побудови i функцiонувaння iонниx кaнaлiв природного токсину RTX ак-тинп Radianthus macrodactilus та ре-комбшантних, генетично змiнениx шляхом внесення точкових мутацш, ß- i 6-токсинiв бактерп Clostridium perfringens дала мож-ливють визначити меxaнiзми утворення ци-ми протешами кaнaлiв у лiпiдному бiшaрi мембрани, !хню структуру та можливу роль у процесах, що зумовлюють лiзис кл^ин або впливають на нервово-м'язову передачу. Окрiм цього, реконструкщя юнних кaнaлiв цитолiтичниx токсинiв, е важливим етапом, що необхщний для створення зaсобiв лiку-вання токсичних уражень шляхом блоку-вання струму юшв через канали токсинiв.

Л1ТЕРАТУРА

1. Монастырная М. М. Исследование структуры и мембранолитического действия поро-формирующих токсинов актиний: Автореф. дис. докт. хiм. наук.: 02. 00. 10 / Тихооке-анський ш-т бiооpг. хiмii, Владивосток, 2006. — 51 с.

2. Хартманн У. Очарование нанотехнологии. — Бином: Лаборатория знаний, 2010. — 173 с.

3. Nagahama M, Hayashi S., Shinsuke M. et al. Biological activities and pore-formation of Clostridium perfringens beta toxin in HL 60 cells // J. Biol. Chem. — 2003. — V. 278, N 38. — P. 36934-36941.

4. Vidal J. E., McClane B. A., Saputo J. et al. Effects of Clostridium perfringens Beta-Toxin on the Rabbit Small Intestine and Colon // Infect. Immun. — 2008. — V. 76. — P. 4396-4404.

5. Tweten R. K. Clostridium perfringens beta toxin and Clostridium septicum alpha toxin: their mechanisms and possible role in patho-genesis // Veterinary Microbiology. — 2001. — V. 82. — P. 1-9.

6. Flanagan J. J., Tweten R. K., Johnson A. E., Heuck A. P. Cholesterol Exposure at the Membrane Surface Is Necessary and Sufficient to Trigger Perfringolysin O Binding // Biochemistry. — 2009. — V. 48, N 18. — P. 3977-3987.

7. Клышко Е. В., Ильина A. П., ЛихацкаяГ. Н. Актинопорины: структура и функция // Вестник ДВО РАН. — 2004. — № 3. — С. 45-53.

8. Чантурия А. Н., Шатурский О. Я., Лиш-ко В. К. и др. Взаимодействие токсина морской актинии Radianthus macrodactylus с бислойными фосфолипидными мембранами // Биол. мембраны. — 1990. — Т. 7. — С. 763-769.

9. Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. — 2002. — V. 40, N 2. — P. 111-124.

10. Gouaux E. alpha-Hemolysin from Staphylo-coccus aureus: an archetype of beta-barrel, channel-forming toxins // J. Struct. Biol. — 1998. — V. 121, N 2. — P. 110-122.

11. Hunter E. S., Brown J. E., Oyston P. C. F. et al. Molecular genetics analysis of beta-toxin

of Clostridium perfringens reveals sequence homology with alpha-toxin, gamma-toxin, and leukocidin of Staphylococcus aureus // Infect. Immun. — 1993. — V. 61, N 9. — P. 3958-3965.

12. Steinthorsdottir V., Halldorsson H., Anders-son O. S. Clostridium perfringens beta-toxin forms multimeric transmembrane pores in human endothelial cells // Microb. Pathog. — 2000. — V. 28. — P. 45-50.

13. Carvalho A. V. A., Heneine L. G. D., Assis R. A. et al. Production and purification of beta-toxin from Clostridium perfringens type С // Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. — 2006. — V. 58, N 2. — P. 276-278.

14. Hunter E. S., Brown J. E., Oyston P. C. F. et al. Molecular genetics analysis of beta-toxin of Clostridium perfringens reveals sequence homology with alpha-toxin, gamma-toxin, and leukocidin of Staphylococcus aureus // Infect. Immun. — 1993. — V. 61, N 9. — P. 3958-3965.

15. Steinthorsdottir V. Fridriksdottir V., Gun-narsson E. et al. Site-directed mutagenesis of Clostridium perfringens beta-toxin — expression of wild type and mutant toxins in Bacillus subtilis // FEMS Microbiol. Lett. — 1998. — V. 158. — P. 17-23.

16. Nagahama M., Morimitsu S., Kihara A. et al. Involvement of tachykinin receptors in Clostridium perfringens beta-toxin-induced plasma extravasation // Br. J. Pharmacol. — 2003. — V. 138. — P. 23-30.

17. Tweten R. K. Cholesterol-dependent cyto-lysins, a family of a versatile pore — forming toxins // Infect Immun. — 2005. — V. 73, N 10. — P. 6199-6209.

18. Shepard L. A., Shatursky O., Johnson A. E. et al. The mechanism of pore assembly for a cholesterol-dependent cytolysin: formation of a large prepore complex precedes the insertion of the transmembrane ß-hairpins // Biochemistry. — 2000. — V. 39. — P. 10284-10293.

19. Rossjohn J., Feil S. C., McKinstry W. J. et al. Structure of a cholesterol-binding, thiol-activated cytolysin and a model of its membrane form // Cell. — 1997. — V. 89, N 5. — P. 685-692.

20. Monastyrnaya M. M., Kozlovskaya E. P., Elyakov G. B. Hemolysins from sea anemones: investigation of mechanism of action

// J. Toxicol. — 1990. — V. 9, N 1. — P. 82.

21. Menestrina G. Bashford C. L., Pasternak C. A. Pore-forming toxins: experiments with S. aureus alpha-toxin, C. perfringens theta-toxin and E. coli haemolysin in lipid bilayers, liposomes and intact cells // Toxicon. — 1990. — V. 28, N 5. — P. 477-491.

22. Ide T., Ichikawa T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation // Biosensors and Bioelectronics. — 2005. — V. 21, N 4. — P. 672-677.

23. Rossjohn J., Shepard L. A., Heuck A. P. et al. Identification of a membrane-spanning domain of the thiol-activated pore-forming toxin Clostridium perfringens perfringolysin O: an alpha-helical to beta-sheet transition identified by fluorescence spectroscopy // Biochemistry. — 1998. — V. 37, N 41. — P. 14563-14574.

24. Shatursky O. Ya., Heuck A. P., Shepard L. A. et al. The mechanism of membrane insertion for a thiol-activated cytolysin: a new paradigm for pore-forming toxins // Cell. —

1999. — V. 99. — P. 293-299.

25. Shatursky O. Ya., Bayles R., Rogers M. et al. Clostridium perfringens beta-toxin forms potential-dependent, cation-selective channels in lipid bilayers // Infect. Immun. —

2000. — V. 68, N 10. — P. 5546-5551.

26. Oh K. J., Zhan H., Cui C. et al. Organization of diphtheria toxin T domain in bilayers: a site-directed spin labeling study // Science. — 1996. — V. 273, N 5276. — P. 810-812.

27. Benson E. L., Huynh P. D., Finkelstein A. et al. Identification of residues lining the anthrax protective antigen channel // Biochemistry. — 1998. — V. 37, N 11. — P. 3941-3948.

28. Shatursky O. Ya., Volkova T. M., Romanen-ko O. V., Grishin E. V. Vitamin B1 thiazole derivative reduces transmembrane current through ionic channels formed by toxins from black widow spider venom and sea anemone in planar phospholipids membranes // Biochim. Biophys. Acta. — 2007. — V. 1768.— P. 207-217.

29. Shatursky O. Ya., Pashkov V. N., Bulgacov O. V., Grishin E.V. Interaction of a-latroinsectotox-in from Latrodectus mactans venom with bilayer lipid membranes // Ibid. — 1995. — V. 1233. — P. 14-20.

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ИОНПРОВОДЯЩИХ КАНАЛОВ ЦИТОЛИТИЧЕСКИХ ПРОТЕИНОВ ПРИ РЕКОНСТРУКЦИИ

В ИСКУССТВЕННЫХ ЛИПИДНЫХ БИСЛОЯХ

О. Я. Шатурский

Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев

E-mail: [email protected]

Особую роль при патологиях, возникающих вследствие образования цитолитически-ми токсинами протеинов ионных каналов в плазматической мембране пораженных клеток, играет пассивная транспортировка каналами токсинов неорганических ионов и органических соединений, которые принимают участие в обмене веществ или являются важными составляющими клетки. Поэтому исследование процесса образования и функционирования ионных каналов цитолитичес-кими токсинами является важным для определения строения канального олигомера в плазматической мембране клетки-мишени и механизмов лизиса клетки.

Цитолитическое действие рассмотренных в работе протеиновых токсинов осуществляется путем увеличения непосредственной транспортировки неорганических ионов через нативные мембраны пораженных клеток и высвобождения их внутренних компонентов (протеинов, органических кислот и т. п.). Это связано с образованием токсинами ион-проводящих олигомеров — каналов в липид-ном бислое плазматической мембраны. Реконструкция ионных каналов цитолитических протеинов в искусственных бислойных ли-пидных мембранах и липосомах дает возможность исследовать их образование и функционирование, что важно для определения структуры ионпроводящего олигомера и механизма его токсического действия с целью лечения токсических поражений путем блокирования тока ионов через каналы токсинов. Основное внимание в обзоре уделено обсуждению закономерностей образования и свойств сравнительно недавно реконструированных ионпроводящих олигомеров нейро- и дерма-токсичного ß-токсина бактерии Clostridium perfringens, а также гемолитических 6-токси-на бактерии Clostridium perfringens и RTX-токсина Radianthus macrodactilus.

Ключевые слова: бислойная липидная мембрана, ионные каналы, ß- и 6-токсины Clostridium perfringens, RTX-токсин Radianthus macrodactilus.

CHANNEL FORMATION AND FUNCTIONING REGULARITIES

FOR CYTOTOXIC PORE-FORMING PROTEINS UNDER RECONSTRUCTION INTO ARTIFICIAL LIPID BILAYERS

O. Ya. Shatursky

Palladian Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

E-mail: [email protected]

Passive transporting of inorganic ions and organic compounds, that take part in metabolism or are the important cell constituents plays a special role in pathologies resulting from cytotoxic proteins channel creation into a target cells plasma membrane. Therefore, research of cytotoxic proteins channel creation and functioning is important for determination of a channel oligomer structure in a target cells plasma membrane and the mechanisms of cell destruction.

Cytolytic effect of protein toxins reviewed is carried out via direct transporting increase of inorganic ions through the native membranes of the target cells and release of their interior components (toxic protein channels). It is associated with formation of ion-conducting oligomers — channels in lipid bilayer of plasma membrane — by toxins. These pore-forming proteins reconstruction into bilayer lipid membranes and liposomes allows to research their channel formation and functioning that provides a possibility to investigate the cytolytic protein pore structure and action mode aiming cells lysis prevention via blocking of ionic current across toxin channels. Most of the review is focused on regularity of creation and properties for relatively recent reconstructed ion-conductive oligomers of neuro- and dermatoxic P-toxin from bacteria Clostridium perfringens, another haemolytic 6-toxin of Clostridium perfringens and actoporine RTX of Radianthus macrodac-tilus.

Key words: bilayer lipid membrane, ion channel, Clostridium perfringens ß- and 6-toxin, Radianthus macrodactilus RTX toxin.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬН1 СТАТТ1

УДК 577.113.4:546.28:546.212

ГИДРАТНЫЕ СВОЙСТВА КОМПОЗИТНОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ ВЫСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЕМА И ДНК

В. В. Туров1 1Институт химии поверхности им. А. А. Чуйко

В. Н. Барвинченко1 НАН Украины, Киев

Т. В. Крупская1 2Институт экспериментальной патологии, онкологии

В. М. Гунько1 и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого

В. Ф. Чехун2 НАН Украины, Киев

E-mail: [email protected]

Кремнеземы широко используют в биомедицине не только в качестве сопутствующих веществ, придающих лекарственным формам требуемые физико-химические свойства, но и как самостоятельное лекарственное средство с выраженным детоксицирующим эффектом, хорошо зарекомендовавшее себя при лечении пищевых отравлений, бактериальных заражений и раневых инфекций.

Создана нанокомпозитная система на основе высокодисперсного кремнезема, модифицированного адсорбированной ДНК. Свойства композита изучены методами ЯМР-спектроскопии, термогравиметрии, ИК-спектроскопии. Проведены биометрические исследования композита SiO2-ДНК на суспензию клеток Saccharomyces cerevisiae. Показано, что нанокомпозит обладает достаточной биоактивностью, поскольку может существенно ускорять процессы жизнедеятельности хлебопека-рских дрожжей. Детально изучены гидратация композита SiO2-ДНК и влияние на нее среды органических растворителей. Обнаружено несколько форм межфазной воды, в том числе и слабоассоцииро-ванной, которая практически не образует водородных связей с соседними молекулами. Показано, что при варьировании температуры или введении в систему органических веществ происходят взаимопревращения между разными формами межфазной воды. Высказано предположение, что именно слабоассоциированная форма воды может быть ответственна за биосовместимость с клетками.

Ключевые слова: нанокомпозит кремнезем-ДНК, гидратация, сильно- и слабоассоциированная вода, суспензия клеток БассНаготусев cerevisiae.

Кремнеземы широко используют в биомедицинских целях не только в качестве сопутствующих веществ, придающих лекарственным формам требуемые физико-химические свойства, но и как самостоятельное лекарственное средство с выраженным детоксицирующим эффектом, хорошо зарекомендовавшее себя при лечении пищевых отравлений, бактериальных заражений и раневых инфекций [1-3]. В последние годы разрабатываются технологии использования пористых кремнеземов как средств направленной доставки лекарственных препаратов, предполагающие создание в пленочных образцах кремнезема нанорозмер-ных каналов, в которые может быть внедрен лекарственный препарат [4-6]. В дальнейшем благодаря диффузионным процессам или физическому воздействию (электрофо-

рез) препарат перемещается в контактирующую с пленкой ткань или биологическую жидкость. Для той же цели можно использовать также сильно гидратированные полимерные и биополимерные молекулы [7]. Весьма перспективными материалами для направленной доставки фармпрепаратов могут стать композиты, созданные на основе нанокремнезема, модифицированного адсорбированной ДНК. Хотя сама ДНК плохо растворяется в воде, ее молекулы легко формируют гелевую (или микрогелевую) структуру, связывающую большое количество воды. Адсорбционное закрепление полимера на поверхности кремнезема может осуществляться механохимической активацией смеси твердых частиц полимера и 8Ю2 в присутствии некоторого количества воды или органического растворителя [8, 9]. При

этом высокая механическая нагрузка позволяет равномерно распределять полимер по поверхности кремнеземной матрицы, создавая большую площадь контакта поверхности субстрата с внешней средой, а его многоцентровое связывание с поверхностью обеспечивает стабильность композита в течение длительного времени. Фармакологические свойства композита будут во многом определяться строением водно-органических смесей на его поверхности.

Ранее, при определении состояния воды в порошках твердой ДНК методом низкотемпературной 1Н ЯМР-спектроскопии [10-12], было показано, что вода, адсорбированная молекулами ДНК, находится в кластерном состоянии, причем одновременно могут наблюдаться несколько типов кластеров, отвечающих воде с разной ассоциированностью (принимающей участие в формировании разных типов водородно-связанных комплексов). Состояние воды существенно изменяется с варьированием температуры и в присутствии органической среды. При этом основными типами межфазной воды в ДНК следует считать ее слабоассоциированные формы (WAW, молекулы которой либо вообще не образуют водородных связей, либо участвуют в формировании малых кластеров, содержащих 2-4 молекулы [10]), сильноассоци-ированную воду (SAW, каждая молекула которой участвует в формировании не менее двух водородных связей), и воду, взаимодействующую с электронодонорными центрами молекул ДНК или органической среды (ASW). Целью настоящей работы было исследование гидратных свойств наноком-позита, созданного на основе высокодисперсного кремнезема и ДНК в среде органических растворителей. Предполагалось, что такие композитные материалы могут быть использованы для селективного связывания биологически активных веществ в разбавленных растворах и биосредах, а также в качестве носителя лекарственных препаратов.

Материалы и методы

В качестве минеральной составляющей на-нокомпозита был выбран высокодисперсный кремнезем (ВДК, Аэросил А-300, с удельной поверхностью 300 м2/г, Калушского опытно-экспериментального завода Института химии поверхности им. А. А. Чуйко НАН Украины). Для приготовления нанокомпозита препарат лиофилизированной ДНК, выделенной из молок лососевых рыб (Sigma), перемешивали с порошком ВДК, добавляя

фиксированное количество воды, и подвергали механохимической активации в течение 20 мин. После этого полученный композит сушили при 60 °С в течение 48 ч. На рис. 1 приведены микрофотографии порошка и водной суспензии нанокомпозита, где видно, что его частицы представляют собой агломераты микронного размера.

■ » , 10 мкм i л ш (J* " ч - ■ О и* * ', - . 10 мкм .

а б

Рис. 1. Микрофотографии порошка нанокомпозита вЮ2-ДНК (а) и его водной суспензии (б)

В качестве органической среды использовали дейтерированные растворители — CDCl3, C6D6, CD3CN, а также смеси CDCl3 и C6D6 с дей-терированными формами ацетонитрила, ДМСО и пиридина. Дейтерированные аналоги растворителей были выбраны с целью предотвращения появления в спектрах 1Н ЯМР интенсивных сигналов жидких органических веществ.

Спектры ЯМР снимали на ЯМР-спектро-метре высокого разрешения Varian Mercury 400 с рабочей частотой 400 МГц. Температуру регулировали с точностью ±1 K, используя термоприставку Bruker VT-1000. Для предотвращения переохлаждения суспензий спектры 1Н ЯМР незамерзающей воды записывали при нагревании суспензий, предварительно охлажденных до температуры 210 К.

Способ определения характеристик межфазных слоев воды с помощью 1Н ЯМР-спектроскопии подробно изложен в [10-12]. Он базируется на влиянии межфазной границы на температуру фазового перехода вода-лед. Благодаря адсорбционным взаимодействиям температура замерзания воды на границах раздела понижена. Свободная энергия льда с понижением температуры изменяется по линейному закону [13]:

AG = -0,036(273 - Т). (1)

Площадь, ограниченная кривой AG(Cuw) [Cuw(T) — температурная зависимость концентрации незамерзшей воды], определяет величину межфазной энергии (ys), которая равна модулю суммарного понижения свободной энергии воды, обусловленного присутствием границы раздела фаз:

Уа =-К | АС(Си„)^Си„, (2)

о

где С™ах — общее количество незамерзающей воды при Т = 273 °К.

На зависимостях АО(Сии) обычно могут быть выделены участки, относящиеся к слабосвязанной (WBW) и сильносвязанной (SBW) воде. При этом под WBW понимают ту часть незамерзающей воды, свободная энергия которой лишь немного понижена (-АО < 0,5-0,8 кДж/моль) в результате адсорбционных взаимодействий, и замерзает она при Т > 250-260 К. SBW (-АО > 0,8 кДж/моль) может не замерзать даже при сильном охлаждении суспензии [10, 12]. Количественные (Сиив и Сиии для SBW и WBW, соответственно) и энергетические (АОв и АОи) характеристики слоев связанной воды могут быть получены экстраполяцией соответствующих участков зависимостей к осям абсцисс и ординат.

Процесс замерзания воды во внутриклеточных полостях или карманах в макромолекулах может быть описан уравнением Гиббса-Томсона [10, 14]:

АТ _ Т (Я) - Т _

2°в1Тт,~ _ к

АН,рЯ Я'

(3)

где Тт(Я) — температура плавления льда, локализированного в порах (пустотах) радиусом Я, Тт^ — температура плавления объемного льда, р — плотность твердой фазы, ав1 — энергия взаимодействия твердого тела с жидкостью (посредством водородных связей), АН -объемная энтальпия плавления, к — константа. Это уравнение может быть использовано для расчета распределений по размерам пор (заполненных связанной водой пустот) на основе зависимостей Сии(Т). Зависимость АО(Сии) можно преобразовать в распределение незамерзающей воды по изменениям свободной энергии Гиббса АСии(АО), где АСии — инкрементальная функция температуры.

Поскольку время поперечной релаксации протонов в твердых телах, к которым относятся биополимерные молекулы ДНК, лед и ВДК на несколько порядков меньше, чем для жидкостей или воды, физически адсорбированной на нанокомпозите [15], в спектрах 1Н ЯМР могут регистрироваться исключительно сигналы протонов молекул адсорбированной воды.

Для исследования биоактивности полученного нанокомпозита использовали сухие хлебопекарские дрожжи БассНаготусев

ceгevisiae (производства ЗАО «Энзим», Украина), которые культивировали в 17%-м растворе сахарозы при 25 °С. Активность суспензии дрожжевых клеток определяли по кинетике выделения углекислого газа в процессе их брожения при фиксированном содержании питательных веществ [16]. Выделившейся углекислый газ определяли количественно. В начале опыта колбу со средой, дрожжами и затвором взвешивали на технических весах с точностью до 0,01г. Далее реакционную колбу взвешивали периодически, что позволяло определять массу выделившегося углекислого газа за определенный промежуток времени. Достоверность полученных результатов обеспечивалась повторением измерений и статистическим вычислением среднего значения.

Результаты и обсуждение

На рис. 2 приведены результаты термогравиметрических исследований наноком-позита ДНК-8Ю2, снятые на дериватогра-фе марки Q-1500D (Венгрия) в воздушной среде при скорости нагрева 10 градус/мин. Показаны (а) кривые относительного изменения массы от температуры (ТГ), производная от изменения массы по температуре, ёт/ёТ (ДТГ) и характеризующая поглощение или выделение тепла исследуемым образцом (ДТА). При этом рост кривой ДТА свидетельствует об эндо-, а уменьшение — об экзотермических эффектах, происходящих в процессе термолиза. Показаны (б) зависимость этих величин от времени нагрева, потеря массы относительно массы исходной навески (в). На кривой потери массы (ТГ) регистрируется перегиб в области 120 °С, который отвечает удалению физически адсорбированной воды. При этом потеря массы составляет 3% мас. Полная потеря массы образцом нанокомпозита при нагреве его до 1 000 °С составляет 8,1% мас. Следовательно, количество остаточной воды в образце было 3% мас, а содержание полимерной составляющей в композите — 6,1% мас.

При создании минерально-полимерных композитов с помощью механохимической активации возможна адсорбция полимера на поверхности, которая происходит с участием активных центров поверхности кремнезема, либо образование механической смеси, характеризующейся присутствием в ней слабо связанных между собой частиц кремнезема и ДНК. С целью определения взаимодействия компонентов в композитной системе

Температура, °С

Рис. 2. Результаты термогравиметрических исследований нанокомпозита, приготовленного на основе ВДК и ДНК:

а — кривые относительного изменения массы от температуры (ТГ), dm/dT (ДТГ) и направления

теплового потока (ДТА); б — их зависимость от времени нагрева; в — кривая потери массы относительно исходной навески

были проведены ИК-спектроскопические исследования (однолучевой Фурье-спектрометр фирмы Thermo Nicolet Nexus FT-IR, Германия, таблетки в виде прессованных порошков с KBr при соотношении компонентов 1 : 5). Их основой служили измерения изменения интенсивности полосы остаточных гидроксильных групп кремнезема (v = 3750 см-1) до и после механохимической активации.

На рис. 3 представлены результаты исследования исходного кремнезема, порошка ДНК и нанокомпозита SiO2-ДНК, содержащего 6% мас ДНК. Подробное отнесение полос в ИК-спектрах ДНК приведено в [17]. Поглощение в области частот, отвечающее 3800-2200 см-1, относится преимущественно к поглощению молекул свободной и связанной воды. На его фоне видны слабоинтенсивные полосы, обусловленные СН3, СН2, СН, NH2 и NH- группами дезоксирибозы и оснований. Наиболее интенсивные из них 3 350, 2 210 и 2 280 см-1 относятся к NH^ NH-груп-пам оснований. В области спектра, отвечающей 1 750-1 250 см-1, находится большая группа интенсивных полос валентных колебаний сопряженных связей азотистых гете-роциклов, экзоциклических С-О- связей

и деформационных колебаний NH2 и NH- групп оснований. В области 1 250-1 090 см1 наблюдается выраженная группа полос колебаний сахарофосфатного остова. Две наиболее интенсивные из них — 1 230 см1 и 1 090 см1 — могут быть отнесены к антисимметричному и симметричному валентным колебаниям О2-Р-О3.

Сигнал силанольных групп, не участвующих в образовании водородных связей (с молекулами воды или другими активными центрами), наблюдается в виде узкой характеристичной полосы с V = 3 750 см1 [18, 19]. Интенсивность этой полосы в нанокомпозите существенно меньше, чем в исходном кремнеземе. Если учесть, что полимерная составляющая в композите составляет всего 6,1 %мас, в то время как для полного покрытия полимерами разных типов поверхности нанокре-мнзема А-300 обычно требуется на порядок больше полимера [10], можно сделать вывод, что большая часть присутствующей в образце ДНК распределяется по поверхности кремнезема таким образом, что ее электронодонор-ные группы формируют водородно-связан-ные комплексы с силанольными группами. Это обеспечивает высокую энергию связывания биополимера с поверхностью и формирование стабильного композита 8Ю2-ДНК.

100

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

V, см-1

100-|

90-

80- —"" —'Х-'—-

70-

60-

50- 1 ■ ."

40-

30- 'V

20- \ ' 1 1 ■ ! 1 1 ■ 1 1 1

3500 3550 3600 3650 3700 3750 3300 3050 3900 3950 4000

V, см-1

Рис. 3. ИК-спектры исходного кремнезема (1), порошка ДНК (2) и нанокомпозита вЮ2-ДНК (3), снятые в таблетках с КВг при соотношении компонентов 1:5

На рис. 4 приведены снятые при разных температурах спектры 1Н ЯМР воды, связанной синтезированным нанокомпозитом, содержащим 50% мас (а) и 3% мас воды в среде дейтерохлороформа (б), дейтеробензола (в) и дейтероацетонитрила (г). В 5%-й суспензии основной сигнал имеет химический сдвиг 4,5-5 м. д., что совпадает со значением химического сдвига жидкой воды и отвечает сильноассоциированной воде, в которой каждая молекула участвует в формировании 2,5-3,0 водородных связей [10]. При большом усилении в спектрах становятся наблюдаемыми слабоинтенсивные сигналы в области 1,2-1,7 м. д., которые могут быть связаны с наличием небольшого количества слабоассоциированной воды (на каждую ее молекулу приходится менее одной водородной связи), и в области 7 м. д., вероятно, обусловленной молекулами воды, взаимодействующей с сильными электронодонор-ными центрами, способными к формированию комплексов с перенесенным протоном. Точное измерение интенсивности этих сигналов на фоне интенсивного сигнала SAW затруднительно. Качественная оценка показывает, что их интенсивность не превышает 0,2% от интенсивности сигнала SAW.

Для нанокомпозита, насыщенного водой при 50 °С (СН О = 3% мас), помещенного в среду слабопо2лярного органического растворителя — хлороформа, в спектрах 1Н ЯМР раздельно регистрируются сигналы сильно-и слабоассоциированной воды. С понижением температуры их интенсивность уменьшается за счет вымерзания воды. Причем интенсивность сигнала SAW ослабевает значительно сильнее, чем сигнала WAW (рис. 4), т. е. свободная энергия WAW понижена адсорбционными взаимодействиями

с поверхностью композита в большей степени, чем SAW. В спектрах регистрируется также сигнал непродейтерированной составляющей хлороформа с химическим сдвигом §н = 7,2 м. д.

В среде бензола при 280 К (рис. 4, в), количество WAW существенно повышается (примерно вдвое) по сравнению с ее количеством в среде CDCl3. Однако с понижением температуры концентрация слабоассоци-ированной воды быстро снижается (рис. 5). Одновременно уменьшается и относительно узкий сигнал непродейтерированного жидкого бензола (8Н = 7,2 м. д.), который замерзает (Тпл = 280 К) и практически перестает регистрироваться в спектрах. Твердый бензол находится в состоянии молекулярного кристалла. Его сигнал может наблюдаться в виде очень широкого сигнала с химическим сдвигом 8Н = 7,2 м. д. Таким образом, возможность существования воды в слабоассо-цированном состоянии связана с наличием жидкой фазы неполярного органического растворителя (рис. 4, в). На рис. 4, в в спектрах присутствует также сигнал тетраметил-силана (ТМС), добавляемого во многие дей-терорастворители в качестве стандарта химического сдвига (8Н = 0 м. д.).

При замене бензола ацетонитрилом (полярность которого значительно выше) вид спектров воды, связанной с поверхностью композита, существенно изменяется. Концентрация слабоассоциированной воды становится намного большей, чем сильноассо-циированной, вплоть до температуры замерзания жидкого ацетонитрила (233 К). При более низкой температуре, как и в случае бензола, интенсивность сигнала WAW быстро уменьшается с понижением температуры, и он перестает регистрироваться

5, м.д.

8, М.Д.

3% НгО CDCI,

С5Н5 3% н20 в C6DB

.230 К 270

10 9

8: М.д.

5, М.Д.

Рис. 4. Снятые при разных температурах спектры 1Н ЯМР воды, в суспензиях нанокомпозита вЮ2-ДНК в воде при СН О = 50% мас (a), CDCl3 (б), C6D6 (в) и CD3CN (г) при СН О = 3% мас

в спектрах при T < 220 K (рис. 4, г). Химический сдвиг слабоассоциированной воды в среде ацетонитрила несколько больше (8Н = 2,5 м.д.), чем в среде слабополярных растворителей. Это позволяет предполагать возможность существования в композите SiO^^ двух ее форм — WAW1 и WAW2. Вероятно, WAW2 отвечает несколько более упорядоченным кластерам воды, которые стабилизируются полярной средой. Химический сдвиг сигнала SAW с ростом температуры уменьшается от 6 м.д. при 200 К до 4 м.д. при 280 К. Такая резкая зависимость

8Н(Т) может быть связана с возможностью существования воды как в виде кластеров сильноассоциированной воды, так и в виде водородно-связанных комплексов HO-H...N-CCD3 (ASW), локализованных в среде жидкого ацетонитрила. Поскольку в спектрах присутствует только один сигнал, следует предполагать наличие быстрого молекулярного обмена между этими состояниями [15]. При замерзании ацетонитрила химический сдвиг SAW становится заметно большим, чем для жидкой воды. Это может быть обусловлено формированием водородных связей

а

б

в

г

между молекулами воды, расположенными снаружи кластеров SAW, и молекулами ацетонтрила. В результате среднее координационное число воды увеличивается. Слабоинтенсивный широкий сигнал в области 8Н = 2 м.д. следует относить к сигналу ме-тильных групп непродейтерированной составляющей ацетонитрила.

На рис. 5 представлена температурная зависимость концентраций разных форм воды, полученная на основе измерения интенсивности сигналов в спектрах 1Н ЯМР, а на рис. 6 — рассчитанные в соответствии с формулой (3) распределения по размерам кластеров SAW. При содержании в нанокомпо-зите 50% мас воды средний размер кластеров составляет 4 нм. Для нанокомпо-зита, содержащего 3% мас адсорбированной воды в среде слабополярных растворителей, средний размер кластеров SAW близок к 1 нм.

На рис. 7, 8 приведены снятые при разных температурах спектры 1Н ЯМР воды, адсорбированной нанокомпозитом SiO2-ДНК в смесях хлороформа и бензола с электроно-донорными растворителями — ацетонитри-лом, ДМСО и пиридином при СН О = 3 и 6% мас. В бинарной смеси 2: 1 CDC13/CD3CN (рис. 7, а) кроме сигналов СН3 и СН групп ацетонитрила и хлороформа раздельно регистрируются SAW (или SAW+ASW), WAW1 и WAW2. Сигнал WAW1 слабо изменяется с понижением температуры, в то время как сигнал WAW2 проявляет способность как к уменьшению за счет замерзания воды при T < 230 K, так и к росту из-за перехода в слабо-ассоциированное состояние части воды, идентифицируемой как SAW+ASW (рис. 7, а, б).

В смеси CDC13/;Mm-d6 (рис. 6, б, в) сигнал метильных групп ДМСО точно совпадает с химическим сдвигом WAW2. О присутствии в суспензии кроме WAW1 также

30

25

О

20 15 10

- С DO,

- CD3CN 2CDCI+1CD,CN

190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

Т, К

О

* CDjCN

-т- 2CDCI3+1CD3CN -4— 2CDCI+CD CN

WAW2

190 200 210 220 230 240 250 260 270 2Э0 290

T, к

Рис. 5. Температурная зависимость концентрации сильно- и слабоассоциированной воды в нанокомпо-зите вЮ2-ДНК, содержащем 3% мас воды в среде органических растворителей для сильноассоцииро-

ванной (а) и слабоассоциированной (б) воды

О тз

8 64 2 й

876 54 3 2 ■ 1

О-250 ■ 20D-150100 500-

3% Н20 в CBDB

—г-

ю

-г-

12

3% HLO в CDCL

10

12

50 % Н20

-г-

14

14

12

14

-Г"

16

16

_L

16

0 2 4 6 3 10

R, нм

Рис. 6. Распределение по размерам кластеров сильноассоциированной воды

в нанокомпозите вЮ2-ДНК

б

а

3% н20 е 2с dci3+-1 cd,cn

saw + asw

3ilH2OBeCDCI,HDMSO<f6 W.iyyi+CH.

8 7 * 5 4 321

В, м.д.

CHClj

v.—300

м.д.

3% H20 з SCDCIj+2DMSO-d6 ^^ , CH

ASW I

&

fy\\.W WAW1

/ I

510 --.200

S, м.д.

3% н20 в eCDCU+ZPy

lW ----— 280 К

■ N-!......; : ..

- V' 1 """-■ —-■■''.'Л ' '""250 — Л -|l\ "" --.___- -240

" ""'/ ' ■ J' \ ""'""' ' J Д J}-_ 2Z4

-■" ~ '|V — jxjy ™

-----'!\J\ """2,°

- __ _- - --- 200

12 11 10 S e 7 6 ! 4 J 2 1 0 -1

5, М.Д.

WAW2

230 '220 . - - 210 j _200

1110 9

H20BSCDCI3+ 3Py

5. М.Д.

Рис. 7. Снятые при разных температурах спектры Щ ЯМР воды, адсорбированной нанокомпозитом SiO2-ДНК в суспензии СБС13 с добавками электронодонорных органических растворителей: а — СБ3СК; б, в — ДМСО^б; г, д, е — Ру^5 при содержании воды в образцах 3% мас (а-д) и 6% мас (е)

и WAW2 свидетельствует температурное изменение интенсивности сигнала с химическим сдвигом 8Н = 2,5 м.д. Однако, в отличие от смеси CDCl3/CD3CN, рост сигнала WAW2 происходит не с увеличением, а с понижением температуры, т. е. с ростом температуры часть WAW2 трансформируется в ASW, которая регистрируется отдельно от SAW (рис. 6, б, в). Как и WAW2, с ростом температуры около 280 К SAW имеет тенденцию к уменьшению за счет перехода воды в жидкую фазу, где она существует в виде водородно-связанных комплексов HO-H...O=S(CD3)2 (ASW). С возрастанием концентрации ДМСО (рис. 6, в) концентрация SAW уменьшается, а ASW — растет. Химический сдвиг SAW практически не отличается от такового жидкой воды.

При замене ДМСО пиридином (рис. 7, г-е) в спектрах раздельно регистрируются сигналы WAW1 и WAW2. Раздельная регистрация сигналов SAW и ASW зависит от температуры и соотношения концентраций компонен-

тов. Вероятно, SAW легко замерзает, т. е. является слабосвязанной, поэтому регистрируется только при относительно высокой температуре. Обращает на себя внимание большая величина химического сдвига как для SAW, так и для ASW (HO-H. NC5H5). Она может достигать 8Н = 7,5 м.д., что несколько больше, чем для тетракоординиро-ванной воды, формирующей кристаллы гексагонального льда [20]. Это может быть связано со способностью молекул пиридина переходить в протонированное состояние [21]. Учитывая, что кластеры SAW относятся к межфазной воде, связанной частицами на-нокомпозита, а ASW — к воде, растворенной в органической фазе, можно предположить, что ионы пиридина формируются как на поверхности, так и в жидкой органической среде. Понижение температуры стабилизирует комплексы с перенесенным протоном. Соответственно химический сдвиг ASW смещается в область слабых магнитных полей.

б

а

г

в

д

е

Поскольку при T < 280 K бензол легко замерзает, в смесях органических растворителей, приготовленных на основе бензола, состояние межфазной воды зависит не только от соотношения концентраций компонентов, но и от фазового состояния дисперсионной среды, о котором можно судить по присутствию в спектрах сигналов протонов непродейтерированной составляющей органических растворителей. В спектрах нанокомпозита, помещенного в смесь 3:3 C6D6/CD3CN, сигнал СН-групп бензола наблюдается при T > 230 K, а СН3-групп ацетонитрила — при T > 250 K (рис. 8, а). Следовательно, дисперсионная среда замерзает как единая фаза после начала кристаллизации бензола. При 280 К в спектрах раздельно регистрируются сигналы SAW и WAW1. Концентрация слабоассо-циированной воды примерно вдвое меньше, чем сильноассоциированной. Замерзание органической фазы сопровождается уменьшением интенсивности сигнала WAW и его смещением в слабые магнитные поля таким образом, что при T < 240 K имеет место трансформация WAW1 ^ WAW2. C повышением концентрации ацетонитрила (рис. 8, б) доля слабоассоциированной воды увеличивается за счет снижения концентрации SAW.

В смесях C6D6/nMCO (рис. 8, в, г) дисперсионная среда находится в замерзшем (или частично замерзшем) состоянии уже при T < 270 K. Это вызывает значительное уши-рение сигналов межфазной воды. При

С^6/ДМСО, равном 5:1, в спектрах раздельно регистрируются сигналы SAW и WAW1, интенсивность которых близка (рис. 8, в). С ростом концентрации ДМСО его растворимость в твердом бензоле уменьшается (о чем свидетельствует появление сигнала протонов метильных групп). Происходит также перераспределение интенсивности между сигналами SAW и WAW1 в сторону повышения вклада SAW. При Т = 280 К сигнал SAW имеет тенденцию к уширению, которая, вероятно, обусловлена появлением ASW.

В общем виде процессы, происходящие в гидратированном порошке нанокомпозита SiO2^HK в среде органических растворителей при температуре ниже 273 К, могут быть представлены схематично:

Гексагональный лед :, V'-wS-P. ■■ ,.,.., Аморфный лед

(4)

В среде слабополярных органических растворителей (CDCl3, C6D6) с понижением температуры наблюдается процесс (I) — замерзание сильноассоциированной воды. Методами рентгеновской спектроскопии показано, что при замерзании водно-органических систем при температуре T > 200 K вода переходит в форму гексагонального льда [21]. Замерзание слабоассоциированной воды (WAW1) происходит только при очень

Рис. 8. Снятые при разных температурах спектры 1Н ЯМР воды в суспензиях нанокомпозита вЮ2-ДНК в С6Б6, содержащих добавки электронодонорных растворителей: СБ30К (а, б) и ДМСО^б (в, г) при содержании адсорбированной воды 3% мас

низкой температуре, что позволяет предполагать наличие равновесия (VII). При введении в дисперсионную среду электронодонор-ных веществ (CD3CN, (CD3)2SO, C5H5N) при разной температуре и соотношении концентраций компонентов могут реализовываться равновесия (II)-(VI). Температурная зависимость изменения концентрации SAW, ASW, WAW1 и WAW2 для гидратированного порошка нанокомпозита SiO2^HK в смешанных средах, приготовленных на основе хлороформа, приведена на рис. 8, 9, а на основе бензола — рис. 10. Несмотря на то, что эти растворители являются слабополярными из-за высокой температуры замерзания в суспензиях, приготовленных на основе бензола, в широком температурном интервале возможно замерзание дисперсионной среды. Таким образом, можно было сравнить влияние на межфазную воду жидкой и твердой фаз с регулируемыми гидрофильными характеристиками.

В смесях хлороформа с наиболее слабым элетронодонорным растворителем — ацето-нитрилом с понижением температуры наблюдается уменьшение интенсивности сигналов SAW+ASW, WAW1 и WAW2 (рис. 5, 7, а). Поскольку изменение интенсивности слабоассоциированных форм воды относительно невелико, можно сделать вывод, что имеют место процессы (V) и (VII). Химический сдвиг SAW не превышает 4 м. д., что свидетельствует о совместной регистрации сигналов SAW и ASW, между которыми имеет место быстрый молекулярный обмен, т. е. на межфазной границе нанокомпозита реализуются равновесия (I), (II) и (III). В присутствии ДМСО (рис. 7, б, в и 9, а, б) молекулярный обмен между SAW и ASW замедляется, и сигналы этих форм воды регистрируются раздельно. С понижением температуры существенно уменьшается только интенсивность сигнала SAW [процесс (I)]. Большой разброс точек на кривых зависимостей СЦШ(Т) (рис. 9) обусловлен снижением точности определения площади пиков ЯМР при необходимости интегрирования нескольких близко расположенных сигналов с разной шириной. Из рис. 8 следует, что концентрация слабоассоциированных форм воды (WAW1 + WAW2) достигает 10 мг/г, что составляет около трети всей связанной воды. Следовательно, в отличие от исходного кремнезема [10], нанокомпозит SiO2^HK способен стабилизировать значительное количество слабоассоциированных форм воды.

В присутствии пиридина (рис. 9, в, г) при T > 250 K рост концентрации ASW происхо-

дит синхронно с уменьшением концентрации SAW, что свидетельствует о наличии равновесия (II). Кроме того, с понижением температуры наблюдается ощутимый рост концентрации WAW1, который может происходить за счет перехода в слабоассоцииро-ванное состояние некоторой части воды, растворенной в жидкой среде [равновесие (VIII)]. Возможны также и более сложные превращения с участием разных форм воды, выделить которые невозможно из-за относительно малой точности определения интенсивности сигналов разных типов кластеров межфазной воды.

При добавлении в CDCl3 (рис. 6) ДМСО или пиридина распределение по размерам кластеров сильноассоциированной воды, связанной нанокомпозитом SiO2^HK, существенно изменяется (рис. 9, д). С ростом концентрации полярной добавки или увеличением ее электронодонорной способности проявляется тенденция к увеличению размера кластеров SAW. Так, если в среде чистого CDCl3 размер кластеров SAW не превышал 2 нм (рис. 6), то рост концентрации ДМСО и замена его на Py (пиридин) сопровождается появлением кластеров, размер которых может достигать 16,6 нм (рис. 9, д). Однако двукратное увеличение концентрации воды в присутствии Py привело к росту количества кластеров воды размером 1,5-4 нм.

В случае, когда основным компонентом дисперсионной среды является бензол, в зависимости от температуры гидратирован-ный порошок нанокомпозита SiO2^HK может находиться в жидкой или твердой среде. О таянии смеси органических растворителей (C6D6 + CD3CN или C6D6 + ДМСО) свидетельствует появление в спектрах (рис. 8) сигналов метильных групп электронодонорной добавки. ^ рис. 10 приведена температурная зависимость изменения концентрации разных форм воды для дисперсионных сред, приготовленных на основе бензола с добавками CD3CN (а, б) и ДМСО (в, г). В присутствии CD3CN зависимость CSAW(T) имеет сложный вид. В широком температурном интервале (T > 240 K) регистрируется рост концентрации сильноассоциированной воды с понижением температуры. При этом в спектрах фиксируется сигнал WAW1, а после замерзания дисперсионной среды — сигнал WAW2. С понижением температуры CSAW и ^AW2 уменьшаются за счет замерзания воды в результате смещения равновесий (I) и (IV). ^иболее вероятным путем трансформации WAW1-WAW2 может быть последовательное осуществление процессов

(VI) и (VIII). Причиной уменьшения с ростом температуры величины CSAW может служить смещение равновесия (II). При этом, хотя сигнал ASW не регистрируется в спектрах (возможно, из-за его большой ширины), растворенная в дисперсионной среде вода может присутствовать в виде сольватных структур, локализованных преимущественно на межфазных границах частиц нанокомпозита, что объясняет малую подвижность молекул этого типа воды.

При замене ацетонитрила на ДМСО (характеризующегося более высокой температурой замерзания) в спектрах идентифицируются только широкие сигналы WAW1 и SAW (или SAW+ASW) (рис. 7). Зависимость С^^Т) и CWAW1(T) (за исключением участка, отвечающего T > 260 K для образца с соотношением концентраций органических компонентов 5:1) изменяется симбатно, что позволяет предположить наличие взаимосвязи между CWAW1 и количеством неза-

мерзшего вещества (SAW, ASW, C6H5, ДМСО), локализованного вблизи межфазной границы нанокомпозита. Эта особенность поведения межфазной воды позволяет рассчитывать распределения по размерам кластеров незамерзающей воды не только для SAW, но и для WAW1 (рис. 10, д). При этом для кластеров слабоассоциированной воды фиксируются достаточно большие радиусы кластеров (вплоть до 16,6 нм). Вероятно, эти значения характеризуют водно-органические структуры, в состав которых входят кластеры WAW1, находящиеся в незамерз-шем состоянии. После их замерзания сигнал слабоассоциированной воды (включенной в твердую органическую матрицу) перестает регистрироваться в спектрах, аналогично тому, как это происходит с сигналами метиль-ных групп твердых ДМСО или ацетонитрила.

Можно ожидать, что полученные различия в строении слоев воды на межфазных границах нанокомпозтов будут сказываться

t: 14

V*

О 10

&

3% Н,0 в вСОС1,+1ДНСО

- WAW1 WAW2

- ASW -SAW

190 200 210 220 230 240 260 260 270 !60 200 Т. К

16 16 J- 14 1 12

3% HjÛB 8CDCI3+2flMCO т

>___

б

т. к

15

14

13

12

11

3 10

i 9

о $

-WAW1 WAW2 АЯП1 -SAW

3% Н20 в ÜCDCIj+1 Ру

190 200 210 220 230 240 250 2S0 270 280 290 т К

S 25 'i

о m

Kt к20б SCDCLj»2Py --i

x

i *

WAW1 - WAW2 -A5W -3AW

1=0 Л» 21 □ 2 2D 22D 240 212

Г К

2TÖ 2BÜ 2M

д

6% Н?0 в 8CDCI3+2Py

7 S 9 10 11 12 13 14 IS 15 17 344. HjÛ В BCDCIgtIPv

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 IS 16 17 3% H^ в 6С[>С1з+2ДМСО

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 3% Н,0 в вСОС1э+1ДМСО

S 6 7 в 9 10

R. нм

Рис. 9. Температурная зависимость концентрации разных форм воды, связанной с нанокомпозитом ЯЮ2-ДНК в среде смешанных растворителей: СВС13+ДМСО (а, б) и CDCl3+Py (в, г), а также рассчитанные на их основе распределения по размерам кластеров SAW (д)

а

в

г

■с 20 г

I

О 15

10-

ЗИ Н-,Ои ЗС-Цп - 1 CD.CN

■ 'ЛЛЛ

18-

12-

190 200 210 220 230 2411 25а 260 270 250

т, к

Ж, НзО в ЭС,[18 * 2С03СИ

200 210 220 230 240 250 260 270 280

т,к

20-

18-

> 13-

с_1 12-

10-

а

в-

4 -

2-

0-

гк н3о в 5сьч,+' млзо

У

у

«—ВЛИ1

■

п

20 П ■Ё 18 = 14

о1 12 10

6

а« нр д зсвне4-гомЕО

—м- ВДИ |

У

200 210 220 230 240 250- 2в0 270 260 290

т, К

160 200 210 220 230

т,

240 250

К

260 270 260

ЙАУУ в ЗСеОй+2ДМСО

0 12 3

5 6 7 £ 13 11 12 13 14 15 1в 17

8А1ЛГв5С6Ое+1ДМСО

0 1 2 3 4 & в 7 6 & 13 11 12 13 14 15 16 17

№АШ1 в вС^з+ЭДМСО

5 О 1 2 3 4 5 6 7 в в 13 11 12 13 14 15 16 17

ММИМ в 5СеВ6-ИДМСО

II, , I............................

м л

114

0 12 5

1 1 7 1 1 II

нм

12 13 14 15 10 \1

Рис. 10. Температурная зависимость концентрации разных форм воды, связанной с нанокомпозитом SiO2-ДНК в среде смешанных растворителей: С6Б6+СБ3СК (а, б) и СБС13+ДМСО (в, г), а также рассчитанные на их основе распределения по размерам кластеров SAW и WAW1 (д)

и на их биологической активности при контакте с клетками или микроорганизмами [22]. С этой целью было изучено влияние исследуемых материалов на параметры газовыделения дрожжевыми клетками БассНаготусез сегеьЬзЬае.

БассНаготусез сегеьЬзЬае — штамм пекарских дрожжей, обладающих типичными видовыми свойствами. Они представляют собой однородные по морфологии, овальные клетки, обладающие толстой клеточной стенкой и типичной для эукариот структурой [17]. Дрожжевые клетки обладают способностью к регулированию биохимических процессов в зависимости от условий их культивирования. Регуляторные механизмы, определяющие скорость роста дрожжей, присутствуют на многих уровнях организации дрожжевой клетки и функционируют в зависимости от состава питательной среды.

Нами было исследовано влияние нано-композита вЮ2-ДНК и его составляющих на

жизнедеятельность суспензии дрожжевых клеток БассНаготусез сегеьЬзЬае. Определялись абсолютные величины и динамика выделения углекислого газа в процессе брожения. Измерение количества СО2, выделившегося в результате процесса брожения, проводилось при фиксированной температуре (Т = 37 °С), исходной массе дрожжевых клеток и количестве питательных веществ (глюкозы). В качестве контроля использовали суспензию клеток, не содержащих ДНК или частиц нанодисперсного кремнезема. Исследовалась биоактивность нанокомпози-та 8Ю2-ДНК и его компонентов, взятых в том же количестве, в каком они присутствовали в композите, а также биологическая активность разных концентраций ДНК и чистого кремнезема (табл.). На рис. 11 приведены кинетические кривые выделения углекислого газа дрожжевыми клетками в течение первых 10 ч процесса брожения.

а

б

г

в

д

Биоактивность нанокомпозита 8Ю2-ДНК и его компонентов, а также разных концентраций ДНК и чистого кремнезема

№ п/п Исследованные соединения Маса навески вещества, г Интегральное выделение углекислого газа

10 ч 32 ч

1 контроль 3,28 3,15

2 AHK 0,003 3,36 3,21

3 0,006 2,68 2,62

4 0,012 2,86 2,77

5 0,018 2,86 2,77

6 0,038 2,67 2,60

7 SiO2 0,031 3,29 2,77

8 0,047 3,70 3,12

9 0,063 3,45 2,94

10 0,094 3,86 3,2

11 0,125 3,89 3,18

12 0,189 4,49 2,81

13 0,06 г ДHK на поверхности SiO2 0,002 3,22 2,87

14 0,005 2,92 2,64

15 0,01 3,00 2,71

16 0,05 3,10 2,77

17 0,1 3,57 3,09

18 0,15 3,78 3,22

19 0,2 4,27 3,67

20 0,25 3,98 3,44

36 32 28 24 20 16 12 Э

40

0 1 23456789 10 11 12 Продолжительность брожения, ч

2

О "

О

я и н е л

е д

ы в

т н е

и ц

и

о 0.5

■е

m

о

И

б

1Г

lili

2 3 4 Б 6 Oбразцы

Рис. 11. Кинетические кривые выделения углекислого газа дрожжевыми клетками в течение 10 ч (а): 1 — контроль; в присутствии ДНК с разной концентрацией: 2 — 0,003 г; 3 — 0,006 г; 4 — 0,012 г; 5 — 0,018 г; 6 — 0,038 г; интегральные количества выделившегося СО2 (б)

Из полученных результатов (рис. 11, табл.) следует, что при введении в дрожжевую суспензию чистой ДНК на протяжении первых 2 ч брожения выделение СО2 происходит одинаково для всех исследуемых образцов, независимо от концентрации ДНК. В течение следующих двух часов хорошо прослеживается угнетающее действие ДНК, после чего в образце с минимальным количеством ДНК (0,003 г) происходит некоторое активирование процесса газовыделения, ко-

торое со временем увеличивается (рис. 11). Для больших концентраций ДНК такой эффект не наблюдается, имеет место стабильное угнетение метаболизма клеток в суспензии, которое слабо зависит от концентрации ДНК.

На рис. 12, а приведены кинетические кривые выделения углекислого газа суспензией дрожжевых клеток в присутствии композита 8Ю2-ДНК и его компонентов. Из рисунка видно, что на начальной стадии брожения (до 2 ч) активный процесс газовыделения про-

i

а

исходит практически одинаково для образцов, содержащих нанокомпозит 8Ю2-ДНК, и взятый в том же количестве индивидуальный ВДК. В присутствии нативной ДНК (взятой в том же количестве, в каком она содержалась в нанокомпозите) на начальной стадии регистрируется незначительное уменьшение (по сравнению с контролем) выделения СО2, что может быть обусловлено стадией приспособления клеток к новым компонентам среды. После 2-часового культивирования суспензии дрожжевых клеток с чистой ДНК фиксируется стабильное уменьшение газовыделения. Это свидетельствует о существенном ингибирующем влиянии ДНК на процессы клеточного метаболизма. При введении в суспензию чистого кремнезема или нанокомпозита вЮ2-ДНК наблюдается значительное повышение газовыделения, которое максимально в первые 10 ч процесса брожения. Следовательно, иммобилизация ДНК на поверхности кремнезема существенно уменьшает ее негативное влияние на дрожжевые клетки. На рис. 12, б представлена диаграмма интегрального газовыделения за первые 10 ч брожения. Из рисунка видно, что наибольшая активность выделения углекислого газа наблюдается в присутствии кремнезема (0,189 г), тогда как при введении в суспензию нанокомпозита вЮ2-ДНК (0,2 г) имеет место тенденция к некоторому уменьшению выделения СО2. Возможно, закрепленная на поверхности кремнезема ДНК несколько препятствует его взаимодействию с мембранными протеинами дрожжевых клеток, что замедляет процессы клеточного метаболизма.

Таким образом, можно констатировать, что нанокомпозит SiO2-ДНК способствует процессам жизнедеятельности суспензии хлебопекарских дрожжей по сравнению с контролем и нативной ДНК, что свидетельствует о его высокой биологической активности и совместимости с клеточными структурами. Это дает основание к дальнейшему его тестированию при контакте с более сложными биологическими объектами.

Адсорбционное модифицирование поверхности нанокремнезема полинуклеотидами влечет за собой структурную дифференциацию адсорбированной на нем воды, которая для сильногидратированного (СН О = 50% мас) композита выражается в появлен2ии в спектрах 1Н ЯМР наряду с сигналом сильноассоци-ированной воды (SAW) с химическим сдвигом 8Н = 4,5 м. д. сигналов слабоассоцииро-ванных форм воды (WAW), регистрируемых в области 8Н = 1-2 м. д. Для слабогидратиро-ванных образцов (СН О = 3-6% мас) нанокомпозита в среде органических растворителей концентрация WAW может достигать трети от общего количества адсорбированной воды. Обнаружена возможность существования двух типов слабоассоциированной воды — WAW1 и WAW2, различающихся по величине химического сдвига (8Н =1,3 и 2,5 м. д., соответственно). Слабоассоциированные формы воды присутствуют в виде двух типов кластерных структур, различающихся средним числом водородных связей, приходящихся на каждую молекулу воды. В присутствии электронодонорных растворителей в спектрах может фиксироваться также сигнал воды, растворенной в жидкой фазе (ASW), находящейся

2 4 6 8 10 12 14 1С 1в 20 22 24 26

Продолжительность брожения, ч

О

О к к

н

Л

я

т н

е и

я и

в в

я

о

К

4.5 4

3.5 3 2.5 2 1.5 1

0.5 0

б

/Л— —

Y

2 3 4 5 Образцы

6 7 8 9 10

Рис. 12. Кинетические кривые выделения углекислого газа дрожжевыми клетками в присутствии нанокомпозита ¿Ю2-ДНК и соответствующих концентраций его составных — SiO2 и ДНК за 25 ч (а) и интегральные количества выделившегося СО2 в течение 10 ч (б): 1 — контроль, 2 — SiOa-ДНК (0,05 г); 3 — SiOa-ДНК (0,1 г); 4 — SiOa-ДНК (0,2 г); 5 — SiO2 (0,047 г); 6 — SiO2 (0,094 г); 7 — SiO2 (0,189 г); 8 — ДНК (0,018 г); 9 — ДНК (0,038 г); 10 — ДНК (0,075 г)

а

1

в виде водородно-связанных комплексов с электронодонорными центрами органических молекул. Концентрация ASW увеличивается с ростом температуры, количеством электронодонорной добавки и ростом ее электронодонорных способностей. Между разными формами межфазной воды возможно протекание реакции молекулярного обмена и взаимопревращения. Кроме замерзания воды с образованием гексагонального льда (SAW^Ice, ASW^Ice и

ЛИТЕРАТУРА

1. Медицинская химия и клиническое применение диоксида кремния / Под ред. А. А. Чуй-ко. — К.: Наук. думка, 2003. — 375 с.

2. Вильцанюк А. А., Геращенко И. И. Энтеро-сорбция в комплексном лечении острых хирургических заболеваний органов брюшной полости. — Харьков, 2009. — 128 с.

3. Энтеросорбция / Под ред. Н. А. Белякова. — Л.: Центр сорбционных технологий, 1991. — 336 с.

4. Anglin E. J., Cheng L., Freeman W. R., Sai-lov M. J. Sailor Porous silicon in drug delivery devices and materials // Adv. Drug Deliv. Rev. — 2008. — V. 60, N 11. — P. 1266-1277.

5. Coffer J. L., Whitehead M. A., Nagesha D. K. et al. Porous silicon-based scaffolds for tissue engineering and other biomedical applications // Phys. Status Solidi A-Appl.Mat. — 2005. — V. 202, N 8. — P. 1451-1455.

6. Charnay C., Begu S., Tourne-Peteilh C. et al. Inclusion of ibuprofen in mesoporous tem-plated silica: drug loading and release property // Eur. J. Pharm. Biopharm. — 2004. — V. 57, N 3. — P. 533-540.

7. Hamidi M., Azadi A., Rafiei P. Hydrogel nanoparticles in drug delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. — 2008. — V. 60. — P. 1638-1649.

8. Gun'ko V. M., Voronin E. F., Nosach L. V. et al. Adsorption and migration of poly(vinyl pyrrolidone) at a surface of fumed silica // Adsorp. Sci. Technol. — 2006. — V. 24, N 2. — P. 143-157.

9. Gun'ko V. M., Voronin E. F., Nosach L. V. et al. Nanocompozites with fumed silica/ poly(vinyl pyrrolidone), prepared with low content of solvents // App. Surf. Sci. — 2006. — V. 253,N 5.— P. 2801-2811.

10. Гунько В. М., Туров В. В., Горбик П. П. Вода на межфазной границе. — K.: Наук. думка, 2009. — 694 с.

11. Gun'ko V. M., Turov V. V., Bogatyrev V. M. et al. Unusual properties of water at hydro-philic/hydrophobic Interfaces // Adv. Col. Interf. Sci. — 2005. — V. 118, N 1-3. — P. 125-172.

WAW^Ice), зарегистрирована возможность реакций S A W^ ASW, ASWoWAW2, WAW1oASWeWAW2.

Pабота выполнена при поддержке Украинского научно-технологического центра (проект № 3832) и международного гранта 7-й Eвропейской рамочной программы (FP7-IRSES «Compositum»), Marie Curie Action, PEOPLE, International Research Staff Exchange Scheme (IRSES).

12. Turov V. V., Leboda R. Application of 1H NMR Spectroscopy Method for Determination of Characteristics of Thin Layers of Water Adsorbed on the Surface of Dispersed and Porous Adsorbens // Ibid. — 1999. — V. 79, N 2-3. — P. 173-211.

13. Термодинамические свойства индивидуальных веществ / Под ред. В. П. Глушкова. — М.: Наука, 1978. — 495 c.

14. Petrov O. V., Furo I. NMR cryoporometry: Principles, application and potential // Progr. NMR Spectr. — 2009. — V. 54. — P. 97-122.

15. Abragam A. The Principles of Nuclear Magnetism. — Oxford University Press: Oxford, UK, 1961. — 264 p.

16. Соловйова В. П., СотнЬкова О. П., Ло-тош Т. Д. Експериментальне вивчення бiостимуляторiв з природно! сировини // Доклшчш дослщження лшарських за-собiв (методичш рекомендаци) / Шд ред. О. В. Стефанова. — К.: МОЗ Укра!ни, ДФЦ, Авщенна, 2001. — С. 497-502.

17. Векшин Н. Л. Биофизика ДНК-актиноми-циновых нано-комплексов. — Пушкино: Фотон-век, 2009. — 192 с.

18. Киселев А. В., Лыгин В. И. Применение инфракрасной спектроскопии для исследования строения поверхностных химических соединений и адсорбции // Усп. хим. — 1962. — Т. 31, № 3. — С. 351-384.

19. Киселев А. В., Лыгин В. И. Инфракрасные спектры поверхностных соединений и адсорбированных веществ. — М.: Наука, 1972. — 460 с.

20. Kinney D. R., ChaungI-S., Maciel G. E. Water and the Silica Surface As Studied by Variable Temperature High Resolution 1H NMR // J. Am. Chem. Soc. — 1993. — V. 115, N 15. — P. 6786-6794.

21. Грагеров И. П., Погорелый В. К., Франчук И. Ф. Водородная связь и быстрый протонный обмен. — К.: Наук. думка, 1978. — 214 с.

22. Крупская Т. В., Барвинченко В. Н., Туров В. В. Изучение природы стимулирующего воздействия нанокремнезема на клеточные объекты // Химия, физика и технология поверхности. — 2008. — Вып. 14 — С. 511-523.

Г1ДРАТН1 ВЛАСТИВОСТ1 КОМПОЗИТНОГО МАТЕР1АЛУ НА ОСНОВ1 ВИСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЕМУ ТА ДНК

В. В. Туров1 В. М. Барвшченко1 Т. В. Крупська1 В. М. Гунько1 В. Ф. Чехун2

Институт xiMii поверхш iM. О. О. Чуйка НАН Укра1ни, Ки1в

21нститут експериментально! патологи, онкологи i радюбюлогп iM. Р. G. Кавецького НАН Укра1ни, Ки1в

E-mail: [email protected]

Кремнеземи широко використовують у 6io-медицинi не ильки як супутш речовини, що надають лiкарським формам необхiдних фiзи-ко-хiмiчних властивостей, але i як самостш-ний лiкарський засiб з вираженим детоксику-ючим ефектом, що добре зарекомендував себе при лшуванш харчових отруень, бактерiйних заражень i ранових шфекцш.

Створено нанокомпозитну систему на осно-вi високодисперсного кремнезему, модифшо-ваного адсорбованою ДНК. Властивостi композиту вивчено методами ЯМР-спектроскопи, термогравiметрil, 1Ч-спектроскопй. Проведено бiометричнi дослщження впливу композиту ЯЮ2-ДНК на суспензт клiтин Saccharomyces cerevisiae. Показано, що нанокомпозит виявляе значну бмактившсть, осшльки може iстотно прискорювати процеси життедiяльностi хлiбо-пекарських дрiжджiв. Детально вивчено пдратащю композиту ЯЮ2-ДНК та вплив на не1 середовища органiчних розчиннишв. Ви-явлено кiлька форм мiжфазноl води, у тому числi й слабоасоцшовано!, яка практично не утворюе водневих зв'язкiв iз сусiднiми молекулами. Показано, що за вартвання темпера-тури чи введення в систему оргашчних речо-вин вщбуваються взаемоперетворення мiж рiзними формами мiжфазноl води. Висловлено припущення, що саме слабоасоцшована форма води може бути вщповщальна за бiосумiснiсть iз клггинами.

Ключовi слова: нанокомпозит кремнезем-ДНК, гщратащя, сильно- та слабоасоцiйована вода, суспензiя клiтин хлiбопекарських дрiж-джiв Saccharomyces cerevisiae.

HYDRATED PROPERTIES

OF COMPOSITE MATERIAL BASED ON NANOSILICA AND DNA

V. V. Turov1 V. M. Barvinchenko1 T. V. Krupska1 V. M. Gun'ko1 V. F. Chekhun2

1Chuiko Institute of Surface Chemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2Kavetski Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

E-mail: [email protected]

Silica is widely used in biomedicine not only as concomitant matter giving dosage forms the required physical and chemical properties but also as independent medication with the expressed detoxicated effect proved itself to be active at treatment of the food poisonings, bacterial and wound infections.

A nanocomposite system was prepared with finely dispersed silica modified by adsorbed DNA. Nanocomposite properties were studied using NMR spectroscopy, thermogravimetry, and infrared spectroscopy. A biometric study of SiO2-DNA composite influence was carried out for suspended Saccharomyces cerevisiae yeast cells. It was shown that the composite possesses a significant bioactivity since it can substantially accelerate the processes of vital functions of bakery yeasts. Hydration of SiO2-DNA composite and influence of organic solvent media were studied in detail. It was found out some forms of interfacial water including weakly associated water that practically does not form the hydrogen bonds with neighboring molecules. It was shown that interconversion of different forms of interfacial water occurs at varying temperature or addition of organic compounds. It was assumed that weakly associated water could affect the biocompatibility of nanoparticles with respect to cells.

Key words: Silica-DNA nanocomposite, hydratation, strongly and weakly associated water, suspension of Saccharomyces cerevisiae cells.

УДК 577.118:636.4

МЕТАБОЛ1ЧН1 ПОКАЗНИКИ КРОВ1 ПОРОСЯТ ЗА УМОВ ЗГОДОВУВАННЯ 1М КУЛЬТУРАЛЬНО1 Р1ДИНИ ДР1ЖДЖ1В Saccharomyces cerevisiae, ЯКА М1СТИТЬ Б1ОКОМПЛЕКСИ ХРОМУ

Р. Я. 1скра1 Институт бюлогп тварин НААН Украши, Льв1в

М. В. Гончар2, 3 21нститут бюлогп кл1тини НАН Украши, Льв1в

Г. I. Нечай1 2 3Зам1ський факультет бютехнологи,

I. Я. Максимович1 Жешувський ушверситет, Кольбушова, Польща

E-mail: [email protected]

У природному середовишД хром е переважно у двох валентних станах: шестивалентному (хрома-ти та бiхромати) i тривалентному (сполуки Cr3+). Хромати широко використовують у промисловостi, у процесах виробництва сталь сплавiв чавуну, обробки деревини та дублення шшри. G багато даних про токсичну, мутагенну й канцерогенну дт Cr(VI).

З'ясовано дт бiокомплексiв Cr(III) з культурально' рiдини дрiжджiв Saccharomyces cerevisiae на обмш проте'шв та вуглеводiв, а також систему антиоксидантного захисту в кровi поросят у пермд вщлучення вiд свиноматок. Встановлено, що введення до ращону поросят культурально' рщини, яка мiстить бiокомплекси хрому, спричинюе зменшення вмiсту сечовини та глюкози у плазмi кровi, збiльшення концентраци загального проте'ну, активностi ензимiв лактатдегщрогенази, каталази i глутатiонпероксидази та вм^ту вiдновленого глутатiону в еритроцитах кровь Не було виявлено суттевих вщмшностей мiж показниками тварин, що споживали культуральну рщину дрiжджiв, яка метила Cr(III) у формi природно-синтезованих бмкомплекмв, i таку, до складу яко1 входив хелато-ваний Cr(III).

Ключовi слова: поросята, дрiжджi, бiокомплекси хрому, проте'н, лактатдегiдрогеназа, вiдновлений глутатiон, ензими антиоксидантного захисту.

У природному середовишД хром е переважно у двох валентних станах: шестивалентному (хромати та бiхромати) i тривалентному (сполуки Сг3+). Хромати широко використовують у промисловоста, у процесах виробництва стал^ сплавiв чавуну, обробки деревини та дублення шшри. У л^ератур1 е багато даних про токсичну, мутагенну й канцерогенну дiю Сг^1) [1]. Цитоток-сичнiсть Cr(VI) вивчено недостатньо, проте велика шлькють дослщжень показуе, що Cr(VI) iндукуе оксидативний стрес, ушкод-ження ДНК, апоптоз клггин i модифiковану експресiю гешв [1, 2]. Через високу ток-сичнiсть i канцерогеннiсть хромати дуже не-безпечнi для навколишнього середовища i здоров'я людини [3], тому актуальною проблемою е розроблення ефективних ме-тодiв детоксикацп сполук хрому^1). На вщ-мiну вiд сполук хрому з вищою валентнютю, похщш Сг(Ш) не е такими токсичними [4], а в малих шлькостях вони потрiбнi вищим органiзмам. Сг(Ш) мае важливе значення

для активност iнсулiну, що в свою чергу позначаеться на метаболiзмi протеiнiв, жи-рiв i вуглеводiв. Вiн активуе ензими вугле-водневого обмiну, знижуе рiвень лiпiдiв у плазмi кров^ стимулюе процес включення амiнокислот у молекули протеМв [2, 5].

Вщновлення Cr(VI) до Сг(Ш) може вщбу-ватися за участю мiкроорганiзмiв [6, 7]. Важливими редуктантами хрому (VI) е дрiжджi БассНаготусвв сегеьЬёЬаг [7].

Вщомо, що анюни хромату транспорту-ються у мiкробнi клiтини сульфатспецифiч-ними пермеазами i можуть вщновлюватись до сполук Сг(Ш) клiтинними редукуючими системами, через ензиматичш й неензима-тичнi шляхи. Найпотужнiшими неензима-тичними вщновниками хроматiв е аскорбь нова кислота, глутатюн i цистеiн [7, 8]. Нещодавно показано, що дрiжджi вщпра-ють важливу роль у детоксикацп хромату позаклiтинною редукцiею: Сг^1) ^ Cr(V) ^ Сг(Ш) з утворенням двох тишв стабiльних Сг(Ш)-бюхелатованих комплексiв [9, 10].

Важливою практичною проблемою е збе-реження позитивно'! динамши росту поросят пюля вiдлучення '!х вщ свиноматок [11, 12]. У перюд вiдлучення поросята зазнають стресу, який зумовлений власне вщлучен-ням, перегрупуванням у зв'язку зi змiною типу живлення, послабленням iмунiтету, що мае наслщком вiдставання '!х у роста та розвитковi [13].

Одним iз чинникiв, що справляе пози-тивний вплив на фiзiологiчний стан поросят пщ час вiдлучення, е повноцшне живлення, збалансоване за складом в^амшв та мшро-елементiв, серед яких важливого значення в останн роки набувае хром. Додавання хрому може здшснюватись у формi погано засвоюваних неоргашчних солей або синте-тичних комплекйв, зокрема трипiколiнату хрому, запропонованого для згодовування ягнятам, телятам та свиням [14-16]. Головною фiзiологiчною функщею хрому е його опосередкований вплив на дт шсулшу [17, 18]. Хром — компонент фактора толерант-ностi глюкози, який позитивно впливае на п засвоення клггинами, покращуючи зв'язу-вання шсулшу з вщповщним рецептором [17]. Тому хром виявляе низку метаболiч-них ефектав, бiльшiсть з яких стосуеться змш у толерантностi глюкози i опосередко-вуеться участю елемента в мехашзмах iнсулiну. Дефiцит хрому в органiзмi людей та тварин може призвести до порушень дп iнсулiну [18].

З метою полшшення засвоення глюкози кровi в стресовий перюд можна використо-вувати добавки хрому до рацюну тварин. Шд час стресу в плазмi кровi збiльшуеться вмiст кортизолу, порушуеться метаболiзм глюкози, посилюеться видiлення хрому iз сечею [19]. Згодовування дослiдним телятам комбшорму з додавання хромовмiсних дрiжджiв [20, 21] або комплексних сполук хрому [20] супроводжувалося зменшенням вмюту кортизолу в сироватцi кровь Незва-жаючи на позитивний ефект у разi введення хрому в рацюн телят, у поросят не отримано однозначних результатав.

Метою наших дослщжень було з'ясувати дiю Сг(Ш) у формi природно-синтезованих бiокомплексiв, що мютяться в культу-ральнiй рщиш дрiжджiв Б. сегеьЬзЬае, iнку-бованих попередньо з хроматом та хромом Сг(Ш), на деякi метаболiчнi характеристики кл^ин кровi поросят пiд час годiвлi '!х зазна-ченими джерелами хрому(Ш).

Матерiали i методи

Методи отримання природно-синтезо-ваних бюкомплексЬе, що мЬстяться в куль-туральнш рЬдит дрЬжджЬв

Для одержання культурально'! рщини дрiжджiв, збагачено'! сполуками Сг(Ш), використовували промисловий штам дрiж-джiв БассНаготусез сегеьЬзЬае «Ензим». Дрiжджi вирощували на роторному шейкер1 при 250 об/хв, температурi 29 °С, у колбах Ерленмеера (0,5 л), в 100 мл середовища Беркгольдера з таким мшеральним складом (г/л): КН2РО4 — 1; (N^2804 — 3,5; Мя804-7Н20 — 0,5; СаС12 — 0,1; залiзо у виг-лядi солi Мора в концентрацп 0,2 мг/л та 0,1% дрiжджового екстракту «Дiфко».

Дрiжджовi клiтини в логарифмiчнiй фазi росту (перша доба) збирали центрифу-гуванням при 3 000 об/хв, стерильно переносили в свiже середовище, до якого додавали у вщповщних шлькостях сполуки хрому.

1. Отримання природно-синтезованих бюкомплексЬв Сг(111) вЬдновленням хромату. 1нкубащю кл^ин дрiжджiв (1 мг/мл) з 1 мМ хроматом катю проводили до повно-го зникнення хромату. Вмют залишкового хромату в культуральнш рiдинi пiд час шку-бацii визначали колориметрично дифенiл-карбазидним методом [10]. Шсля iнкубацГi культуральну рщину вiддiляли вiд клiтин центрифугуванням та заморожували. У про-цей заморожування природно-синтезован1 бiокомплекси Сг(Ш) сконцентровувались у верхнш частинi «крiоконцентрату», який шд час розморожування вiдбирали й заморо-жували повторно [10]. Шсля кожного циклу заморожування-розморожування вщбува-лось концентрування бюкомплекйв Сг(Ш). Вмiст Сг(Ш) у концентратах виявляли пiсля мiнералiзацii '!х алiквоти з використанням пергщролю в кислому середовищi. Концент-ращю Сг(Ш) в мiнералiзованих зразках визначали iз застосуванням хромазуролу 8 [22].

Для отримання препаратав, ям згодову-вали тваринам, концентрати, що мютили бiокомплекси Сг(Ш): 9-10 мМ, у перерахун-ку на Сг(Ш), лiофiлiзували.

2. Одержання бюхелатЬв неоргатчного Сг(111). 1нкубащю клiтин дрiжджiв (1 мг/мл) проводили з 1 мМ хлориду хрому. Рiвень хе-латування визначали за доступнютю Сг(Ш) в реакцп з хромазуролом 8 [22]. За рiвня бiо-хелатування 90-95% культуральну рщину вщбирали й заморожували. Бiохелати неорга-нiчного Сг(Ш) збирали «крюконцентруван-ням», як описано вище, та лiофiлiзували для виготовлення препаратав, ям безпосередньо

вводили тваринам. Алшвоти «крюконцент-ратав» бюхелатав Сг(Ш) мiнералiзовували, визначали в них вмют Сг(Ш) в реакцп з хро-мазуролом 8, який становив 5-6 мМ.

Характеристика дослЬдних груп тварин

Дослщження проводили на свиноферм1 учбового господарства Львiвського нащо-нального аграрного ушверситету на поросятах великоi бiлоi породи масою 8,0-10,0 кг пщ час вiдлучення 'х вiд свиноматок у 30-денному вщь

Було вiдiбрано 3 групи поросят: контрольна i 2 дослщнь Контрольна група поросят отримувала комбшорм, збалансований за вйма необхiдними мiкроелементами та вiтамiнами [23]. Дослщним групам згодову-вали комбшорм з препаратами сконцентро-ваноi лiофiлiзованоi культуральноi рiдини дрiжджiв. 1-й дослщнш групi призначали препарат, який мютив Сг(Ш) у формi при-родно-синтезованих бюкомплекйв, у доз1 250 мкг/кг корму, в перерахунку на Сг(Ш). Характеристику бюкомплекйв було наведено нами рашше [24]. 2-га дослщна група спо-живала препарат сконцентрованоi люфШ-зованоi культуральноi рiдини дрiжджiв, яка мiстила хелатований Сг(Ш). Тваринам зго-довували бiохелати Сг(Ш) в дозi 250 мкг/кг корму, в перерахунку на Сг(Ш). Тривалiсть уведення препаратав становила 40 дiб: з 20-до 60-добового вiку.

Визначення деяких метаболЬчних характеристик клЬтин кровЬ поросят

Матерiалом для дослщження слугували проби кровi поросят, ввдбраш за 5 дiб до 'х вiдлучення, та на 3-тю, 10-, 20- та 30-ту добу шсля вiдлучення. Визначали вмiст хрому в плазмi кровi методом атомно-абсорбцiйноi спектрометра, активнiсть ензимiв проте'но-вого i вуглеводного обмiну, антиоксидантно! системи в кровi поросят. Вмiст протешу, сечовини та глюкози, вщновленого глутатю-ну, актившсть гексокiнази, лактатдегщро-генази, глюкозо-6-фосфатдегщрогенази, супероксиддисмутази, каталази, глутатюн-

пероксидази визначали загальновизнаними методами [25]. Актившсть амшотрансфераз — на бiохiмiчному аналiзаторi «Бютронш-H2000».

Результати та обговорення

Згодовування дослщним групам поросят комбшорму з препаратом дрiжджiв, що мютив Cr(III) у формi природно-синтезова-них бiокомплексiв, зумовлюе пiдвищення вмюту хрому в кровi тварин через додаткове надходження його з кормом. У поросят до вщлучення в контрольнш та дослщних гру-пах концентращя мiкроелемента в плазм1 кровi iстотно не вiдрiзнялась (табл. 1).

На 3-тю добу шсля вщлучення поросят друго! дослщно! групи спостернаеться дос-товiрно бiльша (на 19%) концентращя хрому у тварин контрольно'! групи. У поросят 1-Ï та 2-Ï дослщних груп на 10-ту, 20- i 30-ту добу шсля вщлучення вщ свиноматок концентращя хрому в плазмi кровi достовiрно бiльша порiвняно з тваринами контрольно'! групи на 13-26%. Порiвняння результатав дослiджень 1-Ï та 2-Ï дослiдних груп не вия-вило суттевих мiжгрупових рiзниць.

Як вщомо, хром(Ш) посередньо лiмiтуе синтез проте!шв [5]. У результатi проведе-них нами дослiджень з'ясовано, що загаль-ний вмiст протешу в плазмi кровi поросят контрольно! групи у перюд з 20- до 60-добо-вого вiку iстотно не змшюеться.

За 5 дiб до вщлучення поросят вщ свиноматок не було встановлено достовiрно'í рiзницi вмiсту загального протешу плазми кровi у поросят контрольно! та обох дослщних груп (табл. 2).

Проте шсля вщлучення поросят вщ свиноматок концентращя загального протешу плазми кровi достовiрно вiдрiзняеться у тварин дослщних та контрольно! груп. Так, концентращя загального протешу в плазм1 кровi поросят на 3-тю i 10-ту добу шсля вщлучення 1-Ï та 2-Ï дослщних груп порiвня-но з поросятами контрольно! групи була дос-товiрно вищою на 12-20%. На 20-ту i 30-ту

Таблиця 1. Вм^т хрому в плазмi кровi поросят, мкг/л (M±m, n = 3)

Група За 5 дiб до вщлучення Доба шсля вщлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

^э^рольна 0,32±0,02 0,21±0,01 0,24±0,01 0,38±0,01 0,37±0,02

1-ша дослвдна 0,33±0,03 0,24±0,01 0,28±0,01** 0,44±0,01** 0,42±0,01**

2-га дослвдна 0,32±0,02 0,25±0,01** 0,29±0,01** 0,48±0,02*** 0,42±0,01**

Примтка. У цШ та !.нших таблицях статистична достов1рн1сть р1зниць м1ж показниками у тварин досл1дно1 групи пор1вняно з контрольною: * — P < 0,05; ** — P < 0,01; *** — P < 0,001.

Таблиця 2. Bmïct загального протешу в плазмi KpoBi, г/л (M ± m, n = 3)

Група тварин За 5 дiб до вiдлучення Доба пiсля вiдлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 53,7±2,04 51,8±0,73 53,6±0,64 56,2±1,47 56,6±0,72

1-ша дослана 57,4±1,63 60,4±1,03** 60,3±1,05** 60,3±1,97 57,0±2,18

2-га доcлiдна 57,0±0,73 62,7±0,33*** 63,5±0,86*** 62,9±2,40* 59,6±1,03*

добу в другш дослiднiй rpyni спостерiгалась достовiрно бiльша концентрацiя загального протешу плазми кровь вщповщно на 11% та 5%, порiвняно з поросятами контрольно! групи.

У тварин 2-Ï дослщно! групи концент-рацiя загального протешу плазми кровi на Bcix етапах пiслястресових дослщжень була дещо бiльша, нiж у першш доcлiднiй групi, що можна пояснити впливом бюкомплекйв Сг(Ш), утвореними як у процей вiдновлення хромату, так i пiд час хелатування екзоген-ного неорганiчного хрому(Ш) [26].

1нсулш завдяки полiпшенню зв'язуваль-но! здатноcтi з рецепторами клiтин за допо-могою хром(Ш)-вмicного пептиду хромо-дулiну [27] бiльш повною мiрою виявляе свою бiологiчну дiю — посилення синтезу протешу в кл^инах.

У процей доcлiдження активноcтi амшо-трансфераз плазми кровi доcлiджуваних поросят не було встановлено доcтовiрних рiзниць мiж тваринами контрольно! та обох дослщних груп упродовж усього перюду доcлiджень (табл. 3). Визначення активноста амiнотранcфераз плазми кровi в сучаснш медицинi е важливим кл^чним тестом, який cвiдчить про функщональний стан печiнки, зокрема про руйнащю пiд впливом токсичних речовин чи патогенних чиннишв гепатоцитiв, якi, руйнуючись, викидають в кров рiзнi ензими, серед яких е й амшотранс-ферази. З отриманих нами результатав можна зробити висновок, що згодовуваш поросятам препарати культурально! рщини

дрiжджiв, що мicтять хром, не спричиняють токсичного ефекту на оргашзм доcлiдних тварин.

Як вщомо, недостатне надходження енергоемних cубcтратiв у оргашзм поросят, спричинене !хшм стресовим станом, призво-дить до накопичення в органiзмi продуктiв промiжного обмшу — сечовини, сечово! кис-лоти, амiаку, кетонових тiл [26].

Дослщжуючи концентрацiю сечовини в плазмi кровi поросят доcлiдних та контрольно! груп, яка характеризуе штенсив-шсть катаболiзму амiнокиcлот у печiнцi (табл. 4), не виявили доcтовiрних рiзниць за 5 дiб до вщлучення та на 3-тю добу шсля вщлучення поросят вiд свиноматок. Слщ за-уважити, що вмicт дослщжуваного мета-болiту в плазмi кровi пicля вiдлучення зб^ь-шуеться порiвняно з перiодом доcлiджень до вщлучення, що свщчить про процеси поси-леного катаболiзму амiнокиcлот, спричине-ного стресовими чинниками.

Концентращя сечовини в плазмi кров1 поросят шсля !х вiдлучення вiд свиноматок у 1-й та 2-й дослщних групах доcтовiрно менша порiвняно з поросятами контрольно! групи на 10-ту добу вщповщно на 8% та 6%, на 20-ту добу — на 18% та 14%.

Отже, з цього можна зробити висновок, що додавання препаратав культурально! рщини дрiжджiв, як мютять хром, сприяе нормалiзацiï обмiну амiнокиcлот в ор-ганiзмi, порушеного пiд впливом стресового стану.

Таблиця 3. Актившсть амiнотрансфераз у плазмi KpoBi, мкмоль/л на год (M ± m, n = 3)

Група тварин За 5 дiб до вiдлучення Доба шсля вщлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Аланiнамiнoтpансфеpаза

Контрольна 0,785±0,062 0,647±0,032 0,764±0,024 0,633±0,030 0,630±0,033

1-ша доcлiдна 0,685±0,036 0,693±0,006 0,810±0,062 0,669±0,060 0,712±0,031

2-га доcлiдна 0,667±0,014 0,664±0,024 0,815±0,011 0,570±0,017 0,664±0,013

Аспаpтатамiнoтpансфеpаза

Контрольна 0,505±0,006 0,470±0,023 0,636±0,034 0,447±0,007 0,442±0,011

1-ша дослана 0,506±0,033 0,512±0,033 0,630±0,018 0,472±0,012 0,420±0,021

2-га доcлiдна 0,420±0,007 0,490±0,031 0,647±0,028 0,421±0,007 0,427±0,009

Таблиця 4. BMicT сечовини у плазмi кров^ ммоль/л (M ± m, n = 3)

Група За 5 дiб до вiдлучення Доба пicля вiдлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 4,23±0,05 6,11±0,05 6,35±0,03 6,43±0,03 5,93±0,05

1-ша дослщна 4,31±0,07 6,13±0,04 5,87±0,04*** 5,27±0,06*** 5,74±0,06

2-га дослщна 4,36±0,04 6,04±0,03 5,97±0,04** 5,53±0,10*** 5,66±0,09

Вважають, що енергетичш потреби поросят раннього вшу на 80% забезпечуються за рахунок вуглеводiв. Вiдомо, що в перюд пю-лястресово! адаптацiï основним джерелом енергп для поросят е глюкоза та амшокисло-ти з розгалуженим ланцюгом. Поряд iз цим вщомо, що за додаткового введення в оргашзм тварин препаратав хрому посилюються процеси вуглеводного обмшу [5].

Дослщження концентрацп глюкози плазми кровi поросят обох дослщних та контрольно! груп до вщлучення вщ свиноматок не встановило мiжгрупових доcтовiрних рiзниць (табл. 5).

Проте вже на 3-тю добу пicля вщлучення поросят контрольно! групи вщ свиноматок концентращя глюкози плазми кровi зб^ь-шуеться порiвняно з ïï вмютом перед вщлу-ченням. Це зумовлено стресовим станом тварин, пщ час якого в органiзмi посилюеться розклад глшогену.

Поряд iз цим концентращя глюкози в плазмi кровi поросят 1-Ï та 2-Ï дослщних груп доcтовiрно менша, нiж у контрольнш групi тварин, на 3-тю, 10- i 20-ту добу шсля вщлучення на 10-15%, що свщчить про стресостшкють тварин шсля вщлучення внаслщок дiï сполук хрому.

Мехатзм зменшення концентрацп глюкози в плазмi кровi поросят обох дослщних груп пщ впливом хрому зводиться до бiльш iнтенcивного ïï використання шляхом глiколiзу

та синтезу глшогену. Хромомодулш, до складу якого входить хром, активуе шсуль новi мембранш рецептори, унаcлiдок чого iнcулiн краще зв'язуеться з рецепторами на клггинних мембранах i довше здатен вияв-ляти свш бiологiчний ефект [5].

Концентращя вiльноï глюкози в кл^иш порiвняно невелика, проте бiльша частина глюкози в кл^инах органiзму мютиться у фоcфорильованiй формi. Цей процес ката-лiзуетьcя гекcокiназою — ензимом, що за-пускае глiколiз. Активнють гекcокiнази в лiзатах еритроцитiв кровi поросят 2-Ï до-cлiдноï групи на 3-тю добу шсля вщлучення доcтовiрно б^ьша на 20% за активнють ен-зиму в тварин контрольно! групи (табл. 6).

На 10-ту, 20- та 30-ту добу шсля вщлучення поросят обох дослщних груп спос-тершали тенденщю до збiльшення актив-ноcтi гексокшази в гемолiзатах порiвняно з активнютю ензиму в тварин контрольно! групи.

Дослщжуючи активнють лактатдегщро-генази в лiзатах еритроцитiв кровi тварин до вщлучення контрольно! та обох дослщних груп, встановили приблизно однаковий ïï рiвень. Однак, вже на 3-тю добу шсля вщлучення поросят вщ свиноматок вщбуваеться зб^ьшення активноста дослщжуваного ензиму в кровi тварин 2-Ï доcлiдноï групи на 23% порiвняно з активнicтю ензиму в тварин контрольноï групи (табл. 7).

Таблиця 5. BMicT глюкози у плазмi кpoвi, ммоль/л (M ± m, n = 3)

Група За 5 дiб до вщлучення Доба шсля вщлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 4,88±0,46 7,48±0,24 6,48±0,42 6,09±0,10 5,65±0,07

1-ша доcлiдна 5,73±0,12 6,32±0,16** 5,48±0,10** 5,34±0,17*** 5,43±0,04

2-га дослщна 4,94±0,14 6,42±0,07*** 5,47±0,05** 5,46±0,20** 5,43±0,05

Група За 5 дiб до вщлучення Доба шсля вщлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 1,85±0,06 1,57±0,21 1,33±0,10 1,38±0,09 1,38±0,09

1-ша доcлiдна 1,84±0,08 1,84±0,07 1,51±0,20 1,56±0,09 1,40±0,19

2-га дослщна 1,54±0,02 1,88±0,12* 1,66±0,18 1,55±0,01 1,55±0,21

Таблиця 6. Актившсть гекcoкiнази в лiзатах еpитpoцитiв кpoвi, нмоль/(хв • мг протешу) (M ± m, n = 3)

Таблиця 7. Актившсть лактатдегщрогенази в лiзатах еритроцитав кровi, нмоль/(хв • мг протешу) (M ± m, n = 3)

Група За 5 дiб до вщлучення Доба пiсля вiдлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 12,7±1,59 10,6±0,46 8,1±0,03 4,7±0,23 8,6±0,83

1-ша дослiдна 11,7±0,40 11,6±0,49 10,2±0,02*** 6,5±0,29** 10,5±0,29

2-га дослщна 14,2±0,71 13,2±0,65* 11,6±0,78** 5,9±0,62 10,3±0,52

На 10- i 20-ту добу пiсля вщлучення поросят вщ свиноматок у першш та другiй дослiдних групах актившсть лактатдегщро-генази достовiрно перевищуе на 25-40% вiдповiднi показники в гемолiзатах тварин контрольно! групи.

Порiвняння рiвня активностi лактатде-гiдрогенази мiж 1-ю та 2-ю дослiдними трупами показуе, що актившсть дослщжувано-го ензиму дещо бiльша у тварин 2-Ï дослiдно'ï групи порiвняно з поросятами 1-Ï дослiдно'ï групи. Особливо яскраво щ змiни виражеш на 3-тю та 10-ту добу шсля вщлучення, що можна пояснити дiею природно-синтезова-них бiокомплексiв Cr(III).

Збiльшення активностi гексокiнази та лактатдегщрогенази в лiзатах еритроцитiв пiд впливом препарату культурально! рщи-ни дрiжджiв, що мiстить бiокомплекси хрому, свщчить про посилений глiколiз у зв'яз-ку з енергетичними потребами. Мехашзм посилення активностi дослiджуваних ен-зимiв вуглеводневого обмiну пiд впливом хрому пояснюеться активуванням ще! ланки обмшу речовин iнсулiном.

Важливу роль в живому органiзмi вщь грае пентозофосфатний шлях розщеплення глюкози, де утворюються NADPH та пенто-зи. Дослiдження активностi глюкозо-6-фос-фатдегiдрогенази в лiзатах еритроцитiв

кровi поросят не виявило мiжгрупових достовiрних розбiжностей у тварин обох дослщних та контрольно! груп на вйх етапах дослщжень (табл. 8).

У перюд вiдлучення поросят вщ свиноматок спостерiгаеться досить високий рiвень ак-тивностi антиоксидантних ензимiв у кровi. Очевидно, це пов'язано з активащею обмш-них процейв, змiною парцiального тиску кисню в тканинах поросят i необхщшстю за-побiгання посиленню процесiв пероксидного окиснення лшвдв за цих умов.

Ключовим ензимом у ланщ ензиматич-ного антиоксидантного захисту е суперок-сиддисмутаза, яка каталiзуе дисмутацiю супероксиду в кисень i пероксид водню. Актившсть ензиму в лiзатах еритроцитав кров1 поросят достовiрно не вiдрiзнялась у тварин контрольно! та обох дослщних груп упро-довж усього перюду дослiджень (табл. 9). Це, у свою чергу, можна пояснити вщсут-шстю в дослiдних групах тварин надлишко-вого утворення токсичних радикалiв О/".

Пероксид водню як побiчний продукт окисних реакцiй знешкоджуеться катала-зою. Рiвень активностi ензиму в лiзатах еритроцитiв кровi поросят контрольно! та обох дослщних груп за 5 дiб до вщлучення вщ свиноматок однаковий, без достовiрних змш (табл. 10).

Таблиця 8. Актившсть глюкозо-6-фосфатдегщрогенази в лiзатах еритроцитав кровi, нмоль/(хв • мг протешу) (M ± m, n = 3)

Група За 5 дiб до вщлучення Доба пiсля вiдлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 6,56±0,099 5,39±0,169 5,37±0,155 4,77±0,226 4,77±0,226

1-ша дослана 5,92±0,281 5,16±0,572 5,37±0,330 4,43±0,236 4,43±0,236

2-га дослiдна 6,26±0,224 6,23±0,282 5,48±0,093 4,32±0,147 4,32±0,147

Таблиця 9. Актившсть супероксиддисмутази в лiзатi еритроцитв кровi, ум. од./мг протешу (M ± m, n = 3)

Група За 5 дiб до вiдлучення Доба пiсля вщлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 15,5±0,36 8,6±0,34 10,3±0,87 16,9±0,55 14,9±0,08

1-ша дослана 17,5±0,89 7,9±0,59 12,2±1,75 13,5±2,64 14,9±0,15

2-га дослвдна 15,5±0,33 8,9±0,57 13,5±1,46 13,2±1,20 14,8±0,12

Таблиця 10. Актившсть каталази в лiзатах еритроцитав кров^ ммоль/(хв • мг протешу) (М ± m, n = 3)

Група За 5 дiб до вщлучення Доба шсля вщлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 3,55±0,33 3,65±0,23 2,99±0,02 2,82±0,04 2,82±0,03

1-ша дослГдна 3,62±0,40 4,53±0,07** 3,52±0,20* 2,81±0,07 2,80±0,02

2-га дослГдна 3,57±0,08 4,22±0,04** 3,52±0,02*** 2,87±0,19 2,81±0,13

Шсля вщлучення поросят вщ свиноматок актившсть каталази доcтовiрно бГльша на 15-24% в кровi тварин 1-Ï та 2-Ï доcлiдних груп на 3-тю та 10-ту добу порiвняно з актив-нicтю в кровi тварин контрольно! групи.

Важливою ланкою в ензиматичнш сис-темi антиоксидантного захисту е глутатаон-пероксидаза, яка каталiзуе реакцiï усунен-ня токсичних гiдроперокcидiв за допомогою !х редукцп глутатiоном. Встановлено, що на 3-тю i 10-ту добу шсля вщлучення поросят актившсть ензиму в гемолiзатах тварин 1-Ï та 2-Ï дослщних груп достовГрно зростае на 14 — 20% вщносно аналопчно! активноcтi у тварин контрольно! групи (табл. 11).

ЗбГльшення активноcтi ензимiв антиоксидантного захисту в еритроцитах кровГ поросят дослГдних груп свщчить про полшшен-ня функщонального стану ензиматично'1 ланки антиоксидантного захисту за умов зго-довування бюлопчно активних форм хрому.

Основним компонентом глутатаоново'1 системи антиоксидантного захисту е вщнов-лений глутатiон. Встановлено, що шсля вщлучення поросят вщ свиноматок концентращя вщновленого глутатiону в лiзатах еритроцитiв нижча, нГж до вщлучення (табл. 12). Проте у поросят 1-Ï та 2-Ï дослГдних груп на 3-тю, 10- i 20-ту добу шсля вщлучення концентращя вщновленого глутатаону в гемолГзатах е достовГрно бГльшою порГвняно

з його концентращею у поросят контрольно'! групи. Поряд Гз цим, зГставляючи мГжгрупов1 рГзницГ показникГв 1-Ï та 2-Ï дослГдних груп, виявили, що вмГст вГдновленого глутатГону в тварин 1-Ï дослщно! групи дещо бГльший, нГж у поросят 2-Ï дослщно! групи.

ЗбГльшення концентрацп вГдновленого глутатГону, беззаперечно, е позитивним ефек-том, що може забезпечити потреби ензиматич-но! ланки антиоксидантного захисту у вмюта активного антиоксиданту, для знешкодження токсичних штермедГатав оксидативних про-цесГв, особливо пГд час стресових сташв.

Таким чином, одержанГ результати досль джень дають пГдстави вважати можливим ви-користання продуктГв життедГяльностГ дрГж-джГв, що багатГ на бюкомплекси з хромом, як джерела цього мГкроелемента в рацГонГ свиней. Встановлено, що введення культурально'1 рщини, яка мГстить бГокомплекси хрому до ращону поросят, сприяе активацп процесГв синтезу протешу, глГколГзу та системи антиоксидантного захисту в кровь Водночас не було виявлено рГзнищ в показниках мГж тварина-ми обох дослГдних груп, що свщчить про мож-ливГсть використання препаратав культураль-но! рГдини дрГжджГв Saccharomyces cerevisiae, шкубованих попередньо з хроматом Cr(VI) та хромом Cr(III), як компонента кормГв у годГвл1 молодняку йльськогосподарських тварин.

Таблиця 11. Актившсть глутатшнпероксидази в лiзатах еpитpoцитiв кров^ мкмоль/(хв • мг протешу) (М ± m, n = 3)

Група За 5 дiб до вщлучення Доба пicля вiдлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 51,1±3,91 45,0±1,76 46,8±2,36 33,7±1,60 33,9±1,32

1-ша дослГдна 52,5±1,77 52,6±1,48** 54,5±2,02* 33,0±1,33 33,1±1,15

2-га дослГдна 46,6±2,06 54,0±0,89** 53,8±2,15* 32,0±1,02 32,6±0,84

Таблиця 12. Вм^т вщновленого глутатшну в лiзатах еpитpoцитiв кpoвi, ммоль/л (М ± m, n = 3)

Група За 5 дiб до вiдлучення Доба пicля вiдлучення

3-тя 10-та 20-та 30-та

Контрольна 0,88±0,02 0,36±0,006 0,44±0,02 0,35±0,01 0,49±0,02

1-ша дослГдна 0,89±0,03 0,56±0,08** 0,52±0,01** 0,47±0,01*** 0,53±0,01

2-га дослГдна 0,87±0,02 0,42±0,01** 0,54±0,02** 0,44±0,02** 0,52±0,01

Л1ТЕРАТУРА

1. Alcedo J. A., Wetterhahn K. E. Chromium toxicity and carcinogenesis // Int. Rev. Exp. Pathol. — 1990. — N 31. — P. 85-108.

2. Anderson R. A. Stress effects on chromium nutrition of human and farm animals // Biotechnology in the Feed Industry. Proc. Alltech's 10th Annual Symposium. (T. P. Lyons and K. A. Jacques, eds). — Nottingham University Press, Loughborough, Leics, UK. — 1994.— P. 267-274.

3. De Flora S, Wetterhahn K. E. Mechanisms of chromium metabolism and genotoxicity // Life Chem. Rep. — 1989. — N 7. — P. 169-244.

4. Boleman S. L., Boleman S. J., Bidner T. D. et al. Effect of chromium tripicolinate on growth, body composition, and tissue accretion in pigs // J. Anim. Sci. — 1995. — N 73. — P. 2033-2042.

5. Сологуб Л. I., Антоняк Г. Л., Бабич Н. О. Хром в opraHi3Mi людини i тварин. Бю-XÎMÎ4HÎ, iмунологiчнi та еколопчш аспек-ти. — Львiв: ввросвгг, 2007. — 128 с.

6. Cervantes C., Campos-Garcia J., Devars S. et. al. Interactions of chromium with microorganisms and plants // FEMS Microbiol. Rev. — 2001. — V. 25, N 3. — P. 335-347.

7. Plus R. Chromium. Mineral Levels in Animal Health. — British Columbia, Canada: Sherpa International, 1988. — P. 61-62.

8. Mertz W. Chromium in human nutrition: A review // J. Nutr. — 1993. — V. 123. — P. 626-633.

9. Ksheminska H, Fedorovich D, Honchar T. et al. Yeast tolerance to chromium depends on extra-cellular chromate reduction and Cr(III)-chelation // Food Technol. Biotech-nol. — 2008. — V. 46, N 4. — P. 420-427.

10. Ksheminska H. P., Honchar T. M, Gay-da G. Z, Gonchar M. V. Extra-cellular chro-mate-reducing activity of the yeast cultures // Cent. Eur. J. Biol. — 2006. — V. 1, N 1. — P. 137-149.

11. Desmoulin B., Aumaitre A., Peiniau J. Influence du poids a 10 jours et de l'age a la castration des porcelets males sur la croissance et la qualite des carcasses a l'abbattage // Ann. Zootech. — 1990. — V. 39. — P. 219-227.

12. Hardy B. Diets for young pigs // Neonatal survival and growth. Occasional Publication no. 15. British Society of Animal production, UK. — 1992. — P. 99-107.

13. Pluske J. R., Williams I. H., Aherne F. X. Nutrition of the neonatal pig. // Development and survival. CAB International, Wallingford, UK. — 1995. — P. 187-235.

14. Kitchalong L., Fernandez J. M., Bunting L. D. et al. Chromium picolinate supplementation in lamb rations: effects on performance, nitrogen balance, endocrine and metabolic parameters //J. Anim. Sci. —

1993. — V. 71 (Suppl. 1) — P. 291.

15. Bunting L. D., Fernandez J. M., Thompson Jr. D. L. et al. Influence of chromium picolinate on glucose usage and metabolic criteria in growing Holstein calves // Ibid. —

1994. — V. 72 — P. 1591-1599.

16. Amoikon E. K., Fernandez J. M., Southern L. L. et al. Effect of chromium tripicolinate on growth, glucose tolerance, insulin sensitivity, plasma metabolites, and growth hormone in pigs // Ibid. — 1995. — V. 73 — P. 1123-1130.

17. Anderson R. A. Chromium. Trace elements in human and animal nutrition // Academic Press, Inc., New York, NY. — 1987. — V. 1. — P. 225-244.

18. Mertz W. Chromium in human nutrition: a review // J. Nutr. — 1993 — V. 123. — P. 626-633.

19. Mowat D. N., Chang X., Yang W. Z. Chelated chromium for stressed feeder calves // Can J. Anim. Sci. — 1993 — V. 73 — P. 49-55.

20. Chang, X., Mowat D. N. Supplemental chromium for stressed and growing feeder calves // Ibid. — 1992. — V. 70 — P. 559-565.

21. Moonsie-Shageer S., Mowat D. N. Effect of level of supplemental chromium on performance, serum constituents, and immune status of stressed feeder calves // Ibid. — 1993. — V. 71 — P. 232-238.

22. Honchar T. M., Ksheminska H. P., Patsay I. O. et al. Assay of chromium(III) in microbial cultures using Chromazurol S and surfactants // Бютехнолопя. — 2008. — Т. 1, N 4. — P.64-67.

23. Калашников А. П., Фисинин В. И., Щеглов В. В. и др. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. Справочник. — М.: Россельхозакадемия, 2003. — 456 с.

24. Fedorovych D. V., Gonchar M. V., Ksheminska H. P. et al. Mechanisms of chromate detoxification in yeasts // Microbiol. Biotech-nol. — 2009. — N 7. — P. 15-21.

25. ВлЬзло В. В., Федорук Р. С., Макар I. А. та 1н. Фiзiолого-бiохiмiчнi методи дослщжень у бюлогп, твариннищв та ветеринарнш медициш. Доввдник. — Львiв: ВМС, 2004. — 400 с.

26. Понд У. Д., Хаупт К. А. Биология свиньи: Пер. с англ. — М.: Колос, 1983. — 334 с.

27. Cefalu W. T., Hu F. B. Role of chromium in human health and in diabetes // Diabetes Care. — 2004. — V. 27, N 11. — P. 2741-2751.

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ПОРОСЯТ ПРИ СКАРМЛИВАНИИ ИМ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ

ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae, СОДЕРЖАЩЕЙ БИОКОМПЛЕКСЫ ХРОМА

Р. Я. Искра1 М. В. Гончар2- 3 Г. И. Нечай1 2 И. Я. Максимович1

1Институт биологии животных HAAH Украины, Львов 2Институт биологии клетки НАН Украины, Львов

3Загородный факультет биотехнологии, Жешувский университет, Кольбушова, Польша

E-mail: [email protected]

В естественной среде хром находится преимущественно в двух валентных состояниях: шести- (хроматы и бихроматы) и трехвалентном (соединения Cr3+). Хроматы широко используют в промышленности, в процессах производства стали, сплавов чугуна, обработки древесины и дубления кожи. В литературе есть много данных о токсичном, мутагенном и канцерогенном действии Cr(VI).

Выяснено действие Cr(III) из культураль-ной жидкости дрожжей Saccharomyces cerevisiae на обмен протеинов и углеводов, а также систему антиоксидантной защиты в крови поросят в период отлучения от свиноматок. Установлено, что введение в рацион поросят культуральной жидкости, которая содержит биокомплексы хрома, способствует уменьшению содержания мочевины и глюкозы в плазме крови, увеличению концентрации общего протеина, активности лактатдегидрогеназы, каталазы и глутатионпероксидазы и содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах крови. Не было выявлено существенных различий между показателями у животных, которым скармливали культуральную жидкость дрожжей, содержащую Cr(III) в форме естественно-синтезированных биокомплексов, и жидкость, в состав которой входил хелатиро-ванный Cr(III).

Ключевые слова: поросята, дрожжи, биокомплексы хрома, протеин, лактатдегидроге-наза, энзимы антиоксидантной защиты.

METABOLIC INDICES OF PIGLETS BLOOD

AT FEEDING OF CULTURAL LIQUID OF THE YEAST Saccharomyces cerevisiae CONTAINING CHROMIUM BIOCOMPLEXES

R. Ya. Iskra1 M. V. Gonchar2 3 H. I. Nechay1- 2 I. Ya. Maksymovych1

institute of Animal Biology of the National Academy of Agricultural

Sciences of Ukraine, Lviv 2Institute of Cell Biology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv

3Branch Campus of the Faculty of Biotechnology, Rzeszow University, Kolbuszowa, Poland

E-mail: [email protected]

In natural environment chrome is mainly in two valency states: six- (chomates and bichromates) and trivalent (Cr3+ compounds). Chromates are widely used in industry, in the process of steel production, cast-iron alloys, treatment of wood and leather tanning. There is a lot of information about toxic, mutagenic and carcinogenic action of Cr(VI).

The effect of chromium in cultural liquid of the yeast Sacharomices cerevisiae on protein and carbohydrate metabolisms as well as a system of antioxidant protection in piglets' blood after weaning was investigated. It was found that culture liquid addition to the piglets diet containing biocomplexes of chromium led to reduction of urea and glucose in blood plasma, increase of total protein, activity of enzymes lactate dehy-drogenase, catalase and glutathione peroxidase and reduced glutathione content in erythrocytes of blood.

No significant differences between animal parameters that were fed culture — liquid of the yeast containing Cr(III) in the form of synthesized biocomplexes and one containing chromium as chelant were found.

Key words: piglets, yeast, chromium, protein, lactate dehydrogenase, antioxidant protection enzymes.

УДК 57.083.1:615.322

ОПТИМИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ЭКСТРАКТОМ Ungernia victoris

Т. П. Перерва А. Ю. Мирюта

A. С. Дворник Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Л. П. Можилевская Киев

B. А. Кунах

E-mail: [email protected]

Оптимизация состава питательных сред считается одним из способов повышения выхода биомассы бактериальных клеток, а также целевого продукта при культивировании штаммов продуцентов всех видов и назначений. В связи с развитием биотехнологической промышленности все большее значение приобретает поиск новых компонентов питательных сред, их оптимального соотношения с базисным составом среды и соответствия свойствам культивируемого объекта.

Добавление экстракта Ungernia victoris к бактериальной питательной среде оптимизирует ее состав и позволяет повысить выход биомассы E. coli. На LB-среде статистически достоверное превышение выхода биомассы штаммов M17 и HB101 наблюдается только для более высоких концентраций экстракта (5-10%), в то время как выход биомассы штамма JM109 повышается на всех испытанных концентрациях (0,5-10%). Наиболее высокий выход биомассы всех трех штаммов соответствует концентрации экстракта 10%. Влияние экстракта U. victoris на рост бактериальных штаммов на обогащенной среде отличается от его воздействия на эти же штаммы на LB-среде. Прирост биомассы происходит при низких концентрациях экстракта (0,25-1%) и не столь значителен, как на LB-среде. Начиная с концентрации экстракта от 2% и до 10% наблюдается тенденция снижения выхода биомассы для штаммов М17 и НВ101 и более низкого прироста биомассы JM109 по сравнению с концентрациями 0,25-1%. Таким образом, при помощи растительного экстракта можно достичь увеличения выхода биомассы бактерий как на бедной, так и на обогащенной среде. Оптимальное количество прибавляемого экстракта колеблется в зависимости от состава среды и особенностей объекта выращивания.

Ключевые слова: Escherichia coli, растительные экстракты, питательные среды.

В последнее время прослеживается четкий переход от эмпирического подхода к выбору среды культивирования с использованием уже готовых наборов различных биотехнологических фирм, в частности Athena Enzyme Systems, Балтимор (США), до систем расчета, позволяющих четко определить количество и оптимальное соотношение отдельных компонентов питательной среды. В качестве примера можно привести метод Плакетт-Бермана (Plackett-Burman design), разработанный еще в 1946 г. [1] и нашедший успешное применение в наши дни [2]. Широкое распространение получил также так называемый метод поверхностного ответа (response surface method), без которого в настоящее время не обходится почти ни одна серьезная биотехнологическая работа, связанная с выращиванием бактериальных культур [3]. Метод позволяет рассчитать наиболее приемлемое количество дополнительного компонента или смеси, вносимых в питательную среду в качестве добавок. Традиционно такими

добавками выступают продукты животного происхождения — кислотные и энзиматичес-кие гидролизаты казеина, энзиматические гидролизаты мяса и препараты типа дрожжевого экстракта [4]. Вещества растительного происхождения используют не столь широко, хотя соевый гидролизат находит применение в микробиологической практике, в том числе в медицинской микробиологии, в частности для обнаружения различных О-серотипов E. coli в продуктах животного происхождения [5] или наработки плазмидсодержащих штаммов с целью получения рекомбинантного протеина [6]. В бактериологической диагностике коклюша также давно известна и часто применяется картофельно-глицероловая среда [7].

В то же время продукты растительного происхождения, составляющие базис целых отраслей фармакологической, косметологической и пищевой индустрии, еще недостаточно используются в микробиологической практике, несмотря на то, что в них обнаружен ряд биологически

активных веществ, обладающих антибактериальными, антивирусными, антигрибковыми, антипаразитарными, антиоксидантными и антиканцерогенными свойствами [8-10].

В проведенных нами ранее исследованиях было показано, что экстракты, полученные из биомассы культивированных in vitro клеток некоторых лекарственных растений, также обладают антимутагенной, антиканцерогенной и противоопухолевой активностью, тестируемой в нескольких фаговых и бактериальных системах [11-17]. Кроме обнаружения этой активности мы установили, что компоненты растительных экстрактов связываются с протеинами-поринами наружной мембраны E. coli [18], т. е. в соответствии с данными литературы [19, 20] те из них, размер которых не превышает 600 Да, могут проникать внутрь бактериальной клетки через поровые каналы. Биологический эффект таких веществ в этой системе легче всего отследить по изменениям роста и накоплению биомассы бактерий. В данной работе мы изучали накопление биомассы трех штаммов E. coli — M17, HB101 и JM109 в присутствии одного из растительных экстрактов, а именно U. victoris, выбранного нами, поскольку его свойства, в том числе и механизм проникновения в бактериальную клетку, были наиболее детально исследованы нами ранее [11, 13, 17, 18]. С одной стороны, повышение выхода биомассы могло бы свидетельствовать о включении в бактериальный метаболизм мелких гидрофильных компонентов растительного экстракта, а с другой — дало бы основание рассматривать растительный экстракт как добавку к питательной среде, оптимизирующую качество последней.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы. В работе использованы штаммы E. coli М17 (колибакте-рин — аптечный препарат) и два лабораторных штамма JM109 — e14(McrA) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rk- mk+) surE44 relA1 A(lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZAM15] и НВ101 — supE44 ara14 galK2 lacY1 A(gpt-proA)62 rpsL20 (Strr) xyl-5 mtl-1 recA13 A(mcrC-mrr) HsdS(r- m), полученных из Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино-на-Оке (Россия).

Питательные среды. Бактерии выращивали на питательной среде LB (Luria-Berta-ni) [21] или на обогащенной питательной среде М9 [21] следующего состава: на 1л среды триптона — 10 г; дрожжевого экстракта — 5 г; Na2HPO4 — 6 г; KH2PO4 — 3 г; NH4Cl — 1 г; NaCl — 0,5 г; 1M MgSO4 — 2 мл; 1M CaCl2 — 0,1 мл; 20%-й глюкозы — 10мл.

Растительный экстракт прибавляли до концентрации 0,5-10% для среды Luria-Bertani и 0,25-10% для среды на солевой основе М9. Диапазон концентраций был подобран так, чтобы в него вошли как низкие концентрации (0,25-1%), наиболее приемлемые для технологического выращивания, так и высокие (2-10%), важные с точки зрения максимального влияния экстракта в составе бедной и обогащенной сред. Каждую культуру выращивали в течение 18-24 ч при 37 С, после чего ресуспендировали в соотношении 1:100 в такой же питательной среде, распределяли по пробиркам и вносили растительный экстракт в заданных концентрациях. В качестве контроля использовали эту же бактериальную суспензию, но без экстракта. После этого все культуры выращивали в течение 18-24 ч при температуре 37 °С с аэрацией.

Растительный экстракт получали в виде 40% -й этанольной вытяжки, используя конечное соотношение спирт : биомасса — 3:1. Экстракт упаривали при помощи ваку-умно-ротационного испарителя при температуре 40 °С почти до сухого остатка и растворяли в стерильной дистиллированной воде до исходного объема. Как источник экстракта использовали биомассу клеток Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko из семействаAmaryllidaceae (штамм UV-2, коллекционный № 10, ККК ИМБиГ НАН Украины, Киев) — далее экстракт U. victoris.

Статистическая обработка данных. Результаты опытов обрабатывали статистически на основании общепринятых методов [22].

Результаты и обсуждение

Результаты экспериментов по влиянию экстракта U. victoris на выход биомассы E. coli представлены на рисунке.

Как следует из приведенных данных, добавление экстракта U. victoris к обеим средам приводит к статистически достоверному повышению выхода биомассы всех трех использованных штаммов. Это свидетельствует о влиянии растительного экстракта на метаболизм бактерий и подтверждает возможность проникновения его компонентов внутрь неповрежденной бактериальной клетки.

Такими компонентами могут быть моносахариды, представленные у рода Ungernia галактозой, глюкозой, маннозой, арабино-зой, рамнозой, а также ряд микроэлементов, в том числе Cu, Zn, Co, Mn, Mo, Al, количество которых зависит от состава почвы или искусственной питательной среды для выращивания культуры клеток in vitro [23].

А

% 250 -|

200 --Г -

□ к

■ 0,5

□ 2

□ 1(1

Штамм Е. coli

Б

% 25«

200

100

50

НВ101

III I .1M /' ri'll

Влияние экстракта и^вгнЬа иЬеЬоНв на выход биомассы штаммов M17, HB101 и JM109 на среде LB (А) и на обогащенной среде на солевой основе М9 (Б):

по оси ординат даны значения прироста биомассы бактериальных клеток, выраженные в % относительно контрольного варианта (К), выращенного на питательной среде без прибавления растительного экстракта. Столбики разных цветов соответствуют вариантам питательной среды с содержанием экстракта в диапазоне 0,25-10% от объема

Мелкие гидрофильные компоненты растительных экстрактов могут быть представлены также ди- и трисахаридами и аминокислотами. В предшествующей работе [18] мы показали, что экстракт U. victoris, полученный нашим методом, содержит протеиновых веществ 4,25 мг/мл, углеводов 15,5 мг/мл и алкалоидов 0,25 мг/мл. Молекулы массой не более 600 Да проникают в бактериальную клетку через каналы про-теинов-поринов [19, 20], что влечет за собой эффекты самого различного и даже противоположного характера, например падение ре-цепторной активности клетки для OmpC-и OmpF-зависимых бактериофагов и повышение ее для ЛПС-зависимых. Последнее свидетельствует о включении компонентов растительного экстракта в углеводный обмен бактериальной клетки, что, очевидно, сказывается и на уровне выхода биомассы выращиваемой культуры.

Установлено, что на среде LB превышение выхода биомассы наблюдается при более высоких концентрациях экстракта для штаммов М17 и НВ101 (5-10%), тогда как статистически достоверное превышение биомассы штамма JM109 происходит на всех испытанных концентрациях экстракта (от 0,5 до 10%) с тенденцией постепенного увеличения выхода от низких концентраций экстракта к высоким. Наиболее высокий выход биомассы всех трех штаммов на LB-сре-де соответствует концентрации экстракта U. victoris 10%. Такой эффект можно объяснить, очевидно, составом LB-среды, которая содержит только компоненты, необходимые для поддержания жизнедеятельности бакте-

рий, но в ней отсутствуют источники углерода и буферной системы; обогащение такой среды существенно повышает ее способность обеспечивать прирост бактериальной биомассы. Что касается разницы, наблюдаемой в ответе штамма JM109 по сравнению со штаммами М17 и НВ101, то наиболее вероятно, что она обусловлена особенностями генетической структуры и физиологическими свойствами этих штаммов.

Влияние экстракта U. victoris на рост бактериальных штаммов на обогащенной среде отличается от его воздействия на эти же штаммы на LB-среде. Прирост биомассы наблюдается при низких концентрациях экстракта (0,25-1%) и не столь значителен, как на LB-среде. Начиная с концентрации экстракта от 2% и до 10% прослеживается тенденция снижения выхода биомассы для штаммов М17 и НВ101 и более низкий прирост биомассы JM109 по сравнению с концентрациями 0,25-1%. Этот результат подтверждает многочисленные данные, согласно которым существует некий оптимум насыщения среды питательными компонентами, превышение которого быстро приводит к угнетению роста культуры из-за накопления в среде продуктов ее жизнедеятельности [24]. Интересно, что, как и на LB-среде, штамм JM109 более активно накапливает свою биомассу, что указывает на связь этого показателя с эффектом обогащения питательной среды и генетической организацией выращиваемого объекта.

Несмотря на то, что в данной работе мы отслеживаем только прирост биомассы, а не наработку целевого протеина, есть достаточ-

ные основания считать, что эти два параметра хорошо коррелируют между собой. Так, сравнение выхода биомассы клеток и реком-бинантного протеина вируса Денге на средах LB, TB (триптонный бульон), SB (бульон на соевом гидролизате) и TY (триптон + дрожжевой экстракт) показало, что повышение выхода целевого протеина четко соответствует приросту клеточной биомассы на единицу объема среды [6].

Таким образом, при помощи растительного экстракта можно достичь увеличения

ЛИТЕРАТУРА

1. Plackett R. L., Burman J. P. The design of optimum multifactorial experiments // Biomet-rika. — 1946. — V. 33, N 4. — P. 305-322.

2. Deshmukh D. V., Puranik P. R. Application of Plackett-Burman design to evaluate media components affecting antibacterial activity of alkaliphilic Cyanobacteria isolated from Loran lake // Turk. J. Biochem. — 2010. — V. 35, N 2. — P. 114-120.

3. Adinarayana K., Ellaiah P. Response surface optimization of the critical medium components for the production of alkaline protease by a newly isolated Bacillus sp // J. Pharmaceut. Sci. — 2002. — V. 5, N 3. — P. 272-278.

4. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. — М.: Мир, 1967. — 367 с.

5. Catarame T. M. G., O'Hanlon K. A., Duffy G. et al. Optimization of enrichment and plating procedures for the recovery of Escherichia coli 0111 and 026 from minced beef // J. Appl. Microbiol. — 2003. — V. 95. — P. 949-957.

6. Tripathi N. K., Shrivastva A., Biswal K. C., Lakshmana Rao P. V. Optimization of culture medium for production of recombinant dengue protein in Escherichia coli // Industr. Biotechnol. — 2009. — V. 5, N 3. — P. 179-183.

7. Лабинская А. С. Практическое руководство по микробиологическим методам исследования. — М.: Гос. издат. мед. лит., 1963. — 463 с.

8. Hayatsu H., Negishi T., Arimoto S. Dietary inhibitors against mutagenesis and carcino-genesis // Proc. Third Intern. Conf. Mech. Antimutag. Anticarcin. — Plenum Press, New York. — 1993. — P. 387-418.

9. Ikken Y., Morales P., Maetinez A. et al. Antimutagenic effect of fruit and vegetable ethanolic extracts against N-nitrosamines evaluated by the Ames test // J. Agr. Food Chem. — 1999. — V. 47. — P. 3257-3264.

10. Negi P. S., Jayaprakasha G. K., Jena B. S. Antioxidant and antimutagenic activities of pomegranate peel extracts // Food Chem. — 2003. — V. 80. — P. 393-397.

11. Дворник А. С., Перерва Т. П., Кунах В. А. Скриншг препаратав, отриманих iз культу-ри тканин лшарських рослин, на антиму-тагенну актившсть у системi Escherichia

выхода биомассы многих бактериальных штаммов на средах разнообразного состава, хотя очевидно, что оптимальное количество прибавляемого экстракта будет колебаться в зависимости от состава базисной среды и особенностей объекта выращивания.

Исходя из полученных в настоящей работе данных, можно предположить также, что не только экстракт U. victoris, но и другие растительные экстракты способны оказывать стимулирующее влияние на рост многих бактериальных культур и могут успешно использоваться в промышленной микробиологии.

coli — бактерюфаг X // Цитология и генетика. — 2002. — Т. 36, № 2. — С. 3-10.

12. Мирюта Г. Ю., Дворник А. С., Можилевська Л. П., Перерва Т. П. Вивчення бюлопчно! активноста рослинних екстрактав у систем! трансформаций Escherichia coli плазмщною ДНК // Biopolymers and Cell. — 2003. — V. 19, N 6. — С. 525-529.

13. Дворник А. С., Перерва Т. П., Можилевська Л. П., Кунах В. А. Вивчення активноста рослинних екстрактав у системi нестабшь-них мутантав Escherichia coli // Цитология и генетика. — 2004. — Т. 38, № 4. — С. 9-13.

14. Мирюта А. Ю., Перерва Т. П., Можилевська Л. П., Кунах В. А. Влияние экстракта культивируемых клеток Ungernia victoris и катионов некоторых металлов на эффективность трансформации клеток Escherichia coli плазмидной ДНК // Там же. — 2005. — Т. 39, № 6. — С. 34-40.

15. Перерва Т. П., Мирюта А. Ю., Можилевс-каяЛ. П. Бактериальная тест-система для первичного скрининга препаратов на антиканцерогенную и антимутагенную активность // Вкник Укр. т-ва генетишв i селек-цiонерiв. — 2007. — Т. 5, № 1-2. — С. 55-61.

16. Перерва Т. П., Дворник А. С., Мирюта А. Ю. и др. Бактериальная тест-система для первичного скрининга веществ с потенциальной противоопухолевой активностью // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 4. — С. 59-65.

17. Мирюта А. Ю., Перерва Т. П. Биологическая активность экстракта Ungernia victoris в системе CaCl2 — трансформации Escherichia coli в присутствии модуляторов кальциевых каналов // Там же. — 2008. — Т. 42, № 4. — С. 45-48.

18. Перерва Т. П., Мирюта А. Ю., Мойса Л. Н. и др. Взаимодействие растительных экстрактов Ungernia victoris, Rhodiola rosea и Polyscias filicifolia с бактериальной клеткой // Там же. — 2010. — Т. 44, № 4. — С. 34-40.

19. Nicaido H, Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability // Microbiol. Rev. — 1985. — P. 1-32.

20. Benz R., Bauer K. Permeation of hydrophilic molecules through the outer membrane of gram-ne-

gative bacteria. Review on bacterial porins //Eur. J. Biochemistry. — 1988. — V. 176. — P. 1-19.

21. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. — М.: Мир, 1976. — 436 с.

22. Плохинский Н. А. Биометрия. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1970. — 367 с.

ОПТИМ1ЗАЦ1Я БАКТЕР1АЛЬНИХ ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ ЕКСТРАКТОМ Ungernia victoris

Т. П. Перерва, Г. Ю. Мирюта, А. С. Дворник, Л. П. Можилевська, В. А. Кунах

1нститут молекулярноï бюлогп та генетики НАН Украши, Кшв

E-mail: [email protected]

Оптимiзацiя складу живильних середовищ вважаеться одним i3 3aco6iB тдвищення виходу бюмаси бaктерiaльних клiтин, а також щльового продукту при культивувaннi штaмiв продуцен-тiв усiх видiв i призначень. У зв'язку з розвитком бiотехнологiчноï промисловостi дедaлi бiльшого значення набувае пошук нових компонентiв живильних середовищ, ïх оптимального стввщно-шення з базисним складом середовища i вщпо-вiдностi властивостям культивованого об'екту.

Додавання екстракту Ungernia victoris до бaктерiaльного живильного середовища оп-тимiзуе його склад i дае змогу шдвищити вихiд бiомaси E. coli. На LB-середовишД статис-тично достовiрне перевищення виходу бiомaси штaмiв М17 та НВ101 спостерiгaеться ильки для вищих концентрацш екстракту (5-10%), тодi як вихiд бiомaси штаму JM109 пщви-щуеться на вмх випробуваних концентрaцiях (0,5-10%). Найвищий вихщ бiомaси всiх трьох штaмiв вщповщае концентрaцiï екстракту 10%. Вплив екстракту U. victoris на рют бак-терiaльних штaмiв на збагаченому середовищ! вiдрiзняеться вщ його впливу на щ сaмi штами на LB-середовищь Прир^т бiомaси вщбуваеть-ся за низьких концентращй екстракту (0,25-1%) i не такий значний, як на LB-сере-довищь Починаючи з концентрацп екстракту вщ 2% i до 10% спостерпаеться тенденцiя зни-ження виходу бюмаси для штaмiв М17 та НВ101 i нижчого приросту бюмаси JM109 пор!вняно з концентращями 0,25-1%. Таким чином, за допомогою рослинного екстракту мож-на досягти тдвищення виходу бюмаси бaктерiй як на бвдному, так i на збагаченому середовища Оптимальна шльшсть доданого екстракту коли-ваеться залежно вщ складу середовища та особ-ливостей об'екта вирощування.

Ключовi слова: Escherichia coli, рослинш екстракти, живильш середовища.

23. Хамидходжаев С. А. Лекарственные растения рода унгернии в Средней Азии // «ФАН» Узб. ССР. — 1982. — 148 с.

24. Lee S. Y. High cell-density culture of Escherichia coli // Trends Biotechnol. — 1996. — V. 14, N 1. — Р. 98-105.

OPTIMIZATION OF BACTERIAL

NUTRIENT MEDIA BY Ungernia victoris EXTRACT

T. P. Pererva, A. Yu. Miryuta, A. S. Dvornik, L. P. Mozhylevskaya, V. A Kunakh

Institute of Molecular Biology and Genetics of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

E-mail: [email protected]

Optimization of culture media is considered to be one of the ways to increase biomass output of bacterial cells as well as a base product at cultivation of all types and purposes.

In connection with the development of the biotechnology industrya, search of the new components of nutrient solution and their optimum ratio with the base composition of the medium and corresponding properties of the cultivated object is becoming increasingly important.

Addition of Ungernia victoris extract to bacterial nutrient medium optimizes its composition and enables to increase production of E. coli biomass. Statistical reliable exceeding of biomass production of M17 and HB101 strains in LB medium occurs only at higher concentrations of extract (5-10%) while biomass production of JM109 strain increases at all tested concentrations (0,5-10%). The highest biomass yield of all three strains corresponds to extract concentration of 10%. The influence of U. victoris extract on growth of bacterial strains in enriched medium differs from its influence on the same strains in LB medium. Biomass increase happens at low concentrations of extract (0.25-1%)and it is not such significant as its increase in LB medium. Starting with extract concentration from 2% and to 10%, the tendency towards biomass decrease for M17 and HB101 strains and lower biomass increase for JM109 strain as compared with 0.25-1% concentrations takes place. Thus, it is possible to get improvement of bacterial biomass production by means of plant extract using both poor and enriched medium. Optimal quantity of the added extract fluctuates depending on medium composition and peculiarities of object of growth.

Key words: Escherichia coli, plant extracts, nutrient media.

УДК 57.083.3:616.578.7:616.579.61

СУПЕРСИНТЕЗ РОЗЧИННОГО ПРОТЕШУ — ПРОДУКТУ ЕКСПРЕСП ГЕНА, ЩО М1СТИТЬ 1МУНОДОМ1НАНТН1 Д1ЛЯНКИ ГЛ1КОПРОТЕ1НУ G В1РУСУ ГЕРПЕСУ 2-ГО ТИПУ, У БАКТЕР1ЙН1Й СИСТЕМ1 Escherichia coli

Л. М. Коршун1

Л. М. Мойса1 1АТЗТ НВК «Дгапроф-Мед», Кшв Г. В. Ковтонюк1

Л. О. Ганова1 2 21нститут мiкробiологГí i вiрусологГí iм. Д. К. Заболотного

О. К. Кисельова1 НАН Украши, Кт'в М. Я. Ствак2

E-mail: [email protected]

На сьогоднг в усьому свгтг значно зросла розповсюдженгсть гнфекцгй, спричинених вгрусами простого герпесу типгв 1 та 2. Захворювання, спричиненг вгрусом герпесу 2-го типу, проходять у бгльш тяжкгй формг, з частгшими рецидивами та ускладненнями поргвняно з тими, якг зумовленг збудником 1-го типу. Тому при проведеннг клгнгко-лабораторних дослгджень важливого значення набувае диференцгйна дгагностика мгж цими двома типами вгрусу.

Мета роботи полягала в оптимгзаци умов бактерiальноí експресií рекомбгнантного протеíну, що мгстить гмунодомгнантнг дглянки глiкопротеíну G вгрусу простого герпесу 2 типу, в клгтинах Escherichia coli та отримання високоочищенного препарату, придатного для використання у складг гмуносорбенту при розробленнг дгагностичних тест-систем.

Встановлено, що рекомбгнантний полгпептид накопичуеться у клгтинах бактергй як у розчиннгй формг, так г у виглядг тглець включень. Показано вплив складу живильного середовища, температури експреси та концентрацií 1ПТГ на ргвень накопичення гетерологгчного протеíну та його гмунохгмгчнг властивостг. Зменшення концентрацií 1ПТГ до 0,1 мМ за температури культивування продуцента при 37 °С гз використанням середовища ТВ (1,2% бактотриптону, 2,4% дргжджового екстракту, 55 мМ глгце-ролу, 17 мМ KH2PO4, 72 мМ K2HPO4, рН 7,2) дае змогу досягти найвищого показника бгосинтезу розчин-ного протешу.

Цгльовий продукт очищали з використанням технологгй афiнноí хроматографií. Питомий вихгд очи-щеного протеíну гз клгтинного супернатанта за оптимгзованих умов становив 78,74% вгд загальноí кгль-костг рекомбгнантного протеíну в клгтинг.

1мунохгмгчнг властивостг протеíну GST-HSV2gG оцгнювали за допомогою iмуноензимноí тест-систе-ми. Результати дослгджень свгдчать про перспективнгсть його використання при розробленнг тест-систем для дгагностики вгрусу герпесу 2-го типу.

КлючовЬ слова: рекомбгнантнг протеши, експресуючг вектори, вгрус простого герпесу людини 2-го типу, гмуноензимний аналгз, Escherichia coli.

На сьогоднг в усьому свгтг значно зросла розповсюдженгсть гнфекцгй, спричинених вгрусами простого герпесу типгв 1 та 2 (ВПГ-1 та ВПГ-2, вгдповгдно). Зггдно зг звгтами ВООЗ, у до рослого населення ВПГ-1 вияв-ляеться в 98-99%, а ВПГ-2 — у 20-25% [1]. Як свгдчать епгдемгологгчнг дослгдження, проведенг за останнг 30 рокгв, поширенгсть герпетично'1 гнфекцг'1 залежить вгд вгку, соцгально-економгчного статусу дослгджува-них осгб, географгчного розташування краши тощо [2].

Бiльшiсть людей шфшоваш одним або двома типами ВПГ, який збершаеться в ор-ганiзмi впродовж усього життя. Слiд заува-жити, що захворювання, спричиненi вiру-сом герпесу 2-го типу, мають бiльш тяжкий перебiг, з часташими рецидивами та ускладненнями порiвняно з тими, якi зумовлен1 збудником 1-го типу [2-4]. Особливу загрозу шфекщя становить для ваптних жшок, оскiльки в результатi трансплацентарно'! пе-редачi ВПГ-2 смертнiсть у новонароджених у разi розвитку герпетичних енцефалтв та

меншгтв становить близько 70% [5]. Тому пщ час проведення клшшо-лабораторних дослщжень важливого значення набувае ди-ференцiйна дiагностика мiж цими двома типами вiрусу.

Встановлено, що геноми ВПГ-1 та ВПГ-2 мають 83% гомологи ДНК, що призводить до щентичност 85% амшокислотно! посль довностi деяких проте1шв. Так, ВПГ-1 та ВПГ-2 мютять у складi оболонки 11 глшопро-те1шв [6, 7], що дають перехресну реак-тивнiсть, яка ускладнюе серолопчну дiагнос-тику захворювань. Вiдкриття глшопротешу G (gG) у серединi 1980-х рошв дозволило вирiшити цю проблему завдяки типоспе-цифiчним розбiжностям у структурi цього протеiну для ВПГ-1 та ВПГ-2 [6-8].

Сучасна дiагностика ВПГ ^рунтуеться на прямому вид^енш вiрусу з клiнiчного ма-терiалу, а також на серологiчних методах. 1дентифшащю вiрусу проводять з викорис-танням культур клiтин або лабораторних тварин. Однак останш методи е досить тру-домiсткими, високовартiсними та тривали-ми i не завжди можуть бути типоспе-цифiчними щодо ВПГ-1 та ВПГ-2. Серед рутинних лабораторних дослщжень найпо-ширенiшим е метод твердофазного iмуноен-зимного анатзу (1ЕА), що дае змогу виявляти вiрусоспецифiчнi антигени або вiрусоспе-цифiчнi антитiла класiв M та G залежно вщ виду бiологiчного матерiалу [9].

У процесi розроблення комерцшних 1ЕА-дiагностичних тест-систем як антигени зас-тосовують отриманi з лiзатiв заражених культур нативнi протеши ВПГ або 'хш ре-комбiнантнi аналоги [10-12]. Використання лiзатних протеiнiв забезпечуе високу чутли-вiсть методу, проте не е високоспецифiчним i, крiм того, пов'язане з багатьма бюлопчни-ми ризиками. У сучасному бютехнолопчному виробництвi для одержання рекомбшант-них проте'1шв застосовують рiзнi бiологiчнi системи: мшрооргашзми, клiтиннi лiнii комах, рослин та ссавщв, багатоклiтиннi орга-нiзми тощо. Одне з провщних мiсць серед зазначених об'ектiв належить бактерiям Escherichia coli. Це зумовлено тим, що гене-тичнi, молекулярно-бюлопчш, бiохiмiчнi та фiзiологiчнi властивостi цього мшроор-ганiзму досить детально вивчено, а в разi використання таких штамiв-продуцентiв рiвень бiосинтезу щльового протешу може становити десятки вщсотшв вщ сумарних клiтинних протеiнiв.

Мета роботи полягала в оптимiзацii умов бактерiальноi експресii рекомбiнантного протеiну, що мютить iмунодомiнантнi

д1лянки глшопротешу G в1русу простого герпесу 2-го типу, у кл1тинах бактер1й Escherichia coli та отримання високоочи-щенного препарату, придатного для використання у склад1 1муносорбенту при роз-робленш д1агностичних 1ЕА тест-систем.

Матерiали i методи

Бактерiальнi культури та експресуючi вектори. Штам-продуцент E. coli BL21(DE3)/ pET28-GST-HSV2gG було створено на основ1 вектора pET28a (Novagen) клонуванням послщовноста глутатюн-8-трансферази (GST) та фрагмент1в 1мунодомшантних д1лянок глшопротешу G ВПГ-2 з використанням експресуючо! системи рецип1ента Escherichia coli BL21(DE3) [E. coli B F- dcm ompT hsdS (rBmB) gal X (DE3)]. В одержанш ген-но-шженернш конструкци транскрипщя клонованого гена контролюеться промотором гена 10 фага Т7, а бюсинтез ц1льового продукту 1ндукуеться за домопогою 1зопро-пiл-ß-D-тiогaлaктопiрaнозиду (1ПТГ).

Готували компетентн1 кл1тини та здшс-нювали !х трансформац1ю рекомб1нантною плазм1дою згщно з1 стандартними протоколами [13]. Отриману сум1ш бактер1й вийва-ли на агаризоване середовище LB (1% бак-тотриптону, 0,5% др1жджового екстракту, 1% NaCl, 1,5% агару «Дифко»), що м1стило селективний антиб1отик канамщин в кшце-в1й концентрацп 25 мкг/мл. Для вщбору найб1льш продуктивного клону зразки бюмас анал1зували за допомогою електрофо-резу в денатуруючих умовах з використан-ням 12% ПААГ у присутност 1% SDS з на-ступним забарвленням гелю розчином Кумасй R-250 за методом Леммл1 [14].

Культивування штаму-продуцента. Бактер1альну культуру, вирощену з найпро-дуктившшого клону впродовж 16-18 год за температури 30 °С з використанням середовища LB у присутност селективного ан-тиб1отика, перервали на св1же живильне середовище в розведенш 1:30. Подальшу 1нкубац1ю клггин проводили при темпера-тур1 25 °С i 37 °С в умовах штенсивного пере-м1шування (220 об/хв) та аерацп. Для одержання бюмаси продуцента застосовували так1 живильн1 середовища: LB (1% бакто-триптону, 0,5% др1жджового екстракту, 1% NaCl, pH 7,2), TB (1,2% бактотриптону, 2,4% др1жджового екстракту, 55 мМ глще-ролу, 17 мМ KH2PO4, 72 мМ K2HPO4, рН 7,2) та середовище № 3 оригшального складу (сольова основа М9 з додаванням 1% г1дрол1зату казешу, 0,5% др1жджового

екстракту та 1% глюкози, рН 7,4). Ди-намшу росту бактерiальноï культури конт-ролювали, вимiрюючи оптичну густину (ОГ) на спектрофотометрi (Ultrospec 2000) за дов-жини хвилi 600 нм, i на фазi експоненцшного росту клiтин у живильне середовище додавали 1ПТГ для шдукцп бiосинтезу цiльового протешу. Пiсля завершення культивування бактерiальну суспензiю збирали центрифу-гуванням при 8 000 g протягом 10 хв.

Отримання очищеного препарату ре-комбшантного протешу. Для вид!лення ре-комбшантного протешу осад бактерiальних клiтин ресуспендували в лiзуючому буферi, що мiстив 0,1 мг/мл лiзоциму, 0,1% Тритону Х-100, 1 мМ PMSF, 0,2 М NaCl, рН 8,0. Клiтинну суспензт тричi заморожували-вiдтаювали, додавали ДНК-азу (Sigma, США) в кшцевш концентрацп 6 од/мл у присутностi 20 мМ MgSO4. Пiсля iнкубацi'ï протягом 1 год бактерiальну суспензiю об-робляли ультразвуком на дезiнтеграторi УЗДН-А (6 разiв по 10 с). Надосадову рщину та тiльця включень роздiляли центрифугу-ванням при 11 000 g упродовж 25 хв за 10 °С. Т^ьця включень, попередньо вщмита в буферних розчинах, що мютили детерген-ти (0,5% Тритону Х-100, 0,1% Твiн-20), роз-чиняли в буферi, що мютив 8 М сечовини, 20 мМ натрш-фосфату та 0,2 М NaCl, рН8,0.

Хроматографiчне очищення рекомбь нантного протешу здшснювали за допомо-гою хроматографiчноï системи Bio-Rad (США) iз застосуванням методiв iммобiлiзо-вано! металоафшно! хроматографы (1МАХ) з використанням сорбенту IDA-toyoperl (TOSOH, Японiя), попередньо активованим юнами нiкелю згiдно з шструкщею фiрми-виробника. Елюцiю протешу проводили способом ступшчасто! хроматографа з рiзними концентрацiями iмiдазолу (40-200 мМ). У разi накопичення протешу в кл^инах E. coli в розчинному виглядi його подальше доочищення здшснювали методом афшно'1 хроматографа з використанням сорбенту глутатаон-сефарози (Amersham, США), а елющю — за допомогою розчину 10 мМ вщновленого глутатiону i 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0. Концентращю протешу вимiрювали бiуретовим методом, а якють очищення оцiнювали за допомогою електрофорезу в 12%-му ПААГ-SDS.

Оцшювання iMy^xiMi4Hux властивос-тей протетових фракцш. Для тестування застосовували внутршньовиробничу панель сироваток кровi (ВВП, <^апроф-Мед»), зразки яко! мiстять (16 сироваток) i не мютять (14 сироваток) антитала клайв G до

ВПГ-2. Уй зразки панелi було попередньо дослщжено та пiдтверджено в iмуноензим-них тест-системах Herpes Simplex Virus HSVType 2 IgG-ELISA (Ltd. Nova Tec, Шмеччина) та HSV 2-IgG (Ltd.Immulite, США).

Якiснi характеристики рекомбшантного протешу оцiнювали за допомогою тест-сис-теми у форматi непрямого 1ЕА. Для приготу-вання iмуносорбенту використовували полiстироловi 96-лунковi планшети (Nunc, Дашя), в лунки яких сорбували дослщжува-ний зразок в 50 мМ карбонат-бшарбонатному буферi (рН 9,6). Специфiчнi iмуннi комплек-си антиген-антитало виявляли з використанням мишачих моноклональних антитiл, мiчених пероксидазою, що розтзнають IgG людини.

Як проявник iмуноензимноï реакцп ви-користовували хромоген тетраметилбензи-дин (ТМБ), розведений у цитратному буферi з додаванням пероксиду водню. Реакщю зу-пиняли додаванням 0,5 М йрчано! кислоти. ОГ визначали на спектрофотометрi Labsystems Multiskan (Фiнляндiя) у двохвильовому ре-жимi 492/620 нм.

Результати 1ЕА розраховували за формулою (1):

А=(ср.ОГ+ )/(cut off),

де в числiвнику показник (ср.ОГ+) — се-редне значення позитивних сироваток, а в знаменнику величина cut off = (ср.ОГ )+0,2, де (ср.ОГ) — середне значення негативних сироваток. Кожну дослщжувану сироватку тестували в чотирьох повторах.

Статистичне оцшювання одержаних ре-зультатав виконували стандартними методами з використанням t-критерт Стьюдента за допомогою програмного забезпечення Microsoft Excel.

Результати та обговорення

На основi використання вектора рЕТ28а рашше нами було створено рекомбшантну плазмщу pET28-GST-HSV2gG, продуктом експресп яко! в клiтинах штаму-реципiента E. coli BL21 (DE3 ) е пбридний полшептид, що мiстить афшний тег у виглядi шести пстидинових залишкiв His6-tag та амшо-кислотну послщовшсть глутатюн^-транс-ферази, злиту з iмунодомiнантними д^ян-ками глiкопротеïну G ВПГ-2 (GST-HSV2gG).

На початковому етат дослiджень проводили скринiнг трансформованих бактерiаль-них клiтин для вщбору найбiльш продуктивного клону. Даш електрофореграми (рис. 1) наочно свщчать, що лише у 25% трансфор-

мантгв спостерггали суперсинтез цгльового продукту. Вгдгбранг клони було перевгрено на плазмгдну стабгльнгсть та величину ргвня експресií в ходг декглькох пересгвгв культу-ри продуцента.

кДа э 116,0

» 66,2

45,0 35,0

25,0 18,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 1. Електрофореграма зразшв бшмас клошв-трансформантав E. coli BL21(DE3)/pET28-GST-HSV2gG, отриманих п1сля шдукцп 1 мМ 1ПТГ протягом 3,5 год: зразок № 10 — л1зат вих1дних клггин штаму-ре-цип1ента E. coli BL21(DE3); зразок № 14 — про-теши-маркери молекулярно'1 маси (Fermentas)

Вгдомо, що клгтини бактергй Escherichia coli широко застосовують для одержання ре-комбгнантних протешгв як для наукових до-слгджень, так г з комерцгйною метою. Проте, незважаючи на велику кглькгсть отриманих знань щодо механгзмгв бгосинтезу та нагрома-дження гетерологгчних протеíнiв, а також вгдомостей про те, що утворення вторинних метаболгтгв залежить вгд складу середовища, яке використовують для росту культур мгкро-органгзмгв [15], на думку деяких авторгв, ще недостатньо уваги придгляеться дослгджен-ням впливу складу живильних середовищ на процес накопичення рекомбгнантних проте1-нгв [16]. У сво1х роботах вони переконливо довели, що склад середовища може суттево впливати як на вихгд бгомаси г ргвень накопичення рекомбгнантних протешгв, так г на íхнi якгснг характеристики. Тому монгторинг складу середовищ слгд розглядати як рутинну час-тину оптимгзацг! бготехнологгчних процесгв.

Результати наших дослгджень повнгстю пгдтверджують такий пгдхгд. Встановлено, що склад живильного середовища вливае не лише на загальний вихгд бгомаси, але й на власти-востг цгльового продукту. Так, зггдно з наведе-ними в табл. 1 даними, вихгд бгомаси при куль-тивуваннг продуцента на середовищг LB за температури 37 °С становив 2,1 г, на середовищг ТВ — 4,0 г, а в разг його вирощування на середовищг № 3 цей показник доргвнював 5,1 г бгомаси в розрахунку на 1 л живильного середовища.

Електрофоретичний аналгз протешових фракцгй, отриманих у процесг видглення та очищення, показав, що гетерологгчний про-теш GST-HSV2gG накопичуеться в клгтинах бактергй E. coli BL21(DE3) як у виглядг тглець включень, так г в розчиннгй формг (рис. 2). При цьому найвищий ргвень накопичення його в розчинному виглядг спостерггали на середовищг ТВ — 12,5 мг на 1г бгомаси або 50 мг у розрахунку на одиницю об'ему (1л) культу-рального середовища (табл. 1). Молекулярна маса цгльового протешу збггалася з теоретично розрахованою г становила 35,4 кДа.

Рис. 2. SDS-ПААГ-аналiз сшввщношення протешових фракцш рекомбшантного протешу GST-HSV2gG у клiтинах штаму-продуцента за умов його культивування з використанням середовища ТВ при температурi 37 °С: 1 — лгзат клгтин штаму-реципгента E. coli BL21(DE3); 2 — сумарнг протеши гндукованих клгтин; 3 — супернатант пгсля лгзису бгомаси; 4 — зразок вгдмивки тглець включень; 5 — фракцгя тглець включень, розчинених у буферг з 8М сечовиною; 6 — протеши-маркери молекуляржй маси (Fermentas)

Таблиця 1. Загальний вихщ бiомаси та очищеного препарату протешу GST-HSV2gG залежно вiд типу живильного середовища, використаного для культивування штаму-продуцента E. coli

BL21(DE3)/pET28-GST-HSV2gG

Тип живильного середовища Загальний вихщ бшмаси, г/л Вихщ очищеного протешу шсля лiзису бшмаси, мг/г Вихщ очищеного протешу, мг/л

гз супернатанта гз фракцп тглець включень гз супернатанта гз фракцп тглець включень

LB 2,1 9,6 4,4 19,2 8,8

ТВ 4,0 12,5 4,3 50,0 17,2

Середовище №3 5,1 8,4 5,3 42,8 27,0

Отримаш нами результати дослщжень, як1 показали, що процес мшробного синтезу рекомбшантного протешу в1дбуваеться як у розчиннш форм1, так i у вигляд1 нерозчин-них т1лець включень, зумовили необхщ-н1сть оц1нити його бюлопчш властивост1 за критер1ем 1ЕА-специф1чно! активность На рис. 3 наведено даш пор1вняльного оцшю-вання 1мунох1м1чно! активност очищених препарат1в проте'ш1в 1з цих фракцш у раз1 використання !х у склад1 1муносорбенту 1му-ноензимно! тест-системи. Для шлькюно! оц1нки величини активност рекомбшантно-го протешу застосовували показник А, який розраховували за формулою (1). На д1аграм1 добре видно, що вщповщш показники ак-тивност мали достов1рно вищ1 значення для протешу, вид1леного з кл1тинного суперна-танта п1сля л1зису бюмаси, пор1вняно ie фракц1ею т1лець включень (Р < 0,05). Ця залежнють спостершалася для вс1х тип1в живильних середовищ, використаних для культивування продуцента.

< 8

À 7 H 7

Ü

и 6 я

g 5

и

cd 4 cd

H 3

о и t*

LB TB Середовище №3

Середовище культивування

и GST-HSV2gG розчинна форма протешу

i GST-HSV2gG фракция т1лець включень

Рис. 3. Пор1вняльна оц1нка 1мунох1м1чно'1 активност1 очищених препаратов рекомбшант-

ного протешу GST-HSV2gG, отриманих i3 розчинно'1 та нерозчинно'1 фракц1й клгтинно'1 б1омаси штаму-продуцента залежно вщ типу культурального середовища

Таку р1зку зм1ну як1сних властивостей протешу у форм1 т1лець включень можна по-яснити тим, що агрегащя молекул у кл1ти-нах бактерш впливае на його структурно-функцюнальш характеристики, призводячи до зниження активноста, а наступне застосу-вання денатуруючих ф1зико-х1м1чних аген-т1в у процей рефолдингу посилюе цей нега-тивний вплив [17].

Як вщомо з л1тератури, суперсинтез роз-чинних проте'ш1в значною м1рою залежить в1д особливостей генно-шженерно! конструкцп продуцент1в та умов !х культивування [18, 19].

Так, наприклад, 1ПТГ може впливати на запуск мехашзму транскрипцп клонованого гена та р1вень експресп ц1льового протешу, а та-кож на метабол1зм кл1тини-хазяша [20], гальмуючи р1ст бактер1й [21, 22]. Вщомо, що величина накопичення продукту мшробного синтезу не завжди пропорцшна часу його експресп [22]. Температура вирощування продуцента теж е важливим чинником, що впли-вае на вихщ експресованого кл1тиною чужого для не! протешу [23]. Як правило, у б1льшост1 випадшв зниження температури шсля шдукцп б1осинтезу призводить до п1двищення р1вня накопичення розчинного протешу [19]. Слщ зауважити, що наявн1сть посл1довност1 глутатюн-8-трансферази як аф1нного партнера у склад1 рекомбшантно! молекули е одним 1з фактор1в, що можуть посилювати роз-чинн1сть злитих 1з GST полшептид1в [24, 25]. Тому наступш етапи нашо! роботи передбача-ли проведення оптим1зацп умов бактер1ально'1 експресп з метою отримання максимального виходу розчинно! фракцп рекомб1нантного пол1пептиду GST-HSV2gG з урахуванням ви-щенаведених технолопчних п1дход1в.

Як уже зазначалося, найвищий р1вень б1осинтезу розчинно! форми протешу пщ час культивування продуцента E. coli BL21(DE3)/ pET28-GST-HSV2gG спостерпали на середо-вищ1 ТВ, тому його використовували в по-дальших дослщженнях. Насамперед вивча-ли динам1ку накопичення рекомбшантного продукту в кл1тинах бактерш залежно вщ температури експресп (25 °С i 37 °С) та в присутност р1зних концентрац1й 1ПТГ (0,1 мМ i 1мМ). Як свщчать результати, на-веден1 на рис. 4, максимальний вихщ щльового протешу спостерпали через 3,5 год шсля шдукцп 1ПТГ незалежно вщ температурного режиму культивування продуцента.

Варто зазначити, що сшввщношення фракцш протешу в розчиннш та нерозчиннш форм1 в процей бюсинтезу залежить як в1д температури експресп протешу, так i вщ концентрацп 1ПТГ. На рис. 5 добре видно, що за умов культивування продуцента при темпе-ратур1 25 °С спостер1гаеться стшка тенденц1я до зб1льшення р1вня накопичення протешу в розчинному вигляд1 з використанням ви-що! концентрацп! шдуктора 1мМ 1ПТГ пор1вняно з концентращею 0,1 мМ. З 1ншого боку, як випливае з табл. 2, за умов проведен-ня бактер1ально! експресп при температур1 37 °С найвищого виходу очищеного протешу 1з супернатанта п1сля л1зису бюмаси (26,3 мг/г) було досягнено з використанням 0,1 мМ 1ПТГ, який перевищував у 2,7 раза вихщ протешу (9,8 мг/г) при концентрацп 1 мМ 1ПТГ.

2

1

0

кДа 116,0 66,2

Рис. 4. Динамжа мжробного синтезу ре-комбшантного протешу GST-HSV2gG залежно вщ температури культивування продуцента з використанням середовища ТВ при 25 °С

(треки 1-6) та 37 °С (треки 8-13) у присутностi рiзних концентрацiй 1ПТГ: 0,1 мМ 1ПТГ — треки 1, 2, 3 та 8, 9, 10; 1 мМ 1ПТГ — треки 4, 5, 6 та 11,12,13 впродовж 1 год (треки 1, 4, 8, 11), 2 год (треки 2, 5, 9, 12) та 3,5 год шсля шдукцп 1ПТГ (треки 3, 6, 10, 13); 7 — хроматографiчно очищений проте!н GST-HSV2gG; 14 — проте!ни-маркери молекулярно! маси (Fermentas)

Як уже зазначалося, рекомбшантна плаз-мща pET28-GST-HSV2gG м1стить у своему склад1 1мунодом1нантн1 д1лянки глшопро-те!ну G ВПГ-2 та посл1довност1 двох афшних партнер1в — His6-tag i GST в N-кшцевш дь лянщ молекули. Шестигiстидиновий тег часто застосовують у процесi одержання ре-комбшантних протеiнiв, оскiльки вiн мае дешлька очевидних переваг: невеликий розмiр, що не впливае на властивост пбрид-ного протешу, а також досить сильну вза-емодiю з деякими юнами перехiдних ме-талiв (Ni2+, Zn2+, Cu2+, Co2+), що дае змогу здшснювати очищення за допомогою методу iммобiлiзованоi металоафiнноi хромато-графи [26, 27]. Послiдовнiсть глутатюн-S-трансферази, окрiм функци пiдвищення рiвня синтезу щльового протешу в розчин-нш формi, також виконуе роль афшного тегу. Це дае змогу проводити процес доочищення протешу на глутатiонсефарозi завдяки утво-ренню комплексу мiж глутатiоном сорбенту

18,4 14,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Рис. 5. Вплив pÍ3HHX температурных режимiв на piBeHb експресп розчинно'1 фракцй' (треки 2, 4, 6, 8) та нерозчинних тшець включень (треки 1, 3, 5, 7) рекомбшантного протешу GST-HSV2gG у клiтинах штаму-продуцента E. coli BL21(DE3)/pET28-GST-HSV2gG: за умов його культивування з використанням середовища ТВ при 25 °С (треки 1-4) та 37 °С (треки 5-8), шдукованих 0,1 мМ 1ПТГ (треки 1,2, 5, 6) та 1 мМ 1ПТГ (треки 3, 4, 7, 8) упродовж 3,5 год шсля шдукцп; 9 — хроматогра^чно очищений протеш GST-HSV2gG; 10 — проте1ни-марке-ри молекулярно! маси (Fermentas)

та GST-послiдовнiстю протешу. Елюц1ю ц1льового протешу Í3 сорбенту в даному разi здiйснюють за допомогою розчину вщновле-ного глутатiону.

У нашiй робота на першому етапi очищення протешу GST-HSV2gG застосовували метод 1МАХ з використанням сорбенту IDA-toyopearl, активованого iонами нiкелю. Хро-матограму очищення щльового протешу з розчинно! фракци лiзату бiомаси подано на рис. 6, А. Очищену на IDA-toyopearl про-тешову фракцiю (рис. 6, Б, трек 3) далi наносили на колонку з глутатюнсефарозою. Пи-томий вихiд очищеного препарату протешу з клiтинного супернатанта за оптимiзованих умов становив 78,74% загально! кiлькостi рекомбiнантного протешу в клггиш. Слiд зазначити, що такий двоступеневий шдхщ до розроблення технологи очищення з використанням сорбентав IDA-toyopeаrl та глу-татiонсефарози дав можливють значно пiдвищити специфiчнiсть 1ЕА, не призводячи

Таблиця 2. Вихщ очищеного peKOM6ÍHaHTHoro протешу GST-HSV2gG, експресованого в клггинах штаму-продуцента E. coli BL21(DE3)/pET28-GST-HSV2gG залежно вщ температури культивування га концентрацп 1ПТГ у живильному середовиш^ ТВ

Температурний режим культивування штаму-продуцента Вихщ очищеного протешу, мг/г бiомаси

0,1 мМ 1ПТГ 1 мМ 1ПТГ

Í3 супернатанта шсля лiзису бiомаси Í3 фракцй тiлець включень Í3 супернатанту шсля лiзису бiомаси Í3 фракцй тiлець включень

25 °С 5,4 8,1 11,9 7,3

37 °С 26,3 7,1 9,8 3,4

до зменшення його чутливостг (данг не наведено). При цьому, як свгдчать данг табл. 3, якгснг характеристики протешу GST-HSV2gG були згставними з показником активностг (по-казник А) комерцгйного аналога HSV2-gG2c виробництва LTD.Viral Therapeutics (США), використаного як референс-зразок (Р > 0,05).

Таблиця 3. Порiвняльна ощнка якiсних характеристик очищеного з клгганного супернатанта протешового препарату GST-HSV2gG та комерцшного аналога HSV2-gG2c

(виробництво LTD.Viral Therapeutics, USA) у разi використання ix у складi iмуносорбенту дiагностичноi тест-системи

Рeкoмбiнaнтний пpoтeïн Iмyнoхiмiчнa a^^mcro, A Р

GST-HSV2gG б,бб ±0,47 Р > 0,05

HSV2-gG2c б,88 ±0,51

A

28G Iß

1,4

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Ыщазол, мМ mAU Iмiдазол

400

Об'eм колонки А

1 2 S Б

Рис. 6. IMAХ-пpoфiль oчищeння нa copбeнтi IDA-toyopearl зpaзкiв peкoмбiнaнтнoгo пpoтeïнy GST-HSV2gG, oтpимaних i3 poзчиннoï фpaкцiï лiзaтy бioмacи (А):

1 — протеши, що не зв'язались iз сорбентом;

2 — неспецифiчно зв'язанi iз сорбентом кл^инш протеïни; 3 — цiльовий протеш;

SDS-ПAAГ-aнaлiз зpaзкiв хpoмaтoгpaфiчних фpaкцiй (Б ):

1 — супернатант шсля лiзису бiомаси; 2 — протеши, що не зв'язались iз сорбентом, S — xрома-тографiчно очищений протеïн GST-HSV2gG

Таким чином, результати доойджень свiдчать про те, що одержаний iз розчинно'1 фракцп високоочищенний препарат протешу GST-HSV2gG за сво!ми iмунохiмiчни-ми характеристиками е перспективним для використання у складi iмуносорбенту з метою розроблення в^чизняних iмуноензим-них тест-систем для дiагностики вiрусу герпесу людини 2-го типу.

Встановлено, що рекомбшантний про-теш, який мютить iмунодомiнантнi дiлянки глiкопротеïну G вiруса герпесу 2-го типу, злит з послiдовнiстю глутатюн^-трансфе-рази, накопичуеться в к лбинах бактерiй Escherichia coli як у розчиннш формi, так i у виглядi тiлець включень. Показано вплив складу живильного середовища, температу-ри експресп та концентрацп 1ПТГ на рiвень накопичення пбридного протешу та його iмунохiмiчнi властивостi. Визначено опти-мальнi умови експресп розчинно! фракцп протешу в кл^инах продуцента: середови-ще ТВ, температура експресп — 37 °С, кон-центрацiя 1ПТГ — 0,1 мМ, час культивування тсля шдукцп — 3,5 год.

Рекомбшантний полшептид очищали двоступенево за допомогою технологш iммо-бiлiзованоï металоафiнноï та афшно! хрома-тографп з використанням сорбентав IDA-toy-opeаrl та глутатюн-сефарози, вiдповiдно. Питомий вихiд високоочищеного препарату з кл^инного супернатанта за оптимiзованих умов становив 78,74% вiд загально! шль-костi рекомбiнантного протешу в клггинь

Результати дослiджень iмунохiмiчних властивостей розчинного протешу GST-HSV2gG свщчать про перспективнiсть його використання в складi iмуносорбенту пiд час розроблення iмуноензимних тест-систем для дiагностики вiрусу герпесу 2-го типу.

Л1ТЕРАТУРА

1. Дранник Г. М., СвЬдро О. В. Torch-шфекцп: герпес // Клин. иммун. аллерг. инфектол. — 2006. — № 1. — С. 3-17.

2. Казмирчук В. Е., Мальцев Д. В. Клиника, диагностика и лечение герпесвирусных инфекций человека. — К.: Феникс, 2009. — 248 с.

3. Gorander S., Svennerholm Bo., Liljeqvist J.-A. Secreted portion of Glycoprotein G of Herpes

Simplex Virus Type 2 Is a Novel Antigen for Type-Discriminanting Serology // J. Clin. Microbiol. — 2003. — V. 41, N 8. — P. 3681-3686. 4. Munday P. E., Vuddamalay J., Slomka M. J., Brown D. W. G. Role of type specific herpes simplex virus serology in the diagnosis and management of genital herpes // Sex. Transm. Infect. — 1998. — V. 74. — P. 175-178.

5. Al-Sulaiman A. M., Valley P. J., Klapper P. E. Comparative Performance of a Novel Herpes Simplex Virus Type 2-Specific Enzyme-Linked immunosorbent Assay Using a Targeted Chain Oligopeptide, peptide 55 // Clin. Vac. Immunol. — 2009. — V. 16, N 6. — Р. 931-934.

6. Whitley R. J., Roizman B. Herpes simplex viruses: is a vaccine tenable? //J. Clinic. Invest. — 2002. — V. 110, N 2. — Р. 145-151.

7. Dolan A., Jamieson F. E., Cunningham C. et al. The Genome Sequence of Herpes Simplex Virus Type 2 // J. Virol. — 1998. — V. 72, N 3. — P. 2010-2021.

8. William L. H., Connie L., Ashley R. Use of a Glycoprotein G-Based Type-Specific Assay to Detect Antibodies to Herpes Simplex Virus Type 2 Among Persons Attending Sexually Transmitted Disease // Sex. Transm. Dis. — 2001. — V. 28, N 2. — Р. 99-104.

9. Reddy S. M., Balakrishnan P., Uma S. et al. Performance of Two Commercial Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits Using Recombinant Glycoprotein G2 Antigen for Detection of Herpes Simplex Virus Type 2 Specific Antibodies // Clinic. Diagn. Lab. Immun. — 2005. — V. 12, N 2. — Р. 359-360.

10. Ashley R. L., Wald A. Genital Herpes: Review of the Epidemic and Potential Use of Type-Specific Serology // Clin. Microbiol. Rev. — 1999. — V. 12, N 1. — Р. 1-8.

11. Ikoma M., Liljegvist J.-A.. Groen J., Glazen-burg K. L. The T.H. Use of a Fragment of Glycoprotein G-2 Produced in the baculo-virus Expression System for Detecting Herpes Simplex Virus Type 2-specific Antibodies // J. Clin. Microbiol. — 2002. — V. 40, N 7. — P. 2526-2532.

12. Jamalidoost M., Soleimanjiahi H., Fotouhi F., Meshkat Z. Amplification and Cloning of Herpes Simplex Virus Type 2 Glycoprotein G from an Iranian Isolate // Pakist. J. Biol. Sci. — 2007. — V. 10, N 6. — Р. 955-958.

13. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984. — 479 с.

14. Laemmli U. K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of the bacte-riophage T4 // Nature. — 1970. — V. 227. — P. 680-685.

15. Шдгорсъкий В. С., 1утинсъка Г. О., Пирог Т.П. 1нтенсифгкацгя технологгй мгкробного синтезу — К.: Наук. думка, 2010. — 328 с.

16. Broedel S. E., Papciak S. J., Jones W. R. The selection of optimum media formulations for improved expression of recombinant proteins in

E. coli // Techn. Bull. — 2001. — V. 2. — P. 1-8.

17. Славченко И. Ю., Борейко Е. В., Воробей Н. В. и др. Суперсинтез альфа-2Ь интерферона человека в клетках Escherichia coli в растворимой форме с использованием системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 // Бiополiмери i кл^ина. — 2003. — Т. 19, № 4. — С. 367-373.

18. Sorensen H. P., Mortensen K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli // Microb. Cell Fact. — 2005. — V. 1. — P. 62-76.

19. Zhang D., Wei P., Fan L., Lian J. High-level soluble expression of HIGF-1 fusion protein in recombinant Escherichia coli // Proc. Biochem. — 2010. — V. 45. — P. 1401-1405.

20. Lian J. Z., Ding S. H., Cai J. et al. Improving aquaporin Z expression in Escherichia coli by fusion partners and subsequent condition optimization // Appl. Microbiol. Biotechnol. —

2009. — V. 82. — P. 463-470.

21. Peng L., Xu Z. N., Fang X. M., Cen P. L. Highlevel expression of soluble human Beta-Defensin-2 in E. coli // Proc. Biochem. — 2004. — V. 82. — P. 199-205.

22. Baharum S. N., Rahman RNZRA, Basri M. Chaperone-dependent gene expression of organic solvent-tolerant lipase from Pseudomonas aeruginosa strain S5 // Ibid. —

2010. — V. 45. — P. 346-354.

23. Hartinger D., Heinl S., Schwartz H. E. Enhancement of solubility in Escherichia coli and purification of an aminotransferase from Sphingopyxis sp.MTA 144 for Deamina-tion of hydrolyzed Fumonisin B // Microb. Cell Fact. — 2010. — V. 9. — P. 62-76.

24. Rabhi-Essaffi I., Sadok A., Khalaf N., Fathal-lah D. A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon — as a GST-fusion protein in E. coli // Prot. Eng. Design Select. — 2007. — V. 12. — P. 201-209.

25. Esposito D., Chatterjee D. K. Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags // Cur. Opin. Biotechnol. — 2006. — V. 17. — P. 353-358.

26. Gaberc-Porekar V., Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography // J. Biochem. Biophys. Meth. — 2001. — V. 49. — P. 335-360.

27. Карбовский Л. Л., Савчук А. Н., Волков Г. Л. Подходы к получению рекомбинантних фармацевтических белков на примере фрагмента стрептокиназы // Биофарм. журн. — 2010. — Т. 2, № 2. — С. 9-14.

СУПЕРСИНТЕЗ РАСТВОРИМОГО ПРОТЕИНА — ПРОДУКТА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА, СОДЕРЖАЩЕГО ИММУНОДОМИ-НАНТНЫЕ УЧАСТКИ ГЛИКОПРОТЕИНА G ВИРУСА ГЕРПЕСА 2-ГО ТИПА, В БАКТЕРИАЛЬНОЙ СИСТЕМЕ Escherichia coli

Л. Н. Коршун\ Л. Н. Мойса\ Г. В. Ковтонюк1, Л. А. Ганова1 2, Е. К. Киселева1, Н. Я. Спивак2

1АОЗТ НПК «Диапроф-Мед», Киев 2Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев

E-mail: [email protected] Сегодня во всем мире значительно возросла распространенность инфекций, вызванных вирусами простого герпеса типов 1 и 2. Заболевания, вызываемые вирусом герпеса 2-го типа, протекают в более тяжелой форме, с более частыми рецидивами и осложнениями, чем те, которые обусловлены возбудителем 1-го типа. Поэтому при проведении клинико-лабораторных исследований большое значение имеет дифференциальная диагностика между этими двумя типами вируса. Цель работы заключалась в оптимизации условий бактериальной экспрессии рекомбинантного протеина, содержащего иммунодоминантные области гликопротеина G вируса простого герпеса 2-го типа, в клетках Escherichia coli и получение вы-сокоочищенного препарата, пригодного для использования в составе иммуносорбента при разработке диагностических тест-систем.

Установлено, что рекомбинантный полипептид GST-HSV2gG накапливается в клетках бактерий как в растворимой форме, так и в виде телец включений. Показано влияние состава питательной среды, температуры экспрессии и концентрации ИПТГ на уровень накопления гетерологичного протеина и его иммунохимические свойства. Уменьшение концентрации ИПТГ до 0,1 мМ при температуре культивирования продуцента 37 °С с использованием среды ТВ (1,2% бактотриптона, 2,4% дрожжевого экстракта, 55 мМ глицерола, 17 мМ KH2PO4, 72 мМ K2HPO4, рН 7,2) позволяет получать наиболее высокий показатель биосинтеза растворимого протеина.

Целевой продукт очищали с использованием технологий аффинной хроматографии. Удельный выход очищенного протеина с клеточного супернатанта при оптимизированных условиях составлял 78,74 % от общего количества рекомбинантного протеина в клетке.

Иммунохимические свойства протеина GST-HSV2gG оценивали с помощью иммуноэн-зимной тест-системы. Результаты исследований свидетельствуют о перспективности его использования при разработке тест-систем для диагностики вируса герпеса 2-го типа.

Ключевые слова: рекомбинантные протеины, экспрессирующие векторы, вирус простого герпеса человека 2-го типа, иммуноэнзимный анализ, Escherichia coli.

SUPERSYNTES OF PRODUCT GENE EXPRESSION SOLUBLE PROTEIN, WHICH INCLUDES IMMUNODOMINANT REGIONS OF GLYCOPROTEIN G HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 2 IN THE BACTERIAL Escherichia coli SYSTEM

L. M. Korshun1, L. M. Moysa1, G. V. Kovtonjuk1, L. O. Ganova1-2, O. K. Kiselyova1, M. J. Spivak2

JSC «Diaproph-Med», Kyiv 2Institute of Microbiology and Virology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

E-mail: [email protected]

The spread of infections caused by herpes simplex virus types 1 and 2 has increased significantly worldwide now. Diseases caused by herpes virus type 2 occurring in more heavy form, with frequent recurrences and complications compared with those caused by agent type 1. When clinical and laboratory tests were carried out, differential diagnosis between these two types of virus became more important. Purpose of the work was optimizing conditions of the bacterial expression of recombinant protein containing immunodominant regions of glycoprotein G of herpes simplex virus type 2 in the Escherichia coli cells and obtaining of the highly purified preparation suitable for use in the immunosor-bent composition to the development of diagnostic test kits.

It was found that recombinant protein GST-HSV2gG accumulated both in a soluble form and as insoluble inclusion bodies in bacterial cells. Influence of media composition, expression temperature and IPTG concentration on the level accumulation of the heterologous protein and its immunochemical properties was shown. The maximum level of the soluble protein biosynthesis was reached when the bacteria had been cultivated with use the TB medium (1,2 % bactotryp-tone, 2,4 % yeast extract, 55 mM glycerol, 17 mM KH2PO4, 72 mM K2HPO4, pH 7,2) at 37 °C with decreasing concentration IPTG up to 0,1 mM.

The target protein was purified by affinity chromatography technologies. Under the optimized conditions the yield of the purified soluble protein was up to 78.74 % relative to total recombinant protein.

The immunochemical properties of GST-HSV2gG protein was estimated by ELISA. The results suggested that it might be applicable for the development of the diagnostic kits for the detection of herpes simplex virus type 2.

Key words: recombinant proteins, expression vectors, herpes simplex virus type 2, ELISA test, Escherichia coli.

УДК 611.127-002.4.085:612.59

МОДЕЛИРОВАНИЕ НЕКРОЗА МИОКАРДА С ПОМОЩЬЮ КРИОТЕХНОЛОГИИ

И. В. Слета

Н. А. Чиж Институт проблем криобиологии и криомедицины

С. Е. Галъченко НАН Украины, Харьков

Б. П. Сандомирский

E-mail: [email protected]

Ежегодно в нашей стране регистрируется около 50 тыс. новых случаев инфаркта миокарда. Совершенствование способов профилактики и лечения этой патологии должно базироваться на адекватных экспериментальных моделях.

В работе рассмотрены биотехнологические этапы воспроизведения некроза миокарда у крыс с использованием криомедицинских методов. Изучена зависимость полученных результатов от оперативного доступа, диаметра криоаппликатора и длительности криовоздействия. Установлена зависимость величины зоны крионекроза миокарда от параметров криовоздействия.

Показана высокая точность воспроизведения топографии и размеров зоны некроза миокарда с использованием гистологических и ЭКГ-методов, а также возможность формирования субэпикарди-ального и трансмурального некроза миокарда, что чрезвычайно важно для доклинического изучения различных методов лечения.

Исследования патологических изменений сердца в динамике показали, что в зоне криовоздей-ствия в миокарде развивалась воспалительная реакция, которая в свою очередь сменялась процессами фибротизации с формированием соединительнотканного рубца.

Ключевые слова: некроз миокарда, моделирование, криодеструкция.

Ежегодно в нашей стране регистрируется около 50 тыс. новых случаев инфаркта миокарда [1]. Инфаркт миокарда (ИМ) — одна из форм некроза миокарда, вызванная нарушением притока крови через пораженные артерии. Совершенствование способов профилактики и лечения ИМ может базироваться на адекватных экспериментальных моделях [2-4].

В экспериментальных исследованиях в качестве моделей ИМ для создания «коро-нарогенных» некрозов выполняют эмболиза-цию или перевязку коронарных артерий [2], для формирования «некоронарогенных» некрозов вводят химические или гормональные препараты, а также проводят электрокоагуляцию [3] или криодеструкцию сердца [5, 6].

Высокая летальность и отсутствие точной повторяемости повреждения сердца при использовании существующих моделей ИМ побуждают исследователей искать новые варианты моделирования ИМ, позволяющие стандартизировать зону поражения.

Цель настоящей работы — разработать биотехнологический метод получения прогнозируемой зоны некроза миокарда (НМ) методом локальной криодеструкции.

Материалы и методы

Исследования выполнены в соответствии с «Общими принципами экспериментов на животных», одобренными II Национальным конгрессом по биоэтике (20.09.04, Киев) и согласованными с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985).

Эксперименты проведены на 106 беспородных крысах-самках массой 180-250 г. Модель НМ создавали хирургическим способом на животных под эфирным наркозом на спонтанном дыхании. Перед вхождением в грудную полость накладывали 2 провизорных шва (рис. 1), что позволяло быстро ее ушить после криовоздействия и таким образом снизить риск послеоперационных осложнений, включая пневмоторакс.

Криовоздействие на сердце производили азотным криоинструментом с температурой рабочей поверхности аппликатора -196 °С (рис. 2). После криодеструкции сердца грудную полость быстро и герметично ушивали. С целью профилактики пневмоторакса шприцем удаляли воздух из грудной полости.

Рис. 1. Наложение провизорных швов перед криовоздействием на сердце

Рис. 2. Проведение криовоздействия на сердце

Отработку параметров криовоздействия проводили в 2 этапа.

1-й этап — выбор диаметра аппликатора (15 крыс). Животные были разделены на 3 группы, по 5 крыс в каждой, с использованием криоаппликаторов диаметром 7 мм, 5 мм и 3 мм. Длительность криовоздействия на сердце составляла 10 с, а оперативный доступ осуществляли в 4-5-м межреберьях. Критерием оценки выбора диаметра криоаппликатора служил показатель летальности животных.

2-й этап — определение зависимости функциональных и морфологических изменений сердца от локализации и экспозиции криовоздействия (91 крыса). Для получения НМ в различных топографических областях сердца оперативный доступ осуществляли в 4-5-м или в 5-6-м межреберьях.

При проведении 2-го этапа эксперимента животные были разделены на 3 группы:

1-я группа (контроль) — животные с то-ракотомией без криовоздействия на сердце при оперативном доступе в 4-5-м межре-берьях;

2-я группа — животные после криовоз-действия на левый желудочек при оперативном доступе в 4-5-м межреберьях;

3-я группа — животные после криовоздействия на верхушку сердца при оперативном доступе в 5-6 межреберьях.

Животные 2-й и 3-й групп по длительности криовоздействия на сердце разделили на 3 подгруппы: А — 10 с; Б — 15 с; В — 30 с.

Группа интактных животных (норма) — 7 крыс.

Функциональную способность миокарда исследовали электрокардиографически. Электрокардиограммы (ЭКГ) животных регистрировали на аппаратно-программном комплексе «Поли-Спектр» («Нейрософт»,

Россия) до операции, в первые минуты после операции и через 1, 7, 14 и 30 сут после операции. Амплитуду устанавливали на 20 мм, а скорость записи — на 50 мм/с. По ЭКГ определяли частоту сердечных сокращений (ЧСС) в 1 мин, оценивали ритм и проводили анализ комплекса QRS-T.

Морфологическую картину миокарда изучали на 1-, 7-, 14- и 30-е сут после крио-воздействия по гистологическим срезам, окрашенным гематоксилином и эозином. Визуально определяли степень воспалительной реакции и формирования соединительнотканного рубца в зоне криовоздействия. Глубину очагов криодеструкции миокарда рассчитывали с помощью компьютерной программы Bio Vision 4.0.

Статистическую обработку результатов проводили параметрическим методом Стью-дента-Фишера с использованием t-крите-рия и непараметрическим методом ANOVA. Количественные данные представлены в средних величинах и средних квадратичных отклонениях. Расчет показателей выполняли с помощью SPSS 17.0 для Windows.

Результаты и обсуждение

На 1-м этапе эксперимента крионекроз, полученный при воздействии на сердце крио-аппликатором диаметром 7 мм, приводил к 100%-й летальности животных, а при диаметре 5 мм летальность крыс составляла 60%. Применение криоаппликатора диаметром 3 мм способствовало образованию зоны криоповреждения сердца с отсутствием летальности животных во всей группе. В связи с этим дальнейшие эксперименты по моделированию НМ осуществляли с помощью криоаппликатора диаметром 3 мм.

На 2-м этапе эксперимента исследование ЭКГ у интактных крыс и крыс перед операцией по моделированию НМ (норма) показало, что у всех животных был правильный синусовый ритм с ЧСС 420 ± 25 в 1 мин, отсутствовали нарушения проводимости и изменения в комплексе QRS-T (рис. 3).

лМДД

^лЛуК

■аИ1

Рис. 3. ЭКГ крысы в норме

В ранние сроки после операции у животных 1-й группы (контроль) наблюдали увеличение зубца Т. Ритм синусовый правильный, ЧСС составляла 402 ± 16,0 в 1 мин (таблица). Во все остальные сроки наблюдения существенных нарушений в электрокардиограммах у животных этой группы выявлено не было (рис. 4, а, б).

Рис. 4. ЭКГ крыс после торакотомии (контроль) в 4—5-м межреберьях:

а — непосредственно после криовоздействия; б — через 1 сут после криовоздействия

Криовоздействие на сердце при оперативном доступе в 4-5-м межреберьях (2-я группа) с экспозицией 10 с (подгруппа А) и 15 с (подгруппа Б) приводило к образованию на боковой поверхности левого желудочка сердца зон оледенения, диаметр которых

Рис. 5. ЭКГ крыс после 10 с криовоздействия на сердце при оперативном доступе в 4—5-м межреберьях:

а — непосредственно после криовоздействия; б — через 1 сут после криовоздействия

б

Рис. 6. ЭКГ крыс после 30 с криовоздействия на сердце при оперативном доступе в 4—5-м межреберьях:

а — непосредственно после криовоздействия; б — через 1 сут после криовоздействия

Щ—г-г

б

аМ= -

Рис. 7. ЭКГ крыс после 30 с криовоздействия на сердце при оперативном доступе в 5—6-м межреберьях:

а — непосредственно после криовоздействия; б — через 1 сут после криовоздействия

соответствовал размерам криоаппликатора (3 мм). Глубина криоповреждения сердца животных подгруппы А достигала 0,18 ± 0,03 мм, а Б — 0,28 ± 0,02 мм. При исследовании ЭКГ сразу после окончания оперативного вмешательства в подгруппах А и Б частота сердечных сокращений была на 16% и 19% меньше нормы (с достоверностью Р < 0,05, таблица).

Динамика частоты сердечных сокращений крыс после криовоздействия на сердце

Группы Срок наблюдения, сут

После операции 1 7 14 30

Норма 420±25

Контроль 402±16,0 412±15,7 408±19,5 417±10,9 415±14,5

Подгруппа А 354±9,01, 2 427,5±9,9 420±19,9 420±10,6 417±16,3

Подгруппа Б 348±12,21, 2 416±14,5 418±15,5 429±19,6 429±19,3

Подгруппа В 325±10,71, 2 389±19,9 401±16,2 400±15,3 407±13,4

Примечание: 1 — различие достоверно относительно нормы, Р < 0,05; 2 — различие достоверно относительно контроля, Р < 0,05.

а

а

Отмечали снижение амплитуды зубцов R, появление q-зубца и отрицательных зубцов Т в I и avL-отведениях, что свидетельствовало о развитии у животных этих подгрупп субэпикардиального НМ (рис. 5). При увеличении времени криовоздействия на сердце до 30 с (подгруппа В) увеличивалась и глубина криоповреждения сердца — до 0,42 ± 0,05 мм. При этом ЭКГ соответствовала картине трансмурального ИМ в тех же топографических областях со снижением ЧСС до 325±10,7 [4]. Появление зубца Q в I и avL-отведениях сопровождалось увеличением сегмента ST (рис. 5, а).

Криовоздействие на сердце при оперативном доступе в 5-6-м межреберьях (3-я группа) с экспозицией 10 с (подгруппа А), 15 с (подгруппа Б) и 30 с (подгруппа В) приводило к образованию зон криоповреждения на верхушке сердца, объемы которых аналогичны зонам соответствующих подгрупп 2-й группы. ЭКГ во II, III и avF-отведениях показали, что у животных подгрупп А и Б сразу же после операции появлялись признаки ишемического повреждения сердца, а у животных подгруппы В — изменения, характерные для трансмурального инфаркта миокарда с появлением Q-зубца в этих отведениях (рис. 7, а).

Через 1 сут после криовоздействия зоны криоповреждения сердца макроскопически у животных всех групп имели четкие границы, были отечны, с синюшным оттенком. Исследование гистологических препаратов сердца крыс показало, что применяемое криовоздействие привело к образованию трех биологически значимых зон: I — зона криоповреждения, в которой отмечали участки некроза и паранекроза сердечной мышцы с выраженными дистрофическими явлениями; II — пограничная зона, окружающая зону криоповреждения, в которой уже заметны признаки воспалительной реакции; III — периферические участки сердца, морфологическая картина которых практически не отличалась от нормы.

Изменения электрокардиограмм, отмеченные непосредственно после операции, сохранялись и через 1 сут. Данные ЭКГ свидетельствовали о развитии ишемических повреждений в переднебоковой поверхности сердца подгрупп А и Б животных 2-й группы (рис. 5, б), в заднедиафрагмальных областях и верхушке сердца подгрупп А и Б животных 3-й группы. ЧСС у животных 2-й и 3-й групп имела одинаковую динамику. Через 1 сут после оперативного вмешательства сохранялся правильный синусовый ритм,

а ЧСС восстанавливалась до показателей нормы (таблица).

У животных подгруппы В 2-й и 3-й групп электрокардиографические изменения подтверждали наличие трансмурального НМ в тех же топографических областях, т. е. в переднебоковой поверхности сердца животных 2-й группы (рис. 6, б) и заднедиаф-рагмальных областях и верхушке сердца животных 3-й группы (рис. 7, б). Особенностью ЭКГ животных 2-й группы подгруппы В было появление на 1-е сут отрицательных зубцов Т и реципрокных изменений в avR-отведении (рис. 6, б.).

Исследование ЭКГ животных на 7-, 14-и 30-е сут после операции показало, что электрокардиографическая картина, зарегистрированная на 1-е сут, сохранялась на протяжении всего срока наблюдения во всех экспериментальных группах (рис. 8). Появление аритмий и экстрасистолий не отмечали. Частота сердечных сокращений варьировала в пределах значений нормы. При этом амплитуды Q-зубцов после 30 с крио-воздействия (подгруппы В во 2-й и 3-й группах) сохранялись на одном уровне.

До криовоздействия

После 1-е сут 7-е сут 14-е сут 30-е сут

■

иш^'г A*JUKlkJU isKliVKvJ,-

Рис. 8. Динамика ЭКГ в течение 30 сут после 30 с криовоздействия на сердце при оперативном доступе в 4—5-м межреберьях

Исследование гистологических препаратов сердца крыс после криовоздействия дает основания утверждать, что ремоделирова-ние миокарда проходило по классическому пути — от асептического воспаления до формирования соединительнотканного рубца (1-30-е сут) [4]. Объемы зон крионекроза, пограничных зон миокарда и морфологические изменения в них у животных подгрупп А, Б и В 2-й группы были аналогичны объемам зон и морфоструктурным изменениям миокарда у животных 3-й группы соответст-

вующих подгрупп. Гистологические картины сердца животных подгрупп А, Б и В отличались вовлечением в воспалительный процесс различных по глубине слоев миокарда.

Через 7 сут после 10 и 15 с криовоздей-ствия наблюдали зоны реактивного воспаления, сопровождавшиеся развитием лейкоцитарной инфильтрации. Очаги деструкции и воспалительной реакции характеризовались разрушением пучков кардиомиоцитов, дилатацией сосудов и скоплением нейтро-филов (рис. 9).

Рис. 9. Очаг некроза миокарда после 15 с криовоздействия на сердце, 7 сут:

а — формирование четкой зоны крионекроза миокарда, об. х10, ок. х10; б — стаз и тромбоз микрососудов; в — расслоение пучков кардиомиоцитов, об. х40, ок. х10. Гематоксилин-эозин

После 30 с криоповреждения сердца наблюдали формирование трансмурального некроза миокарда. На рис. 10 представлены участки полной деструкции миокарда с ге-моррагиями и клеточной инфильтрацией всего поперечника боковой стенки левого желудочка.

Рис. 10. Очаг некроза миокарда после 30 с криовоздействия на сердце, 7 сут. Полная деструкция миокарда боковой стенки левого желудочка.

Гематоксилин-эозин. Об. х10, ок. х10

Благоприятным исходом НМ является организация соединительнотканного рубца. В наших исследованиях на 14-е сут в зоне криовоздействия воспалительная реакция сменялась процессами фибротизации с формированием рыхлой соединительной ткани. На месте погибших кардиомиоцитов начинал формироваться соединительнотканный каркас с большим количеством фиброблас-тов в стадии коллагенообразования. Сохранялось полнокровие микрососудов. В отдельных участках отмечались диапедез и скопление макрофагов вокруг сосудов микроциркуляторного русла (рис. 11).

Рис. 11. Формирование соединительнотканного рубца в зоне 15 с криовоздействия на сердце, 14 сут.

Гематоксилин-эозин. Об. х10, ок. х10

Продолжение реконструктивной фазы отмечали и через 30 сут после криовоз-действия. Имели место признаки прогрессирующего фиброза с формированием соединительнотканных тяжей по ходу поврежденных артериальных сосудов. Фиброзная ткань состояла из созревших колла-геновых волокон, которые формировали соединительнотканный рубец (рис. 12).

Рис. 12. Формирование соединительнотканного рубца в зоне 15 с криовоздействия на сердце, 30 сут.

Гематоксилин-эозин. Об. х10, ок. х10

Следовательно, во всех группах после криодеструкции сердца развивались признаки острого некроза миокарда, которые имели отчетливую и закономерную динамику на протяжении всего срока наблюдения.

Моделирование некроза миокарда криохирургическим методом не может претендовать на точное воспроизведение развития клинических событий при ИМ у человека. Поскольку в наших исследованиях было проведено криовоздействие на миокард здоровых животных, атеросклеротический процесс в коронарных артериях и ишемическая стадия, предшествующие возникновению некроза миокарда в клинике, при этом отсутствовали. Предлагаемая модель НМ может вызывать интерес у исследователей и врачей в тех случаях, когда развитие острого ИМ происходит без явного атеросклеротического процесса в коронарных сосудах, в частности

при спазме участка венечной артерии или на этапе терапии после применения реканали-зирующих препаратов.

Таким образом, установлено, что при криохирургическом методе моделирования некроза миокарда наблюдается минимальное количество осложнений и высокая повторяемость повреждения сердечной мышцы при заданных параметрах криовоздействия.

Определены параметры криовоздействий, при которых формируется субэпикардиаль-ный и трансмуральный некроз миокарда.

Крионекроз миокарда с прогнозируемой зоной повреждения сердечной мышцы может быть моделью для доклинических испытаний фармакологических препаратов кардиотроп-ного действия и исследований, направленных на изучение ремоделирования миокарда при применении клеточной терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бабушкина А. В. Инфаркт миокарда: от фундаментальных исследований — к практическим достижениям (по материалам X Национального конгресса кардиологов Украины) // Укр. мед. часопис. — 2009. — Т. 53, № 5. — С. 10-13.

2. Давыденко В. В., Матюков А. А., Цупки-наН. В. и др. Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на функциональное состояние миокарда кролика после инфаркта // Клет. трансплантол. и ткан. инж. — 2007. — Т. 11, № 2. — С. 52-61.

3. Дремина Н. Н., Шурыгина И. А., Лушнико-ва Е. Л. и др. Влияние эндотелиального фактора роста на постинфарктное ремоделиро-

вание миокарда крыс // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2009. — Т. 148, № 9. — С. 330-336.

4. Шилов А. М. Инфаркт миокарда (Патофизиологические и клинические аспекты). — М.: Миклош, 2009. — 164 с.

5. Bos E. J., Mees B. E., Waard M. C. et al. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation // J. Physiol. Heart Circ. Physiol. — 2005. — V. 289. — P. 1291-1300.

6. Murry C. E., Wiserman R. W., Schwartz S. M. et al. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis // J. Clin. Invest. — 1996. — V. 98. N 11. — P. 2512-2523.

МОДЕЛЮВАННЯ НЕКРОЗУ М1ОКАРДА ЗА ДОПОМОГОЮ КР1ОТЕХНОЛОГП

I. В. Слета М. О. Чиж С. С. Гальченко Б. П. Сандомирський

1нститут проблем крюбюлогп та крюмедицини НАН Украши, Харкiв

E-mail: [email protected]

Щорiчно в нашiй кра1ш рееструеться близько 50 тис. нових випадшв шфаркту мiокарда. Удосконалення способiв профшак-тики i лiкування ще1 патологи мае базуватися на адекватних експериментальних моделях.

У робота розглянуто бютехнолопчш етапи вщтворення некрозу мiокарда у щурiв з вико-ристанням крюмедичних методiв. Вивчено залежнiсть отриманих результатав вiд оперативного доступу, дiаметра крiоаплiкатора i тривалостi крюди. Встановлено залежшсть величини зони крiонекрозу мюкарда вiд пара-метрiв крюди.

Показано високу точшсть вiдтворення то-пографи i розмiрiв зони некрозу мюкарда з ви-користанням гiстологiчних та ЕКГ-методiв, а також можливiсть формування субепшар-дiального i трансмурального некрозу мюкар-да, що вкрай важливо для доклШчного вив-чення рiзних методiв лiкування.

Дослiдження патологiчних змш серця в ди-намiцi показало, що в зон крюди в мюкард1 розвивалася запальна реакцiя, яка, у свою черту, змшювалася процесами фiбротизацil з фор-муванням сполучнотканинного рубця.

Ключовi слова: некроз мюкарда, моделюван-ня, крiодеструкцiя.

MYOCARDIUM NECROSIS MODELING BY CRIOTECNOLOGY

I. V. Sleta N. A. Chizh S. Ye. Galchenko B. P. Sandomirsky

Institute of Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv

E-mail: [email protected]

About 50 thousand of new cases of myocar-dial infarction are registered in our country annually. Perfection of methods of prophylaxis and treatment of this pathology should be based on adequate experimental models.

In the paper the technological stages of myocardium necrosis simulation in rats using cryomedical methods were reviewed. The influence of the obtained results on surgery access, diameter of cryoapplicant and cryoeffect duration was studied. The dependence of the myocardium cryonecrosis zone volume on the cryoeffect parameters was established.

Reproducing with high accuracy of topography and dimensions of myocardium necrosis zone using histological and ECG methods was shown and the possibility of formation of subepi-cardial and transmural myocardium necrosis was demonstrated as it is extremely important for pre-clinical study of different treatment methods.

Investigations of heart pathological changes in dynamics shown that an inflammatory reaction was developed in the zone of cryoeffect in myocardium, which in its turn was changed under the fibrotization processes with formation of connective tissue cicatrix.

Key words: myocardium necrosis, modeling, cryodestruction.

УДК 579.222

ВПЛИВ ЛЮФ1Л1ЗАЦП НА ЖИТТСЗДАТШСТЬ ДР1ЖДЖ1В Pichia anómala

С. М. Шульга

О. О. Тиунова ДУ «1нститут харчово'1 бютехнологп та геномши»

А. Ф. Ткаченко НАН Украши, Кт'в

Н. 6. Бейко А. I. Хоменко

E-mail: [email protected]

Збереження мшрооргашзм1в у колекщях чистих культур е актуальною проблемою. 1снуе багато метод1в збереження бактерш, але жоден з них не дае 100%-го захисту вщ мутацш, змш властивостей мшрооргашзм1в або ix загибель На життездатшсть м1кроорган1зм1в у процем л1оф1л1зацй впливае низка фактор1в: умови культивування (рН i температура), вш культури, концентращя клгтин, склад захисного середовища i метаболiчна активнiсть. Оптимiзацiя цих процемв дозволяе зберегти до 80-90% життездатних клггин. Для культури Pichia anómala визначено умови культивування, фазу росту, в якш дрiжджi виявляють найбiльшу стiйкiсть до несприятливих умов люфьизацп. Оп-тимiзовано склад захисного середовища, що дало змогу досягти максимального (до 95%) збереження життездатних клггин шсля лiофiлiзацii. Високий рiвень життездатних клiтин пiсля заморожу-вання вiдзначено у дрГжджовш суспензп з 36 до 48 год росту. Визначено оптимальну температуру i термш зберпання лiофiлiзованиx дрГжджГв з максимальною шльшстю життездатних клГтин.

Ключовi слова: дрГжджГ Pichia anómala, люфШзащя, захисне середовище, життездатнiсть клгтин.

Традицшш методи пiдтримання культур мiкроорганiзмiв зводяться до 1х вирощуван-ня на багатих живильних середовищах iз частими перейвами. При цьому спостерша-ються мутацiйнi змiни i автоселекцiя, як1 часто призводять до втрати важливих фiзiо-лого-бiохiмiчних властивостей. Тривале збе-рiгання культур мiкроорганiзмiв без втрати властивостей продуценйв можливе, якщо рiзко припинити перебiг усiх процесiв у клггиш, тобто перевести 11 в стан, близь-кий до анабюзу [1-3].

Вщомо багато способiв збершання культур мiкроорганiзмiв: перiодичнi перейви, зберiгання в 25%-му розчинi глщеролу при температурi -20 °С, у дистильованш водi, пiд вазелiновим маслом на агаризованому сере-довищi та в люфШзованому станi. Жоден з вщомих способiв не е ушверсальним [4-6].

Пiд час лiофiлiзацii у б^ьшост мшроор-ганiзмiв вiдбуваеться часткова загибель клггин, а в деяких випадках — змша iхнiх властивостей [7-8]. Окрiм того, характеристики люф^зованих культур (кiлькiсть життездатних клггин, залишкова вологiсть, структура сухого матерiалу та iн.) залежать вiд правильного проведення кожно1 операцп i визначаються, у свою чергу, фiзiологiчни-

ми та технолопчними властивостями мшро-оргашзму, який пiдлягае лiофiлiзацii. У зв'язку з цим юнуе необхiднiсть визначення впливу рiзних чинникiв на життездатшсть дрiжджiв РЬсЫа апота1а за 1х лiофiлiзацii.

Мета дано1 роботи — вивчення впливу умов культивування, вшу культури та пере-несення мшробних кл^ин в захиснi середовища рiзного складу на життездатнiсть дрiжджiв РЬсЫа апота1а за лiофiльного ви-сушування.

Матерiали i методи

Об'ектом дослщжень були дрiжджi РЬсЫа апота1а штаму L-1 з «Колекцii штамiв мiкроорганiзмiв i лiнiй рослин харчово! та сiльськогосподарськоi бiотехнологiй» 1нсти-туту харчовоi бiотехнологii та геномiки НАН Украши.

Культури збершали на солодовому агар1 (8% сухих речовин, у тому числi 2% агару).

Дрiжджi культивували глибинним перiодичним способом на качалках (240 об/хв) при температурi 30 °С в колбах емшстю 0,75 дм3 з 0,05 дм3 живильного середовища такого складу (г/дм3): Н2ЫСОМН2 — 1,0; КН2РО4 — 1,0; Мя804 • 7Н20; FeClз —

0,05; ZnSO4 • 7Н2О — 0,05; меляса — 60,0; рН 5,8. Культури вийвали 3i скошеного солодового агару, переносячи дрiжджовi кль тини в колбу емшстю 0,25 дм3 i3 0,1 дм3 стерильного живильного середовища, та культивували на шейкерЫнкубатор1 BIOSAN ES-20 (Латвiя) 3i швидкiстю пе-ремшування 200 об/хв та за температури 30 °С протягом 24 год. Пойвний матерiал, виготовлений таким методом, вмщували в колби eмнiстю 0,5 дм3 з 0,2 дм3 середовища. Як джерело вуглеводiв використовували ме-лясу в шлькоста 60 г/дм3.

Дрiжджi вирощували в бiореакторi для культивування мiкроорганiзмiв — АКЛ — 10М (Ройя). 1нокулят вирощували тим самим методом, що й пойвний матерiал, i вносили у шлькоста 10%.

Склад окремих компонентав середовища змiнювався залежно вщ поставленого зав-дання.

Кислотнiсть середовищ визначали на рН-метрi — рН-150М (Бiлорусь).

Для одержання желатози 10%-й розчин желатини готували на бщистильованш вод1 та автоклавували протягом 1 год. Одержа-ний розчин желатози ф^ьтрували i згодом використовували для приготування захис-них середовищ.

Для отримання суспензп дрiжджiв культу-ральну рщину осаджували центрифугуванням i ресуспендували в захисних середовищах до концентрацп 6,5106 клiтин/дм3. Для досль дження ефективноста захисного середовища було використано метод, за яким пряме вияв-лення зв'язано! води можна замшити визна-ченням порiвняльноï гiдрофiльностi, зокрема залишково! вологостi в бюлопчних препаратах за !х одночасно! люфШзацп [9, 10].

Для з'ясування впливу захисного середовища на життездатшсть клггин пiсля люфь лiзацiï дослiджували захиснi середовища такого складу (%): глюкоза або цукроза — 1,0; 10,0; 30,0; желатоза — 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; агар — 0,2.

Дрiжджi вносили в захисне середовище з роз-рахунку концентрацп клгтин 6,5-106 клгтин/дм3, потiм дрiжджову суспензiю в шлькоста 5 см3 вмiщували в пенiцилiновi флакони.

Одержанi зразки заморожували в низь-котемпературному холодильнику LAB 11/EL19LT фiрми Elcold (Данiя) за температури -80 °С. Замороженi зразки переносили в спещальних касетах в попередньо охоло-джену камеру (температура конденсатора -50 °С) люф^ьно! сушарки CRU0D0S-50 фiрми TELSTAR( 1спатя). Тривалiсть вису-шування становила 24 год.

Шд час пiдготовки люфШзованого ма-терiалу для дослiджень слщ було виконати двi умови: максимально точно вщновити по-переднiй (до висушування) об'ем матерiалу та вивести живi клiтини зi стану анабюзу. Для виконання цих умов люфШзований ма-терiал доводили дистильованою водою до об'ему 510-3 дм3 i витримували за кiмнатноï температури в дистильованш водi протягом 30 хв.

Кiлькiсть кл^ин (живих i мертвих) ви-раховували за методикою, викладеною в робота [11].

Пiдрахунок загально! кiлькостi кл^ин дрiжджiв у культуральнiй рiдинi проводили за допомогою камери Горяева з паралельним розйвом у чашки Петрi з сусло-агаром. Життездатнiсть дрiжджiв Pichia anomala штаму L-1 визначали за шльшстю тдрахо-ваних колонiй на чашках Петрi пiсля двох дiб культивування [12].

Пiсля регiдратацiï дрiжджi пiддавали гли-бинному культивуванню упродовж двох дiб.

У процесi люфШзаци мiкроорганiзми iнодi залишаються життездатними, але з по-рушеними обмiнними функщями клiтин, що призводить до зниження фiзiологiчно'í активностi.

Дрiжджi Pichia anomala — продуцент лшвдв, тому !хню фiзiологiчну активнiсть встановлювали за шльшстю накопичено'1 бiомаси i синтезом лшвдв.

Бiомасу визначали таким способом: осад тсля центрифугування культурально! рщи-ни протягом 30 хв при 5 000 g висушували в бюксах за температури 105 °С до незмшно'1 маси (у трьох повторах) з подальшим зважу-ванням висушено! наважки дрiжджiв на вагах RADWAG WPS 4000/C/1 (Польща).

Для обчислення шлькоста лiпiдiв вису-шену бiомасу (наважка 10 г) вкладали в пакетик з ф^ьтрувального паперу та зважува-ли. Потам пакетик вносили до екстрактора i герметично з'еднували вй частини апара-та. Колбу апарата ставили у киплячу водяну баню. Через верх холодильника проводили послщовне екстрагування дiетиловим ефь ром i сумшшю хлороформ + етанол в апа-ратi Сокслета протягом 5-6 год. Дрiжджову масу, яка залишилась тсля першо! екстрак-цiï, пiддавали обробленню 10% -ю HCl на киплячш водянiй банi впродовж 3 год, тсля чого тими самими розчинниками екстрагу-вали частину лiпiдiв, яка залишилася.

Пiсля екстракцiï пакетик з матерiалом висушували спочатку при 20-30 °С (за кiмнатноï температури), а потам при 100-105 °С. Зважували i за рiзницею мiж

масою до та тсля екстрагування визначали к1льк1сть жиру.

К1льк1сть цукр1в вираховували за стандартом СОУ.15.9-37-240 2005 р.

Ефективнють синтезу л1п1д1в оцшювали за показником жирового коеф1ц1ента (дор1внюе к1лькост1 мг л1п1д1в/мг цукр1в х100).

Ус1 досл1ди проводили в трьох повторах, статистичне оброблення результатав викону-вали зг1дно з [13]. Р1зницю м1ж двома се-редшми величинами вважали достов1рною при Р < 0,05.

Результати та обговорення

Збереження життездатност та шших бюлопчних властивостей м1кроорган1зм1в залежить в1д багатьох чиннишв: в1ку культури (деяк1 види м1кроорган1зм1в найб1льш ст1йк1 до заморожування [14] наприкшщ ло-гарифм1чно! стадп та на початку стацюнар-но! фази росту), концентрацп кл1тин, складу захисного середовища, активност1 метабо-л1чних процейв тощо.

Нами дослщжено вплив в1ку др1жджово'1 культури на життездатшсть клггин п1д час заморожування й визначено тривал1сть фаз росту др1жджових кл1тин за !х культивування в рщкому середовищ1. Початок логарифм1ч-но! фази заф1ксовано на 7-8-й год, а початок стацюнарно! — на 28-й год культивування. У середиш кожно! фази розвитку культури вщбирали б1омасу i в1дпов1дно до наведено'1 вище методики пiддавали заморожуванню. Результати визначення життездатност за-морожених дрiжджiв наведено на рис. 1.

Високий рiвень збереження життездатних кл^ин пiсля заморожування вiдзначено в дрiжджовiй суспензiï лише з 36-Ï до 48-Ï год росту. Шсля 48 год життездатшсть

клгтин починала знижуватись. Цей факт можна пояснити тим, що на крюстшкють суспензп впливае рiзний фiзiологiчний стан клгтин, спiввiдношення чутливих i стiйких особин в популяцп культури. Окрiм того, стшкють залежить вiд хiмiчного складу клгтин, передусiм плазматично! мембрани.

Результати проведених дослщжень дозволили встановити оптимальний вш культу-ри (42 год росту) для збереження життездат-ностi кл^ин пiсля заморожування.

На життездатнiсть мiкроорганiзмiв на ета-пах заморожування i висушування вплива-ють також умови !х культивування. Суттевий вплив на крюрезистентнють та життездат-нiсть кйтин за глибинного культивування мiкроорганiзмiв тд час висушування справ-ляють pH i температура середовища.

Результати проведених експерименйв дали змогу вивчити, як впливае рН середо-вища на життездатшсть дрiжджових кл^ин (табл. 1).

Оптимальним для синтезу бюмаси е рН 5,5, кiлькiсть життездатних клгтин — 75,7% за максимального накопичення бюмаси — 4,0 гАСБ/дм3. Якщо рН середовища стано-вить 6,0, синтез бюмаси знижуеться до 3,9 гАСБ/дм3, однак процес накопичення лшвдв тривае i вмют !х досягае 2,0 г/гАСБ.

Також можна зробити висновок, що змша рН середовища вщ 5 до 6 не мае знач-ного впливу на шлькють лшвдв.

Таким чином, лшщи як важливi компо-ненти цитоплазматичних мембран, так само як трегалоза i глiкоген, виконують роль резервного матерiалу [15] i виявляють захисну дГю стосовно бюлопчних мембран пГд час лiофiлiзацiï.

Дослщжено вплив температури культивування дрГжджГв на бiомасу та накопичення лшвдв (рис. 2).

100

1 В 16 24 32 40 48 56

Термш вирощування, год

Бюмаса

Життездатшсть

н и

í-

к

X

и н т

а д

Рис. 1. бioмacи тa життeздaтнicть

дpiжджiв зaлeжнo вiд фaз pocтy

28

30

Бiомаса

32

34

36

38

Температура, С

Лшщи

Рис. 2. B^niM тeмпepaтypи нa нaкoпичeння лiпiдiв Pichia anómala штaмy L-1

TaÔM-u^ 1. Bn.niiB pH cepegoBHm;a Ha BH^HBaHicTB gpmg^oBHX khïthh

pH EioMaca, rACE*/gM3 BMICT ninigiB, r/rACE Ki^BKiCTB XHBHX KniTHH

flo nio$iniзaцiï, Kyo ■ 109 nic.A nio$iniзaцiï, Kyo ■ 109 Bu»HBaHicTb,%

4,0 2,40±0,10 1,30±0,01 6,00±0,12 2,20±0,04 33,9

4,5 3,00±0,05 1,60±0,02 6,50±0,11 1,80±0,01 27,7

5,0 3,40±0,08 1,80±0,01 6,90±0,14 3,00±0,06 43,5

5,5 4,00±0,07 1,80±0,03 7,50±0,13 5,00±0,11 72,5

6,0 3,90±0,10 2,00±0,01 7,40±0,15 5,60±0,09 75,7

6,5 3,60±0,06 1,90±0,02 7,00±0,10 3,00±0,05 59,4

7,0 3,00±0,08 1,70±0,01 6,50±0,09 2,60±0,03 40,0

npuMimKa. ACB — aSconroTHo cyxa SioMaca.

nigBurn;eHHA TeMnepaTypu Big 28 °C go 34 °C 3yMoB.roBano 3Si.bmeHHA HaKonuTOHHA SioMa-cu. 3 nigBH^eHHHM TeMnepaTypu go 38 °C chh-Te3 SioMacu 3MeHmyBaBcA, ogHaK cHHTe3 ninigiB npogoBœyBaBca i MaKcHMa.tHa Ki.bKicTb ninigiB cnocrepiranacA 3a TeMnepaTypu 36 °C.

Ki.bKicTb œHTT63gaTHHX K.iTHH nic.fl nio$ini3a^ï 3Ha^Horo Miporo 3ane»HTb Big cK.agy 3axucHHX cepegoBum;.

BuœHBaHicTb gpiœgœoBHX K.iTHH nig ^ac nio$ini3a^ï Mo^Ha 3Si.bmHTH, nigSuparo™ 3axucHi cepegoBurn;a go onTHManbHoro ïx cK.agy i cniBBigHomeHHH KoMnoHeHTiB y cepe-goBH^i, m;o 3anoSiraroTb aSo 3MeHmyroTb iHTeHcuBHicTb gecTpyKTHBHux пpoцeciв.

IcHyroTb 3ara.bHi BHMoru go 3axucHux ce-pegoBum;. Bohh MaroTb SyTH rigpo^i.bHHMH (pe^oBHHH, AKi He 3B'A3yroTb Bogy, He e 3axuc-hhmh g.A MiKpoopraHi3MiB 3a ïx nio$ini3a^ï) i He MicTHTH conen (g.A цboгo ïx roTyroTb Ha gucTH.boBaHiH aSo SigucTH.boBaHiH Bogi). KpiM Toro, cnig 3anoSiraTH noTpan.AHHro co-nen i3 cepegoBH^a Ky.bTHByBaHHA pa3oM 3 MiKpoSHoro Macoro. fl.A цboгo nepeg 3mh-BaHHHM MiKpoSHoï Macu 3axucHHM cepegoBH-^eM noTpiSHo Buga.HTH KoHgeHca^HHy Bogy 3 npoSipoK, b AKHx Bupo^yBa.u Ky.bTypy.

floc.igœeHHH pi3Hux 3axucHux cepego-Bum; gonoMor.o nigiSpaTH cepegoBurn;a, go cK.agy akhx Bxogunu ByrneBogu (rnroKo3a i caxapo3a ak rigpo^i.bHi peTOBHHu), œena-THHa h arap (ak Konoïgu), m;o MaKcuManbHo 3axu^a.u K.iTHHH MiKpoopraHi3My Big mKignuBoro BnnuBy nio$ini3a^ï i He Manu aH-TureHHux B.acTHBocTen. ^ cepegoBurn;a Moœ-Ha BBaœaTH rigpo^i.bHHMH, ane BMicT 3a3Ha-tohhx peTOBHH He noBHHeH SyTH HagMipHHM. 3aHagTo Be.HKHH BMicT rigpo^i.bHux pe^o-bhh ynoBi.bHroe пpoцec BucymyBaHHA, ctbo-proe nigBH^eHy 3anumKoBy BonoricTb i 3MeH-mye po3^HHHicTb cyxoro npenapaTy. ToSto BMicT цнx pe^oBHH Mae .ume 3aSe3ne^yBaTH onTHMa.bHy 3a.umKoBy BonoricTb [16].

Byno goc.igœeHo rigpo^i.bHicTb gpiœ-gœoBux cycneH3in 3a.e^Ho Big кoнцeнтpaцiï b hhx r.roKo3H i цyкpoзн (TaSn. 2).

3 gaHux TaSnu^ BugHo, ak 3MiHroBanaca 3a.umKoBa BonoricTb KiH^Boro MaTepiany 3a-.emHo Big BMicTy ByrneBogiB i ïxHboï koh^h-Tpa^ï 3a ogHux i thx caMux yMoB nio$ini3a-цiï. 3 BHKopncTaHHHM rnroKo3H Ta цyкpoзн b Ki.bKocTi 10% ogepœanu noKa3HHKH 3annm-koboï Bo.orocTi 2,85 i 1,94%, BignoBigHo. fl.A noganbmoï poSoTH 3 nigSopy 3axucHoro cepegoBH^a g.A nio$ini3a^ï gpiœgœiB ak rigpo^i.bHHË KoMnoHeHT Syno oSpaHo цyкpo-3y b кoнцeнтpaцiï 10%.

OKpiM HaABHocTi pe^oBHH, Big akhx 3a.e-œuTb rigpo^i.bHicTb MaTepia.y, b cepegoBH^i MaroTb SyTH ^e h pe^oBHHH, AKi MaKcuMa.bHo 3axu^aroTb K.iTHHH MiKpoopraHi3My Big mKig-.HBoro Bn.HBy 3aMopoœyBaHHA i BucymyBaHHA.

y poSoTi [17] noKa3aHo, ^o œe.aTo3a 3gaTHa 3axu^aTH MiKpoopraHi3MH Big 3rySHoï giï пpoцe-ciB 3aMopoœyBaHHA Ta .io4>i.i3a^ï. HaHSi.bm цiнннмн B.acTHBocTAMH œe.aTo3H b 3axucHux cepegoBH^ax Sy.o Te, m;o BoHa 3aSe3ne^yBa.a .io^i.bHy cTpyKTypy cyxoro Marepiany i, Ha BigMiHy Big œenaTHHH, Syna He gyœe B'A3Koro, He yTBoproBana reniB HaBiTb 3a bhcokoï кoнцeнт-paцiï i He Mana aHTureHHux BnacTHBocTen.

HaMH gocnigœeHo Bn.HB pi3Hux кoнцeнт-paцiн œenaTo3H Ha Ki.bKicTb œHTTe3gaTHux gpiœgœoBux K.iTHH nic.A nio$iniзaцiï. Pe-3y.bTaTH nogaHo b TaSn. 3.

Ta6au^ 2. nopiBHH^BHa rigpo^inBHÏCTB cycneH3iï Pichia anomala 3ane^HO Big концентpaцlï raroK03H Ta ^Kpo3H

3axHCHe cepegoBH-^e 3 raro- K030M,% 3annmKOBa BonoricTB, % 3axHCHe cepegoBH-^e 3 цук-po3oro,% 3annrnKOBa BonoricTB, %

1 19,67 1 18,11

10 2,85 10 1,94

30 40,43 30 50,33

Таблиця 3. Вплив концентрацп желатози на кшьшсть дрiжджових кл1тин в сухому матерiалi

Концентрацiя желатози, % Кшьшсть мiкроорганiзмiв КУО • 109 Життездатшсть, % Залишкова волопсть, %

До лiофiлiзацiï ПГсля лiофiлiзацiï

5 4,90±0,06 2,35±0,01 47,9 4,0

6 5,10±0,09 3,21±0,02 63,0 2,9

7 5,00±0,10 3,36±0,05 67,2 3,0

8 5,60±0,10 4,60±0,09 82,1 3,1

9 5,50±0,11 4,20±0,06 81,8 2,8

10 5,40±0,08 5,20±0,12 96,3 1,9

11 5,00±0,04 4,20±0,08 96,0 2,0

Данi таблицi свiдчать, що концентращю желатози в захисному середовишД потрГ6но було довести до 10%, щоб забезпечити мак-симальну фшсащю клГтин дрГжджГв у сухому матерiалi i запобiгти надмiрному вису-шуванню клГтин (залишкова волога — на рГвш 1,9%).

За результатами дослщжень оптимГзова-но склад захисного середовища, яке мГстило такГ компоненти (%): глюкоза — 10,0; жела-тоза — 10,0; агар — 0,02.

Для визначення часу зберГгання без значно! втрати життездатностГ та фГзюлопч-но! активностГ дрГжджових клГтин шсля лю-фШзацп слГд вивести !х з анабГотичного стану. Якщо не забезпечити оптимальних умов виведення клГтин з анабюзу, то одержат даш щодо життездатностГ мГкроорганГзму будуть занижень

Особливе значення пГд час зберГгання люфШзованих мГкроорганГзмГв мають тем-пературнГ умови. Чим вища температура зберГгання культур, тим швидше знижува-лась кГлькГсть життездатних клГтин мГкроорганГзмГв. МГж температурою зберГгання люфШзованих мГкроорганГзмГв i швидкГстю вГдмирання спостерГгалась певна за-лежнГсть (рис. 3).

У разГ зберГгання зразкГв люфШзованих дрГжджГв упродовж мГсяця за температури 6 °С кГлькГсть життездатних клГтин не змен-шувалась порГвняно з вихщною культурою, а з шдвищенням температури — поступово знижувалась i за температури 34 °С втрача-лося приблизно 13%. Вщповщно i кГлькГсть синтезованих лшвдв зменшувалася з шдви-щенням температури.

Спостереження за сухим матерГалом дрГжджГв, одержаним з урахуванням уйх чинникГв, якГ позитивно впливали на про-цес люфШзацп культури, показали, що шд час зберГгання за температури 6 °С протягом року (рис. 4) життездатшсть дрГжджГв наприкшщ року досягала 94-95%. За ммнатно'!

Рис. 3. Вплив температури збер1гання на життездатшсть 1 синтез лш1д1в лшфш1зованих др1ждж1в

температури (20 °С) кiлькiсть життездатних клiтин поступово зменшувалась i через рiк збершання становила 90%.

Дослiдженнями процесу лшщоутворен-ня лiофiлiзованих дрiжджiв пiд час зберь гання протягом року встановлено, що синтез лiпiдiв наприкiнцi термiну збершання змен-шився на 5% за температури збершання 6 °С i на 10% за кiмнатноi температури (рис. 4). Вщповщно змiнювалась i величина жирового коефiцiента. Це е важливим чинником для збершання продуцента в люф^ьному станi впродовж року.

З'ясовано, що для збершання люфШзо-ваних дрiжджiв РЬсЫа аиотаЬа протягом року з концентращею 93-95% життездатних клггин, стабiльною фiзiологiчною ак-тивнiстю i синтезом лшвдв потрiбно:

- перед заморожуванням культивувати дрiжджi протягом 48 год за температури 36 °С i рН 6,0;

- переносити дрiжджi в захисне середо-вище такого складу (%): цукроза — 10,0; желатоза — 10,0; агар — 0,2.

ti я

Е-

Í-

С

'Е í-

Й ч

105 100 ■ ■ сс ".й о <

95 ■ 90 : ^ ' : ■ .3 д Ó.S -0

й.й

S3 -80 ~ - сть ■1

75 ■ -1-1-1-1-

13 6 9

Час зберiгання, мiсяцi

12

Лiпiди 1 ~~ Лiпiди 2 - Життездат-

HiCTb 1

Життездат-HicTb 2

Рис 4. Порiвняльна характеристика лшфШзованих дрiжджiв при рiзних температурах збер^ання упродовж року:

1 — за температуры 6 °С;

2 — 20 С

Встановлено, що зберiгати сухий MaTepian дpiжджiв Pichia anómala L-1 протягом року можна в штерваш температур вiд 6 °С (95% житгездатних клiтин нaпpикiнцi року) до 20 °С (93% нaпpикiнцi процесу зберпання). Вiдповiдно збepiгaеться i здатшсть до синтезу лiпiдiв 2,85 г/гАСБ (T = 6 °С) i 2,7 г/гАСБ (T = 20 °С) проти 3 г/гАСБ вихщно'1 культури.

Таким чином, aнaлiз peзультaтiв досль джень впливу таких чиннишв, як вш куль-тури, умови '' культивування, склад захис-ного середовища i температура зберпання висушених дpiжджiв, показав, що зберпання сухого мaтepiaлу Pichia anómala штаму L-1 упродовж року можливе без значних втрат 1хньо1 життездaтностi i фiзiологiчноi актив-ностi за умови дотримання вщповщних пара-мeтpiв висушування в пpоцeсi лiофiлiзaцii.

Л1ТЕРАТУРА

1. Мацкевич Н. В. Спонтанная изменчивость и кариология несовершенных грибов. — М.: Наука, 1981. — 184 с.

2. Филиппова С. М., Кузнецов В. Ю., Бадяутди-нов Д. Н. и др. Изучение внутрипопуляционных спонтанных морфологических вариантов Streptomyces oligocarbophilus ISP5589 // Микробиология. — 1999. — Т. 68, № 3. — С. 375-382.

3. Ганбаров Х. Г., Абдулгамидова С. М. Изучение внутрипопуляционных морфо-культу-ральных изменений дрожжевых грибов, хранившихся в коллекции культур // Вестн. Бакин. гос. ун-та, сер. биол. наук. — 2007. — № 1. — С. 42-46.

4. КуплетскаяМ. Б., Аркадьева З. А Методы длительного хранения коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ // Микробиология. — 1997. — Т. 66, № 2. — С. 283-288.

5. Стоянова Л. Г., Аркадьева З. А Сравнения способов хранения молочнокислых бактерий // Там же. — 2000. — Т. 69, № 1. — С. 98-104.

6. Fermandez-Segovia I., Escriche A., Fuentes A., Serra I. A. Microbial and sensory changes during refrigerated storage of desalted cod (Gadus morhua) preserved by combined methods // Int. J. Food Microbiol. — 2007. — V. 116, Is. 1. — P. 64-72.

7. Михайлова Р. В., Семашко Т. В., Лобанок А Т., Осока О. М. Спонтанная изменчивость Penicillium feniculosum — продуцента глюкозо-оксидазы // Микол. фитопатол. — 2001. — Т. 35, Вып. 3. — С. 73-79.

8. Абдулгамидова С. М., Ганбаров Х. Г. Выживаемость дрожжевых культур при хранении в коллекции на сусло-агаре // Сб. научн. тр. Ин-та микробиол. НАН Азербайджана. — Баку, 2007. — Т. 4. — С. 34-39.

9. Абдулгамидова С. М. Сравнительная эффективность различных методов длительного хранения дрожжей //В^н. Харшв. нац. ун-ту iM. В. Н. Каразина. Сер.: бюл. — 2008. — Вип. 8, № 828. — С. 132-136.

10. Бланков Б. И., Клебанов Д. Л. Применение лиофилизации в микробиологии. — М.: Изд-во мед. лит-ры, 1961. — 263 с.

11. Бабьева И. В., Голубева В. И. Методы выделения и идентификации дрожжей. — М., 1979. — С. 120.

12. Луста К. А., Фихте Б. А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов / Ред. В. К. Ерошин. — Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1990. — С. 186.

13. Лакин Г. Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1990. — 300 с.

14. Осадчая А. И., Кудрявцев В. А., Софроно-ва Л. А. Влияние некоторых факторов на криорезистентность и сохранение жизнеспособности при лиофилизации культур Bacillus subtilis // Биотехнология. — 2002. — Т.3. — С. 45-54.

15. Квасников Е. И., Щелокова И. Ф. Дрожжи. Биология. Пути использования / Отв. ред. Смирнов В.В.; АН УССР. Ин-т микробиол. вирусол. им. Д. К. Заболотного. — К.: Наук. думка. — 1991. — 328 с.

16. Данилова М. В., Надирова И. М, Кудрявцев В. И. Лиофилизация бактерий / Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. — М.: Наука. — 1967. — С. 131.

17. Похилено В. Д., Баранов А М, Детушев К. В. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития // Изв. высш. уч. зав. По-волж. рег. — 2009. — № 4. — С. 99-121.

ВЛИЯНИЕ ЛИОФИЛИЗАЦИИ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ Pichia anómala

С. М. Шульга Е. А. Тигунова А. Ф. Ткаченко

Н. Е. Бейко А. И. Хоменко

ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики» НАН Украины, Киев

E-mail: [email protected]

Сохранение микроорганизмов в коллекциях чистых культур является актуальной проблемой. Существует много методов сохранения бактерий, но ни один из них не дает 100%-й защиты от мутаций, изменений свойств микроорганизмов или их гибели. На жизнеспособность микроорганизмов при лиофилизации влияет ряд факторов: условия культивирования (рН и температура), возраст культуры, концентрация клеток, состав защитной среды и метаболическая активность. Оптимизация этих процессов позволяет сохранить до 80-90% жизнеспособных клеток. Для исследуемой культуры РЬсЫа аиотаЬа определены условия культивирования, фаза роста культуры, при которой дрожжи проявляют наибольшую устойчивость к неблагоприятным условиям процесса лиофилизации. Оптимизирован состав защитной среды, что позволило получить после процесса лиофилизации максимальное (до 95,5%) сохранение жизнеспособных клеток. Высокий уровень жизнеспособных клеток после замораживания отмечен в дрожжевой суспензии с 36 до 48 ч роста. Определены оптимальная температура и срок сохранения лиофилизованных дрожжей с максимальным количеством жизнеспособных клеток.

Ключевые слова: дрожжи РЬсЫа апота1а, лио-филизация, защитная среда, жизнеспособность клеток.

LYOPHILIZATION EFFECT ON Pichia anomala YEASTS VIABILITY

S. M. Shulga O. O. Tigunova A. F. Tkachenko

N. E. Beyko A I. Khomenko

State organization «Institute of Food Biotechnology and Genomics» of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

E-mail: [email protected]

Saving microorganisms in clean culture collections is an actual problem. There is a lot of methods to save bacteria, but none of them give 100% protection from mutation, changing microorganism properties or their death. A lot of factors influence on microorganism survival: cultivation factors (pH and temperature), culture age, cell concentration, protection medium consistency and metabolic activity. Optimization of this process enables to have about 80-90% survival cells. Cultivation factors, culture grown phase for the investigated Pichia anomala culture, were determined, in which yeasts showed the most stability for unfavorable conditions of lyophilization process. Composition of the protective environment were optimized that enabled us to obtain maximum (up to 95.5%) saving of the viable cells after the lyophilization process. High level of the viable cells was observed after freezing in the yeast suspension from 36 to 48 hours of growth. The optimum temperature and time saving of lyophilized yeast with the highest number of the viable cells were determined.

Key words: Pichia anomala yeasts, liophiliza-tion, protective environment, cell viability.

УДК 581.143.6

СОДЕРЖАНИЕ СВОБОДНОГО ПРОЛИНА КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ Nicotiana tabacum L.

ПРИ СТРЕССЕ

Л. Е. Сергеева

Л. И. Бронникова Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев

Е. Н. Тищенко

E-mail: [email protected]

Проблема стрессоустойчивости растений — одна из наиболее фундаментальных и является предметом исследований на всех иерархических уровнях. В настоящее время она стала еще более актуальной из-за обеднения дикой и культивируемой флоры, вызванного нарушениями (нередко необратимыми) окружающей среды и климатических условий.

Получены Cd-резистентные клеточные линии табака (Nicotiana tabacum L .), обладающие комплексной устойчивостью к разным типам засоления и водному дефициту. Из них выделены варианты (С. №1 и С. №6), растущие на средах, которые содержат троекратно-летальную дозу ионов кадмия. Клеточные линии продолжали расти в условиях действия летальных доз ионов кадмия, солей морской воды, сульфата натрия, маннита. При этом относительный прирост биомассы каллуса был наивысшим на среде с ионами Cd2+ и превышал этот показатель в нормальных условиях. Изучали содержание свободного пролина в клетках в период их активного развития. Уровень свободного пролина у клеточной линии С. №1 при культивировании на всех селективных средах превышал контрольные показатели. У линии С. №6 при выращивании на среде с добавлением Na2SO4 уровень пролина был ниже контрольных данных. Максимальное содержание пролина в клетках обеих линий зафиксировано при выращивании на среде с маннитом. Колебания содержания пролина могут быть показателем жизнедеятельности организма в стрессовых условиях. Высказывается предположение о различных механизмах процесса адаптации Cd-устойчивых линий табака к засолению, что может быть обусловлено эпигенетическими изменениями.

Ключевые слова: N. tabacum L., клеточные линии, ионы кадмия, осмотический стресс, устойчивость.

Проблема стрессоустойчивости растений — одна из наиболее фундаментальных и является предметом исследований на всех иерархических уровнях. В настоящее время она стала еще более актуальной из-за обеднения дикой и культивируемой флоры, вызванного нарушениями (нередко необратимыми) окружающей среды и климатических условий. Возникает потребность в растениях, способных не только выдерживать неблагоприятные условия, но и активно им противостоять, т. е. функционировать при стрессе. Очевидно, мониторинг таких феноменов в природных ценозах, а особенно их идентификация среди полученных в результате разнообразных биотехнологических экспериментов генотипов, должны базироваться на гарантированных маркерах устойчивости.

Одним из таких показателей может быть содержание свободного пролина. Установле-

на положительная корреляция между содержанием свободного пролина и солеустойчи-востью генотипов и гибридов тыквы [1, 2]. Некоторые авторы даже настаивают на стимулирующем действии NaCl на продуцирование глутамата для последующего синтеза пролина [3]. Аналогичное явление прослеживается и при изучении клеточных культур in vitro [4]. Отмечено возрастание уровня пролина, связанное с устойчивостью к водному стрессу [5]. В ряде публикаций показана зависимость содержания свободного про-лина от действия тяжелых металлов. Так, способность хрустальной травки расти в водной культуре при высоких концентрациях ионов меди или цинка сопровождалась накоплением пролина [6]. Устойчивость к ионам никеля и кадмия также связывают с накоплением пролина [7, 8]. Следует, однако, отметить, что в указанных экспериментах

количество используемых стрессоров, во-первых, не достигало летальных пределов, во-вторых, не была исследована динамика колебаний содержания пролина, что, по нашему мнению, не позволяет установить происхождение данного соединения, а это особенно важно, учитывая фиксированное (во всех публикациях) снижение биомассы тестируемых объектов. В предыдущих публикациях мы сообщали о получении клеточных линий табака, устойчивых к летальным концентрациям ионов Сё2+ [9, 10]. Эти линии также росли и пролиферировали при добавлении в культуральные среды летальных доз солей морской воды, сульфата натрия (20 г/л) или маннита (145 г/л). Такие комплексно устойчивые феномены выделены впервые, более того, из них получены фер-тильные растения, в которых сохраняется перекрестная устойчивость к различным типам засоления и водному дефициту.

Ранее нами было установлено, что комплексная устойчивость клеточных линий табака к различным типам осмотического стресса сопряжена со значительным повышением содержания пролина. При этом имела значение только сила, но не тип стресса [11]. Поэтому представлялось логичным изучить роль пролина у Сё-устойчивых клеточных линий при культивировании на различном стрессовом фоне.

Материалы и методы

Устойчивые клеточные линии табака (ШсоЫапа tabacum L.) сорта Самсун отбирали на селективных средах, содержащих 50 мкМ ионов Сё2+ (летальная концентрация для клеточных культур табака дикого типа). За время пассирования (более 6 мес) отобранные клоны не только не снижали темп роста, но среди них были выделены варианты (С. №1 и С. №6) с повышенным уровнем устойчивости, растущие в присутствии 150 мкМ данных ионов. Эти клеточные линии переносили на селективные среды, содержащие 20 г/л солей морской воды или сульфата натрия либо 0,8М (145 г/л) маннита. На селективных и контрольной средах устойчивые клеточные линии культивировали при постоянной перемене типа стрессового давления. При этом чередования: стресс А — стресс В, стресс А — контроль, контроль — стресс В всегда было произвольным во избежание адаптации.

Определение свободного пролина производили по модифицированной методике Чи-нарда [12]. Навеску каллусной ткани расти-

рали в 10 мл 3,0%-го раствора сульфосали-циловой кислоты для осаждения протеинов. Гомогенат фильтровали. К 2,0 мл фильтрата приливали 2,0 мл нингидринового реактива, приготовленного без нагревания (1,25 г нингидрина, 30 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл 6 М раствора Н3РО4), и 2,0 мл ледяной уксусной кислоты. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч на водяной бане при 100 °С, после чего быстро охлаждали до комнатной температуры, переносили в делительную воронку с 4,0 мл толуола и встряхивали. Верхний окрашенный слой (хромофор) колориметрировали против толуола при длине волны X = 520 нм. Концентрацию пролина (Х) рассчитывали по формуле:

Х = а • с • V -100 / а1 <

н • 1000,

где а — экстинкция опытного раствора; а1 — экстинкция стандарта; с — концентрация стандарта (мкг); V — разведение (10 мл); н — навеска; V1 — объем, взятый для цветной реакции (2 мл); 100 — расчет в %; 1 000 — перевод мкг в мг. Стандартную кривую строили по кристаллическому пролину.

Поскольку содержание свободного про-лина существенно варьирует в течение суток и зависит от возраста культуры, отбор проб для анализа производили от 8 до 9 ч утра (время максимального синтеза). Уровень аминокислоты определяли на 14- и 21-й дни пассажа; ранее было отмечено, что максимальные абсолютные величины параметра приходятся именно на этот срок [11].

Эффективность — относительный прирост биомассы (Дш), который определяли:

Дш = (шк — ши)/ши,

где ши, шк — масса каллуса в начале и конце пассажа соответственно.

Измерения проводили в троекратной биологической и двукратной аналитической пов-торностях и статистически обрабатывали.

Результаты и обсуждение

Уровень свободного пролина — динамический параметр, изменяющийся даже в нормальных условиях. Ранее нами был исследован характер флуктуаций в течение пассажа в норме и при стрессе у устойчивых и неустойчивых культур [11, 13]. Установлено, что абсолютная величина данного параметра как таковая, вне привязки к конкретному функциональному состоянию клетки, неинформативна. Содержание про-лина в культивируемом каллусе определяли

на 14- и 21-й дни пассажа. Известно, что с 7-го по 14-й день культура клеток проходит стадию логарифмического роста. Это период максимального клеточного деления, следовательно, и максимального использования аминокислот, в том числе пролина, для синтеза протеиновых компартментов. С 14-го дня культура вступает в стадию стационарного роста, которая длится до 21-го дня. Далее начинается старение культуры, ускоряющееся пропорционально исчерпанию ресурсов. Поэтому измерение пролина на 14- и 21-й дни пассажа, по нашему мнению, наиболее адекватно отражает состояние культивируемых клеток в период максимальной физиологической активности.

На диаграммах, представленных на рис. 1, отображено содержание свободного пролина у различных растущих клеточных культур табака, культивируемых в нормальных условиях и на различных селективных средах, а также относительный прирост их биомассы, измеренный в конце пассажа.

Из диаграмм следует, что при культивировании в нормальных условиях (рис. 1, а) содержание свободного пролина в клетках невысокое; существенного различия между культурами дикого типа (контроль) и Сё-ус-тойчивыми вариантами не наблюдалось. Рост клеточных культур в норме аналогичен.

При перенесении устойчивых клеточных линий в селективные условия уровень про-лина (относительно параметра, измеренного в нормальных условиях) возрастал. На первый план выступает реакция взаимодействия генотип/среда ^/Е).

Селективная среда с ионами кадмия (рис. 1, б). Эта среда содержала 150 мкМ ионов Сё2+. Такая концентрация троекратно превосходила летальную дозу, при которой проводили селекцию на устойчивость. Однако исследовавшиеся клеточные линии табака не только продолжали расти в таких жестких условиях, но и отличались максимальным показателем относительного прироста биомассы, превосходившим даже показатель, зафиксированный при выращивании Сё-устойчивых вариантов на контрольной среде. Уровень свободного пролина превышал контрольные значения в 1,6-1,9 раза на 14-й день и более чем в 3 раза — на 21-й день. Столь существенное увеличение содержания аминокислоты в одно и то же время не следует, по нашему мнению, считать следствием стрессовых реакций, учитывая активный рост каллуса. Более вероятна происходившая в клетках под действием ионов

кадмия стимуляция активности ряда энзимов синтеза пролина по глутаматному пути

[14]. Образовавшийся пролин в период активного клеточного деления, вероятно, используется для синтеза протеинов. В пользу такого предположения свидетельствуют данные об увеличении общего числа рибосом и содержании полисом после обработки прорастающих семян гороха ионами кадмия

[15]. Вместе с тем имеются данные, указывающие на угнетение роста и снижение уровня пролина пропорционально увеличению концентрации ионов кадмия [16]. Однако в этих случаях были использованы не летальные дозы ионов. Далее с прекращением деления и переходом клеток в стадию стационарного роста (14-21-й дни пассажа) пул пролина возрастал. Генотипических различий в реакции между устойчивыми клеточными линиями не отмечалось.

Селективные среды с солями морской воды и сульфатом натрия (рис. 1, в, г). Устойчивые к ионам кадмия клеточные линии табака росли в присутствии летальных концентраций солей морской воды и Ыа2804 (модели сульфатно-хлоридного и сульфатного засолений). Относительный прирост биомассы каллуса, культивированного при засолении, существенно уступал этому показателю, измеренному у линий, помещенных на среды с ионами кадмия. По темпу роста при засолении устойчивые линии С. №1 и С. №6 отличались незначительно. В то же время содержание свободного пролина указывало на различия в реакции взаимодействия G/E. У линии С. №1 уровень свободного пролина в клетках был аналогичным при культивировании на солевом фоне и в присутствии ионов кадмия (рис. 1, б, в, г). В условиях засоления стабильность содержания пролина в пассаже сохранялась. У линии С. №6, помещенной на засоление, уровень пролина в клетках был более динамичным. Очевидно, Сё-устойчивые линии С. №1 и С. №6 по-разному адаптируются к засолению. Линию С. №1 можно со значительной степенью вероятности отнести к условной категории «пролинпротекторных», т. е. таких, у которых накопление пролина при засолении является основным показателем со-леустойчивости. На эту характеристику, особенно сочетающуюся (как в настоящем эксперименте) со снижением относительного прироста биомассы, указывают и другие источники [11, 17]. Учитывая полифункциональную роль пролина при стрессе, в данном случае его можно рассматривать как осморегулирующее соединение [18]. В вакуолях

Na2SO4

18 т= 16 - рвлинмг^Уг н у

1 1 1 1 1 1 1 1 4 14 день Н1 21 Д| энь П контроль ■ 5_№1 □ 8.1*6

про пи сью 01- мг%;г массы морская соль

го

т —I-

14 день 21 день

ЙИт

■ в.№1 □ 8.№6

I

д

морская соль

Na2SO4

д

Рис. 1. Влияние условий культивирования на содержание свободного пролина и рост биомассы (Дm)

клеточных линий табака №1 и №6:

а — нормальные условия;

б — селективная среда, содержащая 150 мкМ С^+; в — селективная среда, содержащая 2,0% солей морской воды; г — селективная среда, содержащая 2,0% №^04; д — селективная среда, содержащая 0,8 М маннита

а

а

б

б

в

в

г

г

маннит

клеток при засолении накапливается значительное количество ионов Na+, что направлено на защиту компартментов цитоплазмы. В наших экспериментах этот факт также был установлен. Для стабилизации осмотического потенциала в цитоплазме клеток увеличивается уровень пролина [11]. При этом реакция клеток на засоления различного типа единообразна, что можно рассматривать как аргумент осморегулирующей составляющей пролина.

Cd-устойчивая клеточная линия табака С. №6 реагирует на засоление по-иному. Если при выращивании клеток на среде с солями морской воды содержание пролина в них незначительно отличается от контрольных показателей, то при культивировании в условиях сульфатного засоления оно ниже (рис. 1, в, г). Это может свидетельствовать о минорной роли пролина в солеустойчивости линии. Очевидно, в клетках задействованы другие протекторные соединения, в частности биогенные амины. Ранее было установлено, что ионы кадмия могут стимулировать синтез полиаминов: путресцина, спермина, спермидина [15]. Эти соединения существенно повышают солеустойчивость растений [19, 20]. С другой стороны, они же могут ин-гибировать синтез пролина [20]. В связи с этим предполагается наличие различных способов процесса адаптации Cd-устойчивых линий табака к засолению, что может быть отражением эпигенетических изменений.

Селективная среда с маннитом (рис. 1, д). Селективную среду, содержащую маннит, используют для моделирования водного стресса in vitro. Cd-устойчивые клеточные линии табака стабильно росли на селективной среде, содержащей летальную для контроля концентрацию соединения, однако Дт в этих условиях был наименьшим. Снижение биомассы, отмечавшееся и ранее, характерно для высокоустойчивых клеточных линий [11, 17]. Такие клетки отличаются измененной морфологией: вместо цилиндрической клетка приобретает сферическую форму, вследствие чего снижается объем клетки. Такая обратимая адаптивная реакция способствует поддержанию осмотического баланса при стрессе [17]. Аналогичный феномен роста наблюдали у устойчивого к 20,0%-му ПЭГ-10 000 средиземноморского галофита Atriplex halimus L. в присутствии 100 мкМ CdCl2 [21]. В то же время уровень свободного пролина в клетках в этом варианте опыта был наивысшим (рис. 1, д). Очевидно, в этом случае пролин выступает

как водоудерживающая молекула [18]. Поэтому вполне объяснимо, что на 14-й день отмечали максимальное значение показателя: для делящихся клеток особенно необходимо поддержание их водного баланса. По абсолютной величине содержание свободного пролина в клетках тестированных линий существенно различалось, однако сходная динамика его изменений в пределах пассажа может свидетельствовать о реализации одних механизмов устойчивости.

В последнее время изучению роли проли-на в растениях придают особое значение [20-22]. Собственная метаболическая система этой аминокислоты отличается специфическими особенностями, позволяющими рассматривать пролин как «стрессовый субстрат», в частности: 1) участием пролина при передаче стрессовых сигналов; 2) значительным доступным пулом свободного про-лина; 3) реализацией специфических стрессовых функций в процессе метаболизма пролина [23]. В ряде случаев пролин рассматривается как облигатный источник углерода для цикла трикарбоновых кислот [24]. В нашем эксперименте Сё-устойчивые линии росли на всех селективных средах (рис. 2). При этом содержание свободного пролина, его аккумуляция/расходование соответствовало функциональному состоянию клеток: делению/ растяжению.

Методом клеточной селекции неоднократно отбирали линии с комплексной устойчивостью к различным осмотическим стрессам. Однако летальные дозы ионов тяжелых металлов для этой цели использовали в единичных случаях [13]. Преимущество настоящего метода состоит в том, что в результате создаются предпосылки для гарантированного отбора вариантов, адаптирующихся к действию конкретного стрессора, т. е. отличающиеся физиологической устойчивостью, показателем которой может быть содержание свободного пролина в динамике.

Таким образом, в результате проведенной работы установлено, что клеточные линии табака, отобранные на селективных средах, содержащих летальные дозы ионов кадмия, характеризуются устойчивостью к солевому стрессу; содержание свободного пролина может служить показателем адаптации к конкретному типу засоления: хлоридно-му, сульфатно-хлоридному; колебания этого показателя могут свидетельствовать об адаптации организма в условиях стресса.

Рис. 2. Культивирование клеточных культур табака in vitro:

А — устойчивая линия №1; Б — контроль, дикий тип; а — нормальные условия;

б — селективная среда, содержащая 150 мкМ Cd2+; в — селективная среда, содержащая 2,0% солей морской воды; г — селективная среда, содержащая 2,0% Na2SO4; д — селективная среда, содержащая 0,8 М маннита

ЛИТЕРАТУРА

1. Zhou J.-G., Zhu Y.-I., Liu G.-W et al. Физиологическая и биохимическая характеристики гибрида Cucurbita moschata при NaCl-стрессе взрослых растений // Xibei zhiwu xuebao — Acta Bot. Boreali Occid. Sin. — 2007. — V. 27, N 10. — P. 2052-2058.

2. Wang R., ChenG.-L., Song W. et al. Влияние NaCl-стресса на содержание катионов у растений двух разновидностей тыквы // Zhiwu shengli yu fenzish. Xuebao — J. Plant. Phys. Mol. Biol. — 2006. — V. 32, N 1. — P. 94-98.

3. Skopelitis D. S., Paranychianakis N. V., Pascha-lidis K. A. et al. Abiotic stress generates ROS that signal expression of anionic glutamate dehydrogenases to form glutamate for proline synthesis in tobacco and grapevine // Plant Cell. — 2006. — V. 18, N 10. — P. 2767-2781.

4. Sumithra K., Jutur P. P., Dalton C. B., Reddi A. R. Salinity induced changes in two cultivars of Vigna radiata: Responses of antioxidative and proline metabolism // Plant Growth Reg. — 2006. — V. 50, N 1. — P. 11-22.

5. Zhang M.-S., Tan F., Zhang Q.-T., Yang Y.-H. Physiological indices and selection of methods on rapid identification for sweet potato drought resistance // Agric. Sci. China. — 2005. — V. 4, N 1. — P. 826-832.

6. Холодова В. П., Волков К. С., Кузнецов В. В. Адаптация к высоким концентрациям солей меди и цинка растений хрустальной травки и возможность их использования в целях фиторемедиации // Физиол. раст. — 2005. — Т. 52, № 6. — С. 848-858.

7. Tandon P. K., Srivastava M. Effect of cadmium and nickel on metabolism during early stages of growth in gram (Cicer arietinum L.) seeds // Ind. J. Agr. Biochem. — 2004. — V. 17, N 1. — P. 31-34.

8. Qin G.-Q., Yan C. L., Wei L. L. Влияние кадмиевого стресса на содержание таннина в проростках Vandelia candel // Shengtai xuebao — Acta Ecol. Sin. — 2006. — V. 26, N 10.— P. 3366-3371.

9. Sergeeva L. E., Poretskaya E. I. Cell selection: from cells heavy metal resistance to plant resistance to osmotic stresses «Plant Abiotic Stress tolerance» Int. Conf. February, 8-11 2009, Vienna, Austria, Proc. Doc., Vienna: 2009. — P. 161.

10. Патент на корисну модель 27918 Украша А01Н/04. Споиб одержання стшких до ос-мотичного стресу клггинних лшш рослин методами клггинно! селекци / Л. G. Сергеева, С. I. Михальська, О. М. Тищенко. — Заявл. 25.04.2007; опубл. 26.11.2007, бюл. №19.

11. Сергеева Л. Е. Изменения культуры клеток под действием стресса. — К.: Логос, 2001. — 100 с.

12. Андрющенко В. К., Саянова В. В., Жучен-ко А. А. и др. Модификация метода опреде-

ления пролина для выявления засухоустойчивых форм Lycopersicon Tourn // Изв. АН МССР. — 1981. — № 4. — С. 55-60.

13. Сергеева Л. Е., Михальская С. И., Порецкая Е. И. Роль свободного пролина в поддержании солеустойчивости клеточных линий табака и сои, отобранных на селективных средах с ионами бария // Физ. биохим. культ. раст. — 2008. — T. 40, № 6. — С. 532-535.

14. Pavlikova D., Pavlik K. M., Staszkova L. et al. The effect of potentially toxic elements and sewage sludge on the activity of regulatory enzyme glutamate kinase // Plant Soil Envir. — 2007. — V. 53, N 5. — P. 201-206.

15. Мельничук Ю. П. Влияние ионов кадмия на клеточное деление и рост растений. — К.: Наук. думка, 1990. — 148 с.

16. Shekhawat G. S., Verma K., Jana S. et al. In vitro biochemical evaluation of cadmium tolerance mechanism in callus and seedlings of Brassica juncea // Protoplasma. — 2010. — V. 239. — P. 31-38.

17. Niu X., Bressan R. A., Pardo J. M. Ion homeo-stasis in NaCl stressed environments // Plant. Physiol. — 1995. — V. 109, N 3. — Р. 735-742.

18. Кузнецов В. В., Шевякова Н. И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиол. раст. — 1999. — Т. 46, № 2. — С. 305-320.

19. Chen X.-Q., Yu B.-J., Liu Y.-L. Взаимосвязь выносливости к хлоридам и накопления полиаминов у Glycine max, Glycine soja и их гибридных проростков // Zhiwu shengli yu fenzish.- J. Plant Phys. Mol. Biol. — 2007. — V. 33, N 1. — P. 46-52.

20. Sergiev I., Alexieva V., Yanov S., Karanov E. Effect of atrasine and spermine on free proline content and some antioxidants in pea (Pisum sativum L.) plants // Докл. Бълг. АН. — 2000. — V. 53, N 1. — Р. 63-66.

21. Lefevre I., Marshal G., Ghanem M. E. et al. Cadmium has contrasting on polyethylene glycol — sensitive and resistant cell lines in the Mediterranean halophyte species Atriplex halimus L. // J. Plant Physiol. — 2010. — V. 167, N 5. — P. 365-374.

22. Phang J. M,, Pandhare J,, Liu J. The metabolism of proline as microenvironmental stress structure // J. Nutrition Suppl. — 2008. — P. 166-172.

23. Kavi Kishor P. B., Sangam S., Amrutha R. N. et al. Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implication in plant growth and abiotic stress tolerance // Cur. Sci. — 2005. — V. 88, N 3. — P. 424-428.

24. Errabii T., Gandonou C. B., Essalmani H et al. Growth, proline and ion accumulation in sugarcane callus cultures under drought — induced osmotic stress and its subsequent relief // Afr. J. Biotechnol. — 2006. — V. 5, N 6. — P. 1488-1493.

ВМ1СТ В1ЛЬНОГО ПРОЛ1НУ ЯК ПОКАЗНИК ЖИТТСД1ЯЛЬНОСТ1

КЛ1ТИННО1 КУЛЬТУРИ Nicotiana tabacum L. П1Д ЧАС СТРЕСУ

Л. G. Сергеева Л. I. Бронткова О. М. Тищенко

1нститут фГзюлогй рослин i генетики НАН Укра1ни, Ки1в

E-mail: [email protected]

Проблема стресостiйкостi рослин — одна з найбГльш фундаментальних i е предметом дослiджень на Bcix iерархiчних рГвнях. На цей час вона стала ще актуальшшою через збщнен-ня дико1 i культивовано1 флори, спричиненого порушеннями (часто необоротними) навко-лишнього середовища i клiматичних умов.

Отримано Cd-резистентнi кл^инш лшп тютюну (Nicotiana tabacum L.), яким прита-манна комплексна стШшсть до рГзних тишв засолення та водного дефщиту. З них видГлено варiанти (С. № 1 та С. № 6), що ростуть на сере-довищах з дозою юшв кадмiю, яка втричГ пе-ревищуе летальну. КлГтинш лшп тдтримува-ли рГст в умовах дп летальних доз дешв кадмГю, солей морсько! води, сульфату натрГю, мангту. При цьому вщносний прирГст бюмаси калусу обох лшш був найвищим на середовишД з Гонами Cd2+ i перевищував цей показник за нор-мальних умов. Вивчали вмГст вГльного пролшу в клГтинах в перюд 1х активного розвитку. РГвень вГпьного пролшу в клГтиннш лшп — С. № 1 пщ час вирощування на селективних се-редовищах перевищував контрольш показни-ки. У лшп С. № 6 у разГ культивування на се-редовишД з додаванням Na2S04 рГвень пролшу був нижчий за контрольш дань Максималь-ний вмГст пролшу в клГтинах обох лшш за-фшсовано на середовишД з маштом. Коливан-ня рГвня пролшу можуть бути показником життездатносм оргашзму за стресових умов. Висловлюеться припущення про рГзш способи процесу адаптацп Cd-стшких лшш тютюну до засолення, що може бути зумовлено ешгене-тичними змшами.

Ключовi слова: N. tabacum L., клГтинш лшп, Гони кадмГю, осмотичний стрес, стшшсть.

THE FREE PROLINE CONTENT AS THE VIABILITY INDEX OF Nicotiana tabacum L. CELL CULTURE UNDER STRESS CONDITIONS

L. E. Sergeeva L. I. Bronnikova E. N. Tishchenko

Institute of Plant Physiology and Genetics of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

E-mail: [email protected]

Problem of plant resistance to stress is one of the most fundamental and is a scope of researches on all hierarchical levels. Currently, it has become more urgent due to the depletion of wild and cultivated flora caused by violations (often irreversible) of ambient and environmental conditions.

Cd-resistant cell lines of tobacco (Nicotiana tabacum L.) S. No. 1, and S. No. 6 were affected by cadmium ions, sea water salts, sodium sulfate and mannitol in lethal dozes. These lines went on growing under pressure of any stress substance. Relative mass growth of calli was the greatest during cultivation on selective media with the addition of Cd2+-ions and exceeded this parameter measured at normal conditions. Free proline contents was investigated in periods of cell active development. During cultivation on all the selective media, free proline levels of the cell lines S. No. 1 exceeded benchmarks. Proline level was smaller than test data when S. No. 6 lines were cultivated on medium containing Na2S04. Peaks of the free proline contents were in both cell lines during their development on mannitol-containing medium. Free proline content fluctuation could be an indicator of an organism vital factor under stress conditions. The concept about different adaptation of Cd-resistant lines of tobacco to salinity is suggested.

Key words: N. tabacum L., cell lines, cadmium ions, osmotic stress, resistance.

УДК 637.33

М1КРОБ1ОЛОГ1ЧН1 ПОКАЗНИКИ

РОСЛИННИХ ЕКСТРАКТ1В ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА МОРОЗИВА

Г. 6. Полщук

О. В. Гулак Нащональний ушверситет харчових технологш, Кт'в

А. В. Згурський М. М. Антонюк

E-mail: [email protected]

Першочерговим завданням молочно! промисловостi е виробництво яшсних i безпечних для здо-ров'я населення продуктiв. Незважаючи на стрiмкий розвиток вггчизняно! харчово! промисловосл та розширення асортименту молочних продуктав iз застосуванням харчових добавок, в шновацшних технологiях дедалi бiльше переважають поняття «збагачення» та «натуральшсть». Ця тенденщя зу-мовлюе зростання попиту на молочш продукти, збагаченi рослинними добавками.

У стати наведено результати мшробюлопчних дослщжень водних екстрактiв рослин, яш мiстять фенольнi сполуки й можуть бути використаш у виробнищв морозива. Виявлено ан-тимiкробну актившсть екстрактiв гiбiскусу, троянди, котовника та лаванди стосовно патогенних тест-культур. Антимшробну дт найбiльш ефективних екстрактiв троянди та пб^кусу можна пояс-нити бшьшою кiлькiстю фенольних сполук (0,149 та 0,140 мг/см3) порiвняно з екстрактами лаванди та котовника (0,085 i 0,132 мг/см3). Проведено перевiрку щодо вiдповiдностi мiкробiологiчних по-казнишв морозива молочного та молочно-овочевого з рослинними екстрактами вимогам ДСТУ. Доведено, що використання рослинних екстрактав полшшуе мшробюлопчш показники сумiшей та морозива рiзних видiв. Селектившсть антимiкробного впливу дослiджуваних екстрактiв щодо спороутворювальних мiкроорганiзмiв матиме практичне значення в технологи виготовлення морозива для суттевого полшшення його мшробюлопчних показнишв.

Ключовi слова: рослиннi екстракти, антимшробна активнiсть, виробництво морозива.

Першочерговим завданням молочно! промисловост1 е виробництво яшсних i безпечних для здоров'я населення продуктав.

Незважаючи на стр1мкий розвиток в1т-чизняно! харчово! промисловост1 та розширення асортименту молочних продуктав 1з застосуванням харчових добавок, в шновацшних технолопях дедал1 б1льше переважа-ють поняття «збагачення» та «натураль-шсть». Ця тенденщя зумовлюе зростання попиту на молочш продукти, збагачеш рослинними добавками. Адже натуральш шгред1енти м1стять б1олог1чно-активн1 речо-вини природного походження, виявляють технолопчну функц1ональн1сть i е визнани-ми м1кронутр1ентами. Саме до таких рецеп-турних складник1в можна вщнести рослинш екстракти [1, 2].

Найб1льш ориг1нальним за органолеп-тичними властивостями серед молочних де-серт1в е морозиво 1з застосуванням рослинних екстракт1в. Асортиментний ряд такого продукту на сьогодн досить обмежений,

осшльки для одержання водних витяжок застосовують лише чай чорний (ГОСТ 1937, ГОСТ 1938), чай зелений (ГОСТ 3716), ци-корш (ТУ У 22331884/006-2000) та каву на-туральну (ГОСТ 6805) в1дпов1дно до ТТ1 31748658-1-2007 до ДСТУ 4733:2007, 4734:2007, 4735:2007.

З огляду на це науковцями кафедри технологи молока та молочних продукйв Нащонального ушверситету харчових технологш було удосконалено технолопю виготовлення морозива 1з застосуванням рослинних екстрактав за рахунок використання принципово нових вид1в сировини — г1б1скусу, троянди, лаванди та котовника.

Для розроблення нових вид1в морозива на молочнш основ1 було обрано типов1 ре-цептури морозива молочного та морозива молочно-овочевого. Для морозива останньо-го виду як овочеву основу запропоновано гарбуз вщповщно до ДСТУ 3190-95 «Гарбузи продовольч1 св1ж1. Техн1чн1 умови». Техно-лог1чна та харчова сум1сшсть гарбуза

з молочною сировиною зумовлена достатньо низьким вмгстом органiчних кислот (рН 6,30-6,65), високим i рiзноманiтним вмiстом вггам^в (В1, В2, РР, С, К, Т, в-ка-ротин) та мшроелементав (Nа, К, Са, Мg, Р, F), наявнiсгю значно'1 кiлькосгi вуглеводiв (75-85%), пiдвищеною засвоюванiсгю каро-тиновдв у присугносгi жиру [3, 4].

Попередньо авторами було вивчено функщонально-технолойчш властивост рослинно'' сировини та оптимiзовано техно-логiчний процес отримання екстракйв, встановлено мiнiмально необхiдний вмiсг сухих екстрактивних речовин для забезпе-чення оригшальних смаку, аромату i кольо-ру готового продукту, розроблено рецептури нових видiв морозива пiдвищеноi бюлопч-но! цiнностi [5]. Однак, розробляючи та впроваджуючи новi технологii, особливу увагу слщ придiляти вивченню можливих шляхiв мiкробiологiчноi контамiнацii продукту протягом усього технолопчного циклу його виробництва.

Морозиво на молочнш основi е сприятли-вим середовищем для росту мiкроорганiзмiв у зв'язку з високою поживною цiннiстю ре-цептурних компонентiв, майже нейтраль-ним рН (~6,0-6,5) i тривалим збершанням (до 12 мiс.). Мiкрофлора морозива в шльшс-ному та яшсному вiдношеннi формуеться в процесi його виробництва. Пастеризащя — основний тепловий процес у технологи мо-розива, який застосовують для знищення сторонньо! мшрофлори в продуктi. Подаль-шi технологiчнi операцii (охолодження, ви-зрiвання сумiшi) можуть лише iнгiбувати рют залишковоi мiкрофлори. Проте слiд враховувати, що сумiшi для виробництва морозива можуть бути контамшоваш пiсля пастеризацп мiкробiологiчно забрудненими iнгредiентами, а також у разi недотримання санiтарних норм виробництва на подальших етапах технолопчного процесу. Це вкрай важливо у технологи м'якого морозива, осшльки в його виробництвi вiдсутнiй процес загартування, який може слугувати одним iз чиннишв пригнiчення розвитку або повного знищення залишково1 мiкрофлори [6].

Вторинне бактерiальне обсiменiння сумь шей для морозива ймовiрне пiсля !х пастеризацп тд час перекачування, охолодження, фрезерування, а активащя й розвиток мiкроорганiзмiв можливi у процей визрь вання сумiшей (до 24 год при 4±2 °С). Тому авторами було зроблено припущення щодо можливост пiдвищення мiкробiологiчноi чистоти морозива не лише пастеризащею, а й внесенням у харчовi системи природних

антимшробних, зокрема фенольних, сполук [7], що входять до складу рослинних екстрак-тав гiбiскусу, троянди, лаванди та котовника.

З метою з'ясування впливу фенольних сполук на життeдiяльнiсть окремих видiв мiкроорганiзмiв авторами було визначено антимшробш властивостi водних екстрактав лаванди, котовника, троянди та пбюкусу стосовно грампозитивних (Staphylococcus aureus) i грамнегативних (Escherichia coli) мiкроорганiзмiв та спорово'' культури (Bacillus subtilis). Зазначеш мiкроорганiзми не лише спричинюють псування харчових про-дуктав, а й зумовлюють виникнення шфек-цiйних захворювань i отруень у населення [8].

Матерiали i методи

Для проведення дослщжень було викорис-тано рослинну сировину: гiбiскус (ТУ У 15.830307990-002:2005 «Чай каркаде», «Чай i3 пелюсток судансько'' троянди»), троянду (ТУ У 00388079.004-2000 «Пелюстки троянди»), лаванду (ТУ У 15.8-30474971.002-2002 «Фгго-чай Лаванда»), котовник (ГСТУ 01.11-37512:2006 «Сировина котячо'' м'яти. Загальш технiчнi умови») та 1хш воднi екстракти.

Антимiкробну дiю екстрактав визначали методом дифузii в шДльне живильне середови-ще (м'ясопептонний агар). Антимшробну ак-тивнiсть екстрактiв виявляли за утворенням зон пригшчення росту внесених у живильне середовище тест-культур (Bacillus subtilis, Esherichia coli, Staphylococcus aureus) навкру-ги лунок з дослщжуваним матерiалом.

Мшробюлопчш показники морозива з рослинними екстрактами визначали тсля поверхневого вийвання розведеного зразка на агаризоваш живильнi середовища: м'ясопептонний агар (виявлення мезоф^ьних аеробних i факультативно-анаеробних мш-роорганiзмiв — МАФАнМ), сусло-агар (дрiж-джiв та грибiв), середовище № 10 (S. aureus) та ендосередовище (E. coli). Чашки з пойва-ми шкубували протягом 2-3 дiб за темпера-тури 37 °С для встановлення загально'' кiлькостi мiкроорганiзмiв (МАФАнМ), пато-генних мiкроорганiзмiв та бактерiй групи кишкових паличок (БГКП). Посiви на чашки iз середовищем сусло-агар для виявлення грибiв та дрiжджiв шкубували за температу-ри 28 °С протягом 5-7 дiб [6].

Вмют фенольних сполук в рослинних екстрактах оцiнювали фотокалориметричним методом з реактивом Фолша-Дешса [9]. Ста-тистичну обробку отриманих результатов проводили за допомогою стандартно' програми статистичного оброблення Microsoft Exsel [10].

Результати та обговорення

Результати проведених дослщжень наведено в табл. 1.

Таблиця 1. Антимжробна дiя рослинних екстрактав

Водний екстракт Зона пригшчення росту тест-культур, мм

Bacillus subtilis Esherichia coli Staphylococcus aureus

Троянди 60 8 18

Иб^кусу 12 0 2

Котовника 5 2 0

Лаванди 2 0 0

Найб^ьш виражений антимшробний ефект проiлюстровано на прикладi екстрак-ту ri6icKycy та троянди (рис. 1).

Результати дослщжень свщчать про ан-тимiкробну дiю рiзного ступеня стосовно ви-користовуваних тест-культур. Уй групи мiкроорганiзмiв виявилися високочутливи-ми до екстракту троянди. Антимшробну дiю

Рис. 1. Антимiкробна дiя екстракту троянди (А) та ri6icKycy (Б) вiдносно тест-культури Bacillus subtilis:

(стршками позначено зони пригшчення росту тест-культур)

екстракту пбюкусу виявлено щодо тест-культур Bacillus subtilis, S. aureus. Екстракт котовника пригшчував розвиток Bacillus subtilis та E. coli, а екстракт лаванди — лише Bacillus subtilis.

Цей ефект можна пояснити тим, що в до-слщжуваних екстрактах троянди та пбюку-су мютиться б^ьша шльшсть фенольних сполук (0,149 та 0,140 мг/см3) порiвняно з екстрактами лаванди та котовника (0,085 та 0,132 мг/см3).

Селектившсть антимшробного впливу дослщжуваних екстрактiв щодо спороутворю-вальних мiкроорганiзмiв матиме практичне значення в технологи виготовлення морозива для суттевого полшшення його мшробюлопч-них показнишв, оскiльки високий вмiст сухих речовин та вщносно невисока температура пастеризаци е причиною часткового збе-реження активностi мiкрофлори.

На наступному етат було дослiджено вплив рослинних екстрактав на мшробюлопч-нi показники сумшей для морозива упро-довж часу !х визрiвання. Згiдно з розроблени-ми рецептурами було отримано сумiшi для морозива молочного та молочно-овочевого з екстрактами пбюкусу, троянди, лаванди i котовника. Як контроль використовували молочну та молочно-гарбузову сумiшi для морозива без екстрактав. Пастеризованi, гомоге-нiзованi та охолоджеш зразки сумiшей визрь вали протягом 24 год при температурi 4±2 °С.

Загальну кiлькiсть колошеутворюваль-них одиниць мезофiльних аеробних i факуль-тативно-анаеробних мiкроорганiзмiв (КУО МАФАнМ) у сумiшах для морозива з екстрактами та контрольних зразшв визначали як для свiжоприготовлених сумшей, так i в про-цей !х визрiвання на 6-, 12- та 24-ту год [11].

Результати дослщжень для молочних сумiшей про^юстровано на рис. 2.

Виявлено, що в зразках молочних сумь шей з рослинними екстрактами кiлькiсть мiкроорганiзмiв зменшуеться на порядок пiсля 6 год визрiвання порiвняно з конт-рольним зразком. Найбiльша антимiкробна дiя характерна для екстрактiв троянди та пбюкусу. На 12-ту годину визрiвання вплив на залишкову мiкрофлору для цих систем був максимальний. Тривалють визрiвання бiльше 12 год для вйх зразкiв е недоцiль-ною. Таким чином, внесення вищезазначе-них рослинних екстрактав як рецептурних iнгредiентiв у сумiшi для морозива перед визрiванням дасть змогу не лише збагатити готовий продукт бюлопчно активними речовинами, а й покращити його мшробю-логiчнi показники.

Рис. 2. Змша загально'1 кiлькостi мiкроорганiзмiв у молочних сумiшах з екстрактами шд час 1'х визрiвання

Для розширення спектра застосування виявленого антимшробного ефекту авторами було поеднано найефективнiшi екстракти гiбiскусу та троянди з молочно-гарбузовою сумшшю. Така сумiш потребуе додатково1 ароматизацii та пiдвищення гостроти смаку, тому обраш екстракти можна застосовувати i як смако-ароматичнi добавки.

Вплив рослинних екстрактав на мшро-бiологiчнi показники молочно-овочевих сумiшей про^юстровано на рис. 3.

Рис. 3. Змша загально'1 кiлькостi мiкроорганiзмiв у молочно-овочевих сумшах з екстрактами шд час 1'х визрiвання

Вмiст мiкроорганiзмiв у молочно-овоче-вiй сумiшi без екстрактав бiльший в середньо-му на 30 % порiвняно з контрольним зраз-ком i майже в 3 рази перевищуе iншi зразки на 24-ту год визрiвання, що пiдтверджуе встановлений ранiше ефект на прикладi молочних сумшей. Зразки з овочевим компонентом, порiвняно з молочною сумiшшю, характеризуются бiльшим мiкробiологiчним обсiменiнням, що пояснюеться застосуван-

ням св1жо! овочево! сировини, яка в процес1 тдготовки безпосередньо контактуе з облад-нанням, пов1трям, руками роб1тник1в та iH.

З метою перевiрки впливу екстрактав на здатнiсть нових видiв морозива до збершання було дослiджено шльшсть КУО МАФАнМ в 1 г морозива молочного та молочно-овоче-вого протягом 12 мю зберiгання за темпера-тури -24 °С (табл. 2, 3).

Загальна тенденщя щодо змши мшробю-логiчних показникiв для молочних сумшей пiдтверджуеться i для молочно-овочевих.

Вмют БГКП, дрiжджiв, плiсняви у вйх зразках морозива пiд час збершання не перевищував нормативш показники за ДСТУ 4733:2007, 4734:2007, 4735:2007.

У вйх зразках протягом часу збершання виявлено зменшення КУО МАФАнМ як шд дiею антимшробних сполук, так i низьких температур.

Для зразшв з екстрактами троянди та пбюкусу на 4-й мю збершання мшроор-ганiзмiв не виявлено, а в контрольному та дослщжуваних зразках з екстрактами котовника i лаванди шльшсть мiкроорганiзмiв була на порядок б^ьшою. Отже, як для мо-розива молочного, так i для молочно-овоче-вого максимальну антимшробну дт вияв-ляють екстракти троянди та пбюкусу.

Таким чином, встановлено антимшробну дт рослинних екстрактiв стосовно викорис-товуваних тест-культур: усi групи мшроор-ганiзмiв виявилися високочутливими до екстракту троянди; антимшробну д^ екстракту пбюкусу виявлено щодо тест-культур Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus; екстракт котовника пригшчував розвиток Bacillus subtilis та Esherichia coli; екстракт лаванди — лише Bacillus subtilis.

Антимшробну даю найбшьш ефективних екстраклв троянди та пбюкусу можна поясни-ти бшьшою кiлькiстю фенольних сполук (0,149 та 0,140 мг/см3) порiвняно з екстрактами лаванди i котовника (0,085 та 0,132 мг/см3).

Селектившсть антимшробного впливу дослщжуваних екстрактав щодо спороутво-рювальних мiкроорганiзмiв матиме прак-тичне значення в технологи виготовлення морозива для суттевого полшшення його мшробюлопчних показнишв.

Тривалiсть визрiвання сумiшей б^ьше 12 год е недоцiльною, тому що сприятиме зниженню витрат холодонойя i скороченню виробничого циклу.

Виявлений антимiкробний ефект застосову-ваних екстрактiв е характерним для всiх дослъ джуваних сушшей морозива на молочнiй основi.

Таблиця 2. Мжробшлопчш показники морозива молочного на основi екстрактав (КУО МАФАнМ в 1 г)

Вид морозива Тривал^ть збер^ання

Св1жовиго-товлене 3 доби 7 д1б 1 м1сяць 2 м1сящ 4 м1сящ 6 8 10 12 м1сящв м1сящв м1сящв м1сящв

Контроль(морозиво молочне) 2-104 4-103 1,5103 2-102 102 10 Не виявлено

Морозиво молочне з екстрактом троянди 2-104 1,5103 5102 102 10 Не виявлено

Морозиво молочне з екстрактом г151скусу 2-104 2-103 5102 102 10 Не виявлено

Морозиво молочне з екстрактом котовника 2-104 2,5-103 5102 1,5102 10 10 Не виявлено

Морозиво молочне з екстрактом лаванди 2-104 3103 6102 1,5102 10 10 Не виявлено

Таблиця 3. Мжробшлопчш показники морозива молочно-овочевого (КУО МАФАнМ в 1 г)

Вид морозива Тривал^ть зберiгання

Св1жовиго-товлене 3 доби 7 д1б 1 м1сяць 2 м1сяц1 4 м1сяц1 6 м1сящв 8 м1сящв 10 12 м1сящв м1сяц1в

Контроль (морози-во молочне) 2-104 4-103 1,5103 2-102 102 10 Не виявлено

Морозиво молочно-гарбузове 3104 2-104 1104 5103 2-103 1103 102 10 Не виявлено

Морозиво молочно-гарбузове з екстрактом троянди 3104 1104 1,5103 2-102 10 Не виявлено

Морозиво молочно-гарбузове з екстрактом г1б1скусу 3104 1,5-10" 2,5-103 5102 1,5102 210 Не виявлено

Л1ТЕРАТУРА

1. Росляков Н. В. Мировые тенденции на рынке ингредиентов: основной приоритет — здоровое питание // Мол. пром. — 2007. — № 10. — С. 24.

2. Гаврилова Н. Б., Пасько О. В., Каня И. П. и др. Научные и практические аспекты технологии производства молочно-растительных продуктов. — Омск: Изд-во Ом-ГАУ, 2006. — 336 с.

3. Корячкина С. Я. Новые виды мучных и кондитерских изделий. Научные основы. Технологии. Рецептуры. — Орел: Изд-во «Труд», 2006. — 480 с.

4. СЬмахЬна Г. О. Функщональна роль кароти-ноЩв та особливоста 1х використання у хар-чових технолопях // Наук. пращ НУХТ. — 2010. — № 33. — С. 45-48.

5. ПолЬщук Г. £., Гулак О. В., Вовкодав Н. I. та 1н. ОбГрунтування технолопчних режимiв одержання рослинних екстрактав для 1х зас-

тосування у виробнищв морозива // Там само. — 2010. — № 33. — С. 20-23.

6. Фостер Э. М., Нельсон Ф. Ю. Микробиология молока. — М.: Пищепромиздат, 1961. — 534 с.

7. Толкунова Н. Н., Чуева Е. Н., Бидюк А. Я. Влияние лекарственных растений на развитие микроорганизмов // Пищ. пром. — 2002. — № 8. — С. 70-71

8. НЬстратенко Т.1., БЬлко Т.М., Благодаро-ва О. В., ЦипрЬян В. I. ГШена харчування з основами нутрищологп. Шдручник: — Кн. 1. — К.: Медицина, 2007. — 528 с.

9. Запрометов М. Н. Основы биохимии фено-льных соединений. — М.: Высш. школа, 1974. — 213 с.

10. Орвис В. EXCEL для ученых, инженеров и студентов / Орвис В. — К.: Юниор, 1999. — 528 с.

11. Банникова Л. А., Королева Н. С., Семенихи-на В. Ф. Микробиологические основы молочного производства: Справочник / Под ред. канд. техн. наук Я. И. Костина. — М.: Агропромиздат, 1987. — 400 с.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА МОРОЖЕНОГО

Г. Е. Полищук

Е. В.Гулак А. В. Згурский М. Н. Антонюк

Национальный университет пищевых технологий, Киев

E-mail: [email protected]

Первоочередным заданием молочной промышленности является производство качественных и безопасных для здоровья населения продуктов. Несмотря на стремительное развитие отечественной пищевой промышленности и расширение ассортимента молочных продуктов с применением пищевых добавок, в инновационных технологиях все более преобладают понятия «обогащение» и «натуральность». Эта тенденция предопределяет рост спроса на молочные продукты, обогащенные растительными добавками.

В статье представлены результаты микробиологических исследований водных экстрактов растений, которые содержат фенольные соединения и могут быть использованы при производстве мороженого. Установлена антимикробная активность экстрактов гибискуса, розы, котовника и лаванды по отношению к патогенным тест-культурам. Антимикробное действие наиболее эффективных экстрактов розы и гибискуса можно объяснить большим количеством фенольных соединений (0,149 и 0,140 мг/см3) по сравнению с экстрактами лаванды и котовника (0,085 и 0,132 мг/см3). Проведена проверка на соответствие микробиологических показателей требованиям ГОСТ на мороженое молочное и молочно-овощное с растительными экстрактами. Доказано, что использование растительных экстрактов улучшает микробиологические показатели смесей и мороженого различных видов. Селективность антимикробного влияния исследуемых экстрактов относительно спорообразующих микроорганизмов будет иметь практическое значение в технологии изготовления мороженого для существенного улучшения его микробиологических показателей.

Ключевые слова: растительные экстракты, антимикробная активность, производство мороженого.

MICROBIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF PLANT EXTRACTS FOR ICE CREAM PRODUCTION

G. E. Polischuk

O. V. Gulak A. V. Zgurskiy M. M. Antonyuk

National University of Food Technologies, Kiyv

E-mail: [email protected]

A primary task of dairy industry is the production of qualitative and safe-health level products for population. Despite rapid development of the domestic food industry and diversification of dairy products with nutrient additives, the concepts of «enrichment» and «natural» are increasingly dominating in innovative technologies. This tendency predetermines demand growth for dairy products enriched with vegetable additives.

The microbiological studying results of plant aqueous extracts that contain phenol compounds and could be used in the ice cream production are given in the article. Antimicrobial activity of the extracts of hibiscus, roses, nepeta and lavender were found in relation to pathogenic test cultures. The antimicrobial action of the most effective extracts of rose and hibiscus could be attributed to the large amount of phenolic compounds (0.149 and 0.140 mg/cm3) compared to extracts of lavender and nepeta (0.085 and 0.132 mg/cm3). It is proved that herbal extracts improve micro-biologic factor of mixtures of different types of ice cream. Selectivity of antimicrobial influence of the investigated extracts on spore-forming micro-organisms would be of practical value for the ice cream production technique to significantly improve its microbiological indicators.

Key words: plant extracts, antimicrobic action, ice cream production.

КОРОТК1 ПОВ1ДОМЛЕННЯ

УДК 577.151.042: 577.152.311

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ИЗ СЫВОРОТКИ

КРОВИ ЛОШАДИ

Ю. Г. Жуковский

В. А. Жуковская Учреждение Российской Академии наук

Л. П. Кузнецова «Институт эволюционной физиологии и биохимии

Е. Р. Никитина им. И. М. Сеченова РАН», Санкт-Петербург

Е. Е. Сочилина

E-mail: [email protected]

При промышленном производстве холинэстераз и в лабораторной практике иногда возникает необходимость в идентификации этих энзимов. Это может быть связано с нарушениями маркировки в процессе производства энзимов, а также при контроле и хранении готовой продукции.

Предложен способ идентификации, позволяющий отличить бутирилхолинэстеразу из сыворотки крови лошади от холинэстераз из других биологических источников: ацетилхолинэстераз — из электрического органа электрического ската и угря, из эритроцитов верблюда, лошади и человека; бутирилхолинэстераз — из сыворотки крови и из мозговой ткани голубя; пропионилхолинэстераз — из сыворотки крови и из мозговой ткани. Способ основан на различной чувствительности холинэсте-разного домена (каталитического центра) этих энзимов к двум обратимым фосфониевым ингибиторам: (С6Н5)3 Р+- СН31- (1) и (С6Н5)3 Р+- СН2СН2СН3Вг(2). Для каждого энзима определяют концентрацию ингибитора (С1 для ингибитора-1 и С2 для ингибитора-2), которая уменьшает энзиматическую активность в 2 раза, затем вычисляют величину отношения С1/С2. Если эта величина больше, чем 4, можно сделать вывод о том, что идентифицируемым энзимом является бутирилхолинэстераза из сыворотки крови лошади.

Ключевые слова: ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза, пропионилхолинэстераза, фосфониевые ингибиторы.

При промышленном производстве холинэстераз и в лабораторной практике иногда возникает необходимость в идентификации этих энзимов. Это может быть связано с нарушениями маркировки в процессе производства энзимов, а также при контроле и хранении готовой продукции.

Широко известна возможность идентификации типов холинэстераз путем сравнительной оценки их способности гидролизо-вать при оптимальных условиях холиновые эфиры «стандартного набора»: ацетилхо-лин, пропионилхолин, бутирилхолин и аце-тил-в-метилхолин. Так, ацетилхолинэстера-зы с наибольшей скоростью гидролизуют субстрат ацетилхолин, пропионилхолинэс-теразы — субстрат пропионилхолин, бути-рилхолинэстеразы — субстрат бутирилхо-лин, ацетил-в-метилхолинэстеразы — субстрат ацетил-в-метилхолин [1]. Этот спо-

соб позволяет идентифицировать типы хо-линэстераз, но не пригоден для надежной идентификации индивидуальной холинэсте-разы внутри одного типа. Это прежде всего связано с недостаточно выраженной субстратной внутритиповой специфичностью холинэстераз.

Известен способ определения различий между ацетилхолинэстеразами и бутирил-холинэстеразами путем сравнения чувствительности идентифицируемого энзима к различным ингибиторам [2]. Он дает возможность, например, отличить ацетилхоли-нэстеразу эритроцитов лошади от бутирил-холинэстеразы сыворотки крови лошади: первый энзим намного более чувствителен к параоксону, чем к изопестоксу, а второй, наоборот, имеет большую чувствительность к изопестоксу, чем к параоксону. Существует также способ идентификации индивидуальной

ацетилхолинэстеразы среди энзимов этого же класса [3], позволяющий отличить аце-тилхолинэстеразу из электрических рыб от ацетилхолинэстеразы эритроцитов человека, лошади и верблюда. Он основан на различиях в чувствительности этих энзимов к обратимому ингибирующему действию пяти фосфониевых соединений.

Особенности каталитических свойств активного центра холинэстераз по отношению к различным ингибиторам, в том числе и к обратимым фосфониевым, активно изучаются [4, 5]. Накоплен значительный экспериментальный материал, анализ которого дает возможность приблизиться к решению вопроса об идентификации некоторых энзимов.

В настоящей работе описан способ, дающий возможность отличить бутирилхоли-нэстеразу из сыворотки крови лошади от хо-линэстераз, выпускаемых промышленным способом из других биологических источников (бутирилхолинэстераза, пропионилхо-линэстераза). Способ основан на сравнении чувствительности холинэстераз к обратимому ингибирующему действию двух фосфо-ниевых соединений: (С6Н5)3Р+- СН31-и (СбН5)зР+-СН2СН2СНз Вг-.

В работе в качестве субстратов применяли ацетилхолин, бутирилхолин и ацетилтио-холин йодистые (Chemapol, Чехия).

Как обратимые ингибиторы использовали два фосфониевых соединения, синтез которых описан в работах [6, 7]:

(С6Н5)3Р+- СН3Г (ингибитор 1);

(С6Н5)3Р+- СН2СН2СН3Вг- (ингибитор 2).

Использовали частично очищенные лио-филизированные препараты ацилхолинэсте-раз (НФ 3.1.1.8): бутирилхолинэстеразы из сыворотки крови лошади (БуХЭЛ) и голубя (БуХЭГ) c удельной активностью 9,6 Е/мг и 12 Е/мг соответственно, бутирилхолинэсте-разу из мозговой ткани (БуХЭБг) — 18 Е/мг; пропионилхолинэстеразы (НФ 3.1.1.8) из мозговой ткани (ПХЭ № 1) и из сыворотки крови (ПХЭ № 2) — 53 Е/мг и 0,7 Е/мг соответственно; ацетилхолинэстеразы (НФ 3.1.1.7) из электрического органа электрического ската Torpedo marmorata (АХЭС) — 1000 Е/мг и электрического угря Electrophorus electri-cus (АХЭУ) — 1 000 Е/мг (Sigma, США), из эритроцитов верблюда (АХЭВ) — 0,02 Е/мг, лошади (АХЭЛ) — 1,2 Е/мг и человека (АХЭЧ) — 6,1 Е/мг. Препараты холинэсте-раз изготовлены в Пермском НИИВС.

Удельную активность энзимов определяли методом потенциометрического титрова-

ния с использованием в качестве субстрата 2 мМ ацетилхолина для ацетилхолинэсте-раз и 2 мМ бутирилхолина для ацилхоли-нэстераз (25 °С, 0,1 М хлорид калия, рН 7,5).

Скорость холинэстеразного гидролиза ацетилтиохолина в отсутствие и в присутствии ингибитора устанавливали фотометрическим методом Эллмана [8] при температуре 25 °С, рН 7,5. Реакционная смесь состояла из 1 мл 1 мМ раствора 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5), 1 мл раствора энзима (0,2 Е/мл), 1 мл 0,5 М раствора хлорида калия, 1 мл воды в контрольной пробе или 1 мл раствора ингибитора в опытной пробе и 1 мл 2,5 мМ раствора ацетилтио-холина.

С помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-56 (светофильтр № 3) измеряли время в секундах, за которое оптическая плотность реакционной смеси возрастает на величину 0,1 (^ — в контрольном опыте без ингибитора, 1;оп — в опыте с ингибитором). Подбирали такую концентрацию ингибитора, при которой энзиматическая активность уменьшится вдвое, т. е. 1;оп / ^ = 2.

С целью идентификации БуХЭЛ была исследована чувствительность холинэстераз, полученных промышленным способом, к фос-фониевым соединениям, из которых выбраны два — ингибитор 1 и ингибитор 2. В таблице приведены их концентрации, уменьшающие холинэстеразную активность в два раза (С1 — для ингибитора 1 и С2 — для ингибитора 2). Из данных таблицы следует, что наименьшую чувствительность к обоим ингибиторам проявляет только БуХЭБг (С1 = С2 = 1 200мкМ), а наибольшую—АХЭЧ (52 и 120 мкМ). Значения С1 и С2 для БуХЭЛ не выделяются среди таковых для других холинэстераз. БуХЭЛ проявляет примерно одинаковую чувствительность к ингибитору 1 наряду с БуХЭГ, ПХЭ №1, ПХЭ №2, АХЭЛ и АХЭС (300-430 мкМ), и все они уступают в чувствительности АХЭВ, АХЭЧ и АХЭУ (120-200 мкМ). Что касается ингибитора 2, то БуХЭЛ, наряду с АХЭЧ и АХЭВ, наиболее чувствительны к нему (40-82 мкМ) и существенно отличаются по этому показателю от остальных хо-линэстераз (150-600 мкМ). Из вышесказанного следует, что концентрации С1 и С2 не позволяют надежно отличить БуХЭЛ от других холинэстераз. Однако, если сравнить действие ингибиторов 1 и 2 на каждый энзим, отчетливо видно, что только у БуХЭЛ наблюдается особенно большая разница в их действии: величина С1 превышает С2 в 9,5

раза (С1/С2 = 9,5). Для остальных холинэсте-раз величины С1/С2 колеблются от 0,7 до 2,5. Выявленная особенность в чувствительности БуХЭЛ к ингибиторам 1 и 2 позволяет надежно отличить этот энзим от холинэсте-раз, производимых из других биологических источников.

Принимая во внимание вышеизложенное, идентификацию БуХЭЛ предлагается

ЛИТЕРАТУРА

1. Usdin E. Anticholinesterase agents. Intern. Encyclopedia Pharmac. Ther. — Pergamon Press, 1970. — V. 1. — Р. 133.

2. Aldridge W. N. The differentiation of true and pseudo cholinesterase by organophosphorus compounds // Biochem. J. — 1953. — V. 53, N 1. — P. 62-67.

3. Жуковский Ю. Г., Кузнецова Л. П., Сочили-на Е. Е., Никитина Е. Р. Способ идентификации ацетилхолинэстераз из различных биологических источников // Бютехнолопя. — 2010. — Т. 3, № 1. — С. 58-61.

4. Бресткин А. П., Кузнецова Л. П., Мора-лёв С. Н., Розенгарт Е. В., Эпштейн Л. М. Холинэстеразы наземных животных и гид-

осуществлять таким образом. Подбирают такую концентрацию ингибитора [С1 — для (С6Н5)3Р+-СН3-Г и С2 — для ингибитора (с6Н5)3Р+-СН2СН2СН3 Вг ], которая уменьшает холинэстеразную активность в два раза, затем вычисляют величину отношения С1/С2 и в том случае, если эта величина больше, чем 4, делают вывод, что идентифицируемым энзимом является БуХЭЛ.

робионтов. — Владивосток: ТИНРО-центр, 1997. — 466 с.

5. Басова Н. Е., Розенгарт Е. В., Суворов А. А Фосфониевые обратимые ингибиторы холинэстераз разных животных // Докл. акад. наук. — 2010. — Т. 434, № 3. — С. 407-411.

6. Houben-Weyl: Methoden der Organischen Chemie. — 1958. — Bd. XII/I. — P. 75-82.

7. Органикум. Практикум по органической химии / Пер. с нем. Потапова В. М., Пономарёва С. В. — М.: Мир, 1979. — Т. 1. — С. 277-278.

8. Ellman G. L., Courtney K. D., Andres V. Jr., Featherstone R. M. A new and rapid colorimet-ric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. — 1961. — V. 7, N 1. — P. 88-95.

Концентрации ингибиторов 1 (С1) и 2 (С2), при которых холинэстеразная активность уменьшается в 2 раза, и величины их отношения (С1/С2) (Погрешность 10%; п = 5; Р = 0,95)

Энзим Сх, мкМ С2, мкМ Ci/C2

БуХЭЛ 380 40 9,5

БуХЭГ 430 280 1,5

БуХЭБг 1200 1200 1,0

ПХЭ №1 430 600 0,7

ПХЭ №2 380 280 1,4

АХЭВ 200 80 2,5

АХЭЛ 380 150 2,5

АХЭЧ 120 52 2,3

АХЭС 300 360 0,8

АХЭУ 180 210 0,9

СПОС1Б 1ДЕНТИФ1КАЦН БУТИРИЛХОЛ1НЕСТЕРАЗИ 13 СИРОВАТКИ КРОВ1 КОНЯ

Ю. Г. Жуковський В. А. Жуковська Л. П. Кузнецова О. Р. НЬкЬтЬна О. О. СочилЬна

Установа Росшсько! Академи наук «1нститут еволюцшно! ф1з1олог11 i б1ох1мп 1м. I. М. Сеченова РАН», Санкт-Петербург

E-mail: [email protected]

Шд час промислового виробництва холш-естераз в лабораторнш практищ 1нод1 виникае необхщшсть в щентифшаци цих ензим1в. Це може бути пов'язано з порушеннями марку-вання в процем виробництва ензим1в, а також контролю та збер1гання готово! продукци.

Запропоновано спомб щентифшаци, що дозволяе в1др1знити бутирилхолшестеразу 1з сироватки кров1 коня вщ холшестераз з шших бюлопчних джерел: ацетилхолшестераз — 1з електричного органа електричного ската i вугра, з еритроцимв верблюда, коня i люди-ни; бутирилхолшестераз — 1з сироватки кров1 та мозково! тканини голуба; протошлхолшес-тераз — 1з сироватки кров1 та мозково! тканини. Спомб Грунтуеться на р1зн1й чутливост холшестеразного домена (каталп-ичного центру) цих ензим1в до двох оборотних фосфоше-вих 1нг1б1тор1в: (С6Н5)3Р+- СН31- (1) i (С6Н5)3Р+- СН2СН2СН3 Вг- (2). Для кожного ензиму визначають концентращю шпбггора (С1 для шг1б1тора-1 i С2 для шг1б1тора-2), яка зменшуе ензиматичну актившсть у 2 рази, поим обчислюють величину вщношення С1/С2. Якщо ця величина б1льша за 4, можна зробити висновок про те, що щентифшованим ензимом е бутирилхолшестераза 1з сироватки кров1 коня.

Ключовi слова: ацетилхолшестераза, бутирилхолшестераза, прошошлхолшестераза, фосфон1ев1 1нг1б1тори.

THE METHOD FOR IDENTIFICATION OF HORSE SERUM BUTYRYLCHOLINESTERASE

Yu. G. Zhukovskii V. A. Zhukovskaya L. P. Kuznetsova O. R. Nikitina O. O. Sochilina

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences, St. Petersburg

E-mail: [email protected]

In the industrial production of cholineste-rase and in laboratory practice, sometimes it needs to identificate these enzymes. It might be due to violations of labeling in enzyme production and control and storage of the readymade products as well.

A method for identification of horse serum butyrylcholinesterase out of cholinesterases from other biological sources such as acetyl-cholinesterases of the electric eel and numbfish electric tissues, out of the human, horse and camel erythrocytes; butyrylcholinesterases — of the pigeon blood serum and pigeon brain tissue; propionylcholinesterases — out of the serum and the brain tissue was suggested. The method is based on different sensitivity of cholinesterase domen (catalytic centre) of there enzymes to the two reversible phosphonium inhibitors: (C6H5)3P+- CH3 I- (1) and (C6H5)3P+- CH2CH2CH3 Br- (2). For this purpose inhibitor concentration (C1 for inhibitor 1 and C2 for inhibitor 2) decreasing enzymatic cleavage of each cholinesterase twofold was determined and then the value of relation C1/C2 was calculated. The identified cholinesterase was horse serum butyrylcholinesterase if the value C1/C2 was higher than 4.

Key words: acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, propionylcholinesterase, phosphonium inhibitors.

РЕЦЕНЗН

РЕЦЕНЗ1Я на книгу «Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology III»

за редакщею О. П. Демченка (Springer Series of Fluorescence, т. 10, видавництво Springer, 2011)

Збiрка «Springer Series of Fluorescence» e досить популярною серед науковщв, ос-шльки там друкуються найкрашД розробки в галузi флуоресцентно! спектроскопа, якi було вiдзначено увагою дослщнишв на кон-ференцiях та в часописах. Не e винятком i останнiй, 10-й том збiрки, де упорядником e украшський фахiвець, д. б. н. проф. О. П. Демченко. Збiрку присвячено флуоресцентним репортерам — молекулярним пристроям, ям з однаковим устхом можна вщнести i до популярно! зараз галузi нанотехнологii, i до завжди скромно! у саморекламi «ткотехно-логii», шакше кажучи — до одного iз сучас-них напрямiв фiзичноi оргашчно! хiмii.

Флуоресцентнi репортери та !х рiзновиди — флуоресцентнi зонди i мiтки — дедалi шир-ше застосовують у рiзних галузях науки i практики. Переважна бiльшiсть завдань, пов'язаних з мiжмолекулярними взаeмодiя-ми в складних системах, вирiшуeться з !х допомогою. Це — найб^ьш ефективнi моле-кулярнi iнструменти сучасно! бiологii, ме-дицини та супрамолекулярноi хiмii i, очевидно, !хня ефективнiсть у перспектив! лише зростатиме.

Як i до будь-якого iнформацiйного пристрою, до флуоресцентного репортера вису-ваеться декiлька ключових вимог, пов'язаних !з шльшстю, адекватнiстю та стабiльнiстю передачi iнформацii вщ об'екта дослщжен-

ня. У свiтлi цих вимог, залежно вщ об'екта дослiдження та поставленого завдання, ра-зюче змiнюеться дизайн флуоресцентного репортера. Розглянемо докладно, що ж про-понуеться читачевi у 10-му томi збiрки.

Передусiм слiд вщзначити значний вне-сок укра1нських учених у рецензоване ви-дання. Йдеться не лише про перший розд^ та частину другого, як написано власне О. П. Демченком у спiвавторствi з молодим фiзиком-теоретиком — к. ф.-м. н. Семеном Ясилевським, але й доробок дослщницько! групи вщомого теоретика i практика — д. х. н. Серпя Ярмолюка. А найбiльш важ-ливим у зазначеному аспекта е те, що цей внесок — не результ протекщошзму, а ре-альне свщчення передових позицiй ук-ра!нських учених у цш важливiй галуз! св^ово! науки.

У першому роздШ розглядаються су-часнi тдходи до моделювання м!жмолеку-лярних взаемодiй у багатокомпонентних (у тому числ! гетерогенних) рщинах та структурно! динамiки таких рщин методами квантово! та молекулярно! мехашки. Важ-ливо, що цей розд!л написано у чггкому й доступному стил! пiдручника. Тому вш бу-де корисним не лише спещалютам у галузi молекулярно! динамiки, а й науковцям, що хочуть поглибити сво! уявлення про молеку-лярну структуру бюсистем та про спект-ральнi ефекти, як! е характерним виявом окремих титв мiжмолекулярних взаемодш у рiдинах. Висвiтлюеться природа таких ф!зичних властивостей рщин, як поляр-шсть, в'язкшгь, водневе зв'язування, переважна сольватащя тощо. На прикладах молекул флуоресцентних барвнишв опи-суеться статична i динамiчна взаемодiя ок-ремо! молекули з оточенням.

Другий розд!л присвячено застосуванню флуоресцентних репортерiв у вивченнi окремих властивостей рщин та !хшх важливих складових. Окр!м найбiльш актуальних прикладiв бюоб'ектав у вод! тут представлен також оргашчш пол!мери ! досить ушкальний тип середовища — юнш рщини. Саме з них ! розпочинаеться розгляд впливу структури оточення на флуоресценщю зонд!в сольватохромно! природи (А. Samantha). Дал! йдеться про використання флуоресцентних зонд!в для вивчення пол!мер!в ! про-цесу пол!меризацп (А. Brouwer), а також

рiдкокристалiчних структур, мщел i лшщ-них бГшарГв (A. Demchenko). Читач мае змогу познайомитися з принципами дп, будовою та властивостями численних характерних представникiв флуоресцентних зондiв у ви-щезгаданiй множинi середовищ. Загалом, другий роздал е наочною демонстращею можливостей флуоресцентних репортерiв у вирГшенш важливих завдань окремих нап-рямiв сучасно'! науки та практики.

Принципи мiчення бiооб'ектiв розгляну-то у третьому роздШ. Першi двi частини стосуються флуоресцентного мiчення нуклешових кислот (S. Yarmoluk) i подаль-шого вивчення ''хньо'! взаемодii з шшими бiомолекулами методами флуоресцентно! спектроскопы (Y. Li). Далi обговорюються численнi варiанти ковалентно'! iммобiлiзацii флуорофора на пептида протеiнi чи нук-леiновiй кислота (С. Schultz) з використан-ням рГзних типГв функцiональних груп — як у природнш молекулi, так i в барвниковi, що слугуе мГткою. Розглядаються можли-востГ прямого ковалентного мiчення про-теiнiв безпосередньо в клГгиш, тканинах чи в огашзмь

В наступнiй частинi роздГлу (С. Spag-nuolo) йдеться про новий ефективний метод селективного ковалентного мiчення про-теiнiв in vitro й in vivo за допомогою бГар-сештних похГдних органiчних флуорофорГв та генетично введених у протеш тетрацис-теiнових послiдовностей. Висока мГцнГсть зв'язку мГтки з протеiном, що забезпе-чуеться чотирма ковалентними зв'язками, та висока селектившсть використаного принципу iммобiлiзацii робить його дедалi популярнГшим у дослщженнях клГтинних процесiв.

БГльш ушверсальний у застосуваннi метод мiчення in vitro й in vivo розроблено для олиопстидинових проте1шв (J. Piehler). У ньому висока афшшсть флуоресцентно! мГтки до протеiну створюеться за рахунок

насичення координацiйноi сфери металу в комплекс його з м^кою (Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+) з подальшим приеднанням кiлькох пстидинових залишкiв протеiну. У даному разi мiтка мае специфiчну будову. Вона мо-же мiстити кiлька ^rnpiB координацii металу, з'еднаних довгим лшкером з флуорофо-ром. Зв'язування з протешом завжди спричинюе спалах флуоресценцп.

Двi частини останнього, п'ятого розд^у безпосередньо стосуються мiчення бюоб'ек-тiв in vivo. Тут обговорюються принципи зас-тосування нових зондiв з флуоресценцiею на межi ГЧ-областа для дослiджень судинних процесiв, зокрема тромбоутворення, карци-ногенезу тощо (J. Klohs). Фiнальним акор-дом збiрки можна вважати частину, присвя-чену нешвазивним методам спостереження за функщями окремих органiв тварини за допомогою зондiв iз флуоресценцiею на межi IЧ-областi (A. Harmelin). Розглядаеть-ся повний цикл спостереження починаючи вщ пiдбору флуоресцентного репортера, ме-тодiв його уведення в органiзм та отримання тривимiрного зображення i закшчуючи зас-тосуванням методу в поеднанш з магшторе-зонансною та рентгенотомографiею, бюлю-мiнесценцiею тощо.

Отже, збiрка «Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology III» е змютовною i актуальною, корисною для широкого кола науковщв. А стиль та виклад матерiалу, зокрема велика шльшсть кольо-рових iлюстрацiй та наведеш в кожнiй час-тинi базовi принципи методу, робить ii доступною нав^ь для аспiрантiв та студентав.

Д-р xím. наук, проф. В. Г. Пивоваренко, XÍMÍ4HUÜ факультет Кшвського нащонального утверситету iMeHi Тараса Шевченка

НОВИНИ

Перепрограмоваш CT0B6yp0Bi клiтини iнiцiюють iMyHHy реакцiю у мишей

Ставиться тд сумшв практичне застосу-вання препаратав iндукованих плюрипоте-нтних стовбурових кл!тин. У нещодавно опублiкованому журналом Nature досль дженнi повiдомляeться, що перепрограмоваш стовбуров! кл!тини, призначенi для проростання в р!зш типи тканин, можуть вщторгатися, навiть якщо вони пересаджеш шдивщуумов!, вщ якого !х отримано.

Iнфiльтрацiя Т-клiтин (показано темно-корич-невим кольором) виявляеться в тканинах, яга утворились вщ iндукованих плюрипотентних стовбурових клiтин ( Yang Xu, UC San Diego)

Дослщження проводили в Ушверситета Сан-Дieго, шт. Кал!форшя, США, пщ кер!в-ництвом Ян Х'ю (Yang Xu). Результати !х стали шокуючими для регенеративно'1 меди-цини, адже дой б!льш!сть учених вважали, що перепрограмоваш кл!тини з власних тканин людини можна було безпечно пересад-жувати цш самiй людинь

Пауль Фейрчiлд (Paul Fairchild), !мунолог i бюлог, який дослщжуе стовбуров! кл!тини в Оксфордському унiверситетi Великобританп, вважае, що такий «сюрприз» ставить тд сумшв перспективи використання iндукованих стовбурових кл!тин у медицинi. Нещодавно було проведено дослщження ембрiональних стовбурових та шдукованих плюрипотентних стовбурових кл!тин миш! (iPS). Обидва типи кл!тин виявилися плюрипотентними. А це оз-начае, що вони можуть перетворюватися на багато шших вид!в клггин.

Потенщал змЬни Дослщники групи пщ керiвництвом Х'ю пересаджували стовбуров! кл!тини миш! ге-

нетично щентичним тваринам. Це !м!тувало трансплантащю кл!тин однш ! тай самш лю-динь При трансплантацп ембрюнальш стов-буров! кл^ини спричинювали тератоми — пухлини, що мютять хаотичне нагромад-ження титв клгтин, використовуваних як плюрипотентш. Б^ьшють iPS-клiтин, нав-паки, не могли сформувати або створити тератоми ! були зруйноваш або вщторгнеш !мунною системою рецитента.

Учен! врусалимського ушверситету 1зра!лю пщ кер!вництвом Шссима Бен-вешста (Nissim Benvenisty ) припустили, що iPS-клiтини пащентав можна було б знову !м ! пересадити. Вони виявили, що певш гени були експресоваш на значно вищому р!вш в тератомах, утворених iPS-клiтинами, пор!вняно з ембрюнальними стовбуровими кл!тинами. Два з таких гешв — Zg16 ! Ногтаё1 — було спещально запрограмова-но до !мунно! атаки. Х'ю висловив припу-щення, що з часом щ гени швелюватимуться. Ембрюн розпочне процес вироблення !мун-но! резистетноста до власних тканин. Тому вони не визнаються як власш талом хазя!на. Процедура iPS-перепрограмування може змшити нормальну експрейю цих гешв.

Проблема вiдторгнення

Проте дослщження Х'ю не варто розгля-дати як погану новину для iPS, як це може здатися на перший погляд. Дослщникам, як! працювали з! зрьлими iPS-клiтинами, наприклад нейронами або клггинами серця, вдалося пересадити !х мишам без вщторг-нення, однак експерименти в основному проводили на мишах без урахування функ-цюнальних !мунних систем. Щ дослщження передбачали проведення трансплантацп тальки одного виду диференцшованих кль тин вщразу вщ власних кл!тин шшри па-щента в його ж власш тканини, а не змшу-вання диференцшованих кл!тин у тератом!.

Х'ю та шш! дослщники й дой не впев-неш, чи не почнуть вщторгатися отримаш очищен! диференцшоваш iPS-клiтини, чи ця проблема е специф!чною для недифе-ренцшованих клгтин.

Фейрч!лд вважае, що дослщження Х'ю насправд! не охоплюе вйе! повноти кл^чно! ситуацп. Вш зазначае, що iPS-клi-тини в цих дослщженнях були отримаш з ембрюнальних кл!тин шшри, а не з! шшри доросло! людини, як це мало б бути в реальному

випадку. Найiмовiрнiше, цi незрiлi клiтини шшри викликають iмунну реакцiю частiше, шж дорослi клiтини. I невiдомо, чи спричи-нюють iмунне вiдторгнення клгтини в тератомах, чи так поводяться клгтини людини. До-ти, доки на щ питання не буде отримано вщповвд, заява Х'ю необ^рунтовано кидае гiнь на всю сферу регенеративно! медицини.

Джозеф Ву (Joseph Wu), трансплантолог зi Стенфордського ушверситету в Пало-Аль-то, шт. Катфоршя, погоджуеться, що така заява пов'язана з додатковими проблемами як техшчного, так i морально-етичного характеру за шдивщуально! трансплантацп отриманих iPS-клГтин пацiенга.

Пошук вирiшення цього питання описаний у першш частит публшацп, де вису-ваеться припущення, що iPS-клiгини можуть мютити бiльше генетичних аномалiй порiвняно з ембрiональними стовбуровими клiгинами. Адмшютращя Управлiння з контролю якост харчових продукгiв i лшарсь-ких засобiв США висловила в березш цього року на нарадi у Вiфездi, шт. Мерiленд, сгурбованiсгь з приводу генетично! мугацii iPS-клiгин.

Точно регульована терашя

Очевидно, компанп будуть зацшавлеш в розвигковi терапп, пов'язано! з отриман-ням iPS-клiгин для конкретного пащента. Вони гоговi якнайшвидше зосередитися на терапп цих клГтин i застосовувати ii для ба-гатьох людей, для чого так чи шакше буде необхiдним пригшчення Гмунно! системи.

Пiдсумовуючи, можна зробити висно-вок, що для подальших дослiджень погрiбно вивчити питання, чи мають iPS-клгтини iмуннi переваги, чи rn.

З цими висновками Х'ю згоден. Його трупа збираеться з'ясувати, як конкретш клгтини тератоми i за яких умов викликають Гмунне вiдгоргнення. При цьому для отри-мання iPS-клiгин використовуватимуться два рГзних методи, яш дадуть вщповщь на питання про схильнють до Гмунного вщторг-нення. I тодь щоб уникнути цiеi проблеми, з'явиться можливють доопрацювати методи перепрограмування. Дослщники вважають, що гехнологiя створення iPS-клiтин потре-буе вдосконалення з метою звести до мшГму-му рГзницю мГж iPS- i ембрiональними стов-буровими клiгинами з тим, щоб iPS- клгтини стали корисшшими для терапп людини.

Джерело:

http://www.nature.com/news/2011/ 110513/full/news.2011.286.html

Досягнення в галузi бютехнологп ензим1в

Ензими — це протеши, що прискорюють хГмГчш реакцп, наприклад, тд дiею праль-ного порошку виводяться протешовГ плями, яш за шших обставин украй важко видали-ти. Група доойднишв тд керiвницгвом професора Кам-Бо Вонга (Kam-Bo Wong) з Центру наукових дослГджень протешу i кристалографп Школи природничих наук в Китайському ушверситет Гонконга проде-монстрували основний принцип змши ак-тивност ензимiв за допомогою протеiновоi шженерп.

1м вдалося розкрити таемницю будови бютехнолопчно важливих ензимiв, повщом-лення про що з'явиться найближчим часом в 1нтернет-видант журналу PLoS Biology.

Протеши з термофШв, теплолюбних ор-ганiзмiв, що живуть в умовах високих температур, стшшшГ до теплово! денатурацп порГвняно з мезофГльними органiзмами, як1 живуть при помГрних температурах. У при-родГ ензими з мшробГв, що вiддають перевагу життю за надзвичайно високих температур, наприклад у гщротермальних джерелах, можуть залишатися стабГльними навiть при 100 °С. Щ термофiльнi ензими е корисними для бютехнолопчно! промисловост завдяки !хнш високш стабГльность

Залишаеться загадкою, чому термофГль-н ензими менш активш, шж !хш мезофГль-н гомологи, незважаючи на подГбнють структури. Професор Вонг (Wong) проводить порГвняння !х з двома машинами ана-логГчно! системи, з яких одна працюе в 10 ра-зГв швидше за шшу. Якби термофГльш ензими могли б бути актившшими без втра-ти стабГльностГ, то вони б становили собою велику комерцшну цшнють для бютехно-логГчно! промисловость

Дослщницька група Вонга використову-вала методи проте'ново! шженерп для з'ясу-вання, чому термофГльш ензими менш активна Було виявлено, що термофГльний ензим ацилфосфатаза мае уншальну влас-тивють, яка полягае в тому, що ii активний центр стае стабГльшшим тд впливом сольо-вого мютка. ТермофГльш ензими, як правило, виявляють схильнють до стшкГших взаемодш аналопчно сольовим мюткам. У разГ видалення цього мютка термофГльш властивост ацилфосфатази перетворюються на властивостГ, притаманш мезофГльним ен-зимам. КрГм того, мезофГльна ацилфосфатаза людини моделювалася в термофГльно-подГбну зГ введенням сольового мютка.

Дослщники дшшли висновку, що стабГль-шсть сольового мiстка пiдсилювала актив-шсть ензимiв за високих температур i водночас знижувала ïï за низьких. Можна сподГвати-ся, що закономiрностi, виявленi дослгджен-нями групи професора Вонга, буде покладе-но в основу дослГджень з оптимГзацп активност ензимiв i впровадження в бютех-нологГЧНГЙ ПРОМИСЛОВОСТГ.

Джерело: http://www.sciencedaily.com/ releases/2011/03/110315192813.htm

Зуби 3i стовбурових клггин

Морфогенез i диференщювання зубних зачатшв регулюють складш взаемодГ! мГж мезенхГмальними стовбуровими клГтинами крашального нейрального хреста та етте-лГю ротово! порожнини. 1талшськГ вчеш з University of Udine в своему дослщженш показали, що отримана з едино! клГтини по-пулящя мезенхГмальних стовбурових кль тин (МСК) in vitro може бути диференцшо-вана в структуру, що нагадуе зубний зачаток. Учеш шкубували первинну культуру одержаних з людсько! жирово! тканини мезенхГмальних стовбурових клГтин в середовище що шдукуе диференщювання СК в клгтини, як створюють зачаток зуба. Три-вимГрш скупчення клгтин, що сформували-ся, культивували ще 4 тижнь Утворена структура була схожа на зачаток зуба. За до-помогою рГзних методГв аналГзу було вста-новлено експрейю маркерГв, характерних для тканин зуба. У середовишД клгтини, що шдукуе диференщювання, були експресо-ваш маркери амелобластГв i одонтобластГв, а також характеры для них матричш РНК i протеши. ОкрГм того, вщповщно до розта-шування клГтин виявлялась експрейя мар-керГв основно! мембрани, а також еттелГа-льних i мезенхГмальних, схожа з експрейею маркерГв за нормального фГзюлопчного морфогенезу зуба. ФГзико-хГмГчний аналГз виявив 200-нм i 50-нм правильно орГенто-ваш кристали ггдроксГапатиту, вщповщно, емалГ й дентину in vivo.

Таким чином, результати цього досль дження свгдчать про те, що видГлеш з жирово! тканини стовбуровГ клГтини in vitro навГть за вГдсутност специфГчного структурного матриксу або тдкладки здатш до диференщювання в спещалГзоваш клгтини, що оргашзовуються в тривимГрну структуру, схожу за фенотипом на зачаток зуба.

МатерГали дослщження подано в статтк Ferro F, et al. Adipose tissue-derived stem cell in vitro differentiation in a three-dimensional dental bud structure. Am. J. Pathol., 2011 May;178(5): 2299-2310.

Джерело:

http://www.stemcells.ru/news-286

Ввд гена до протешу: транслящя регулюе piBeHb вмюту протешових молекул у кл^иш

Як гени контролюють процеси, що вщбу-ваються в нашому органГзмГ? Це питання фундаментально'ï бiологi'ï, незважаючи на довгГ роки проведення рГзних експери-ментГв, ще до кшця не з'ясовано. Гени — це одинищ геному, що мГстять в собГ шфор-мащю про рГзнГ проте'ïновi молекули, ям ви-конують життево важливГ функцп. ВГдомо, що деякГ захворювання, такГ, наприклад, як рак, характеризуються не тальки змшами на рГвнГ гешв, але й виникненням дефектГв синтезу протешових молекул. Як же конт-ролюеться сам проте!новий синтез? Результати дослГджень, проведених ствробГтника-ми Центру молекулярноï медицини Гм. Макса Дельбрюка (Max Delbruck Center for Molecular Medicine -MDC, Berlin-Buch of the Helmholtz Association), показали, що контроль цього процесу здшснюеться головним чином в цитоплазмГ клГтини.

p growing

CT X protein

tRNA Is h amino acid

VI 1, Ii

lip /it iiii

mRNA ^

movement of ribosome »

Модель процесу трансляцп

(www.frontiers-in-genetics.org)

ПротешовГ молекули — основа оргашч-ного життя. «Вони контролюють фактично вй бюлопчш процеси: вГд серцебиття i транспортування кисню до мислення», — зазначив МаттГас Сельбак (Matthias Selbach), один з провГдних авторГв цього

дослщження. 1нформащя про будову про-те!нових молекул записана в геном! клтти-ни, який, у свою чергу, мютиться в ядрь 1нформацшш РНК ^РНК) клгтини, що утво-рюються в процей транскрипцп в ядр!, несуть в соб! вщображення шформацп про не-обхщш проте!ни г спрямовуються з ядра в цитоплазму кл^ини — на рибосоми, де ця органела певним чином транслюе ГРНК в амшокислотш послщовноста. Питання, яке довго не давало спокою фах!вцям, поля-гае в тому, який з двох процейв (тран-скрипщя або транслящя) большою м!рою бе-ре участь у регулюванн р!вня вмюту проте!нових молекул в кл^иш. За допомо-гою шльшсно! мас-спектрометрп г нов^шх методик секвенування автори дослщжень встановили тлькють проте!нових молекул та ГРНК, шформащя про як! зберпаеться б!льш шж в 5 000 генах. Математичне моде-лювання, проведене на пщстав! отриманих даних, допомогло вченим зробити певш вис-новки про контроль р!вня вмюту проте!но-вих молекул усередиш клгтини. На думку автор!в, р!вень вмюту проте!нових молекул в основному залежить вщ процесу транс-ляци, що вщбуваеться в цитоплазм!. «Врешта-решт, рибосоми визначають тлькють проте'!шв. Деяш ГРНК транслю-ються за 1 год в одну проте!нову молекулу, шшГ ГРНК за цей час встигають транслюва-тися 200 раз!в», — наголосив Сельбак.

Клтина працюе як енергоощадна система Окр!м того, автори дослщжень виявили, що клгтини використовують сво! ресурси найб!льш ефективним шляхом. Для велико! шлькоста ГРНК г проте'!шв, як! е продуктами конститутивних гешв, характерна висока стабшьшсть. Ця стабшьшсть необхщна кл^иш для збереження енергп (вщомо, що процес синтезу проте'!шв потребуе чимало! шлькоста енергп). На вщмшу вщ зазначених вище ГРНК та проте!нових молекул, низка ензим!в, що забезпечують швидке форму-вання г передачу сигнатв, навпаки, як правило, мають низьку стаб^ьнють. Завдяки юнуванню проте!шв, яким притаманна низька й висока стаб^ьшсть, кл!тина може швидко пристосовуватися до змш навко-лишнього середовища. Саме цим можна по-яснити те, чому контроль проте!нового синтезу здшснюеться переважно в цитоплазм!, а не в ядрь РГч у тому, що в цитоплазм! вщбуваеться останнш етап формування про-те'!шв — транслящя. Регулювання транс-ляцГ! дозволяе кл^инам швидко пристосо-

вуватись до «вимог» навколишнього сере-довища.

Автори дослщжень сподiваються, що отримаш ними результати будуть кориснi тд час пошуку методiв боротьби з рiзними за-хворюваннями, пов'язаними з порушенням синтезу проте!нових молекул.

Джерело:

http://sci-lib.com/article1144.html

Створено штучш астроцити

Учет створили штучш астроцити — най-поширенiшi клiтини мозку, якi не тальки забезпечують базовi функцп нервових клiтин — нейронiв, але й мають ключ до вивчення ба-гатьох хвороб — вщ головного болю до недо-умства. Астроцити вдалось отримати з ембрюнальних та шдукованих плюрипотентних стовбурових клггин.

ФОТО: drgominak.com

Астроцити — кл^ини у формi зiрки, що становлять велику частину об'ему мозку. Традицшно !х вважали буфером — «цементом» або «клеем» речовини мозку, проте нещодавно проведене дослщження показало, що вони е нойями найважливших функцш. Серед них — формування гематоенцефатч-ного бар'еру — нашвпроникного кордону мiж кровоносною системою i нервовими кль тинами, що захищае мозок вiд проникнення шкщливих речовин з кровi, i забезпечення гомеостазу. Вщповщно, астроцити причетш до розвитку багатьох розладiв центрально! нервово! системи.

Ученим з Ушверситету Вюконсин — Медiсон вдалося виростити астроцити в про-бiрцi зi стовбурових клiтин людини. Повь домлення про !хню роботу опублiковано в Nature Biotechnology.

Бютехнологи отримали астроцити в чаш-цi Петрi спочатку з ембрюнальних, а потам i зi штучно одержаних стовбурових кл^ин

з шдукованою плюрипотентшстю (клiтини другого типу вважають перспективнiшими як з практичних, так i з етичних мiркувань, осшльки !х отримують без використання тканин людських ембрюшв).

Можливють виготовляти великi однорщ-нi проби астроцитав вiдкривае перспективу для кращого вивчення ïхнiх функцiй, а та-кож для розроблення нових ефективних л^в вiд нервових захворювань, вважае про-фесор Сун Чхон Чжан, в лабораторп якого проведено роботу.

«Частково недостатня вивчешсть астро-цитiв пояснюеться складшстю !х отриман-ня. Тепер ми можемо виростити м^ьярди або трильйони таких кл^ин з однiеï стовбу-рово! клiтини», — заявив Чжан.

Хоча традицшно наука про мозок зай-маеться нейронами — великими кл^инами, що обробляють i передають шформащю, ос-таннiм часом дослщники прид^яють дедал1 бiльше уваги вивченню ролi iнших клiтин. 1снуе дешлька типiв астроцитiв, ïхнi функ-цп багатограннi й потребують докладного вивчення. Деяк вченi припускають, що астроцити визначають штелект людини: об'ем, який щ клiтини займають в мозку ното sapiens, значно перевищуе !х об'ем в мозку будь-яко! iншоï тварини. «Без астроцитiв нейрони не можуть працювати. Астроцити оточують нервову тканину, захищаючи ïï й шдтримуючи здоровий режим. Вони бе-руть участь у виконаннi практично кожно'1 функцiï мозку, а також у будь-якому його розладЪ», — зазначив Чжан.

Окрiм функцiï «шлотно! установки» для тестування лiкiв, астроцити (у далекому майбутньому) зможуть стати об'ектом транс-плантацп для пащентав з травмами головного мозку, хворобою Паркшсона i ушко-дженнями спинного мозку. Технолопя, розроблена групою Чжана, дозволяе одер-жувати астроцити будь-якого необхщного типу. Крiм того, генетично модифшуючи можна отримати модель ураженою хворобою тканини. Таким чином з'явиться мож-ливють вивчати в лабораторiях складнi нев-рологiчнi захворювання, об'екти для яких були рашше недоступнi.

Джерело: http://www.eternalmind.ru/ index.php?option=com_content&task= view&id=3362&Itemid=2

Дослщники знайшли спомб перпрограмування клггин шшри людини у функщонуюч1 нейрони

Перетворюючи клiтини шкiри людини на робочi нервовi клiтини, дослщники впри-тул пiдiйшли до створення моделi захворювання нервово! системи i, можливо, навггь регенеративно! терапп, засновано! на кль тинних трансплантатах.

Функцiонуючi нейрони, створенi з ^iran шкiри людини

В он-лайновiй верси журналу Nature повiдомляеться про досягнення в галуз1 «трансдиференцiювання», що стрiмко роз-виваеться, коли клiтини швидко набувають нових форм. Минулого року дослщники перетворили кл^ини сполучно! тканини шири на кл^ини серця, кровi та печiнки.

Трансдиференщювання е альтернативою клiтинного перепрограмування, яке вклю-чае перетворення зрiлих кл^ин на плюрипо-тентнi стовбуровi кл^ини, здатнi стати багатьма типами клгтин, згодом перетворюючи плюрипотентнi кл^ини на певний тип клiтин, наприклад на нейрони. Марiус Уернiнг (Marius Wernig), керiвник досль дження стовбурових клгтин при Стенфо-рдському ушверситет шт. Калiфорнiя, США, повiдомив, що !м вдалося перетвори-ти фiбробласти шкiри людини на нейрони, минувши стадт iндукованих плюрипотентних стовбурових кл^ин (iPSCs), що дозволило уникнути низки проблем, подолання яких могло б зайняти дешлька мюящв.

Група Уернiнга минулого року зацшави-ла клiтинних репрограмiстiв — дослщники перетворювали клiтини, отриманi з кшчика хвоста мишi, на функцiонуючi нервов1 клiтини. Для цього було потрiбно всього три чужорiднi гени, одержан з хвостових кль тин з вiрусом, i менш нiж два тижш досль дiв. На думку вчених, якщо такий прекрас-ний результат було отримано для миш^ то очевидно не буде жодних проблем у разi за-стосування ще! iдеï на людинi. Однак вияви-лось, що це не так.

Не зовсЬм вЬрно

Щ три гени також шдукували одержан-ня клГтин людини, якГ виглядали як нер-вовГ, але такГ нейрони не могли проводити електричний сигнал. Щоб навчити ïх цьому, дослГдникам знадобився четвертий ген, знайдений методом проб i помилок у сполуч-нш тканинГ, що бере участь в загоенш ран, яку було отримано з абортованих плодГв i крайньоï плотГ новонароджених. Приблиз-но через два тижш цГ нейрони почали реагу-вати на електричний Гмпульс включенням своïх трансмембраних Гонних насосГв, як i належить робити звичайним нервовим кль тинам. Ще через дешлька тижшв нейрони почали утворювати з'еднання, або синапси, з мишачими нейронами, з якими ïх було ви-рощено.

Уерншг зГзнаеться, що не все йшло так чГтко. ТГльки 2-4% фГбробластГв становили нейрони проти приблизно 8% у клГтин ми-шГ. КрГм того, бГльшГсть отриманих нейро-шв використовували як хГмГчну речовину нейромедГатор глутамат, що обмежуе ïх ви-користання в лГкуваннГ таких захворювань, як хвороба Паркшсона, пов'язана з проблемами в нейронах, що виявляеться в деграда-цп саме глутаматзалежних нервових клГтин шд дГею хГмГчних речовин. Проте вчеш не втрачають нади на шдвищення ефектив-ностГ своïх дослГджень i намагаються ство-рити нейрони, ям б взаемодГяли мГж собою за допомогою Гнших хГмГчних речовин.

Швидкий ycnix

Еван Снайдер (Evan Snyder), дослщник в галузГ клiтинноï бiологiï при Стенфордсь-кому медичному дослщницькому шститута Бернема, вважае, що нейрони, отримаш шляхом трансдиференщювання, мають переваги порГвняно з клгтинами мозку, отри-маними з iPSCs: окрГм того, що ïх можна швидше й простГше створити, вони з мен-шою вГрогщнютю призводять до онколопч-них ускладнень за Гмплантацп в тканину.

Проте, з другого боку, клГтинш ознаки захворювання можуть з'являтися тГльки в тому разГ, коли клГтина розвиваеться при-родним шляхом з плюрипотентних стовбу-рових клГтин у диференцшоваш нейрони. Намагання перетворити клГтини на нейрони може призвести до того, що вони почнуть пе-ретворюватися на раковГ пухлини. КрГм того, фГбробласти, ям е початковим матерГа-лом для трансдиференщювання, не здатш дГлитися з такою штенсивнютю, як шдуко-ваш стовбуровГ клГтини, що обмежуе вико-ристання ïх у тих випадках, коли потрГбна

велика шлькють таких клГтин, зокрема тд час скриншгу лшГв.

Уерншг шдсумував, що обидва шдходи слГд активно розвивати, адже невГдомо, в яких випадках i за яких конкретних умов виявиться бГльш вщповщним той чи шший метод.

Джерело:

Оригшальна стаття Ewen Callaway, How to make a human neuron, он-лайнова верйя журналу Nature — doi:10.1038/nature10202 http://www.nature.com/news/2011/110526/ full/news.2011.328.html?WT.mc_id=FB

K NPG

Протеш Rasipl може стати ключем до шпбування формування кровоносних судин, що живлять пухлини

Дослщники з Швденно-захщного центру медичних дослГджень при Техаському ушверситет виявили протеш, який керуе розвитком кровоносних судин i мае вй шан-си на те, щоб його було покладено в основу створення методики боротьби з розповсюд-женням ракових клГтин в оргашзмь У ход1 проведення дослГджень на лабораторних мишах учеш показали, що протеш Rasip1 (Ras interacting protein) е вельми специфГчним i вщшрае ключову роль у низщ клГтинних процесГв. За словами д-ра Ундши КлГвер (Ondine Cleaver), доцента кафедри молеку-лярноï бiологiï Техаського ушверситету, основного автора дослГджень, без активност Rasip1 кровоноснГ судини не здатш форму-ватися. «Те, що ми виявили, е фактором першоï необхщност для формування внут-рГшшх каналГв i перебГгу тубулогенезу, шшими словами найголовнГшим фактором для перетворення чогось схожого на нитку на щось схоже на поливальний шланг», — зазначила д-р КлГвер. Розвиток пухлинноï тканини залежить вщ формування кровоносних каналГв, якГ мають забезпечити клГтини пухлинноï тканини поживними ре-човинами, необхщними для швидкого росту пухлини. РаковГ пухлини так само викорис-товують систему кровоносних судин як зайб розповсюдження малшшзованих клГтин в оргашзмь ХГмГчнГ сполуки, що пригшчу-ють активнють Rasip1, ГмовГрно, можуть протистояти розвитковГ ракових захворювань двома напрямами: через порушення живлення клГтин пухлинноï тканини i порушення системи транспортування клГтин, що перероджуються.

Tunica media

Загальна модель будови кровоносних судин

У процей внутршньоутробного розвит-ку в органiзмi плоду виникають органи у формi трубок (йдеться про кишечник i су-дини серцево-судинно! системи). За словами авторiв дослiджень, механiзми, в межах яких здшснюеться перетворення кл^ин-прабатькiв кровоносних судин на трубочки, ям здатш переносити кров, тiльки розпочи-нають дослщжувати. Утiм, автори досль джень виявили значну шльшсть регулятор-них молекул, що мають велике значення для рiзних тканин, процесiв формування i роботи кровоносних судин. Щ регуляторш молекули перебувають в активному сташ в середовищi тканин органiзму. Rasip1 е специфiчним регулятором активностi мо-лекул-перемикачiв, названих ГТФ-азами. Вiн з'являеться в активному сташ тальки в кл^инах ендотелт, який створюе внут-рiшнi покриви кровоносних судин. При цьо-му активнiсть Rasip1 не спостерааеться в клiтинах гладко! м'язово! тканини, що входить до складу станки кровоносних судин. Крiм того, автори дослщжень виявили, що для нормального формування каналiв, якими в органiзмi здшснюеться транспорту-вання кровь потрiбен ще один проте'ш, з яким зв'язуеться Rasip1. На думку Ундши Клiвер, основнi шдходи, спрямованi на пригнiчення утворення кровоносних судин, базуються на да на фактори росту, що мютяться поза потрiбною клiтиною, тимча-сом як Rasip1 е фактором росту усередиш клiтин-мiшеней. «Незважаючи на те, що проведено дослщження на лабораторних мишах, ми вважаемо, що майбутш дослщження Rasip1 i процейв, як перебувають пiд йо-го контролем, дадуть широк можливоста для створення засобiв i моделей для

полшшення методiв клiнiчноl терапп, спря-мовано! на пригнiчення формування системи кровоносних судин, що живлять пухлин-ну тканину», — наголосила Ундша Ктвер.

Докладнiший опис результатав проведе-них дослiджень можна вщнайти в журнал1 Developmental Cell.

Джерело:

http://sci-lib.com/article1139.html

Аналiз кровi за хвороби Альцгеймера: диференцшна дiагностика на раннiй стада захворювання

Завдяки iнновацiйному дослiдженню, здшсненому науково-дослiдним iнститутом Центру охорони здоров'я Ушверситету Мак-Гiл (McGill University Health Centre, MUHC) невдовзi може з'явитися новий анатз кров1 для дiагностики хвороби Альцгеймера. Роз-роблення уншального бiохiмiчного аналiзу, що виявляе пащентав iз цим нейродегенера-тивним захворюванням, стало можливим завдяки вивченню утворення гормону мозку дегщроешандростерону (ДГЕА) пiд час окис-нення сироватки кровь

Рис. i3 сайту www.muhc.ca

Результати роботи, що мае значення для м!льйошв людей !з щею хворобою, опублшо-вано в Journal of Alzheimer Disease. «Д!агнос-тичного шструмента для хвороби Альцгеймера, що забезпечуе отримання однозначних даних, окр!м посмертного анал!зу мозково! тканини, до сьогодш не юнуе», — зазначив головний автор статта д-р Вюсилюс Пападопулос (Vassilios Papado-poulos), директор науково-дослщного шсти-туту MUHC. — Наш! клшчш дослщження показали, що для д!агностики хвороби Альцгеймера на ii раннш стада можна устшно застосовувати нешвазивний анал!з кров!, що ^рунтуеться на бюх!м!чному процесс який, окр!м того, дае можливють

вщрГзнити ïï вГд Гнших видГв недоумства». Розроблений д-ром Пападопулосом i його колегами тест заснований на утворенш гормону мозку дегГдроепГандростерону. Висок1 рГвнГ цього гормону виявлено в мозку, де вш мае широкий спектр бюлопчних ефектГв. РанГше вчеш щентифшували мозко- i кль тинно-специфГчний опосередкований окси-дативним стресом мехашзм бГосинтезу цього гормону в мозку щурГв, бикГв i людини. Цей альтернативний шлях шдукуеться проокси-дантними речовинами, такими як Fe2+ i бета-амГлощний пептид. Використовуючи зразки тканини мозку, одержан з контролю i вГд пацГентГв з хворобою Альцгеймера, вони от-римали докази, що гормон утворюеться в мозку пащентав з хворобою Альцгеймера як продукт, опосередкований оксидативним стресом через метаболГзм попередника, що знижуе рГвш цього попередника в кровь Дослщники перевГрили присутнГсть попередника ДГЕА в сироватщ кровГ людини, застосовуючи просту, засновану на Fe2+ ре-акцГю, i визначили шльшсть утвореного ДГЕА. 1з 86 осГб, залучених у дослГдження, 19 чоловГкГв i 20 жшок мали хворобу Альцгеймера; 18 чоловшГв i 22 жГнки вщповщно-го вГку становили групу контролю; у 4 чоловшГв i 3 жшок спостершалися помГрш когштивш порушення. Окиснення сироватки призвело до рГзкого пГдвищення рГвнГв ДГЕА в контрольнш групГ, тодГ як у сироватщ пащенйв з хворобою Альцгеймера пГдвищення рГвня або не спостершалося, або було незначним.

ЗмГни в рГвш ДГЕА пГсля окиснення сироватки корелювали з когштивним i пси-хГчним станом пацГентГв. Результати дослГдження показали, що порГвняння рГвшв ДГЕА в сироватцГ кровГ пацГентГв до i шсля окиснення може стати корисним шструментом для дГагностики хвороби Альцгеймера. «1снуе чГтка корелящя мГж вГдсутнГстю можливостГ отримати ДГЕА шляхом окиснення кровГ i ступенем ког-нГтивних порушень, що супроводжують хворобу Альцгеймера, — зазначив Пападопу-лос. — Ми показали, що можна точно i неодноразово дГагностувати хворобу Альцгеймера на основГ невеликих зразшв кровГ. АналГз дозволяе проводити й диференщаль-ну дГагностику раншх стадГй хвороби Альц-геймера, а це означае, що його можна вико-ристовувати як тест на це захворювання на самому початку». «Проте реалГзащя по-тенцГалу будь-якого методу терапп зале-жить вГд достовГрностГ дГагнозу», — додав Пападопулос.

На цей час, встановлюючи дГагноз хвороби Альцгеймера, дослГджують сГмейну ГсторГю, оцГнюють психГчний стан i прово-дять фГзичнГ тести, в яких особливу увагу придГляють неврологГчним симптомам. Тому точний, раннш i специфГчний неГнвазивний бГохГмГчний тест, що корелюе з клшГчними даними, е життево важливим. Дослщники вважають, що тест на ДГЕА методом окис-нення кровГ може бути використано для дГагностики хвороби Альцгеймера на най-рашшш ïï стадп, а також для мошторингу ефективностГ терапп i прогресування захво-рювання.

Джерело:

http://lifesciencestoday.ru/index.php/ vesti-iz-laboratoriy/410-blood-test-for-alzheimers-differential-diagnosis-at-

an-early-stage

«Протоклггини» доставляють терапевтичнi та дiагностичнi засоби в ядро раково!' кл^ини

Об'еднавши нанотехнологГчнГ методи з результатами медичних дослГджень, учеш НацГональних лабораторш СандГа (Sandia National Laboratories), Ушверситету Нью-МехГко (University of New Mexico, UNM) та Дослщницького i лшувального онколопчно-го центру (Cancer Research and Treatment Center, CRTC) при UNM розробили ефектив-ну стратепю використання наночастинок для знищення ракових клГтин.

У статть що анонсуеться на обкладинщ травневого номера журналу Nature Materials, доступного в он-лайш, ученГ описують кремшевГ наночастинки розмГром близько 150 нм у дГаметрь що нагадують бджолиш соти, порожнини яких можуть бути запов-ненГ великою кГлькГстю рГзних лГкарських препаратГв.

Наночастинки й утвореш з лГпосом мемб-рани, що ïх оточують i практично е ана-логГчними клГтинним, разом складають комбшащю, яку можна розглядати як «про-токлГтину»: мембрана «запечатуе» смерто-носний вантаж i модифГкуеться молекулами (пептидами), що специфГчно зв'язуються з рецепторами, ям суперекспресуються на поверхн ракових клГтин. (Дуже велика шльшсть рецепторГв — один Гз сигналГв того, що клГтина е раковою). Наночастинки за-безпечують стабГльшсть мембрани i мГстять терапевтичний (або дГагностичний, наприклад квантовГ крапки) вантаж, вивГльняючи його усерединГ клГтини.

Зображення протоклггини (кршгенна ТЕМ) з нанопорисгим ядром i лшщним бшаром зав-говшки близько 4 нм (фото: nature.com)

Сьогодш схваленою Управлшням з контролю над яшстю харчових продуктiв i лiкарських 3a^6iB США (U.S. Food and Drug Administration) стратепею доставлен-ня терапевтичних препаратав за допомогою наночастинок е використання лшосом. Порiвняння цiльових лшосом i протокл^ин з iдентичними мембранами i пептидними композищями показало, що здатшсть дос-тавляти бiльшу шльшсть препаратiв, ста-бiльнiсть i ефектившсть таргетингу прото-клiтин зумовлюють багатократне посилення цитотоксичносй, специфiчно спрямовано! на клггини раку печiнки людини.

1нша перевага протоклiтин над лшосома-ми, на думку провщного автора дослщження Карлi Ешлi (Carlee Ashley), полягае в тому, що використання лшосом як носив вимагае спецiалiзованих стратегш завантаження, що ускладнюе процес !х виробництва. На вщмшу вiд звичайних лшосом, нанопорист кремнiевi частинки практично просто вби-рають лiкарськi препарати, завантажую-чись унiкальними комбiнацiями, необхщни-ми для персоналiзованоi медицини. Крiм препаратiв хiмiотерапii, вони ефективно шкапсулюють токсини i малi iнтерферуючi РНК (siRNA), що пригнiчують експресiю гешв. РНК, бюлопчш месенджери, що «сиг-натзують» клiтинам, якi протеши вони по-виннi синтезувати, у цьому разi використо-вуються для шпбування синтезу — один зi способiв спричинювати запрограмовану клiтинну смерть, або апоптоз.

Складовi мембрани — лшщи слугують щитом, що обмежуе просочування токсич-них препаратiв хiмiотерапii з наночастинок доти, доки вони не проникнуть у ракову кл^ину. Це означае, що в оргашзм пащента

потрапить менша шльшсть отрути, якщо протокл^ини не вiднайдуть ракових кль тин. Таке покриття пом'якшуe токсичш побiчнi ефекти, практично неминучi пщ час проведення традицiйноï онкоxiмiотерапiï. Замють цього досить маленькi, щоб залиша-тися непомiченими «радарами» печiнки та шших органiв, частинки можуть циркулю-вати в кровi протягом багатьох дшв або навiть тижнiв, залежно вщ ïxнього розмiру, шукаючи свою жертву i не зашкоджуючи органiзмовi.

Застосовуючи даш створеноï в CRTC 6í6-лiотеки фагiв — вiрусiв, що вражають бактерп, ученi виявили пептиди, що специ-фiчно зв'язуються лише з раковими кл^и-нами.

НарЗВ H«p»tcxyt«

4 " •

to., m I ЗОмт

На 3HÍMKy з.тва (Hep3B) показано клiтину раку печiнки, що флуоресцiюe зеленим, з протокл^инами, що мiстяться в нiй.

Маленьк 4epB0HÍ крапки — лiпiднi б^аров1 «упаковки». 1хнш «вантаж» — заповнеш лшарсь-

кими препаратами наночастинки — проникае в ракову клiтину. Тут 1хш пори заповненi бiлим флуоресцентним барвником з метою вiзуалiзацil. На зшмку справа: протоклiтини не проникають в здорову клiтину печiнки (гепатоцит) (фото Carlee Ashley)

Учеш продовжують оптимiзувати po3MÍp наночастинок з пористого кремшю, що !х отримують аерозолiзащею розчину поперед-никiв. Розроблений лабораторieю Брiнкера процес виробництва пористих наночасти-нок — iндуковане випаровування самозби-ранням, дозволяе отримувати частинки вщ 50 нм до дешлькох мiкрон у дiаметрi. Частинки розмiром вiд 50 до 150 нм щеаль-но пiдходять для максимально тривало! циркуляцii в кровi i поглинання раковими клггинами, тому до перетворення в про-токлiтини вони заздалегщь вiдбираються за розмiром.

Зараз метод тестуеться на людських ракових кл^инах in vivo, i найближчим часом

учеш приступлять до його перевГрки на пух-линах мишей. За ïхнiми оцГнками, комер-цГйно доступним вш може стати протягом п'яти рошв.

Джерело:

https://share.sandia.gov/. ..o-treatment/ http://www.nanonewsnet.ru/news/2011/ meditsina-nanotekhnologii-protiv-raka-protokletki-dostavlyayut-terapevtich-

eskie-diagnostic

За регенеращю органiв у хребетних ввдповвдае набiр напiвспецiалiзованих стовбурових клгтин

ВГдростання вГдГрваного плавника, ноги або хвоста у риб i амфГбш вщбуваеться не за рахунок единих i ушверсальних стовбурових клГтин, як вважалося, а за допомогою набору рГзних клГтин, кожна з яких вщнов-люе певний тип тканини.

Danio rerio (фото Elma_Ben)

Регенеращя органГв у хребетних вимагае щлого набору стовбурових клГтин, як пока-зують у свош статтГ дослГдники медичного факультету Вашингтонського ушверситету (США). Здатнють до вгдновлення втрачених органГв е у багатьох хребетних: пригадаемо хоча б яшДрок або саламандр з тритонами. Тривалий час вважали, що вГдновлення кшщвок вщбуваеться за рахунок единих стовбурових клГтин (СК). За щею теорГею, клГтини в мГсцГ ампутацiï втрачали свою спещалГзащю i ставали стовбуровими. ОскГльки всГ вони виглядали однаково, було вирГшено, що вГдростання ноги або хвоста вщбуваеться за рахунок СК, подГбних до ембрГональних, ям можуть перетворитися на клГтину будь-якоï тканини. СтГвен Джонсон i Шу Ту дослГджували регенерацГю плав-никГв у Danio rerio — акварiумноï рибки i популярного модельного об'екта. ПодГбно до саламандр, Danio здатш швидко вщновлю-вати втрачене за рахунок групи клГтин, як1 з'являються на мющ ампутаци вГдразу

пГсля операцiï; i на вигляд щ клГтини не вГдрГзняються одна вГд одноï. ДослГдники вводили в ДНК клГтин на мющ ампутаци фрагмент, що кодуе флуоресцентний про-теш. Усе потомство цiеï клГтини несло кошю такоï ДНК i свГтилося зеленим. I якби загою-вальнГ клГтини дГйсно вГдновлювали вй тканини в новому плавниковГ, то зеленим свГти-лися б i клГтини шкГри, i нервовГ клГтини, i клГтини кровоносних судин. Але такого не вщбувалось. Якщо ДНК зеленого протешу вводили в клГтину шкГри, то в новоутвореному плавниковГ зеленим свГтилася тГльки шшра. Те ж саме спостерГгали i в разГ нервових, Гмун-них, кюткових та Гнших типГв клГтин. Тобто клГтини на мющ розриву тканини не перетво-рювалися на всемогутш ембрГоноподГбнГ, а давали тГльки свш власний тип тканини, шак-ше кажучи, ставали тканиноспецифГчними СК. Таких клГтин дослГдники налГчили 9 типГв. За словами учених, таким же чином це вщбуваеться й у Гнших тварин: амфГбш, ящДрок i т. д., аж до людини. Зроблене вгд-криття мае полегшити завдання медикам, як1 займаються загоенням ран, i за допомогою ре-генеративноï медицини вирГшити проблему, адже при цьому не потрГбно отримувати складш й нестабГльнГ ембрГоноподГбнГ клГтини загальноï спецiалiзацiï, цГлком достатньо буде обмежитися частково стовбуровими.

Джерело:

http://science.compulenta.ru/610939/

Нова програма для нейрональних стовбурових клгтин

Нейральш стовбуровГ клГтини можуть робити багато що, але не все. Наприклад, клГтини головного або спинного мозку, як правило, з'являються не з нейрональних стовбурових клГтин периферичноï нервовоï сис-теми, а клГтини останньоï неможливо отри-мати зГ стовбурових клГтин головного мозку. Проте ученим з 1нституту вивчення головного мозку Макса Планка (Max Planck Institute for Brain Research) у Франкфурта та 1нсти-туту Гмунобюлоги й ешгенетики Макса Планка (Max Planck Institute of Immuno-biology and Epigenetics) у ФрайбурзГ вдалося отримати клГтини центральноï нервовоï сис-теми з нейрональних стовбурових клГтин пе-риферичноï нервовоï системи.

ДослГдники встановили, що за певних умов стовбуровГ клГтини периферичноï нервовоï системи трансформуються в олГгодендроцити — клГтини, як створюють мГелГновГ оболонки нервГв як головного, так i спинного мозку.

Нервова система ссавщв складаеться з центрального (головний i спинний мозок) i периферичного (наприклад, нерви i сенсор-ш ганглп) вГддГлГв. Хоча цГ вщдГли дуже тГсно взаемозв'язанГ, вони вГдрГзняються анатомГчно i представленГ рГзними типами клГтин. Кттинш типи периферичноï нерво-воï системи походять вГд клГтин-попередни-кГв ембрГона — нервового гребеня. Дотепер вважали, що стовбуровГ клГтини нервового гребеня можуть диференщюватися в нейрони i глГальш клГтини периферичноï нервовоï системи (ПНС), але не в клГтини централь-ноï нервовоï системи (ЦНС).

Вид клГтин, в який диференщюються стовбуровГ клГтини нервового гребеня, чГтко визначаеться умовами навколишнього мГкросередовища. Шддавши стовбуровГ клГтини периферичноï нервовоï системи ембрю-нГв i новонароджених мишей впливу рГзних умов, шмецьш вченГ разом зГ своïми фран-цузькими колегами показали, що зГ змГною умов цГ стовбуровГ клГтини можуть диференщюватися i в клГтини центральноï нерво-воï системи. ОкрГм нейронГв, стовбуров1 клГтини нервового гребеня розвивалися в рГзш типи глГальних клГтин ЦНС, включа-ючи олГгодендроцити й астроцити.

«Культуральне середовище перепрогра-мовуе стовбуровГ клГтини нервового гребеня таким чином, що вони змшюють свою щен-тичшсть. Це працюе без генетичноï мо-дифiкацiï клГтин», — пояснив Герман Рорер (Hermann Rohrer) з 1нституту вивчення головного мозку Макса Планка.

Фактори культурального середовища чГт-ко активували рГзш генетичнГ програми, i з1 стовбурових клГтин розвивалися клГтини, як зазвичай з них не розвиваються. Учеш поки що не розумГють, ям саме фактори ввдграють тут свою роль. Проте е деяк тдстави вважати, що в цю трансформащю залучений фактор росту фГбробластГв — FGF.

У мозку мишей на рГзних стадГях його розвитку перепрограмоваш стовбуров1 клГтини в бГльшостГ випадкГв розвивалися в олГгодендроцити, створюючи мГелшову обо-лонку навколо нейронГв ЦНС i, отже, вони е необхгдними для передачГ електричних сигналГв. Експерименти з трансплантацп, проведенГ дослГдниками на генетично моди-фГкованих мишах, ям не здатнГ синтезувати мГелГн i мають серйозш неврологГчнГ дефек-ти, довели, що це завдання можуть узяти на себе новГ олГгодендроцити.

«ПерепрограмованГ стовбуровГ клГтини можуть диференщюватися в клГтини централ ьноï нервовоï системи, i новГ клГтини

здатш постшно штегруватися в цю систему», — зазначив Вердон Тейлор (Verdon Taylor) з 1нституту Гмунологп та ешгенети-ки Макса Планка.

Поки що незрозумГло, якою мГрою нов1 фундаментальш вщкриття сприятимуть роз-витковГ клГтинно! терапп. Це вимагае того, щоб, по-перше, так стовбуровГ клГтини були присутш й доступнГ в ЦНС людини i, по-друге, щоб !х можна було розмножити i перепрогра-мувати в культурь «На сьогоднГ ми знаемо тГльки те, що в мишей цГ стовбуровГ клГтини мають потенщал диференщюватися в олГгодендроцити», — зауважив Герман Рорер.

Трансплантащя перепрограмованих нейрональних стовбурових клтшн в головний мозок генетично модифжованих мишей, не здатних

синтезувати м1елш. Стовбуров1 кл1тини диференц1ювалися в ол1годендроцити (зелеш), як1 синтезували м1ел1н (червоний) (фото: © MPI fur Hirnforschung)

Учеш планують детальшше вивчити, як1 молекулярш механГзми вГдповГдальнГ за пе-репрограмування цих стовбурових клГтин, чи присутш стовбуровГ клГтини нервового гребеня в периферичнш нервовш системГ до-рослих мишей, i ям умови необхщш для ïх перепрограмування.

ОригГнальну статтю: «Peripheral Nervous System Progenitors Can Be Reprogrammed to Produce Myelinating Oligodendrocytes and Repair Brain Lesions» було опублшовано в The Journal of Neuroscience.

Джерело: http://www.sciencedaily.com/ releases/2011/05/110512103948.htm; http://www.nanonewsnet.ru/news/2011/no vaya-programma-dlya-neiralnykh-stvolovykh-kletok

Стовбуровi клгтини з жиру для гканинно-iнженерних шсток

ШвейцарськГ вченГ з УнГверситетського госпгталю в БазелГ (University Hospital Basel) дослгджували, чи можливе формування in vitro судинних структур з культивованих

ендотелiальних i мезенхiмальних клгтин-попередникiв, отриманих зi стромально'1 васкулярно! фракцп (SVF) людсько! жиро-во! тканини. Вирощеш судиннГ структури дадуть змогу полшшити ефективнiсть i рГв-номГрнГсть формування шстково! тканини in vivo на тдкладки, що закривають дефек-ти критично! величини. Свiжовидiленi людськГ клГтини SVF висiвали на гщроксь апатитовi пiдкладки (дiаметр i товщина — 1 см) i культивували на перфузшному бюре-акторi, що дозволяло тдтримувати зростання ендотелiальних клiтин-попередникiв. Як контроль використовували очищенi вГд васку-логенних клГтин стов6уровГ клГтини двох титв: вирощуванГ моношаром адипознГ стро-мальнГ клГтини (ASC) i вщповщного вГку стро-мальнГ клГтини шсткового мозку (BMSC).

Через 5 дГб культивування одержан з SVF ендотелГальш й мезенхГмальнГ клГти-ни-попередники сформували кашлярну сГт-ку, яка дала анастомози Гз судинами реци-шента вже через 1 тиждень тсля ектотчно'1 Гмплантацп позбавленим ГмунГтету щурам. ПорГвняно з BMSC i ASC SVF-клГтини забез-печували швидшу (через 8 тижшв) ште-грацГю в тканину, бГльш рГвномГрне й об'емне формування шстково! тканини з осифшата-ми, що проростають на глибину до 3,5 мм вГд поверхш пГдкладки.

Результати дослГдження показали, що SVF-клГтини мезенхГмально!/ендотелГаль-но! фракцп вГдГграють ключову роль у ство-ренш остеогенно! конструкцп з пГдвищеною здатшстю до приживлення. вдине досяжне джерело цих клГтин i вГдпрацьований стан-дартний процес !х культивування в проточному бюреакторГ роблять запропонований шдхщ вельми привабливим для вирощуван-ня in vitro i клшГчного застосування для замГщення дефектГв шстково! тканини тран-сплантатГв потрГбно! форми i величини.

МатерГали дослГдження наведено в статтГ: Gеven S. et al. Engineering of large osteogenic grafts with rapid engraftment capacity using mesenchymal and endothelial progenitors from human adipose tissue. Biomaterials.

Джерело:

http://www.stemcells.ru/news-444

Створено антитша, здатш долати гематоенцефалггичний бар'ер

Ученим вдалося створити антитГла, що без зусиль долають гематоенцефалГчний бар'ер, що роздГляе системний кровотш ор-ганГзму i кровоносну систему головного моз-

ку. НовГ дат становлять великий потенцГал для створення терапп на основГ антитГл, яка може бути використана для лшування хвороби Альцгеймера та шших захворювань нервово! системи

АнтитГла — розчинш протеши, присутнГ в сироватщ кровГ i тканинно! рГдини, що бе-руть участь в Гмуннш вГдповГдГ проти чу-жорщних агентГв. Вони високоспецифГчнГ, тому вчеш дедалГ частГше прагнуть створити антитГла, здатш зв'язувати бГльш нГж одну молекулярну мГшень.

Антитiла, що зв'язують бiльш нiж одну молекулярну мшень, здатнi подолати гематоенцефалiчний бар'ер (фото: Genentech)

«Ми наблизилися до створення бюпеци-фичних антитал», — повщомив Райан Уоттс (Ryan Watts), нейробюлог з бютехнолопч-но! фiрми Genentech (США), що е пiонером у створенш терапевтичних антитiл. «Перевага нашо! розробки в тому, що багато з цих антитал будуть здатш подолати гематоенце-фалiчний бар'ер, який захищае головний мозок вщ патогенiв, перешкоджаючи про-никненню всередину великих молекул ль карських засобiв», — зазначив Уоттс.

У двох статтях, опублшованих в журнал1 Science Translational Medicine, вченi представили дизайн нових антитал. Антитiла здатш розтзнавати i зв'язуватися з двома протешами-мшенями. Перший проте'!н, названий бета-секретазою 1, е поширеною мiшенню для багатьох препаратав, викорис-товуваних у терапп хвороби Альцгеймера, осшльки вщпрае важливу роль у продуку-ванш мономерiв бета-амiлоiду в головному мозку. Згщно з «амiлоiдною гiпотезою», основною причиною захворювання е вщкла-дення конкрементав протешу — бета-ам^о'!-ду в головному мозку, що призводять до його ушкодження.

Другим проте'ном, що зв'язуеться анти-тiлами, е рецептор трансферину, що активуе

молекулярш юнш канали, ям здГйснюють транспортування юшв залГза в головний мо-зок. Зв'язуючись Гз цим рецептором, антить ла транспортуються в головний мозок, де шпбують функцiï бета-секретази 1. Функ-цГя антитГл була перевГрена на моделГ хвороби Альцгеймера у мишей: через день шсля ш'екцп антитГл концентрацГя бета-амглощу в головному мозку тварин знизилася на 47%.

Для досягнення цих результатГв груш фахГвщв компанiï Genentech необхгдно було кинути виклик ще одному правилу створен-ня антитГл. Сила взаемодп мГж антитГлом i мГшенню називаеться афГннГстю: чим ви-ща афшшсть антитГла, тим сильнГша вза-емодГя. БГльшГсть бГологГв прагнуть отримати антитГла з максимально високою афшшстю. Райан Уоттс i Марк Деншс, бюшженери з компанп Genentech, теж почали роботу з отримання високоафшних антитГл до рецептора трансферину, однак виявили, що таш антитГла не здатш долати гематоенце-фалГчний бар'ер. Проте пГсля зниження афшност антитГл проблему проникнення через кровоносш судини було вирГшено [2].

За словами бюшженера-розробника ДевГда ГГлберта (David Hilbert) з бютехно-логiчноï компанп Zyngenia (США), низько-афГннГ мультиспецифГчш антитГла можуть застосовуватись у багатьох галузях. Наприклад, раковГ клГтини часто щентифшу-ють на основГ комбшацп декГлькох маркер-них протешГв на ïхнiй поверхнГ. Однак щ самГ маркери, але в Гнших поеднаннях можуть бути присутш й на поверхнГ здорових клГтин. Традицшш високоафшш монокло-нальнГ антитГла здатш вбити здоровГ клГтини разом з раковими, але низькоафшш антитГла будуть бГльш вибГрково зв'язуватися з раковими клГтинами.

Проте не вйм ученим подобаеться щея використання низькоафГнних антитГл. «З техшчного погляду робота хороша, але, за великим рахунком, я думаю, що вони зайш-ли в безвихгдь», — зазначив ВГльям Пад-рГдж (William Pardridge), ендокринолог з КалГфорнГйського УнГверситету в Лос-АнджелесГ (США) i засновник бютехноло-гiчноï компанiï ArmaGen, який тривалий час займався вивченням гематоенцефатч-ного бар'ера. За словами Падрщжа, його компанп вдалося отримати антитГла, що до-лають гематоенцефалГчний бар'ер за допомогою тих самих рецепторГв, однак зниження афшност антитГл не було потрГбно. Падрщж додае, що для досягнення бажаного ефекту будуть потрГбш необ^рунтовано висом дози низькоафГнних антитГл.

Уоттс запевняе, що дози антитГл, вико-ристовуваш в експериментах з мишами, не були надмГрно високими. «Для людини щ дози будуть ще меншГ, оскГльки в нашому оргашзмГ антитГла довше залишаються ак-тивними перед руйнуванням. Ми маемо намГр рухатися вперед. Проведена робота була лише перевГркою концепцiï. Дат ми пла-нуемо застосувати ïï до Гнших мГшеней в центральнш нервовГй системГ», — наголо-сив Уоттс.

Джерело:

http://www.cbio.ru/modules/news/ article.php?storyid=3792

Автономне репрограмування соматичних клгтин у стовбуров1 без внесення чужорвдно!' ДНК

НайважливГше вГдкриття останшх ро-кГв, що змГнило можливостГ регенеративно! медицини, — перетворення соматичних клГтин на плюрипотентнГ, по сутГ стовбуровГ, клГтини, для чого в геном клГтин вбудову-ють декГлька певних генГв, факторГв тран-скрипцiï, що повертають клГтиш здатнГсть до диференцГювання за декГлькома напря-мами. Цей пГдхГд значно розширив можливостГ автологiчноï клiтинноï терапiï i дозволив краще зрозумГти механГзм багатьох захворювань, видГляючи пащентспецифГчш лiнiï плюрипотентних клГтин. Було запропо-новано декГлька рГзних стратегш отримання Гндукованих плюрипотентних стовбурових клГтин (1ПСК), зокрема без епiгенетично! модифшацп i внесення до клГтини чу-жорГдних генГв. Мета розроблення нових шдходГв до отримання 1ПСК — не тГльки краще зрозумГти мехашзми диференцГювання клГтин i розвитку захворювань, але й створити придатш для клшГчного застосу-вання лшп стовбурових клГтин, що не несуть генетичних змш i онколопчно безпечш для пацГента.

Група американських учених з Медично-го центру ушверситету шт. Небраска, США (University of Nebraska Medical Center) у своему оглядГ обговорюе рГзш стратеги отримання 1ПСК, особливу увагу придГляючи сучасним неклГтинним пГдходам до репрограмування соматичних клгтин-поперед-никГв у стан стовбурових за допомогою сти-муляцiï ендогенних факторГв транскрипцп. В оглядГ головним чином розглядаеться отримання плюрипотентних клГтин для усу-нення пошкоджень ропвки.

Матерiали дослщження подано в статт Parameswaran S. Balasubramanian S. Rao M. S. Ahmad I. Non-Cell Autonomous Reprogramming: A Nucleic Acid Free Approach to Induction of Pluripotency.Stem Cells. 2011 May 4. doi: 10.1002/stem.655.

Джерело:

http://www.stemcells.ru/news-274 Генетичш вшни: генна iнженерiя

Проблему запобГгання бютероризмов1 слГд розглядати не тГльки вГдносно безпосе-редньо само! загрози застосування бюлопч-но! збро!. Останш документи ООН потребу-ють ширшого аналГзу i рГшучГших дГй свГтово! спГльноти. Йдеться про розроблення системи мГжнародно-правового i, зокрема, мГжнародного полщейського контролю за можливими негативними (кримшальними) наслГдками бютехнологГчно! революцп.

У прийнятш 9 вересня 2006 р. консенсусом на Генеральнш Асамбле! ООН Гло-бальнГй протитерористичнГй стратеги Ор-гашзацп Об'еднаних НацГй запропоновано створити сшльно з державами-членами ООН едину всеосяжну базу даних про бюлопчш шциденти, здГйснивши заходи щодо того, аби вона доповнювала базу даних про бюлопчш злочини, яку мае намГр створити МГжнародна органГзацГя кримшально! поль цГ'х. Водночас Генеральному секретарев1 ООН рекомендовано вГдновити список екс-пертГв i лабораторГй, що е в його розпоряд-женнГ, а також техшчш керГвнГ принципи i процедури для своечасного й ефективного розслщування випадкГв використання таких засобГв. ВГдзначено також важливе зна-чення пропозицп Генерального секретаря ООН про об'еднання за сприяння Оргашза-ци Об'еднаних НацГй зусиль основних заштересованих сторГн у сферГ бютехноло-гп, включаючи промисловГ й науковГ кола, громадянське сусшльство i уряди, в рамках едино! програми, спрямовано! на забезпе-чення використання досягнень в галуз1 бГотехнологГ! тГльки для загального блага, а не в терористичних або шших злочинних цГлях, за належного додержання основопо-

ложних мгжнародних норм захисту прав штелектуально! власностГ.

Чому так гостро поставлено в Глобальнш контртерористичнГй стратеги ООН питання контролю над бютехнолопею? Можна багато й красиво говорити i писати про перспективи гумашстичного використання бГотехнологГ!, про «свГтле майбутне» людства, лГберальну евгеншу, лГкування спадкових захворювань, подовження людського життя практично до безкГнечностГ. Однак все це стосуеться лише легально! частини бютехнологГчно! рево-люцГ!. А Гснуе, i вже тривалий час, нелегальна (i практично завжди кримшальна) ïï складо-ва. НавГть коли цю нелегальну частину ре-алГзуе держава, i хай навГть сама е суперлГбе-рально-демократичною, вона завжди це робить таемно вщ сво!х громадян, демокра-тичних шститутав. I завжди така дГяльнГсть фактично протиправна i злочинна. Злочинна тому, що ГмГтуе дГяльнГсть, заборонену мГжна-родно-правовими документами i нацГональ-ним кримшальним законодавством.

Наука розвиваеться таким чином, що новГтнГ технологГ!, i бютехнолопя зокрема, по сутГ свош, мають «подвГйне призначен-ня». ТГ самГ генно-ГнженернГ методи, якГ да-ють змогу створювати лГки, можуть водночас бути застосоваш для створення збро!. ПередусГм це стосуеться розроблення бюло-гГчно! збро!. Як вщомо, КонвенцГю ООН про заборону розробки, виробництва i накопи-чення запасГв бактерГологГчно! (бГологГчно!) токсично! збро! i про !х знищення було прий-нято ще в 1971 р. Проте е численш свщчення того, що цей тГньовий напрям використання бГотехнологГ! розвивався i розвиваеться дал1 в крашах з абсолютно рГзними видами полГ-тичних режимГв. Причому зброю, створену на основГ генно! ГнженерГ! в рГзних модифша-цГях (генетичну, навГть етнГчну), розробляли ще з 60-х рошв минулого столГття, насампе-ред в СРСР i США. Вщомо, що крГм смертельно небезпечних генетично змшених вГрусГв розробляеться бГологГчна зброя, яка може бути етшчно нащленою i знищувати навГть ок-ремГ групи серед популяцГй (наприклад, залежно вщ статГ, вГку, рГзних антропо-логГчних ознак, якГ можна виявити шляхом аналГзу структури ДНК, що зберГгае генетич-ний код, за кольором шшри, розрГзом очей). За повщомленнями ЗМ1 на початку 2004 р. на семшарГ ЦРУ в США, що проводиться в рамках «Проекту нового американського столГття» (PNAC), американсьш вчеш стверджува-ли, що до 2014 р. таку зброю вже буде створено.

З конфщенцшно! доповщГ Пентагону, датовано! 1998 роком, що стала вщомою

журналГстам у 2002 р., випливало, що бюло-пчний агент може бути генетично трансформований, з тим щоб створити нову смертельну зброю. Ульям Коен, колишнш мШстр оборони США, повгдомив, що вГн отримував вщповщ з крат (ПАР, 1зра1ль), що працюють над створенням «певних титв патогенГв, як1 могли б бути етшчно специфГчнГ». Так, в ПАР велися роботи з розведення бактерш, здатних робити людей з чорною шкГрою безплгдними.

Американський бГолог Блек Дж. Л. (Black J. L.) наводить у своему дослщженш декГлька загальних категорш генГв, ям можуть використовуватись у генетичнш зброк гени, суттевГ для життя клГтин; мутантш гени, вГдповГдальнГ за спадковГ хвороби; токсич-нГ гени екзогенних видГв; ген, що кодуе вироблення ензиму, який забезпечуе пере-творення попередника токсину; вектори структури, що вражають окремГ людськ попу-ляцiï (наприклад, конкретнГ етшчш групи).

АкадемГк РАН О. Ф. Стрш пише, що Гснуе декГлька класГв генГв, якГ стають смертоносни-ми, пГсля того як вбудовуються в клГтину ха-зяша. Так гени запускають у клГтинах синтез речовин протеïновоï природи, що руйнують за-хисну i регуляторну системи, або просто украй токсичних. 1нфшований органГзм сам синтезуе отруту, яка його i вбивае. Для генетичноï збро", на думку академГка О. Ф. Стрша, е характер-ними тривалий латентний перГод i стльшсть симптомГв за величезноï рГзноманГтностГ мож-ливих причин патологи. Все це вкрай усклад-нюе дГагностику, лшування i профГлактику. Використовуючи генетичнГ конструкцп, щен-тичнГ фрагментам людського геному, як в певних умовах спричинюють захворювання, довести зовшшню дГю взагалГ неможливо.

Зараз можливе створення односпрямова-ноï бiологiчноï зброё безпечноï для агресора, наприклад на основГ «повГльних» i «спля-чих» вГрусГв з великими латентними перю-дами. Патогени поширювати легко, зробити це можна так, щоб джерело шфекцп зали-шилося невщомим. ВГдкриваеться можливГсть «тихоï бiологiчноï вшни», в якГй супротивник навГть не дГзнаеться, звГдки виходить небезпе-ка. Зникае останнш стримувальний чинник.

На змшу «Геному» приходить нова прог-рама «Протеом» з розшифрування й вивчен-ня призначення i взаемодп протешГв, не менш складна, шж «Геном», що вГдкривае шлях до абсолютноï зброï, яка дозволяе за будь-який вибраний термш — вГд декГлькох годин до десяткГв рошв — планомГрно зни-щити будь-як людськГ популяцп за ключови-ми генетичними ознаками, не побоюючись при цьому можливого удару у вщповщь.

Бютехнологи пГшли ще далГ: створено мшроби-мутанти, якГ знищують вибГрково неживу матерГю — нафту, пластик, метали, композитш матерГали тощо.

У краïнах, яш створювали бГологГчну зброю, цГ роботи проходили тд контролем вГй-ськових i спецслужб. Але шхто не може дати гарантш, що таш роботи не ведуться пГд контролем Гнших суб'ектав, зокрема терористич-них, фашистських i расистських оргашзацш, мафГозних структур та вчених-манГякГв.

Як вважае академш РАН О. Ф. Стрш, тим, хто захоче виготовити бГологГчну зброю, чи то екстремГстськи настроений уряд, опозицшна партГя, чи просто група громадян, не знадобиться будувати шститут з полшоном. Одна добре оснащена лабора-торГя, в якш працюватиме десятеро людей, щлком у змозГ зробити генетичну зброю. Тим паче, що, за оцшками експертГв, лабо-раторГя з виробництва бiологiчноï зброï в су-часних умовах, разом зГ всГм устаткуван-ням, може коштувати в межах вГд декГлькох десяткГв до декГлькох сотень тис. доларГв США, а як бюлопчна зброя можуть бути ви-користанГ й тГ патогени, яш конвенцГональ-но не заборонеш до застосування в дослГдниць-ких цглях для отримання дГагностичних систем, вакцин та Гнших медичних препаратав.

Американський вчений Роб Карлсон (Rod Carlson), фГзик i бюлог, що працював певний час Гз Брентом в MSI, прогнозуе, що приблизно протягом десятилГття створення бiологiчноï зброï з нуля стане таким же простим i дешевим, як побудова сайту.

Увагу журналютав привернув сайт компанп VH Bio Ltd, що займаеться постачан-ням устаткування i витратних матерГалГв для бюлопчних лабораторш. В одному з ка-талопв бГосировини було знайдено вельми дивш «товари»: на продаж виставили фраг-менти ДНК смертельно небезпечних для лю-дини вГруйв вГспи й Гспанського грипу. Для оформлення замовлення на ДНК вГспи зна-добилося лише назвати адресу, номер мобГльного телефона й адресу електронноï пошти, i вже через три години в редакщю The Guardian подзвонив кур'ер i повщомив, що замовлення доставлено. Жодних пе-ревГрок того, кому вГдправляеться потенцш-но небезпечний вантаж, проведено не було. Одержувачем мГг би бути як законослухня-ний учений, так i можливий терорист.

У цих умовах контроль за бютехно-лопчним ринком у мережГ мае стати важли-вим новим завданням полГцейських шдроз-дГлГв, якГ контролюють тГньовГ кримшальш ринки в 1нтернетГ.

Не меншу небезпеку становить розроб-лення нейрофармакологГчних засобГв контролю за поведшкою. Про те, що й щ роботи вже проводили, на вагомому фактичному матерГалГ написано достатньо багато книг. По сутГ, йдеться про розроблеш види психотропно! збро! на основГ бГотехнологГ!.

Ще наприкшщ 50-х рокГв А. Берл, на той час помГчник державного секретаря США, який брав участь у програмах ЦРУ з контролю поведшки за допомогою нейрофармако-логГ!, записав у своему щоденнику: «Я побо-ююсь одного. Якщо вчеш зроблять те, що запланували, то люди перетворяться на му-рашок, якими маншулюють».

Школи з тГнГ не виходитимуть i евгешчш роботи з надГлення людини надвластивостя-ми (гГперагресГею, гшервитривалютю, гь перреакцГею, нечутливГстю до болю, спеки, холоду, баченням у темрявГ i т. д.). Результата тако! науково! дГяльностГ цГкавлять пе-редусГм вГйськових i спецслужби. Але й шш1 зазначенГ вище суб'екти не обшдуть це стороною. Наприклад, мафюзш структури, що «обслуговують» спорт (а вГрнГше грошГ, що !х заробляють на спортГ), вже зараз активно сшвпрацюють з тшьовими ученими в роз-робленнГ нових засобГв, якГ пГдвищують ви-тривалГсть спортсменГв. При цьому головне завдання тут — розроблення препаратГв, яш неможливо виявити за допомогою тестування.

У березнГ 2006 р. в США проходила перша мГжнародна зустрГч експертГв, присвяче-на питанням генетичного дошнгу. На нГй на-голошувалося, що олГмпГади ХХ1 столГття багато в чому будуть змаганнями фармако-логГ! i генетикГв. На сьогодш вщомо три гени, якГ, ймовГрно, використовуватимуться спортсменами i якГ неможливо буде визначи-ти Гснуючими методами, причому !х можна вводити безпосередньо в м'язову тканину як звичайну вакцину: модифшований вГрус, який менш уразливий до бунту Гмунно! сис-теми (adeno-associated viruses AAVs); другий ген зростання клГтин внутрГшньо! поверхш судин (vascular endothelial growth factor VEGF); третш ген, що сприяе нарощуванню м'язГв, i вш замГнить забороненГ зараз сте-ро!ди (insulin-like growth factor 1 IGF-1). Дон КетлГн (Don Catlin), бюхГмш, який працюе в КалГфорнГйському ушверситета, вважае, що визначити наявнГсть цих гешв в оргашзм1 спортсменГв буде практично неможливо.

З великою часткою ймовГрностГ можна припустити, що, незважаючи на будь-як1 можливГ обмеження i заборони, проводити-муться роботи з нелегального клонування людини i навГть створення людиноподГбних

химер. Тим паче, що технологи для цього вже створено.

Група вчених з 2-го Шанхайського медуш-верситету тд керГвництвом Хуейчжень Шен створила понад 100 гГбридних ембрюшв, з'еднавши клГтини людсько! шкГри з яй-цеклГтинами кроликГв. ГГбридам протягом декГлькох днГв дозволили розвиватися в лабо-раторних блюдцях, а пойм знищили, щоб от-римати з них ембрюнальш стовбуровГ клГтини. Законодавство Китаю не дозволяе вирощувати ембрюшв для дослав бГльше 14 дшв. СтовбуровГ клГтини, отриманГ з гГбридних ембрюшв, здатш до росту протягом тривалих перюдГв часу в лабораторних умовах i можуть перетворю-ватися на будь-який вид клГтин.

Бюлог з Гарварду Дуглас Мелтон вщзна-чив, що створення китайцями «фантастичного» ембрюна може комусь нагадати химеру з грецько! мГфологи з головою лева, головою козла i хвостом зми, але це — не перший випа-док, коли вчеш змГшують в лабораторГ! клГтини людини i тварин. Були, наприклад, експе-рименти з мишами, яких для дослщжень «забезпечували» клГтинами людського мозку або частинами Гмунно! системи.

Британська бютехнолопчна компанГя Imutran з початку 90-х рокГв минулого столГття розводить свиней для використання в трансплантаци людинь Багато дГабе-тикГв було пГдключено до свинячих печшки i нирки в апаратах тимчасового дГалГзу. Проект компани PPL (США) включае створення стада корГв, що виробляють людськГ про-те!ни, i кроликГв з людським кальцитош-ном, який допомагае замщати кГстку.

КомпанГя Pharmino (Нщерланди) займаеть-ся виробництвом в оргашзмГ корГв людського лактоферину, який активГзуе Гмунну систему.

КорпорацГ! Genzyme Transgenics i Advanced Cell Technology сшвпрацюють, щоб створити стада худ оби, яка буде носГем людсь-ких проте!шв у кровГ i м'ясГ, наприклад, таких як альбумшова сироватка, використо-вувана для шдтримки рГдиною балансу кро-вГ у жертв ошшв. УченГ генетично модифь кують свиней з людськими протешами, що слугують як ГдентифГкацГйний сигнал для Гмунно! системи людини. Це приймаеться системою захисту людського оргашзму таким чином, що орган не вГдторгаеться.

Незважаючи на мораторш Ради ввропи на клшГчне тестування трансплантатГв з ор-ганГв тварин на людях, уведений ще в йчш 1999 р., роботи в цьому напрямГ тривають.

Клонування тварин для використання !х як фабрик гормошв для людей розвиваеться посиленими темпами. Ця технологГя щка-

вить учених i компанп через шлькють органГв, гормони i фармацевтичш препарати, ям можна отримати таким чином.

КоролГвський жшочий госпГталь в Мель-бурш (Австратя) створюе мишу, яка синте-зуе людську сперму, трансплантуючи ш клГтини людських яечок. В Япони ушверси-тет у м. ТотторГ досяг таких самих резуль-татГв, i тепер учеш з цього закладу хочуть спробувати заплщнити людську яйцеклГти-ну спермою, синтезованою мишею. Жшоче молоко вироблятимуть корови i кози.

ОскГльки бютехнолопчна революцГя вщ-кривае можливостГ для реалГзаци будь-яких людських фантазГй, завжди знайдуться суб'екти, готовГ ïх використовувати в суто утилГтарних цГлях (вшськових, оператив-них, комерцГйних). Де, наприклад, гаранти того, що мафГознГ структури в майбутньому не оргашзують нелегальш постачання людських клонГв для садомазохГстських утГх рГзного роду збоченщв або людиноподГбних химер для приватних зоопаркГв?

Клонування людини — процес на цей час ще проблематичний (багато вчених-гене-тикГв й досГ сумшваються в можливостГ кло-нування людини, незважаючи на появу клонГв тварин) i вельми витратний.

Криза клонування, що посилилась Гз початком цiлоï епопеï передчасних смертей перших клошв великих ссавцГв, спонукала до перегляду теорш i методГв, якГ застосовували пГд час клонування. Учет вщзначають, що складнГсть будови людських хромосом зробить цей процес стосовно клонування людей ще важчим.

На сьогодш шГсть рГзновидГв ссавцГв: вГв-ця, миша, кролик, свиня, корова i шшка змогли пройти устшно процедуру клонування, але численш спроби досягти подГбних ре-зультатГв з приматами були невдалими.

Можна висунути достатньо об^рунтовану гГпотезу про те, що можлива поява псевдо-клонування людини, людських органГв i тканин. Маеться на увазГ заява про клонування людських органГв, лептимГзащя цього процесу в гуманних цглях (наприклад, для замши хворих органГв), а насправдГ, здшснення кримшального обороту реальних людських органГв i тканин тд виглядом продуктав клонування. Зараз ставити на кон-веер вбивство людей з метою вилучення орга-шв для кримГнальних структур е все-таки морочливим i небезпечним. Немае легального прикриття. ЛегалГзащя клонування вГдкривае для цього широкГ можливостГ. Причому попит на тшьовому ринку трансплантологи цей процес прискорюватиме. Набувае дедалГ бГльшого поширення так зва-

ний «трансплантацшний туризм» до 1нди i Пiвденно-Схiдноï Азiï (по сутГ небезпечний рГзновид мафГозного ринку трансплантаци).

1ншим напрямом дГяльностГ мафюзних структур стало використання генноï шженерп для виведення стшких сортГв нарко-вмГсних рослин з метою пГдвищення ïхньоï врожайностГ, захисту вГд шкГдникГв i т. д.

Тшьовий розвиток бiотехнологiï вщбу-ваеться не тГльки в «законстрованих приватних володшнях», а, як було вже зазначено, в державних лабораторГях, тд контролем вГйськових i спецслужб. I саме це робить мГжнародно-правовий контроль за тшьовим (кримГнальним) використанням бютехнологи найскладнГшим зГ всГх Гнших видГв контролю.

КрГм того, вченГ об^рунтовано наголошу-ють на абсолютно рГзних тдходах у регулю-ваннГ бютехнологи в европейських i азшських крашах. Наприклад, Гудео-християнське уяв-лення Заходу про святють унiкальноï особи не е ушверсальним. В Гнших частинах свГту, наприклад в Азiï, погляд на проблему бютехнологи людини значно менш сентименталь-ний. Отже будь-яш дослГдження там можуть здшснюватись практично безперешкодно.

Азшсьш традицiï на кшталт буддизму i синтоïзму не проводять рГзких етичних вГдмГнностей мГж людством i рештою творГння, як це властиво християнству. Саме тому в Азп рашше була поширена така практика, як шфантицид (вбивство дГтей), а зараз китайське керГвництво вирГшило впровадити ди, на За-ходГ неприпустимГ, зокрема, взяття органГв в ув'язнених, як пГдлягають смертнш карГ. При цьому азГйськГ краши на цей час во-лодГють науковою Гнфраструктурою, необхщ-ною для конкуренци в бГомедицинГ. Виходячи з вГдмГнностей в етичному сприйняттГ свГту бГотехнологГя в майбутньому може стати важ-ливою лГнГею роздГлу в мГжнароднш полГтицГ.

За всГх складностей мГжнародно-право-вого регулювання бiотехнологiï i бюмедици-ни таке регулювання — основоположний початок контролю за кримшальними на-слГдками бiотехнологiчноï революцiï. Основ-нГ принципи такого контролю мютяться в Конвенци ООН про заборону розробки, виробництва i накопичення запасГв бактерю-логiчноï (бiологiчноï) i токсичноï зброï i про ïх знищення (1971 р.), у Загальнш декла-раци ООН про геном людини i права людини (розробленою МГжнародним комГтетом ЮНЕСКО з бюетики i прийнятою Генераль-ною конференщею ЮНЕСКО в 1997 р.), а також в Деклараци ООН про клонування людини (прийнята резолющею 53/280 Гене-ральноï Асамблеï вГд 8 березня 2005 р.).

Однак Конвенщя з бактерюлогГчно! збро!, на думку багатьох фахГвцГв, за бГльш нГж 35-рГч-ний перГод потребуе Гстотних доповнень. Наприклад, вона дозволяе здшснювати контроль тГльки пщ час проведення робГт на оборонних або державних пГдприемствах, якГ фшансуються з державного бюджету, але не в комерцшних структурах. Адже саме в приватних структурах здГйснюеться найбГльш активне розроблення бГотехнологГ. КрГм того, Конвенщя не перед-бачае заборони на застосування бюлопчно! збро! нового поколшня, зокрема генетично!.

Що стосуеться Загально! декларацп про геном людини i Декларацп про клонування людини, то вони е саме декларащями, що не мають конвенщонального мехашзму мГжна-родно! спГвпрацГ. КрГм того, Загальна декла-рацГя про геном людини мГстить об'ективно закладенГ в не! суперечность З одного боку, ст. 11 проголошуе заборону на практику клонування з метою вГдтворення людсько! особини, а державам i мГжнародним органь зацГям пропонуеться ствпрацювати з метою виявлення тако! практики й ухвалення на нацГональному i мГжнародному рГвнях не-обхГдних заходГв. А з другого боку, ст. 12 мГстить вимоги про загальний доступ до до-сягнень бюлогп, генетики i медицини, що стосуеться геному людини, i свободу прове-дення наукових дослщжень. При цьому ст. 11 припускае негативне використання бГотехнологГ!, а ст. 12 — позитивне, для змен-шення страждань людей i полшшення стану здоров'я кожно! людини i всього людства.

Постшна суперечшсть мГж негативними i позитивними наслщками розвитку бГотехнологГ!, що об'ективно не зшмаеться, може регулюватися тГльки додатковими мГжна-родними конвенщональними документами.

Тим часом багато провщних експертГв ООН займають тверду позищю, вГдповГдно до яко! репродуктивне клонування людини та шшГ подГбш види генетично! шженерп мають бути квалГфшоваш як одна з катего-рГй злочинГв проти людства. У зв'язку з цим було сформульовано пропозищю про те, щоб МГжнародний кримшальний суд розслГдував i переслщував випадки клонування людини.

Серед кра!н 6С в авангардГ «хрестового походу» проти клонування людини опини-лися Шмеччина i ФранцГя. Вони запропону-вали розробити в рамках ООН МГжнародну конвенцГю проти клонування людини з метою ïï вГдтворення. Шдтримавши цю ГнГцГативу, Генеральна Асамблея ООН у грудт 2001 р. ух-валила рГшення про розроблення тако! конвенцл.

ОкрГм МГжнародно! конвенцГ! проти клонування людини з метою ïï вГдтворення, доцГльно

також ставити питання про розроблення додаткового протоколу про незаконне вико-ристання i розповсюдження бютехнологп в рамках транснацiональноï органiзованоï зло-чинностГ (як вщомо, три протоколи вже прий-нято: про запобГгання i припинення торпвл1 людьми, особливо жГнками i дГтьми, та пока-раннГ за нец про незаконне ввезення мГгрантГв сушею, морем i повГтрям; про незаконне ви-готовлення i оборот вогнепальноï збро'ь ïï складових частин, компонентГв i боеприпасГв).

Не менш актуальним е розроблення й ухвалення Конвенцп про боротьбу з бютеро-ризмом, про що неодноразово пщшмалося питання на багатьох мГжурядових i мГжна-родних наукових зустрГчах.

Враховуючи ту обставину, що, на думку фахГвщв-генетишв, генетичну зброю можна використовувати не тГльки проти людей, але й проти сГльського господарства, перед системою 1нтерпол стоиь також завдання засто-совувати з метою полщейського контролю мГжнародних документГв, що визначають правила безпеки пщ час роботи з генетично-змГненими оргашзмами.

Це — Картагенський протокол (регулюе перемГщення ГМО), ДекларацГя РГо (визна-чае, що тягар доведення нешкщливоста ле-жить на виробниковГ продукцп), документи Кодексу АлГментарГус i комГсп ООН з харчо-вих стандартГв (мГстять стандарти для ГМО-продуктГв), а також двГ директиви ввросою-зу (визначають методи оцГнки загрози, правила мошторингу, а також умови, за яких видають дозволи на випуск ГМО).

МГжнародно-правовий контроль за бю-технологГею мае стати гранично жорстким, мГжнародно-правовГ норми — максимально обмежувальними, враховуючи, що будь-який вГдступ вщ заборон може стати необоротним злочином проти людства. Вщсуттсть такого жорсткого контролю i единоï мГжнародно'! позицп з цих питань створюе пщ^рунтя для можливостГ виникнення «генетичних Чорно-билГв» у рГзних куточках земноï кулГ.

Багато рокГв тому Ушстон ЧерчГлль сказав: «Кам'яне столГття може повернутися на сяючих крилах науки». Не можна допусти-ти, щоб це попередження видатного полГти-ка стало пророчим.

Джерело:

http://unewworld.com/novosti-nauki-novejshie-texnologii/geneticheskie-vojny-gennaya-inzheneriya.html

Матерiал шдготувала.

О. С. Виноградова

BIOMECHANICAL ENGINEERING: FROM BIOSYSTEMS TO IMPLANT TECHNOLOGY

Бшмехашчна iнженерiя: вщ бшсистем до технологи iмплантащï

За редакщею P. Prendergast

Найбгльш авторитетне видання з бюмехашки вiд провiдних фахiв-цiв CBiTy. Якщо йдеться про сухожилля, метки або серце, кожна час-тина людсько! бюлопчно! системи виконуе свою механiчну функцiю, яку вивчають на рiзних рiвнях. Таким чином, бюмехашка викликае iнтерес з погляду вивчення анатомп, фiзiологiï, техшки, ортопедiï, вiдновлювальноï i спортивно! медицини, ергономши, елект-рофiзiологiчноï кiнезiологiï та шших дисциплiн.

Пропонована книга е першим всеосяжним текстовим матер1алом, призначеним для бюмехашчних iнженерiв. Складаеться з окремих роздШв, якi охоплюють широкий дiапазон питань i висвiтлюють вй аспекти бiомеханiки /бiомеханiчноï iнженерiï. Для урiзноманiтнення процесу навчання вмiщено допомiжний матерiал з 1нтернету. Логiчний розгляд питань побудовано на основi загальноприйнятно! прогресивно! практики викладання в провщних унiверситетах свiту.

Обсяг: 500 стор.

Видавництво: «Academic Press» (США). Дата публжаци: 2011 р. Мова: англ.

BIOMEDICAL CHROMATOGRAPHY Бшмедична хроматографiя

За редакщею J. T. Elwood

Бюмедична хроматографГя — наука, присвячена застосуванню хроматографа i сумГжних методГв у бГологГчних та медичних дослщжен-нях. В основу цих дослщжень покладено методи i технологи, що стосу-ються роздГлення, Гдентифшаци та визначення речовин у галуз1 бюхГмп, бютехнологи, молекулярно'' бюлоги, клГтинно'' бюлоги, клшГчно'! хГми, фармакологи та сумГжних дисциплш, а також аналГзу бГологГчних рГдин, клГтин i тканин, очищенню бюлопчно важливих сполук i т. д. У пропонованш монографи обговорюються i розглядають-ся цГ та пов'язанГ з ними теми.

Обсяг: 178 стор.

Видавництво: «Nova Science Pub Inc» (США). Дата публжаци: 2010 р. Мова: англ.

Biumeiiiral Chromalosraphy

ENVIRONMENTAL BIOTECHNOLOGY: BASIC CONCEPTS AND APPLICATIONS

Еколопчна бютехнолопя: Основш концепцп та використання

I. S. Thakur

Бютехнолопя так чи шакше торкаеться життя кожно! людини. Це одна з основних технологш ХХ1 столiття з багатогранною сферою використання, починаючи вiд малих об'ектiв до застосування у виробництв1 товарiв. Екологiчна бютехнолопя е дуже широкою галуззю, що швид-ко розвиваеться. Актуальнiсть !! постiйно зростае, сприяючи стiйкому розвитковi i захисту довкiлля пiд час виробництва бiоматерiалiв. Ця га-лузь револющошзувала розумшня процейв життезабезпечення навко-лишнього середовища, уможливила застосування чисто! технологи для виршення екологiчних проблем. Книга е оглядом основних екосистемних процейв, перетворень i порушень довшлля в результатi природних явищ i дiяльностi людини з використанням бютехнолопчних прин-ципiв реабiлiтацi! для його розвитку i захисту.

Зм^т:

1. Вступ.

2. Навколишне середовище та екосистемш процеси.

3. Екологiчнi ресурси пов^ря, води i Грунту.

4. Еколопчш порушення повiтря, забруднення води i Грунту.

5. Глобальнi еколопчш проблеми.

6. Структурно-функцiональна динамiка життя мiкроорганiзмiв.

7. Забруднення повiтря i контроль.

8. Забруднення води i контроль цього процесу.

9. Твердi вiдходи i контроль забруднення Грунту.

10. Деградацiя природних сполук.

11. Деградащя ксенобiотикiв.

12. Бiоабсорбцiя металiв.

13. Бiотехнологiчнi процеси в галузi управлiння природокористуванням.

13.1. Поглинання вуглецю.

13.2. Бiодобрива i бiопестициди.

13.3. Бiоремедiацiя.

13.4. Компостування.

13.5. Бiополiмери та бюпластика.

13.6. Бiовилуговування.

13.7. Отримання бюгазу.

13.8. Бiоенергетика бiоетанолу й бюдизеля.

13.9. Наноматерiали: парадигми, процеси i перспективи.

14. Бiотехнологiчнi процеси у виробництвi i засобах захисту.

14.1. Целюлозно-паперова промисловiсть.

14.2. Шкiряна промисловють.

14.3. Лiкеро-горiлчана промисловiсть.

14.4. Лакофарбова промисловють.

14.5. Виробництво антибiотикiв.

14.6. Нафтодобувна промисловють.

14.7. Молочна промисловють.

Обсяг: 534 стор.

Видавництво: «IK International Publishing House Pvt. Ltd» (США). Дата публжацп: 2011 р. Мова: англ.

Environmental biotechnology

(ito

*'/// IЬ 4

Indu Shekar Thakur

PLANT METABOLISM AND BIOTECHNOLOGY Метаболiзм рослин i бiотехнологiя

H. Ashihara, A. Crozier, A. Komamine

Pi3HOMamTHi рослинш метаболiти e корисними для життя людини i тому виробництво ix з використанням сучасних бiотехнологiчних прийомiв мае величезне потенцшне значення, особливо в галузях сiльського госпо-дарства i охорони здоров'я. У пропонованш книзi описуються бюсинте-тичнi шляхи метаболiтiв рослин, ixrn функцп в рослинах i застосування для бiотеxнологi'i. Тематика книги охоплюе такi науковi напрями:

> бiосинтез i метаболiзм цукрiв i крохмалю;

> бiосинтез лiпiдiв;

> симбiотична фiксацiя азоту;

> метаболiзм нуклеотидiв;

> пуриновi алкало'ди в метаболiзмi;

> бiосинтез нiкотину;

> бiосинтез терпеновдв;

> бiосинтез алкало'ду бензилiзоxiнолiну;

> бiосинтез монотерпенощних шдольних алкаловдв;

> бiосинтез флавоновдв;

> бiосинтез пiгментiв: антоцiанiв, бетацiанiв i каротинодав;

> метаболомiки в галузi бютехнологп;

> кроxмалi та цукри.

Пропонована книга е важливим пойбником i призначена для дослiдникiв та студентав, як1 спецiалiзуються в галузi 6юх1мп, бюлогп рослин, метаболiчноi шженерп, бютехнологп, харчо-во' промисловостi, йльського господарства i медицини.

Обсяг: 420 стор.

Видавництво: «Wiley-Blackwell» (США). Дата публжацп: 2011 р. Мова: англ.

BIOMEDICAL MICROSYSTEMS Бюмедичш мiкросистеми

E. Meng

1стотно впливаючи на здоров'я людини, технологи бiомедичниx мшросис-тем (bioMEMS) охоплюють рiзнi аспекти: в1д матерiалознавства до бюлогп, xiмii, Ф1зики, медицини i теxнiки. Вщдзеркалюючи мiждисциплiнарний характер ще! галузi, книга охоплюе основи мшатюризацп з описом бiоматерiалiв, м1кро- i нанотеxнологiй, а також ix вщповщне застосування.

Автор книги — активний дослщник, якого нещодавно було названо одним з новатор!в теxнологiчниx огляд1в серед молодих учених у вщ1 до 35 рок1в. У вступнш частинi йдеться про переваги м^атюризацп. Далi розглянуто матерiали, теxнологiю ix виготовлення та необхщш компоненти для вйх bioMEMS. Висвiтлено також основоположш принципи i складов! елементи, зокрема мшрофлющш концепцп, сис-теми лабораторп-на-чиш, зондування i методи виявлення. У завершальних роздiлаx подано декiлька важливих додатшв bioMEMS (мiкродiалiз, катетер-сенсори, MEMS-iмплантати, ней-ронн1 зонди i тканинна шженер!я).

Для читачiв, як1 мають лише обмежеш уявлення про MEMS i bioMEMS, пропонована книга е практичним вступом у технолопю застосування цих пристро'в i принцип1в ix експлуатацп з наведенням прикладiв для кращого розум1ння цiei складноi теми.

Обсяг: 412 стор.

Видавництво: «CRC Press» (США). Дата публжацп: 2011 р. Мова: англ.

biomedical* microsystems

ELLIS MENG

THE ROLE OF INTELLECTUAL PROPERTY RIGHTS IN BIOTECHNOLOGY INNOVATION

Роль прав на штелектуальну власшсть в шновацшному потенцiалi бютехнологп

ПЬд редакщею D. Castle

Права на штелектуальну власшсть (П1В), зокрема патенти, посща-ють важливе мiсце в iнновацiйнiй систему але дотепер ведуться дискусii щодо того, якою мiрою вони сприяють або перешкоджають iнновацiям. Kpi3b призму бютехнологп ця книга глибоко розкривае основнi питан-ня, що стосуються iнновацiй та iнтелектуально'i власностi для оцшки вимог позитивно'' i негативно'' дп прав штелектуально'' власностi на шновацп. Мiжнародна група вчених з рiзних дисциплiн — економiчноi географп, медичного права, бiзнесу, ф^ософп, юторп, сусшльно'' охоро-ни здоров'я, управлшня вивчають, як П1В фактично працюе в iнновацiйних системах, не тальки з погляду теорп, але й ^рунтуючись на глобальних, регюнальних, нацiональних, поточних та iсторичних контекстах. При цьому автори прагнуть розкрити тематику i вийти за межi устале-ного припущення про роль прав штелектуально'' власностi в шновацшних системах.

Ученi й студенти, заштересоваш в iнновацiях, науково-технiчнiй полiтицi, правi штелекту-ально'' власностi й передачi технологiй, знайдуть у цiй ra^i багато цiкавого, а ii висновки бу-дуть кориснi для ойб, якi беруть участь у прийнятт рiшень у полiтицi науки i технiки, для ме-неджерiв штелектуально'' власностi в галузi бiотехнологii, а також для фiрм венчурного кашталу.

Обсяг: 459 стор.

Видавництво: «Northampton, MA: Edward Elgar, Publishing» (США).

Дата публжацп: 2011 р.

Мова: англ.

BIONANOTECHNOLOGYII: GLOBAL PROSPECTS

Бюнанотехнолопя II: глобальш перспективи

За редакщею D. Reisner

Грунтуючись на шформацп, наведенш у Довiднику з бюмедично'1 iнженерГï (Biomedical Engineering Handbook) i отриманого нового ма-терiалу, ця книга спираеться на досвщ фахiвцiв з таких краш, як 1ран, Куба, Пiвденна Африка, Велика Бриташя, Канада, Китай, Iндiя та Росiя. Вона вiдображае дедалi зростаюче значення наномедицини i бютехнологп, включаючи такi питання, як бiомiмiкрiя, стовбуров1 клiтини, оптичнi тканини, нанопокриття для медичних пристро!в, що iмплантуються, бiобатареï, будiвельнi блоки ДНК, протеïновi пристро!, квантовi крапки, застосування в харчовш промисловостi, косметицi, кардiодiагностицi, достав-леннi лiкарських засобiв, фотонiцi, бiоаналiзi, оптицi, наномедицинi, персонiфiкованiй медицин й бiзнесi бiотехнологiчних компанiй.

Обсяг: 350 стор.

Видавництво: «CRC Press» (США). Дата публжацп: 2011 р. Мова: англ.

Bionanotechnology

Global Prospects J J

Mnrfk»

Divilt- Utisntf

ADVANCts

IS BICK.1IFMICAI- fcSCISEFJUNG

RIinkfHWIIOI.Y

Modern Advances in

С h гошц toKiaphv

MODERN ADVANCES IN CHROMATOGRAPHY (ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING BIOTECHNOLOGY)

Сучасш досягнення хроматографа (Досягнення 6ioxiMi4Hoi' шженерно! бютехнологп)

R. W. Allington, M. Barut, O. Bruggemann, J. M. J. Frechet

Огляд присвячено новому хроматографiчному методу — капiлярнiй електрохроматографii (КЕХ), якш останнiм часом придiляeться велика увага. Принципи цього методу ^рунтуються на поеднанш електроосмо-тичного потоку i стацiонарноi фазовоi взаемодii з аналiзом. Описано прилади КЕХ, технологи катлярних колонок, умови роздiлення, а та-кож детально розглянуто приклади ix застосування.

Обсяг: 283 стор.

Видавництво: «Springer» (США). Дата публжацп: 2011 р. Мова: англ.

И"Ч 1«Т» (n<rd> «I Япи V. ritnü

BioiL-chnntogical Application* of Phoiosyiuhclic Proteins:

Biovliipvt Biovcmorv д n<| Biodcvitu

BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS OF PHOTOSYNTHETIC PROTEINS: BIOCHIPS, BIOSENSORS AND BIODEVICES (BIOTECHNOLOGY INTELLIGENCE UNIT)

Бютехнолопя фотосинтетичних протешгв: бючипи, бiосенсори i бюпри-стро'1 (бютехнолопчш iнтелектуальнi елементи)

М. Т. Giardi, Е. Piletska

У пропонованому виданш подано огляд останшх дослщжень фотосистем II та систем, доступних для бютестування забруднювач1в за допомо-гою 6ioceHcopiB, гцо ]"рунтуються на фотох1м1чнш активность Даш, навешала дет в ц1й книз1, слугуватимуть основою для розроблення комерцшних бюсенсор1в, призначених для використання в оперативному анал131 по-переднього вiдбору забруднювальних речовин фотосистеми II, зводячи до мШмуму дороп й тру-домiсткi лабораторнi аналiзи.

Обсяг: 232 стор.

Видавництво: «Springer» (США).

Дата публжацп: 2011 р.

Мова: англ.

BIOREMEDIATION TECHNOLOGY: RECENT ADVANCES Технолопя бюдеградацп: останнi досягнення

M. H. Fulekar

Забруднення довшлля стало одшею з основних глобальних проблем сьогодення. Сучасне зростання iндустрiалiзацii, урбашзащя, штенсив-ний розвиток йльського господарства i виробництво електроенергп спричинили неврегульовану експлуатащю природних ресурсiв для за-доволення дедалi бiльшиx людських потреб i бажань, порушуючи при цьому еколопчний баланс, вiд якого залежить якють навколишнього середовища. Сучасш технолопчш досягнення в галузi xiмiчниx про-цесiв/операцiй сприяють одержанню нових продуктав, а також появ1 у великш кiлькостi нових забруднювальних речовин, ям перевищують

здатшсть навколишнього середовища проводити самоочищення. У зв'язку з прогресивним попршенням довшлля, що стало загрозою для життя людини, ця проблема постала як одна з найболючших.

У ra^i обговорюеться процес бiодеградацii, що ^рунтуеться на технологи реабiлiтацii, для очищення i вiдновлення забруднених дiлянок i захисту навколишнього середовища. Розглядае-ться можливост ефективнiших бiологiчних процесiв у галузi молекулярноi бiологii та екологп. Книга мiстить спецiальнi документи, подготовлен вiдомими фахiвцями, в яких наведено еко-номiчно об^рунтоваш ефективнi стратеги бюдеградацп за допомогою iммобiлiзацii забрудню-вальних речовин з метою очищення довшлля. Призначена для аспiрантiв з фахiв: бютехно-логiя/науки про життя/еколопя, дослiдникiв з унiверситетiв i науково-дослщних iнститутiв, а також промисловостi.

Обсяг: 290 стор.

Видавництво: «Springer» (США).

Дата публжацп: 2010 р.

Мова: англ.

BIOSENSORS: FROM ELECTRIC CIRCUITS TO IMMUNOSENSORS Бюсенсори: ввд електричних ланцюпв до iмуносенсорiв

J.-Y. Yoon, L. J. Lucas

Книга призначена для бюмедичних iнженерiв та iнженерiв-електрикiв i покликана забезпе-чити мiждисциплiнарний пiдхiд до дослiдження бiосенсорiв. У нш розглядаються основнi схе-ми датчишв для бiомедицини, зокрема бюмедичного зондування. Поданий матерiал стосуеться використання структурних елементав, починаючи з основ дизайну датчишв температури i закшчуючи складнiшими бiосенсорами.

Обсяг: 330 стор.

Видавництво: «Springer» (США).

Дата публжацп: 2010 р.

Мова: англ.

BIOTECHNOLOGY OPERATIONS: PRINCIPLES AND PRACTICES

Бютехнолопчш операцп: принципи i практика

M. J. Roy

Через швидкий розвиток бютехнолопчно'' галузi й цiлого спектра дисциплш, якi сприяють 11 поширенню, виникла пiдвищена потреба в ретельшше спланованiй i повнiшiй штеграцп розвитку бютехно-логiчних проектiв. Незважаючи на великий практичний досвщ i на-явнiсть доступно'1 лiтератури, жодна книга ще не стала всеосяжним практичним пойбником з основних принципiв бютехнологп.

Заповнюючи цю прогалину, пропонована монографiя вiдображаe iнтеграцiйну фiлософiю, виступаючи як практичний пойбник для студентов, фах1вщв, у<пх защкавлених в розвитков1 бютехнолопчно! про-мисловостi. Хоча в багатьох виданнях розглядаються конкретш техшчш аспекти бiотехнологГi, у цiй книзь мабуть, уперше iнтегруються найважливiшi концепцп 11 розвитку, наукових i уп-равлiнських принципiв та навикiв, таких функцюнальних аспектiв бiотехнологГi, як:

> Бiообробка.

> Клiнiчнi випробування.

> Доклiнiчнi дослiдження.

BIOTECHNOLOGY OPERATIONS

> Управлiння проектами.

> Забезпечення якостi.

> Контроль якость

> Питання регулювання.

У детальному практичному поясненш оптимiзацii процесiв бютехнологп йдеться про те, як використовувати конкретне планування випуску продукцп, проектування i процеси управлш-ня проектами для безперешкодного поеднання планiв i зусиль у ключових функцiональних пи-таннях. Застосовуючи уроки всiеi юторп бiотехнологii, Майкл Рой висвiтлюе процес розроблен-ня принципiв, якi можуть сприяти безпечному i бiльш ефективному просуванню продуктав на ринок. Спираючись на досвщ своеi роботи в промисловост i викладання в аспiрантурi в Ушвер-ситетi штату Вюконсин, автор роз'яснюе основнi методологiчнi i практичнi принципи, щоб до-помогти зменшити ризики i вирiшити проблеми реатзацп майбутнiх технологiчних вiдкриттiв у матерiальних продуктах.

Обсяг: 416 стор.

Видавництво: «CRC Press» (США).

Дата публжацп: 2011 р.

Мова: англ.

BIOSEPARATION TECHNOLOGY Технолопя бшсепараци

N. Mishra, A. Dubey

У пропонованш книзi, призначенiй для фахiвцiв у галузi шженерп або бiологГi, розглянуто основи технологи бюсепарацп, що зараз бурх-ливо розвиваеться. Монографiя починаеться зГ вступу з подальшим висвГтленням процесГв руйнування клГтин, фГльтрацГ', центрифугуван-ня, адсорбцГ' i екстракцп. Розглядаються також мембраннГ процеси роздГлення, осГдання, хроматографГя, електрокГнетичнГ методи роздГ-лення i остаточна обробка та формулювання висновкГв.

Обсяг: 416 стор. Видавництво: «CRC Press» (США). Дата публжацп: 2011 р. Мова: англ.

BIOTECHNOLOGY ©

ъ». DaibeshwDi Roy

BIOTECHNOLOGY Бiотехнологiя

D. Roy

У монографГ'' подано опис структури, оргашзацп i функцГ'' генетично-го матерГалу з детальним обговоренням генетичного, структурного коду, кодексу регулювальних норм i положень, РНК-М1Р, «редагування» РНК та Гмпринтингу ДНК. Також розглядаються ген, його структура i експресГя, клонування генГв, мутагенез in vitro, транспозонований мутагенез, сайлесинг гешв, синтез ДНК, технолопя секвенування, а також секвенування i збирання геному. Докладно описано молекулярну техно-логГю маркера та ii застосування, технологи структурно'' геномши, зок-рема методи аналГзу нуклеотидГв i галотипГв, функщональну геномГку, технологГю вивчення функцГй гешв i взаемодГю на рГвнГ окремих гешв та в повногенному масштабу а також технологГю протеомши.

Обсяг: 800 стор.

Видавництво: «Alpha Science International» (США). Дата публжацп: 2010 р. Мова: англ.

BIOMECHATRONICS IN MEDICINE AND HEALTH CARE Бюмехатрошка в медициш та охорош здоров'я

За редакщею R. K. Y. Tong

На сьогодш виникла потреба в бюмехатронних пристроях у ме-дичнш галузi i дедалi бiльша кiлькiсть дослiдницьких груп займаеться розробленням рiзних систем у цш сферi. Мета книги полягае в спри-яннi розумiнню фахiвцями нових технологш, що застосовуються або застосовуватимуться в медициш для виршення рiзних клiнiчних проблем, а також в розкритт можливостей бiомехатронiки шд час лшуван-ня й обслуговування пащентав. Розглянуто також новi й захоплююч1 кйждисциплшарш напрями дослщжень, що стосуються, зокрема, робо-тизовано'' терапевтично'' системи для реабiлiтацii пiсля шсульту, екзоскелетiв для повсякденно' дiяльностi людей, як мають iнвалiднiсть, функцiональноi електрично'' стимуляцii i без-провiдноi активно'' капсульно'' ендоскопп. Кожен роздiл мютить важливi довiдковi матерiали з конкретно'' теми. Книга призначена для дослщнишв, фахiвцiв iнженерного i медичного проф^ю, студентiв i тих, хто захоплюеться мехатронiкою.

Обсяг: 416 стор.

Видавництво: «Pan Stanford Publishing» (Велика Бриташя ). Дата публжацп: 2011 р. Мова: англ.

BIOMATERIALS AS STEM CELL NICHE

Бiоматерiали як шша для стовбурових клiтин

За редакщею K. Roy

Biomaterials as Stem Cell Niche

Останш досягнення бюлогп стовбурових клiтин вiдкрили новий напрям у кл^иннш терапii. У пропонованш книзi подано сучасний пог-ляд на використання бiоматерiалiв як штучних нiш для iнженерниx стовбурових кл^ин з метою кращого розумiння ix бiологii в 3D бiомiме-тичних умовах та розроблення нових стратегш для ефективного довго-строкового обслуговування i спрямованоi диференцiацii стовбурових клггин в рiзниx терапевтичних лiнiяx. Стовбуровi клiтини тварин i лю-дини як ембрюнального походження, так i дорослих, обговорюються з погляду практичного застосування для регенерацп нервових волокон, використання в ортопедп, серцево-судиннiй терапп, формування клiтин кровi i протипухлинно" терапii. Як синтетичнi, так i природнi бiоматерiали розглядаються з акцентом на характер шдукування матерiально-стовбуровими кл^инами (material-stem cells) прямих конкретних сигнатв.

Книга призначена для фаxiвцiв у галузi бiоматерiалiв i створення тканин, лiкарiв, а також бiологiв, провщних спецiалiстiв з фундаментальних дослiджень i застосування ембрiональниx i дорослих стовбурових клгтин.

Обсяг: 350 стор.

Видавництво: «Springer» (США). Дата публжацп: 2010 р. Мова: англ.

IN-TECH 2011: INTERNATIONAL CONFERENCE ON INNOVATIVE TECHNOLOGIES М1жнародна конференщя з шноващйних технологш

(IN-TECH 2011)

Дата проведення: 01-03.09.2011 р.

Мiсце проведення: Братислава (Республша Словаччина). Веб-сайт: http://www.in-tech.info

Теми конференций

- медичнi iнновацiйнi технологii;

- бiотехнологiя та бiоiнженерiя;

- шноващйш технологii для сiльського господарства;

- нанотехнолопя;

- iнтелектуальнi виробничi системи;

- моделювання i симулящя;

- неемпiричний, генетичний алгоритм, нейронш мережi;

- виробництво бiологiчних систем;

- вщновлюваш i нетрадицiйнi джерела енергп, енергетичнi системи.

AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY INTERNATIONAL CONFERENCE 2011 (ABIC 2011) М1жнародна конференщя 2011 року i3 с1льськогосподарсько1 бттехнолот! (ABIC 2011)

Дата проведення: 06-09.09.2011 р.

Мюце проведення: Йоганнесбург (Швденно-Африканська Республiка).

Веб-сайт: http://www.abic2011.co.za/

ABIC — щорiчне зiбрання вчених, що е унiкальним форумом, на якому обговорюються ос-таннi науковi досягнення в галузi сiльськогосподарськоi бютехнологп, намiчаються майбутнi напрями технологiй, розглядаються рiзноманiтнi чинники, якi можуть вплинути на розвиток науки i бiзнесу в глобальному масштабi.

На сьогодш визнано, що сiльськогосподарська бiотехнологiя може ввдгравати значну роль в економiчному розвитковi на мiсцевому, регiональному, нащональному i мiжнародному рiвнях.

INTERNATIONAL CONFERENCE ON BIOTECHNOLOGY AND ENVIRONMENT MANAGEMENT — ICBEM 2011 Мiжнародна конференщя з бттехнологи та управлшня навколишнiм середовищем — ICBEM 2011

Дата проведення: 06-18.09.2011 р.

Мюце проведення: Сшгапур (Республiка Сiнгапур).

Веб-сайт: http://www.icbem.org/

Метою конференцп е об'еднання зусиль дослiдникiв, учених з метою обмшу досвiдом, нови-ми щеями i результатами дослiджень з уйх аспектiв бiотехнологii та рацiонального природоко-ристування, обговорення практичних проблем управлшня навколишнiм середовищем i сумiжних дисциплш.

6th bionanotox and applications international

RESEARCH CONFERENCE 6-та мiжнародна науково-практична конференцiя з бтнанотоксиколоН'! та и застосування

Дата проведення: 10-13.09.2011 р.

Мiсце проведення: Алабама (США).

Веб-сайт: http://www.goingtomeet.com/228150

ВюЫапоТох (бiологiя, нанотехнологiя i токсикологiя) е новою галуззю дослщжень, яка вив-чае бiологiчнi системи (рослини, тварини i людину) та навколишне середовище у поеднаннi з на-номатерiалами.

Теми конференцп:

- бютехнолопя;

- нанотехнологiя;

- токсиколопя;

- хiмiя;

- бiологiя/мiкробiологiя;

- фармацевтика^агностика;

- охорона здоров'я;

- йльське господарство;

- обчислювальна наука/шформатика;

- бiоiнформатика;

- нейроiнформатика.

1-ST INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON SECONDARY METABOLITES: CHEMICAL, BIOLOGICAL AND BIOTECHNOLOGICAL PROPERTIES

(ISSET 2011)

1-h MmHapogHHM CHMno3iyM 3i btophhhhx MeTaSo^iTiB: ixHi

xiMi^Hi, Sio^ori^Hi Ta SioTexHonori^Hi B^acTHBocTi (ISSET 2011)

Дата проведення: 12-15.09.2011 р. Мюце проведення: Денiзлi (Туреччина). Веб-сайт: http://issmet2011.pau.edu.tr/

Теми конференций

- Хiмiя вторинних метаболiтiв (синтез, властивостi, бiологiчна актившсть i т. д.).

- Роль вторинних метаболтв у клiтинах рослин в середовищах in vitro й in vivo.

- Вторинш метаболии рослин i тварин та 1х бiотехнологiя.

- Вториннi метаболiти лшарських рослин i 1хня роль у фармакологи.

- Використання вторинних метаболтв у промисловост (виноробствё виробництвi чаю, харчовш промисловостi та iн.)

2nd ANNUAL BIO INDIA INTERNATIONAL CONFERENCE 2-га rn;opi4Ha Мiжнародна конференцiя BIO India International partnering

2ndAnnual ,,jj . «й!

BIO INDIA INTERNATIONAL Л PARTNERING CONFERENCE Ш = ¡С; f September 21-21201 I. J | K|я' -AI l (IM ttt И

Дата проведення: 21-22.09.2011 р.

Мюце проведення: Хайдерабад (Iндiя).

Веб-сайт: http://www.bio.org/bioindia/content.aspx?id=358

Цей ексклюзивний форум буде мюцем зустрiчi для бiотехнологiчних i фармацевтичних ком-панiй з Швшчно'1 Америки, ввропи i Азп. Присвячений вивченню й обговоренню можливостей для 6i3^cy в новому бiотехнологiчному секторi 1ндп.

BIO для Iндii — це бгльш нiж 10-рiчний досвiд бютехнолопчного i фармацевтичного партнерства. Конференщя вiдома сво1ми успiшними проектами в США, Японп i Нiмеччинi, зокрема во-на е найбiльшою подieю з партнерства у сферi бютехнологп, бiзнес-форумах i Мiжнароднiй кон-венцп в галузi бiотехнологii.

3rd international conference on chemical, biological

AND ENVIRONMENTAL ENGINEERING (ICBEE 2011) 3-th MmHapogHa KOH^epeH^a 3 xiMmHOi, 6i0^0rmH0i Ta eKo^ori^Hoi iH^eHepi'i (ICBEE 2011)

Дата проведення: 23-25.09.2011 р. Мюце проведення: Ченду (Китай) Веб-сайт: http://www.icbee.org/

Мiжнародна конференщя з хiмiчноi, бюлопчно! та екологiчноi iнженерii е одшею з важливих мiжнародних подiй, де обговорюються новi основнi досягнення i результати дослiджень у цiй галузь

ICBEE 2011 також сприятиме полегшенню взаемодп мiж дослiдниками i практиками, як1 працюють в найрiзноманiтнiших науково-виробничих напрямах i зацiкавленi в ширшому роз-витковi хiмiчноi, бiологiчноi i еколопчно'' iнженерii та пов'язаних з нею методiв.

У конференцп вiзьмуть участь провщш вченi, iнженери i фахiвцi 3i всього свiту, що виявля-ють iнтерес до цiei галузь

8TH EUROPEAN CONGRESS OF CHEMICAL ENGINEERING / 1ST EUROPEAN CONGRESS OF APPLIED BIOTECHNOLOGY 8-й Свропейський конгрес i3 xiMi4HOi шженери / 1-й Свропейський конгрес i3 прикладно! бттехнологи

В European Congress of Chemical Engineering

PliiCLSI.Nft- Allrluil ^'i*

European Congress of Applied Biotechnology

29 OCCMLMAk II :'гч V : ::::. -. v.'-.: j

Дата проведення: 25-29.09.2011 р. Мюце проведення: Берлiн (Шмеччина). Веб-сайт: http://ecce2011.de/ECCE.html

Обговорюванi питання:

• Бювиробництво.

• Процес бiотермодинамiки.

• Вщновлюват джерела енергп, бiопаливо i бiоенергетика.

WORLD CONFERENCE ON MARINE BIODIVERSITY конференщя з морського бiорiзноманiття

Дата проведення: 26-30.09.2011 р.

Мюце проведення: Абердiн (Велика Британiя).

Веб-сайт: http://www.marine-biodiversity.org/about/

Загальною метою Всесвiтньоi конференцп з морського бiорiзноманiття е привернення уваги вчених, практишв i громадськост до обговорення та вирiшення питань, що стосуються ще'1 важливоi проблеми. Мета конференцп:

• огляд знань про бiорiзноманiття i його роль у функщонувант морських екосистем;

• ощнка найважливiших загроз для морських систем i розроблення стратегii управлшня;

• обговорення стiйкого розвитку i соцiально-економiчних наслiдкiв для морськоi галуз^

• визначення майбутнiх прiоритетних дослщжень. Теми конференцп:

- таксономiя;

- бiорiзноманiття;

- змiна бiорiзноманiтностi з часом;

- морсьш технологii: платформи i датчики для 21-го стол^тя;

- морська бiотехнологiя;

- використання екосистем;

- змша клiмату;

- екстремальш морськi ситуацii;

- бюшформатика та надання даних;

- досягнення в галузi статистики у зв'язку з морським бiорiзноманiттям;

- морська пол^ика i право;

- морське бiорiзноманiття та здоров'я людини;

Всесв^ня

- штеграцшна структура фiзичноi динамши i зв'язок з бiорiзноманiттям;

- бiорiзноманiття — функщя екосистеми;

- з'язок бiорiзноманiття — функцii екосистем та iх використання;

- бiорiзноманiття, освiта i роз'яснювальна робота;

- екологiчна фiзiологiя;

- вплив дiяльностi людини на бiорiзноманiття.

VII М1ЖНАРОДНА НАУКОВА КОНФЕРЕНЦ1Я «ЧИННИКИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО! ЕВОЛЮЦП ОРГАН1ЗМ1В»

Дата проведення: 26-30.09.2011 р. Мюце проведення: Алушта, Украша.

Веб-сайт: http://www.kon-ferenc.ru/konferenc04_09_11.html

VII Мiжнародна наукова конференцiя «Чинники експериментальноi еволюцii органiзмiв» присвячена 110-рiччю з дня народження Л. М. Делоне.

Науковi напрями конференци:

1. Еволющя геномiв у природi та експерименть

2. Структура i функцiя хромосом.

3. Молекулярна структура та оргашзащя геномiв.

4. Проблеми екогенетики (до 25^ччя аварii на Чорнобильськiй АЕС).

5. Аналiз i оцiнка генетичних ресурйв.

6. Прикладна генетика i селекцiя.

7. Бiотехнологiя в йльському господарствi i медицинi (до 90^ччя з дня народження Р. Г. Бутенко).

8. Генетика людини i медична генетика.

9. Питання викладання генетики, еволюцп i бiотехнологii.

Дата проведення: 05-07.10.2011 р. Мюце проведення: Б^а Церква (Украша).

Секци конференци:

1. Молекулярна та кл^инна бюлопя.

2. Регуляцiя росту i розвитку рослин.

3. Структурна та функщональна геномша.

4. Бiотехнологiя.

5. Рослинш ресурси для бiопалива.

6. Функщональш харчовi продукти рослинного походження.

I КОНФЕРЕНЦ1Я МОЛОДИХ УЧЕНИХ «Б1ОЛОГ1Я РОСЛИН ТА Б1ОТЕХНОЛОГ1Я»

2-ГА М1ЖНАРОДНА КОНФЕРЕНЦ1Я «РЕГУЛЯЦ1Я РОСТУ I РОЗВИТКУ РОСЛИН: Ф1ЗЮЛОГО-БЮХШ1ЧШ ТА ГЕНЕТИЧН1 АСПЕКТИ»

Дата проведення: 11-13.10.2011 р. Мюце проведення: Харшв (Украша). Веб-сайт: www-biology.univer.kharkov.ua

Тематичш напрями роботи конференцп:

1. Фiзiолого-бiохiмiчна, фiтогормональна та фгтохромна регуляцiя росту i розвитку.

2. Генетична регулящя розвитку.

3. Фотоперюдичний та яровизацiйний контроль розвитку.

4. Молекулярно-бюлопчт та бiогехнологiчнi аспекти регуляцп цвiгiння.

5. Прикладнi аспекти регуляцп росту, розвитку i продуктивное^ рослин.

BIOTECHNIKA 2011 Мiжнародна виставка «БЮТЕХШКА-2011»

Дата проведення: 11-13.10.2011 р. Мiсце проведення: Ганновер (Нiмеччина). Веб-сайт: http://www.biotechnica.de/homepage_d

ВЮ • TECHNICn

lUfowTW. IL-IL Mlotwr Î011

«БЮТЕХН1КА» — провщна Свропейська виставка передово'1 бютех-нологiï. Основна мета заходу — оргатзащя дiалогу мiж фахiвцями, що працюють в рiзних нап-рямах бютехнологп. Цей форум е ушкальною платформою для обмiну iдеями i пошуку парт-нерiв для проведення сумюних дослiджень i вирiшення актуальних завдань.

Тематика Бiоiнженерiя:

- анал^ичт методи;

- гехнологiï бiопроцесу;

- бютехнолопчт продукти;

- хiмiя;

- бюшформатика/послуги;

- медичне i фармацевтичне застосування;

- бютехнолопя для захисту навколишнього середовища;

- застосування в йльському господарсгвi;

- с/х продукщя/заводська бiогехнологiя;

- вирощування тварин;

- бiологiчний контроль над шкщниками сiльського господарства;

- застосування в харчовш промисловосгi;

- бютехнолопя у виробницгвi продукгiв харчування.

BIO CHINA INTERNATIONAL CONFERENCE Мiжнародна конференщя BIO CHINA

BiöCbin*

International Conference

OCTOBER гол SHANGHAI. CHINA

Дата проведення: 12-13.10.2011 р. Мюце проведення: Шанхай (Китай). Веб-сайт: http://www.bio.org/biochina/

У цш конференци вiзьмуть участь керiвники бютехнолопчних виробництв, фармацевтич-них та швестицшних компанiй з Пiвнiчноi Америки, ввропи i Азii з метою вивчення можливос-тей для бiзнесу в новому бютехнолопчному секторi Китаю.

Оргашзаци бiотехнологiчноi промисловостi в Кита! мають бiльш нiж 15-рiчний досвiд в про-веденнi мiжнародних конференцiй для бiотехнологiчноi промисловостi, зокрема Мiжнародноi конференци «Б1О», найбiльшоi в свiтi щорiчноi конференци з бютехнологи. «Б1О» представляе 1200 бiотехнологiчних компанiй, академiчних шститутав, державних центрiв бiотехнологii i пов'язаних з нею оргашзацш на територи Сполучених Штатiв та понад 30 шших краш.

ANALYTICA ANACON INDIA 2011 — 6-ТА М1ЖНАРОДНА ВИСТАВКА АНАЛ1ТИЧНОГО I ЛАБОРАТОРНОГО УСТАТКУВАННЯ, 1НСТРУМЕНТУ,

БЮТЕХНОЛОГИ

Перiодичнiсть проведення виставки — один раз на два роки. Основш тематичш роздiли:

- аналiз / контроль якостi;

- вимiрювальне i тестувальне устаткування;

- лабораторш технологii;

- бiотехнологiя;

- медицина i дiагностика. Галузi застосування:

> хiмiя, нафтохiмiя;

> фармацевтична промисловють, косметологiя;

> медицина, дiагностика;

> електротехнiка, електронiка;

> харчова промисловють, натуральнi продукти харчування;

> еколопя, захист навколишнього середовища та ш.

IV CONGRESS OF POLISH BIOTECHNOLOGY AND IV EUROBIOTECH 2011 IV конгрес бютехнологи Польщi та IV «Свробттех» 2011

Дата проведення: 12-15.10.2011 р. Мюце проведення: Кракiв (Польща).

Веб-сайт: http://eurobiotech.krakow.p1/gb//about-congress.html Тематика

«Червона» бштехнолопя:

- функцiональна перевiрка геному раку;

- опромшення для ядерноi медицини;

- молекулярна дiагностика i персоналiзована медицина;

- перенесення генiв та генна терашя;

- cтовбуровi кл^ини в бiотехнологii;

- cтовбуровi клггини, генна терапiя i бiоетика.

Г)

Дата проведення: 12-14.10.2011 р. Мюце проведення: Бомбей (Iндiя).

Веб-сайт: http://www.profiexpo.ru/exhibition.asp?ID=1774

October. 12»-IS" 2011. Krakow. Poland

«Зелена» бютехнолопя:

- бютехнолопчш пiдходи до виявлення стресостшкост reHiB для шдвищення врожайностi;

- агробiотeхнологiя — йльськогосподарська тeхнологiя, бiологiчна безпека i економша;

- агробiотeхнологiя — бiотeхнологiя геному рослин;

- агробютехнолопя — бютехнолопя у тваринництвi, сiльському господарствi та бюмедициш;

- бiотeхнологiя в харчовш промисловостi й виробництвi кормiв;

- еколопчна бiотeхнологiя. «Бша» бiотехнологiя:

- нутриеномша, нутрiгeнeтика i сучасна дiагностика;

- промисловi бiомаси та промислова бютехнолопя;

- промисловi бiопроцeси i бiокаталiз;

- синтетична бiологiя, бюшформатика i нанотeхнологiï;

- фармацевтична бютехнолопя;

- вiдновлюванi джерела eнeргiï. «Фюлетова» бiотехнологiя:

- передача тeхнологiй — основш питання укладення договорiв у галузi бiотeхнологiï;

- правовi питання, що стосуються iнтeлeктуальноï власностi та сощальних аспeктiв бютех-нологiï;

- права штелектуально! власностi в бютехнологи.

NATIONAL CONFERENCE ON RECENT ADVANCES

IN PLANT SCIENCES Нацшнальна конференщя з останшх досягнень у po^nHHnnTEÎ

Дата проведения: 15-16.10.2011 р. Мюце проведення: Алпарх (1нд1я). Веб-сайт: https://docs.google.com/document/

pub?id=lFJjEInqt_gMcnRtoxZnKcSyR4AWfwaYJQ71InfcC41Q

До участi в конференци запрошуються всi бажаючi для вiльного обмшу думками i встанов-лення наукових контактав. Теми конференци:

- бютехнолопя рослин;

- молекулярна 6ГологГя i цитогенетика;

- еколопя рослин i навколишнього середовища;

- насiннeвi рослини;

- 6юхГмГя i ФГзГологГя рослин;

- рослини для репродуктивно! бюлоги;

- морФологГя та анатомiя рослин;

- мшробюлопя i патологiя рослин.

V М1ЖНАРОДНА НАУКОВА КОНФЕРЕНЦ1Я «В1ДНОВЛЕННЯ ПОРУШЕНИХ ПРИРОДНИХ ЕКОСИСТЕМ»

Дата проведення: 18-21.10.2011 р. Мюце проведення: Донецьк (Украша).

Веб-сайт: http://www.kon-ferenc.ru/konferenc12_10_11.html

Шд час роботи конференцй' плануеться розглянути так питання:

- вивчення бiорiзноманiття природних екосистем, !х вiдновлeння i охорона;

- комплексне збереження i стшке використання бiорiзноманiття;

- гeнeтичнi для популяци i ФГзГолого-6ГохГмГчнГ аспекти стшкост рослин в умовах техногенного забруднення;

- фио^ди^^я техногенних забруднень;

- ф^орекультивування i ф^омелюращя порушених земель;

- штродукщя рослин у ботанiчних садах i дендропарках, 1хня роль у збереженш й вщнов-леннi бiорiзноманiття.

INTERNATIONAL CONFERENCE ON COMPUTER ENGINEERING AND BIOINFORMATICS ICCEB 2011 Мiжнародна конференщя з комп'ютерно'1 iнженерil та бшшформатики ICCEB 2011

Дата проведення: 21-23.10.2011 р.

Мiсце проведення: Ка!р (вгипет).

Веб-сайт: www.icceb.org

Загальна шформащя

Метою серп конференцiй ICCEB е забезпечення форуму для створення основ нового принци-пового тдходу до комп'ютерно! iнженерiï та бюшформатики. 1з цiею метою передбачаеться за-лучення учасникiв з рiзним рiвнем пiдгоговки з метою сприяння встановленню конгакгiв мiж рiзними галузями дослщжень, а також виявлення i обговорення нов^шх георiй, методик, iнсгруменгiв i доповнень.

М1ЖНАРОДНА НАУКОВА КОНФЕРЕНЦ1Я «ДОСЯГНЕННЯ I ПЕРСПЕКТИВИ РОЗВИТКУ СЕЛЕКЦП, ОБРОБКИ ТА ВИКОРИСТАННЯ ПЛОДОВИХ КУЛЬТУР»

Дата проведення: 24-27.10.2011 р.

Мюце проведення: Ялта (Украша).

Веб-сайт: www.nbgnsc.com

Програма конференций

• Генетичн ресурси, селекщя, генетика кiсгочкових, субгропiчних плодових, горiхоплiдних, ягiдних i неградицiйних культур насшневих.

• Сортовивчення плодових культур.

• Технолопчш прийоми обробки i розмноження.

• Зберпання i переробка плодово! продукцiï.

17th ANNUAL BIO EUROPE 2011 17-та щорiчна конференцiя BIO EUROPE 2011

Дата проведення: 31.10-02.11.2011 р. Мюце проведення: Дюссельдорф (Шмеччина). Веб-сайт: http://www.ebdgroup.com/bioeurope/index.php

BIO-EUROPE е найб1лыиою партнерською конференщею у Оврот в галуз1 iндусгрiï бiогехнологiï. Конференцiя щорiчно залучае до учасгi провiдних фахiвцiв у цiй галузi, а також фармацевтики i фшанйв, предсгавникiв найвщомших нових компанiй. Цю подiю, що проводиться за пiдгримки BIO, розщнюють як видатну для розвитку бютехнолопчно! промис-ловосгi.

11th ASIAN TEXTILE CONFERENCE 11-та Азшська конференщя з текстильно!' промисловост

АТС-11 The 11th

Дата проведення: 01-04.11.2011 р.

Мiсце проведення: Дегу (Республша Корея).

Веб-сайт : http://www.atc11.org/program/topics.php

Головною темою конференцп е загальний погляд на текстиль з точки зору людини i приро-ди. З урахуванням постшного процесу розвитку i розширення текстильно! промисловоста, що пов'язаний з проникненням в iншi науково-дослiднi й гехнологiчнi галуз^ тематика включае мiждисциплiнарнi питання, пов'язаш з текстильною промисловiсгю, а також з волоконною, текстильною i полiмерною галузями науки та шженерп.

Головш питання:

• волоконнi та полiмернi магерiали;

• оброблення текстилю, мехашка i машини;

• фарбування, обробка, нанесення покриттав i ламiнування;

• тестування текстилю, ощнка та продуктившсть;

• текстильний дизайн, мода i виробництво одягу;

• штерактивний текстиль i нанотехнологп;

• екологiчно чистий текстиль i бютехнолопя;

• текстиль, що застосовуеться в екстремальних ситуащях/текстиль, що виконуе захисну функщю;

• нетканий i техшчний текстиль;

• новий композитний текстиль i його застосування.

INTERNATIONAL SEMINAR ON THE APPLICATION OF SCIENCE & MATHEMATICS Мiжнародний семшар i3 застосування науки i математики

Seminar Application gt

Дата проведення: 01-03.11.2011 р.

Мюце проведення: Куала-Лумпур (Малайзiя).

Веб-сайт: http://uhsb.uthm.edu.my/isasm2011/index.html

Тематика конференцп:

Фiзика: фiзика високих енергiй, радiацiйна безпека, ядерна фiзика, геофiзика, лазери, фо-гонiка, конгрольно-вимiрювальнi прилади, наногехнологiï.

Хiмiя: органiчна i неорганiчна хiмiя, прикладна хiмiя, бiохiмiя, хiмiчний синтез, аналгтич-на хiмiя, судово-медична хiмiя, «зелена хiмiя».

Бiологiя: бiогехнологiя, бiохiмiя, бюшдус^я, бiополiмери, бiоiнформацiя, бiорiзно-манiггя.

Математика: математичне моделювання, бюматематика, обчислювальна математика, моде-лювання, обчислювальна гiдродинамiка, неч^шсть i ïï застосування, чисельний аналiз, шже-нерна математика, дослiдження операцш i опгимiзацiя.

Статистика: статистичне моделювання, випадковi процеси, операгивнi дослiдження, функщональна статистика, нейронна мережа, прогнозування, евристичний тдхщ.

Iнженернi науки: наногехнологiï, полiмери, магерiалознавсгво, напiвпровiдники, новi ма-терiали, елекгрогехнiчна i електронна гехнiка, цив!льне будiвницгво, машинобудування.

4TH ENVIRONMENTAL TECHNOLOGY AND MANAGEMENT

CONFERENCE (ETMC) 4-та конфеpенцiя з еколоНчно!' технологи i упpaвлiння (ETMC)

П Дата проведения: 03-04.11.2011 р. i™ Micije проведения: Бандунг (1ндонез1я).

Веб-сайт: http://www.etmc-2011.org/index.php

Ця конференцiя, яка рашше називалася «Семшар з еколопчно! технологи i управлiння (ETMS)», проводиться один раз на 4 роки. У нш вiзьмуть участь полггики, вченi, iнженери та експерти в галузi екологiчних технологiй i управлшня. Наголос буде зроблено на поточш й май-бутнi мicцевi, регюнальш та глобальнi екологiчнi проблеми.

Mетa конфеpенцiï:

• Забезпечення платформи для обмшу iдеями, iнформацieю i досвщом мiж зацiкавленими сторонами.

• Розвиток ствпращ та взаeмодiï мiж заштересованим сторонами.

• Обговорення i ощнка оcтаннiх пiдходiв, iнновацiйних технологiй, стратегш i нових на-прямiв у виршенш екологiчних питань.

Oбговоpювaтимуться так теми:

> змiнa клiмaту: пом'якшення наcлiдкiв змiни клiмату, управлiння ризиками i адаптащя;

> досягнення в гaлузi екологiчних технологiй: екологiчна бютехнолопя, газифiкацiя, пiролiз, вдосконалений процес окиснення, передовi методи контролю якоcтi пов^ря, мембран-на технологiя;

> зелеш мiстa: зеленi iнфраcтруктури, утилiзацiя твердих вiдходiв, водопостачання, очи-щення стачних вод i гiгieна навколишнього середовища;

> pa^o^.^^ викоpистaння пpиpодних pесуpсiв: ciльcьке господарство, гiрничодобувна промиcловicть, водш ресурси, якicть повiтря, екологiчний аналiз i управлiння ризиками;

> екогалузк чиcтiше виробництво i запобiгання забрудненню, безпека, охорона здоров'я i довшлля.

THE 24th REGIONAL SYMPOSIUM OF MALAYSIA ANALYTICAL SCIENCES 24-й регшнальний симпоз1ум Малайзи з анал1тичних наук

Дата проведення: 15-17.11.2011 р.

Мюце проведення: Кангар (Малайзiя).

Веб-сайт: http://per1is.uitm.edu.my/skam24

24-й регшнальний симпозiум Малайзи з аналiтичних наук (8КАМ) е шдсумком рiчноi дiяль-ностi малайзшського товариства з аналiтичних наук (АЫАК18). Ця подiя об'еднуе мiсцевих уче-них i дослiдникiв з метою обговорення останшх розробок i результатав аналiтичноi науки зага-лом i аналiтичноi хiмii зокрема.

Наукова програма включае пленарнi засiдання, паралельнi i стендовi сесii.

Головнi теми:

- еколопчний аналiз;

- одержання та екстракщя речовин;

- технiка спектроскопа;

- органiчний i неорганiчний синтез;

- анал^ична бiотехнологiя;

- додатковi матерiали;

- каталiз i промислове застосування;

- бюмедичний i фармацевтичний аналiз;

- аналiз продуктiв та мiкродомiшок;

- аналiз природних продуктiв;

- електроанал^ичний аналiз;

- радiохiмiя;

- продукти переробки масел;

- бюсенсори;

- полiмери;

- дослiдження скупчення рщини в тканинах.

BIOMALAYSIA 2011 Бшмалайз1я 2011

В ЭМ А1 AYS А . Дата проведения: 21-23.11.2011 р.

Micije проведения: Куала-Лумпур (Малайз1я).

Веб-сайт: http://www.biomalaysia.com.my/2011/

Це — найбiльша конференцiя в галузi бiотехнологii в цьому регюш, в якiй беруть участь представники провщних корпорацiй, унiверситетiв, дослiдницьких шститутав i всесвiтньо вiдомi лiдери. Проводиться восьмий рш поспiль. Одночасно з конференщею BioMalaysia 2011 проходитиме i виставка, що виконуе багато нових i цiкавих функцiй, якi дозволять розширити знання в галузi бютехнологп та пiдняти бiзнес на новий рiвень.

Виставка i конференцiя BioMalaysia 2011 проходитимуть разом iз 6-м самцом Азшсько-Тихооке-анського регiону з промисловоi бiотехнологii i бiоенергетики за участю провiдних учених у галузi екологii та промислово'i бiотехнологi'i, увага яких буде спрямована на промислову бютехнолопю в Iндii, Азii i в регiонах свiту, що розвиваються. Конвергенцiя цих двох глобальних подш дасть усiм учасникам i вщвщувачам широкi можливостi для дослiджень, розробок i комерцiалiзацii.

Очiкуеться, що в цш мiжнароднiй подii вiзьмуть участь понад 10 000 фахiвцiв зi всiх регiонiв. Будуть представленi винаходи i розробки бiльш нiж 350 провщних корпорацiй, науково-дослiдних iнститутiв, утверситетав, урядових установ i окремих провщних дослщнишв. Експонати включа-тимуть продукти i прилади для охорони здоров'я i фармацевтики, сiльського господарства, стосу-ватимуться продовольства i напоiв, навколишнього середовища, водних ресурсiв i стачних вод, ви-робництва i бюобробки в лiсовому господарствi, гiрничiй справу бiохiмii та виробництвi бiопалива.

THE 3rd international seminar aptecs

(APPLIED TECHNOLOGY, SCIENCE & ARTS) 3-й м1жнародний семшар APTECS (прикладна технолоНя, наука i мистецтво)

Intrrnulionul Seminar "n Applird Technology, Sciencc and Art*

Дата проведення: 06-07.12.2011 р.

М^це проведення: Сурабайя (Iндонезiя).

Веб-сайт: http://www.aptecs.its.ac.id/

На цьому форумi обговорюватимуться глобальнi питання, що стосуються вщновлюваних джерел енергii, енергоефективностi, реструктуризацii енергетики, бюлогп морiв, морських i прибережних споруд та навколишнього середовища, а також електротки, мехатрошки, матерiалознавства, промислових процейв, iнформацiйних i комунiкацiйних технологш, бiотехнологii, бiомедичноi iнженерii, нанотехнологii. Очшуеться, що в роботi семiнару вiзьмуть участь ученi, дiячi в галузi освiти, бiзнесу i промисловостi, практичноi охорони здоров'я, працiвники державного апарату, мистецтва i культури.

4th POLISH-UKRAINIAN WEIGL CONFERENCE ON MICROBIOLOGY «FROM MICROBIOLOGY TO SYNTHETIC BIOLOGY» (MAY 18-21, 2011, CZESZOW NEAR WROCLAW, POLAND)

Similar to Parnas conferences on Biochemistry, Weigl conferences on Microbiology have been organized periodically in Ukraine and Poland. The 1st Weigl conference took place in Lviv (Ukraine) in 2003, and since that time there were two more Weigl conferences organized in Warsaw and Odesa. The 4th Weigl conference was organized in May 18-21, 2011, and the scientific sessions took place at the hall of the hotel in a small village Czeszow located near Wroclaw (Poland).

Who was Rudolf Stefan Weigl? Briefly, his main discovery is a vaccine against typhus. This discovery was not only a great discovery, but it also got a broad practical application, especially during the 2nd World War. Weigl has started his scientific carrier in 1907 as an assistant at the Department of Zoology of the Faculty of Natural Sciences of Lviv University. At that time, it was one of the best universities in Poland. In his research, Weigl used modern methods related to parasitology, and this led him to the doctorate habilitation in 1913. Visiting the bacteriological lab of Philip Eisenberg has provided Weigl with modern microbiological methods, and the break of typhus epidemic in the Austrian army during the 1st world war has twisted the scientific fate of Weigl. It should be noted that production of the anti-typhus vaccine involved many outstanding Lviv scientists and artists in feeding the Rickettsia infected lice, since this was the only way how those people could save their lives and earn some money in order to survive during German occupation period in 1941-1944.

Why the logo of the 4th Weigl conference was «From Microbiology to Synthetic Biology»? Among the honorary guests and keynote speakers of the conference, there were: Waclaw Szybalski, professor of the University of Wisconsin-Madison (USA) — an outstanding molecular biologist, creator of synthetic biology which was put in founding gene therapy, and Karl Maramorosch, professor of The Rutgers-State University of New Jersey (USA) — an outstanding virologist. They both spent their young years in the Western Ukraine, and prof. Szybalski was born in Lviv, worked at Weigl's laboratory, and studied at Lviv Technical University.

The opening ceremony of the 4th Weigl conference took place in Aula Leopoldinum — a historical hall of Wroclaw University. The meeting was headed by prof. Andrzej Gamian — Head of the Organizing Committee; prof. M. Niemialtowski — President of the Committee on Microbiology, Polish Academy of Sciences; prof. S. Komisarenko — Director of the Institute of Biochemistry, NAS of Ukraine; prof. A. Sibirny — Director of the Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine; prof. W. Szybalski — the University of Wisconsin-Madison (USA), and prof. Karl Maramorosch, The Rutgers-State University of New Jersey (USA). At the end of the opening ceremony, Halina Szymura (Poland) presented the film devoted to prof. R. S. Weigl. Some vivid documents taken during his active work on the development of anti-typhus vaccine were demonstrated in that film.

The Session 1 was devoted to the «History of Medicine and Microbiology», in particular, to the role of prof. Rudolf Weigl and his lab in the development of parasitology, epidemiology, and microbiology. At this session, there were two keynote lectures presented by Waclaw Szybalski «Gene therapy and synthetic biology», and Karl Maramorosch «How Albert Schatz discovered streptomycin and missed

At the Opening Ceremony of the 4th Weigl conference in Wroclaw (Poland) in May 18, 2011.

the Nobel Prize». Besides, Jerzy Chmielowski (Katowice, Poland) who also worked at Weigl's lab during the 2nd world war period, made a presentation about professor Henryk Mosing who was among the best collaborators of R. S. Weigl. Iryna Kurganova (Lviv, Ukraine) delivered a lecture «To the 100-years anniversary of doctor Henrich Mosing birthday», and Rostyslav Stoika (Lviv, Ukraine) had a brief presentation based on some interesting documents from Lviv City Archives that were touching scientific life of prof. Weigl.

The Session 2 was titled «Medical Microbiology», and there were four lectures presented by: Serhiy Komisarenko (Kyiv, Ukraine) «Recombinant proteins in prophylaxis, diagnosis, and treatment of tuberculosis and diphtheria», Macej Ugorski (Wroclaw, Poland) «The role of type 1 fimbriae in pathogenesis of Salmonella enteritidis and S. gallinarum», Rostyslav Stoika (Lviv, Ukraine) «Application of novel functionalized nanosized carriers for drug and gene delivery», and Barbara Dlugaszewska (Labo Baza Company) «New approaches of New Brunswick Scientific towards production and purification of biomass and biologically active compounds».

The Session 3 was titled «Microbial Biotechnology», and all lectures but one (Nataniel Bialas, Katowice, Poland) «Production of the exopolysaccarides by a wild type strain Yersinia enterocolitica») were presented by the conference participants who work at the Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine (Lviv). The session was opened by the lecture of A. Sibirny (Director of this Institute) «Yeast metabolic engineering for construction of the advanced producers of biofuels». The next speakers at this session were: Natalia Finyuk, Yuriy Boretskyy, Yuriy Pynyaha, Valentina Yatsyshyn, Kostantyn Dmytruk, Nataliya Stasyuk, and Oleh Smutok.

The Session 4 was titled «Microbial Genetics», and four lectures were presented by: Mykhailo Gonchar (Lviv, Ukraine) «Nanosized biorecognition elements of biosensors», Andriy Zakalskiy (Lviv, Ukraine) «Overexpression of (His)6-tagged human arginase 1 in Saccharomyces cerevisiae», Anna Grudniak (Warsaw, Poland) «Characterization of E. coli htpG null mutant», and Oleh Stasyk (Lviv, Ukraine) «Construction of yeast producers of recombinant human arginase 1 as anticancer agent».

The Session 5 was titled «Environmental Microbiology», and the following lectures were presented by: Anna Pauter (Torun, Poland) «Some physiological properties of microsymbionts stimulating growth of Robinia pseudoacadia», Anna Brzezinska (Torun, Poland) «Influence of Myxobacteria isolated from the forest soils on the fungi pathogenic to roots of scot pine (Pinus sylvestris)», Maria Boretska (Kyiv, Ukraine) «Features of exopolymer composition in thionic bacteria biofilms», Daria Fedorovych (Lviv, Ukraine) «Study of non-enzymatic systems involved in the chromate tolerance of the yeast Pichia guil-liermondii», Olena Moshynets (Kyiv, Ukraine) «A new methodological approach for studying the phy-toshere as a microbial microcosm: a new insight into plant-microbial interactions».

The Session 6 was titled «Advances in Virology», and the following lectures were presented by: Marek Niemialtowski (Warsaw, Poland) «Mousepox conjunctivitis and herpetic stromal keratitis as example of viral ocular infection», Anatoly Potopalsky (Kyiv, Ukraine) «Elicitation and protection effects of preventive treatments with isatizon against Tobacco Mosaic Virus in Nicotiana tabacum», Liudmyla Leibenko (Kyiv, Ukraine) «Phylogenetic analysis of pandemic 2009 influenza A viruses isolated in Ukraine», Zenoviy Trachuk (Kyiv, Ukraine) «Clinical use of the antiviral effect of yeast RNA and features of the mechanism of action».

The Session 7 was titled «Advances in vaccinology and immunology», and the following lectures were presented by: Andrzej Myc (Ann Arbor, USA) «Nanoemulsions as mucosal vaccine adjuvants», Marek Drab (Wroclaw, Poland) «Caveolae — structure and functions», Anna Kurek (Warsaw, Poland) «Effect of oleanolic and ursolic acids on bacterial susceptibility to antibiotics and biofilm formation and structure», Marcin Lukaszewicz (Wroclaw, Poland) «Investigation of Candida albicans virulence factors», Heinicke Burhard (SHP Steriltechnik AG/Labo Baza Companies) «Steam sterilization in accordance with relevant norms», Andrzej Szkaradkiewicz (Poznan, Poland) «Application of autovaccine in treatment of patients with chronic Staphylococcus aureus infections», Katarzyna Dzierzba (Wroclaw, Poland) «5-amino-2-pyridyl 1-thioglycosidases application in the glycine epitope glycoconjugate synthesis».

As usual, there was the Poster Session during which a competition of the best posters presented by young scientists took place. Selected young scientists also got an opportunity to have short oral presentation. Rostyslav Bilyy (Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine) was nominated as the winner of this competition, and got the 1st prize including the monetary support. Other young scientists working at the research institutions of Ukraine were also awarded.

Those who want to get acquainted with the materials of the 4th Weigl conference in more detail can address the journal «Sepsis» (Vol. 4, N 1, 2011) where some lectures, including the keynote lectures, are presented in the form of the articles.

Prof. Rostyslav Stoika,

Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv

Доповнення до Правил для авторiв

Текст резюме мае починатися реченням, в якому сформульовано актуальшсть аналiзованоi автором (авторами) проблеми. Слщ зазначити, що нового е в цш робота порiвняно з iншими, спо-рщненими за тематикою i цiльовим призначенням.

Дат висвiтлюються:

• предмет, тема, мета роботи;

• метод або методолопя п проведення;

• результати роботи;

• галузь застосування результатав;

• висновки.

Методи в резюме тальки називаються. Результати роботи слщ подавати гранично точно й шформативно. Наводяться основнi теоретичнi та експериментальш результати, фактичнi данi, виявленi взаемозв'язки i закономiрностi. При цьому перевага вщдаеться новим результатам

1 висновкам, ям, на думку автора статта, мають практичне значення. Потрiбно вказати меж1 точностi та надiйностi даних, а також ступшь 'iх об^рунтування. Висновки можуть супроводжу-ватися рекомендащями, оцiнками, пропозицiями, описаними в статта. Рекомендований се-реднiй обсяг тексту резюме для журналу «Бютехнолопя» — 2 000 знашв (30 рядшв тексту).

Зважаючи на зростаючу популяршсть журналу «Бiотехнологiя» серед зарубiжних науковщв, особливу увагу слiд придiляти написанню резюме статтi англiйською мовою. Для цього дощльно користуватися послугами квалiфiкованих фахiвцiв-лiнгвiстiв з подальшою науковою редакщею тексту автором(-ами).

КороткЬ повЬдомлення

Журнал публшуе меншi за обсягом статта, яш мають безумовну новизну i значущiсть для бютех-нологп. Щ статтi проходять прискорене рецензування i публiкуються в короткi термiни. Загальний обсяг короткого повiдомлення обмежений 10 машинописними сторiнками, кiлькiсть малюнкiв ^або таблиць — не бiльше 3, а список використаних лиературних джерел не повинен перевищувати 15. Роздши короткого повiдомлення аналогiчнi роздiлам оригинально'' статтi, але не видiляються заголовками i пiдзаголовками; результати можуть бути викладеш разом з обговоренням.

Доцiльнiсть тако'' позачергово'' публшацп мае бути об^рунтована в листi, що надсилаеться Головному редакторовi автором для кореспонденцп. У разi прийняття така робота може бути опублшована протягом 3-4 мюящв.

У роздiлi «Дискусп» можлива публiкацiя дискусiйного матерiалу.

Дополнения к Правилам для авторов

Текст резюме должен начинаться фразой, в которой сформулирована актуальность анализируемой автором (авторами) проблемы. Следует указать, что нового содержит эта работа в сравнении с другими, близкими по тематике и целевому назначению.

Далее приводятся:

• предмет, тема, цель работы;

• метод или методология ее проведения;

• результаты работы;

• область применения результатов;

• выводы.

Методы в резюме только называются. Результаты работы следует описывать предельно точно и информативно. Приводятся основные теоретические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности. При этом предпочтение отдается новым результатам и выводам, которые, по мнению автора статьи, имеют практическое значение. Следует указать пределы точности и надежности данных, а также степень их обоснования. Выводы могут сопровождаться рекомендациями, оценками, предложениями, описанными в статье. Рекомендуемый средний объем текста резюме для журнала «Бютехнолопя» —

2 000 знаков (30 строк текста).

Учитывая растущую популярность журнала «Бютехнолопя» среди зарубежных специалистов, особое внимание следует уделять написанию резюме статьи на английском языке. Для этого следует пользоваться услугами квалифицированных специалистов-лингвистов с дальшейшим научным редактированием текста автором(-ами).

Краткие сообщения

Журнал публикует меньшие по объему статьи, которые имеют безусловную новизну и значимость для биотехнологии. Эти статьи проходят ускоренное рецензирование и публикуются в короткие сроки. Общий объем краткого сообщения ограничен 10 машинописными страницами, количество рисунков и/или таблиц — не более 3, а список использованных литературных источников не должен превышать 15. Разделы краткого сообщения аналогичны разделам оригинальной статьи, но не выделяются заголовками и подзаголовками; результаты могут быть изложены вместе с обсуждением.

Целесообразность такой внеочередной публикации должна быть обоснована в письме, направляемом Главному редактору автором для корреспонденции. В случае принятия такая работа может быть опубликована в течение 3-4 месяцев.

В разделе «Дискуссии» возможна публикация дискуссионного материала.

Amendment to the Author rules

Text abstract should begin with a phrase which the author(s) formulated the relevance of the analyzed problem in. Then it is stated what kind of news this document bears in comparison to other related topics.

The following are:

• subject, topic, purpose of work;

• method or methodology of work performance;

• results of work;

• application area of results;

• conclusions.

Methods in the abstract are just called. Results are described extremely accurate and informative. The basic theoretical and experimental results, factual data, manifested associations and common factors are provided. Thereat new findings and conclusions are preferred which are of practical importance in the opinion of the author. It should be indicated the limits of accuracy and reliability of data as well as their degree of justification. Recommendations, estimates, proposals, described in the article could be given in conclusions. Recommended average volume of the abstract for the «BioTexHo^oria» journal is 2 000 characters (30 lines of text).

Given the growing popularity of the «Biotechnology» journal of foreign specialists, special attention should be paid to the articles resume writing in English. To do this, use the services of the qualified linguists and scientific text editing by the author(s).

Short messages

«Biotechnology» journal publishes the smaller volume of the items of implicit originality and relevance to biotechnology. These articles are expedited review and published in a short term. The total volume of short messages is limited to 10 typewritten pages, number of drawings and/or tables should not exceed 3, and a list of used literature sources could not be more than 15. Sections of the brief messages are similar to the sections of the original article, but not highlighted with headings and subheadings, the results could be given together with the discussion. Author for correspondence should justify the expediency of such an extraordinary publication in a letter to the editor. In case of acceptance, such work could be published within 3-4 months.

Publication of a material of polemical character is possible in «Discussions».