CC BY
13
ЛАБОРАТОРНАЯ МЕДИЦИНА
LABORATORY MEDICINE
УДК: 612.017.11;612.017.1:57.052;
Н. Абдолла1, 2, Ю.В. Перфильева1, Е.О. Остапчук1, Р. Тлеулиева1, В.К.КрасноштановЗ Н.Н. Беляев1
1МААйтхожин атындагы молекулалыц биология жэне биохимия институты, Молекулалыц иммунология жэне
иммунобиотехнология лабораториясы, 2эл-Фараби атындагы Казац ¥лттыц УниверситетI, 3Онкологиия жэне радиология гылыми-зерттеу институты, Казацстан Республикасы, Алматы ц
АДЪЮВАНТ-ИНДУКЦИЯЛАЖАН АРТРИТТЩ ТЫШЦАН УЛГЮНДЕП МИЕЛОИДТЫ СУПРЕССОРЛЫЦ ЖАСУШАЛАРДЫН,
ФЕНОТИПТ1К ЖЭНЕ ФУНКЦИОНАЛДЬЩ ЕРЕКШЕЛ1Г1
Бул жумыс созылмалы цабыну процессI кезшдег! миелоидты супрессорлыц жасушалардыц (МОБСб) фенотипт!к жэне функционалдыц ерекшел!г!н зерттеуге арналган. Жург!з!лген зерттеулер барысында созылмалы цабынудыц адювант артрит улг!с!нде, квкбауырда супрессорлыц потенциялга ие гранулоцитарлы жэне моноцитарлы MDSC фракцияларыныц жалпы пулыныц айтарлыцтай кебейетш аныцталды.
ТYйiндiсвздер: Созылмалы цабыну, миелоидты супрессорлыцжасушалар, адювант артрит,
Kipicne. Ka3ipri уа;ытта созылмалы ;абыну процесймен байланысты аурулар ;атарыныц пайда болу жшлтшц ecyi бай;алуда, олардыц арасы журек-;антамырлар ауруы, к;атерлi iciK, артрит, диабет, сияк;тылармен ерекшелiнедi [1]. Бул аурулардыц болуы адамдардыц 0мiр сапасын т0мендетедi жэне ец соцында олардыц 0лiмiнiц басты себебi болып ;алады. Жеке алганда созылмалы ;абыну, аны; созылмалы аурудыц алдында болады. Созылмалы ;абынудыц механизiмi iс ЖYзiнде жедел ;абынудыц механизiмiнен 0згешеленедi, оныц морфологиялы; K0рiнiсiнде мастоциттер, нейтрофилдер жэне макрофагтар орталы; орынды иеленедi. Ая;талмаган жедел ;абыну жагыдайында соцына дейiн аныщталмаган себебтер бойынша негiзгi ;атысушылары Т-лимфоциттер, макрофагтар жэне фибробластар болатын созылмалы ;абыну дамиды. Бiзше, иммунорегуляторлы; жасушалар ;атарыныц супрессорлы; активтiлiгiнiц KYшеюi болатын, созылмалы ;абынудыц дамуына алып келетiн, жедел ;абыну реакциясын ая;тауга MYMкiндiк бермейтiн бул процесстеп мацызды р0лге миелоиды супрессорлы; жасушалар (Myeloid Derived Suppressor Cells, MDSC) деп аталатын жасушалар ;атысуы MYMкiн деп жорамалдаймыз. MDSC тыш;андарда CD11b жэне Gr-1 жасушалы; маркерлершщ экспрессиясы бойынша
идентификацияланган, миеломоноцитарлы; багыттагы гемопоэтикалы; бастап;ы 0зiндiк гетерогендi популяция [2]. MDSC кейбiр ;осымша маркерлершщ болуы жэне ядро формасы бойынша: моноцитарлы (M-MDSC) жэне гранулоцитарлы (G-MDSC) ею субпопуляцияга б0лiнедi. Калыпты кезде бул жасушалар к0п м0лшерде жШк кемiгiнде бай;алганымен, к0кбаур мен шетга айма;тык; ;анда негiзiнен аныщталмаган. [3]. Жануарларды iсiк процессiн моделдеуде олардыц лимфотYЙiндерi мен к0кбауырдагы саны едэyiр 0седi, сонымен бiрге iсiктiц стромасында, iсiкке ;арсы иммyнитеттiц элсiреyiмен сэйкес келедi [4]. Бiз MDSC онкогенезд белгiлi децгейде белсендендiретiн созылмалы ;абыну патогенезiмен байланысты жэне осы процессте басты р0лд ат;арады деп жорамалдаймыз.
Зерттеудщ максаты: Созылмалы ;абынудыц адювант артрит Yлгiсiнде MDSC фенотиптiк жэне функционалды; ерекшелiгiн зерттеу болып табылады. Зерттеу материалдары мен эдicтepi.
Цолданылган жануарлар
Адъювант артрит Yлгiлеy КР ДМ Онкологиия жэне радиология гылыми-зерттеу конвенциялы; вивариа жагыдайында усталган салма;тары 30-35г 63 аталы; CD1 линиалы аутбред тыш;андарда ЖYргiзiлдi. Лабораториялы; жануарлармен болган барлы; зерттеу жумыстары, жануарларды ;оргау, зерттеу жэне гылыми ма;саттар Yшiн ;олдану бойынша Европалы; конвенция ;абылдаган ережелерге сэйкес стандартты процедурага непзделген к0пшiлiк мак;улдаган жануарлармен жумыс этикалы; нормасына сэйкес iстелдi.
Адъювант apmpummi улгыеу
Адъювант артрит сына; тобындагы тыш;андарга 0,1 мл толы; адъювант Фрейндт ("Sigma-Aldrich", АКШ) арт;ы аягыныц табан Yлтаныц астына 100 мкл ден бiр рет енгiзy ар;ылы тудырылды. Ба;ылау тобындагы тыш;андарга адъювант Фрейндтщ орнына физологиялы; ертiндi енпзшдъ 2 жэне 4 аптадан кейш тыш;андарыц к0кбауры хиругиялы; жолмен алынып к0кбауыр мононуклеар жасушаларын алу y™^ ;олданылды. Квкбауыр мононуклеарлыц жасушалар суспензиясын алу Сына; жэне ба;ылау тобындагы тыш;андардан хирургиялы; жолмен алынган к0кбаур айнек гомогенизатор K0мегiмен гомогенизацияланды. Алынаган жасушалы; суспензия 20оС -та 1450 g кезiнде 1,083 г/мл гистопак тыгыздьщ градиентiнде 20 мин бойы центрифугаланды ( 3k-30, Sigma, Германия). Са;ина TYрiнде б0лектелген мононуклеар жасушалар фракциясы 300 g кезiнде 10 мин бойы центрифугаланды жэне натрий фосфатты буферде (phosphate-buffered saline-PBS) суспензияланды.
Агынды иммуноцитофлуориметрия
Жасушалар фенотип агынды иммуноцитофлуориметрия к0мепмен CD-маркерлерiн аны;тау жолымен багаланды. Бул y™^ жасушалар суспензиясы фикоэритрин (PE), флуоресцеин-изотиоцианат (FITC) немесе Перидинин-хлорофилл белк (PerCP) тацбаларымен белгiленген CD-маркерлерге ;арсы моноклональды антиденемен 0ндiрyшi фирмалар (BD Biosciences, АКШ немесе Milenyi Biotec, Германия) хаттамасына сэйкес 0цделдъ Алынган жасуша препараттары агынды цитометр (FACS Calibur, BD Biosciences, АКШ) ар;ылы 0ткiзiлдi жэне антиденемен байланыс;ан жасушалар Yлесi сонымен бiрге эр маркердiц орташа интенсивтi флуоресценциясы багаланды. Миелоидты жасушалардыц супрессорлыц потенциялын багалау
G-MDSC жэне M-MDSC фракцияларын, ба;ылау жэне тэжiрибелiк тыш;андардыц к0кбаурынан иммуномагниттш сепарциялау эдiсiмен б0лiп алды; жэне алдын ала виталды боягыш CFSE мен тацбаланган, ConA-мен стимулденген аллогенд мононуклеар жасушалармен 72 сагат бiрге культивациялады;. Т-жасушалардыц пролиферация децгейi агынды цитофлуориметр K0мегiмен жасыл каналы бойынша, алдын ала CFSE-мен тацбаланган жасушалардыц жар;ырау интенсивтiлiгiнiц T0мендеyi негiзiнде багаланды. ROS продукциясын багалау Yшiн бiз флyоресцеттi боягыш ди-хлорфлуоресцеин диацетат (DCFDA) ;олданды;. Спленоциттер тэжiрибелiк жануарлардан алынып, 30 мин бойы DCFDA боялганнан кейiн боягыштыц флyоресценттiк интенсивтшт, жасыл канал бойынша ерекшеленген CD11b+Ly6G субпопуляцияларында багаланды. Мэлiметтердi статистикалыц вцдеу
Алынган мэлiметтер математикалы; статистика эдiстерiмен ;олданбалы программалар t-Стьюдент критериасы (Ттест), арифметикалы; орташа мэндi есептеу
Вестник КазНМУ №3-2017
205
(М) жэне стандартты ауытку (SD) Microsoft Excel ;олданбалы программаларын ;олданып компьютерде ецделдъ Ekî орташа шамалардыц айырмашылыгы Р<0,05 мэндiлiк децгейiнде аны; есептедi. Зерттеу нэтижелерi жэне оларды талдау 1. Бацылау динамикасындагы MDSC курамы Сына; салма;тар 30-35г 63 аталы; тыш;анга журпзШп, олардыц кекбаурдагы эртуш MDSC субпопуляцияларыныц ;урамын ба;ылау динамикасында (2 апта жэне 4 апта) зерттелдь Толы; адъюант Фрейда (ТАФ) енпзгеннен кешн артрит инъекция орнында ;ызару жэне етгар ¡йну туршде бай;алды. 1сшудщ шамасы, адъювант артрит кезшдеп ;абыну процессшщ децгешн багалау ушш жт ;олданылатын, инекция жасалган аягыныц ;алыцдыгыныц езгерк керсетгаштер1 ар;ылы багаланды [5]. Жануарларга адъюват енпзгеннен кешн 2-аптаныц соцына ;арай сына; тобыныц ая;тарыныц диаметры 3,8±0,1 мм, ба;ылау тобы 2,31±0,01 мм (р=0,0009) жэне 4-аптаныц соцына ;арай сына; тобында 3,5±0,1 мм ал ба;ылау тобында 2,4±0,1 мм (р=0,0003) болды. Тэж1рибе басталганнан кешн 2 аптадан соц сына; тобындагы тыш;андардыц кекбаурында CD11b+Gr-1+ фенотипт жасушалардыц улей ба;ылау
тобымен салыстырганда уш есеге кебейд (сурет 1A). Сонымен ;атар б1з кекбауыр MDSC жалпы пулыныц жогарлауындагы гранулоцитарлы (CD11b+Ly6Ghigh) жэне моноцитарлы (CD11b+CD49d+) фракциясыныц улейн аны;тады;. Еганш1 аптаныц соцына ;арай CD11b+Ly6Ghigh фенотипт жасушалар популяциясыныц ба;ылау тобымен салыстрганда сына; тобында айтарлы;тай кебейетМ аны;талды жэне бул кебею тэж1рибе басталганнан тертшш1 аптаныц соцына дешн са;талды. Ал CD11b+CD49d+ фенотипт жасушалар проценттш улей, адъювант артрит даму динамикасыныц ею ба;ылау мерз1мшде де аны; жогарлау бай;алды (сурет 1B). Созылмалы ;абыну бар тыш;андарда CD11b+Ly6Ghigh жэне CD11b+CD49d+ миелоидты; жасушалар улей еганш1 аптаныц соцына ;арай кенет кебеюше сэйкес, кекбауырдагы CD8+ жэне CD4+ T-жасушалар децгешнщ темендеу бай;алды (сурет 1C), б1ра; NK жэне NKT-жасушалары децгешнде езгерк болмады (мэл1меттер керсетшмеда). Сонымен ;атар б1з ба;ылау мерз1мшде (2 жэне 4 апта) барлы; топтагы жануарлардыц (мэл1меттер керсетшмедЦ кекбаурларыныц салмагымен оныц жасушалыгында (жасуша саны/кекбаур салмагы) езгерк бай;амады;.
Сурет 1 - Ба;ылау (Б) жэне адъювант артриттщ дамуыныц динамикасындагы (С) тыш;андардыц кекбаурындагы жасушалар ;урамыныц езгерга. А) CD11b+Gr-1+ жасушалар В) CD11b+Ly6Ghigh жэне CD11b+CD49d+ жасушалар C) CD4+ жэне CD8+ жасушалар. M±SD туршдеп мэл1меттер *Р<0,05*, *Р<0,005, ***Р<0,0005.
Бул кезецдеп зерттеуде адъюват артрит динаммикасында кекбаурда CD11b+Ly6Ghigh жэне CD11b+CD49d+ фенотипт миелоидты жасушалар жина;талуы CD8+ цитотоксикалы; лимфоциттер жэне CD4+ жасушалар децгешнщ темендеу1мен сэйкес журетшш керсеттш. 2. Адъюват артриттi улг!с1ндег! MDSC супрессорлъщ активтшг!н багалау.
Каз1рп уа;ыт;а дешн G-MDSC жэне M-MDSC -дщ б1регей маркерлер1 табылмады жэне нейтрофилдер мен моноциттер у;сас фенотипт сипаттамага ие [6]. Б1зге пайдаланылган созлмалы ;абыну улпм1здеп кебейген миелоидты популяциялардыц супрессорлы; сипаттамага ие екешн керсету керек болды. MDSC д аны;таудыц «алтын стандарты» Т-жасушаныц активтШп мен пролиферациясын басуга арналган тест болып табылады. Тэж1рибелер нэтижейнде б1з ба;ылау тыш;андардан белшш алынган G-
MDSC де жэне M-MDSC де спленоциттердщ митоген-активтШк пролиферациясын тежемейтшш, ал сол уа;ытта сына; тобындагы тыш;андардан алынган G-MDSC жэне M-MDSC спленоциттер културасыныц пролиферациясын айтарлы;тай басатынын бай;ады; (сурет-2А), G-MDSC иммуносупрессорлы; функциясы жанамалай, оттепнщ активт формасы (ROS) непзшде журедь Журпзшген фенотиптш талдаулар сына; тобындагы (2 жэне 4 апта) жануарлардыц ROS продукциясыныц децгей G-MDSC фракциясында, ба;ылау тобымен салыстырганда на;тылы жогары болганын керсетт (сурет 2B). Б1ра; жалгасты цитофлуориметриялы; талдауларда ба;ылау жэне сына; тобындагы жануарлар арасында аргиназа-1 экспрессиясыныц M-MDSC де айрмашылыгы аны;талмады (мэл1меттер керсетшмеда).
А
В
СопА белсендендфтген
M-MDSC 6ак,ылау
G-MDSC бацылау
M-MDSC сынац
G-MDSC сынак,
Спанталды
О 20 40 60 80 100 120
% Пролифеация
Сурет 2 - А) Ба;ылау (Б) жэне сына; (С) тыш;андардыц кекбаурынан алынган M-MDSC жэне G-MDSC ;атысуындагы спленоциттердщ пролиферациясыныц супрессиясы, В) G-MDSC деп ROS экспрессиясы. M±SD туршдеп мэл1меттер *Р<0,05
**Р<0,005, ***Р<0,0005.
1 Prasad S., Sung B., Aggarwal B.B. Age-associated chronic diseases require age-old medicine: Role of chronic inflammation//Prev. Med.-2012.-Vol.54.- P.29-37
2 Gabrilovich D.I., Nagaraj S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system//Nature Rev. Immunol.-2009.-V.9.-P.162-174
3 Greten T.F., Manns M.P., Korangy F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases// Intern. Immunopharm.-2011.-V.11.-P.802-807.
4 Ostrand-Rosenberg S., Sinha P. Myeloid-derived suppressor cells: Linking inflammation and cancer//J. Immunol.-2009.-V.182.-P.4499-4506.
5 Danna E.A., Sinha P., Gilbert M., Clements V.K., Pulaski B.A., Ostrand-Rosenberg S. Surgical removal of primary tumor reverses tumorinduced immunosuppression despite the presence of metastatic disease//Cancer Res.-2004.-V.64(6).-P.2205-2211.
6 Lina A., Mary-Ann F., Gary J. B., Alfredo R. Imaging Studies in Freund's Complete Adjuvant Model of Regional Polyarthritis, a Model Suitable for the Study of Pain Mechanisms, in the Rat//Arthritis & Rheumatism,-2011.-Vol. 63.-P1573-1581. doi 10.1002/art.30303
7 Bronte V., Brandau S., Chen S.H., Colombo M.P., Frey A.B., Greten T.F., et al. Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards//Nat. Commun.-2016.-Vol.7:12150. doi:10.1038/ncomms12150.
Н. Абдолла1, 2, Ю.В. Перфильева1, Е.О. Остапчук1, Р. Тлеулиева1, В.К.Красноштанов3, Н.Н. Беляев1
1Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, Лаборатория молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии, 2Казахский Национальный Университет им. ал-Фараби, 3Казахский научно-исследователский институт
онкологии и радиологии, г.Алматы, Казахстан
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИЕЛОИДНЫХ СУПРЕССОРНЫХ КЛЕТОК В МЫШИНОЙ
МОДЕЛИ АДЪЮВАНТНО-ИНДУЦИРОВАННОГО АРТРИТА
Резюме: В настоящей работе исследованы фенотипические и функциональные характеристики миелоидных супрессорных клеток (MDSCs) при хроническом воспалительном процессе. Исследование показало значительно увеличенный пул селезеночных гранулоцитарных и моноцитарных MDSC с супрессорным потенциалом в модели адъювантного артрита. Ключевые слова; Хроническое воспаление, миелоидной супрессоры клетки, адъювант артрит
Кортынды. Алынган нэтижелердеп талдау барысында толы; адъюант Фрейдп уза; мерз1м,щ тура;ты созылмалы ;абыну процесш тудырды. Осы созылмалы ;абыну фонында тыш;андардыц кекбауырында CD11b+Gr-1+ (MDSC) фенотипт жасушалардыц мелшер1 кебейдт Бул созылмалы ;абыну MDSC жШк кемМнен перифериялды; айма;;а шыгуын белсендретшдМн куэлэндырады. Сонымен ;атар гранулоцитарлы (CD11b+Ly6Ghigh) жэне моноцитарлы (CD11b+CD49d+) миелоидты; жасушалар фракциясыныц созылмалы ;абыну бар тыш;андардагы улес1 еганш1 аптаныц соцына ;арай кенет кебеюше сэйкес, кекбауырдагы CD8+ жэне CD4+ T-жасушалар децгейшщ темендеуь жасуша популяцияларыныц салыстрмалы саныныц езгерга, жасуша популяцияларыныц абсолютты санына сэйкес келед деген ;ортындыга экеледг Ал осы кебейген MDSC субпопуляциялары Т-жасушаныц активттп мен пролиферациясын басуга арналган тестте, M-MDSC Т жасушалардыц пролиферациясын G-MDSC мен салыстырганда жогары децгейде супрессиялады. Бас;ада лабораторияларда алынган нэтижелерде G-MDSC -га ;араганда M-MDSC кеб1рек супрессорлы екендМн керсеткен
[7]. Б1ра; б1зде журпзшген фенотиптш талдауларда сына; тобындагы жануарлардыц M-MDSC фракдиясында супрессорлы; молекула аргиназа продукциясы езгермедг Бул адювант артрит кезшде M-MDSC иммуносупрессорлы; эсерь бас;а супрессорлы; факторлар ар;ылы болуы мумган. Алайда ROS продукциясыныц децгей G-MDSC фракциясында, ба;ылау тобымен салыстырганда 2-аптада на;тылы жогары болуы, осы аптадагы CD8+ жэне CD4+ децгешнщ статистикалы; мэшнщ темендеу мэл1меттер1мен сэйкес келедт Бул MDSC сурессорлы; эсер нэтижес болуы мумш. Журпзшген жумыстар нэтижейнде 6Í3 адьюват артрит тыш;андардыц кекбаурында Т жасуша пролиферациясын супрессиялауга ;абшетт1 MDSC субпопуляциялары жина;талатынын жэне олар иммунды; жауапты реттеуге ;абшетт1 болатынын аны;тады;. Созылмалы ;абынудыц дамуындагы MDSC
субпопуляцияларыныц рел1 жэне иммунологиялы; езгерга туралы жалгасты зеттеулер ;артаю мен созылмалы аурулардыц алдын алу жэне емдеу ма;сатындагы жаца багыттыц дамуы ушш керек.
ЭДЕБИЕТТЕР Т1З1М1
