CC BY
11
1вашкевич Д.В., астрант, Андршчук А.В., Царенко Т.М., к-ти вет. наук, Якименко 1.Л., доктор бiол. Наук ([email protected]) © Бглоцеркгеський нащональний аграрный ушеерситет
ДО ПИТАННЯ ПРО УЛЬТРАФЮЛЕТОВЕ ОПРОМ1НЕННЯ 1НКУБАЦ1ЙНИХ яець С1ЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКО1 ПТИЦ1
З еикористанням хемыюмтесцентного та спектрофотометричного метод1е выявлено тдеищення актиеност1 перекисного окиснення л\тд1е у суспензИ' жоетка перепелиного яйця енасл\док опромшення короткохеильоеим ультраф1олетом протягом ргзних промгжкге часу.
Коефщент кореляцп м1ж показниками р1еня перекисного окиснення лтдге отриманих деома даними методами залежно е1д ступеня розеедення жоетка та триеалост1 опром1нення склае егдпоегдно r=0,99 та r=0,97.
Ключовi слова: хемшюмтесценщя, перекисне окиснення л\тд1е, бактерицидна дгя, УФ-еипромтюеання
Вступ.
Встановлено, що виникнення порушень нормального функцюнування opram3MiB супроводжуеться активащею вшьнорадикальних реакцш перекисного окислення лшвдв (ПОЛ). Ц реакцп шдукуются та розвиваються за участю вшьних радикалiв. Вшьш радикали - це молекули чи атоми, що мютять неспаренi електрони [1].
Процеси перекисного окиснення можуть стимулюватись ультрафюлетовим опромiненням бiологiчних об'екив. Так, короткохвильове УФ-випромiнювання е причиною порушення мембранно! структури клiтин та шактивацп ферментiв, що зокрема проявляеться в його бактерициднш д^.
Для обмеження iнтенсивностi вiльно радикальних процеЫв та рiвня окиснювальних ушкоджень в живих оргашзмах функцiонуе антиоксидантна система (АОС), що складаеться 3i специфiчних ферментiв та групи низькомолекулярних природних антиоксидантiв. При вiдхиленнях вiд нормального функцюнування оргашзму може розвинутись дисбаланс мiж iнтенсивнiстю продукцii активних форм кисню та вiльнорадикального окиснення (ВРО) та рiвнем функцiональноi активностi АОС. Це, в свою чергу, викликае пiдсилення окислювальних ушкоджень бiомолекул, розвиток дисфункцп клiтин та тканин [2].
У результат вiльнорадикальних реакцiй вщбуваеться деградацiя молекул-мiшеней з утворенням стабшьних продуктiв реакцiй, iдентифiкацiя та визначення кшькост яких може бути параметром, що визначае штенсившсть вiльнорадикальних реакцш (ВРР).
Для ощнки рiвня оксидаци чи аутооксидаци лiпiдiв розроблена чисельна кшькють методiв. Серед них найбшьш чутливим методом е метод
© 1вашкевич Д.В., Андр1йчук А.В., Царенко Т.М., Якименко 1.Л., 2008
88
хемшюмшесценци (ХЛ). Суть методу полягае у реестраци фотошв свiтла, емiсiя яких вiдбуваеться в результатi xiMi4H^ реакцiй, що супроводжують процеси ВРО. Метод ХЛ дозволяе не лише оцшити Krn^Bi продукти реакци компонент клiтини з вiльними радикалами, але i дослiдити кiнетику процесiв.
Метою дано! роботи було оцшити вплив короткохвильового УФ-випромiнення на штенсившсть процесiв ПОЛ у бiологiчному субстрат використовуючи модельну систему, а також оцшити вщповщшсть спектрофотометричного та хемшюмшесцентного методiв при вивченнi процесiв ВРО.
Матер1али i методи. Для вивчення вшьнорадикальних процесiв in vitro використовували суспензш лшопротевдв жовтка (ЖЛП) свiжих шкубацшних перепелиних яець. Суспензiя ЖЛП, як модельна система вiдрiзняеться вiд шших лiпiдвмiсних систем доступнiстю отримання, високою стабiльнiстю та вiдносно гарною окиснювашстю. Для розведення жовтка використовували фiзiологiчний розчин.
З метою бактерицидно! обробки перепелине яйце опромшювали свiтлом люмшесцентно! лампи "Philips", що випромiнюе в област короткохвильового ультрафiолету (А =254 нм). Також УФ-опромшення використовували для стимуляцп процесiв перекисного окиснення лшвдв в суспензп жовтку з метою вивчення вшьнорадикальних процеЫв у субстрата
Для оцiнки ступеня бактерiальноl забрудненост поверхнi шкарлупи яець використовували метод сершних розведень в м'ясопептонному агарi [3].
Рiвень ПОЛ визначали спектрофотометричним методом в реакци з тиобарбитуровою кислотою [4].
Хемiлюмiнесценцiю вимiрювали на хемiлюмiнометрi "SmartLum-5115"
(Росiя).
Процес ПОЛ у субстрат здiйснювали шляхом введення в 0,5 мл суспензп жовтка 0,2 мл мкМ розчину сульфату залiза та 100 мкл мМ розчину родамiна Ж при штенсивному перемiшуваннi та при температурi 37°С [5]. Пiсля цього протягом 60 с вимiрювали кiнетику хемшюмшесценци.
Варiацiю даних забезпечували рiзним ступенем розведення суспензп жовтка (вщ 1:30 до 1:10) та рiзним часом опромшення (вiд 6 хв. до 34 хв.) при номшальнш потужностi лампи 14 мВт/см2.
Одержат результата статистично обробляли за допомогою програми Statistika 5.5
Результати дослщження.
Опромiнення протягом 30 хв. поверхш шкарлупи яець спричинило зменшення бактерiальноl забрудненостi вщ 1550 колонiеутворюючих одиниць (КОУ) в 2 г. шкарлупи в контролi до 135 КОУ в дослвд, що узгоджуеться з дослiдженнями шших авторiв [6].
89
1:22 1:18 стушнь розведення
а б
Рис.1. Вмкт кшцевих продуктов перекисного окиснення (а) та показник кшетики залiзоiндукованоï хемiлюмiнесценцГí (б) у суспензп жовтка перепелиного яйця залежно ввд ступеня розведення.
Для ан^зу безпосереднього впливу УФ-випромiнювання на CKnaAOBÎ
перепелиного яйця, зокрема на суспензш жовтка використовували
спектрофотометричний та хемшюмшесцентний методи оцiнки aктивностi ПОЛ у
бюлопчному субстрaтi. Причому якщо спектрофотометричний метод визначення
вторинних продуктiв ПОЛ рееструе вже наявну кiлькiсть лшоперекиав, то ХЛ в . 2+ • • ... присутностi Fe свiдчить про здатшсть лiпiдiв до переокиснення .
При зменшенш ступеня розведення суспензи жовтку (або при збiльшеннi юлькосп лiпiдiв) показник свiтлосуми зaлiзоiндуковaноï ХЛ та рiвня ПОЛ, визначеного за допомогою спектрофотометричного методу, збiльшуеться. Залежшсть цих покaзникiв вiд ступеня розведення мае лишний характер у всьому дослiджувaному iнтервaлi розведень при використанш ХЛ методу (рис. 1а), та на окремих дiлянкaх при використанш ТБК-тесту (рис. 1б). Статистичний aнaлiз покaзникiв виявив високу кореляцiйну залежшсть мiж показниками ТБК-тесту та зaлiзоiндуковaноï ХЛ. Коефiцiент кореляцiï склав r=0,99 (p<0,05, n=7).
3i збiльшенням тривалост опромiнення суспензiï жовтка (розведення 1:10) короткохвильовим ультрaфiолетом iнтенсивнiсть зaлiзоiндуковaноï хемшюмшесценци збшьшуеться (рис. 2 а).
. 200000 100000
26 хв.
30 хв.
6 хв. 10 хв. 14 хв. 18 хв. 22 хв. 26 хв. 30 хв. 34 хв. тривапсть опромшення
а б
Рис. 2. Вмпст кшцевих продуктов перекисного окиснення (а) та показник свгглосуми зашзошдукованоУ хемшюмшесценци (б) у суспензи жовтка перепелиного яйця залежно вщ тривалост опромiиеиия короткохвильовим
ультрафiолетом
1:30
1:26
1:14
2,5
2
1,5
0,5
0
0
тр
90
При цьому спостер^аетсья лшшна залежшсть показниюв свiтлосуми вiд часу опромшення. Паралельно вiдбуваeться збiльшення продуктiв ПОЛ, piBeHb яки визначений за допомогою ТБК-тесту (рис. 2 б). Однак, на B^MiHy вiд методу ХЛ, рiзниця мiж показником рiвня ПОЛ тсля 6 хв. опромiнення, що визначено при використаннi спектрофотометричного методу, не е достовiрним. До того ж лшшний характер залежностi отриманих показниюв вщ часу опромiнення спостер^аеться лише на дiлянцi вiд 6 хв. до 18 хв., тсля чого показники вiрогiдно не змшюються. (спостер^аеться лише тенденцiя до збшьшення). При вивченнi кореляцiйних звязкiв виявлено, що юнуе прямий зв'язок мiж свiтлосумою хемiлюмiнесценцiï та збiльшення продуктсв ПОЛ у суспензiï жовтку. Коефщент кореляцiï склав r=0,97 (p<0,05, n=7). Ui факти свiдчать про бшьшу чутливiсть методу ХЛ порiвняно з спектрофотометричним методом визначення продукив ПОЛ у бюлопчному субстратi.
Висновки.
Пюля 30 хв. опромiнення короткохвильовим ультрафюлетом (А =254 нм) перепелиного яйця спостерталось виражене зменшення бактерiального обамешння.
Опромiнення короткохвильовим ультрафiолетом суспензiï жовтка дозозалежно стимулюе вiльнорадикальнi процеси у суспензп жовтку.
1снуе висока кореляцшна залежнiсть показникiв рiвня ПОЛ визначених методом залiзоiндукованоï хемiлюмiнесценцiï та спектрофотометричним методом.
Лггература
1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.
2. Young IS, Woodside JV. Antioxidants in health and disease. J Clin Pathol. 2001 Mar;54(3):176-86.
3. Coufal CD, Chavez C, Knape KD, Carey JB. Evaluation of a method of ultraviolet light sanitation of broiler hatching eggs. Poult Sci. 2003 May;82(5):754-9.
4. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. Дело. - 1988. - № 11. - С.41-43.
5. Шерстнев М.П., Атанаев Т.Б., Владимиров Ю.А. Активированная родамином Ж хемилюминесценция плазмi крови в присутствии ионов двухвалентного железа // Биофизика. - 1989. - Т. 33, вып. 4. - С. 684-687
6. Отрыганьев Г.К., Отрыканьева А.Ф. Технология инкубации. - М.: 1989
Summary
TBA-acid's indexes and chemiluminescence's indexes dependence from dilution degree and from dose of irradiation was explored. By statistical analysis was shown that indexes of both methods which was used are correlate among themselves.
Стаття надшшла до редакци 15.08.2008
91
