CC BY
24
ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ ОБЩИХ БИОПОЛИМЕРОВ И ОКИСЛЕННОСТИ ЛИПИДОВ ФРАКЦИЙ ХРОМАТИНА ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ, СТИМУЛИРОВАННЫХ К ПРОЛИФЕРАЦИИ ПРИ ПОМОЩИ ЧАСТИЧНОЙ ГЕПАТЭКТОМИИ
A. А. Дудко, кандидат биологических наук (Саранск),
B. А. Трофимов, доктор биологических наук (Саранск)
После стимуляции неделящихся клеток к пролиферации запускается комплекс биохимических реакций, необходимых для регулирования генной экспрессии. Активация хроматина связана с началом функционирования группы новых генов или митотического оперо-на и выражается в динамичной и быстро наступающей интенсификации синтеза РНК [12]. От скорости синтеза белков зависит экспрессия различных групп генов и соответственно активация, и инактивация различных компарт-ментов хроматина в интерфазном ядре. В клеточном ядре различается до семи уровней структурной упаковки хроматина [13]. Доминирующую роль в формировании этих структур играют ядерные белки. Многие белки имеют короткий период жизни, поэтому очевидно, что формирование и поддержание определенного структурного статуса хроматина зависит от синтеза белка de novo. Основное внимание исследователей хроматина направлено на выяснение механизмов активации генов. Показано, что для достижения максимальной активности функционирования генома необходимо полное удаление связанных с ДНК белков [9]. В норме активация затрагивает, как правило, 5 — 10 % всего ядерного хроматина. Поэтому актуальным остается вопрос, как генетические процессы репликации и транскрипции реализуются на уровне структуры хроматина.
В настоящее время широко обсуждается вопрос об участии липидов в регуляции генетических процессов [11]. Выявлены специфические ДНК-связанные липиды и липиды, являющиеся важным компонентом хромосом, хроматина, ядерного матрикса. Отмечается, что в хроматине присутствуют как представители фосфолипидов, так и нейтральных липидов, которые, связываясь в специфических локусах, могут влиять на структуру ДНК [13].
Особое внимание липидам в функционировании ядерного генома уделяется в связи с их участием в процессах свободнорадикального окисления, в первую очередь в реакциях пере-кисного окисления липидов (ПОЛ). Свободные радикалы, перекиси и гидроперекиси липидов обладают мутагенной активностью, приводя к окислительной модификации ДНК [4]. Свободные радикалы вызывают несколько типов повреждений ДНК: одно- и двунитевые разрывы цепей, образование сшивок ДНК—белок, окислительные модификации оснований [11]. При этом стоит отметить, что одноните-вые разрывы, возникающие на одной из цепей ДНК, являются репарируемым типом повреждений. Обычно это самый распространенный тип повреждения ДНК. Двунитевые разрывы происходят редко, обычно при большой дозе повреждающего фактора или при длительном его воздействии. Только часть этих повреждений репари-руема, вследствие чего наличие этого типа повреждений ДНК в хроматине обычно корелиру-ет с гибелью клетки. Сшивки ДНК—белок в хроматине возникают при одновременном повреждении молекулы ДНК и белка. Повреждения такого типа частично репарируются, так как процесс репарации требует одновременного удаления участка ДНК и молекулы белка с последующей их заменой на вновь синтезированные компоненты хроматина [12; 13]. При усилении процессов ПОЛ происходит необратимое окисление БН-групп белков, что, соответственно, ведет к нарушению их функции и всего хроматина в целом. В ходе ПОЛ могут образовываться поперечные белковые сшивки и ковалентно связанные белковые полимеры [5]. Поперечно-сшивающими свойствами обладают вторичные продукты ПОЛ, в том числе и малоновый диаль-дегид (МДА). Способностью образовывать ковалентно связанные белковые полимеры обладают свободные радикалы липидов [6].
© А. А. Дудко, В. А. Трофимов, 2007 ВЕСТНИК Мордовского университета | 2007 I № 4
Изменение физико-химических свойств липидов хроматина (текучести, заряда), обусловленное усилением процессов ПОЛ изменением качественного и количественного состава липидов, может влиять на полярные и гидрофобные белок-липидные и ДНК-липид-ные связи, конформацию белка, доступность белка и ДНК для различных ферментов. До недавнего времени инициацию перекисного окисления липидов в результате действия разнообразных факторов констатировали только в биомембранах. При этом упускалось из виду, что хроматин содержит собственные липиды. В настоящее время установлено, что ядерный геном обладает собственной систе-
О
мои переокисления хроматин-связанных липидов [4; 5]. Отмечено, что по ряду характеристик (отношение к индукторам и ингибиторам, временная кинетика накопления конечных продуктов) процессы липопереокисления в хроматине существенно отличаются от таковых, происходящих в мембранах эндоплаз-матического ретикулума клеток печени [6].
Поэтому исследование молекулярных составляющих хроматина неделящихся клеток, стимулированных к делению, является перспективным подходом для изучения активного и репрессированного хроматина, выяснения молекулярных механизмов, регулирующих его активность.
Удобной моделью для изучения этого процесса выступает печень мышей, стимулированная к пролиферации с помощью частичной гепатэктомии.
Методы исследования. В опыте использовались белые беспородные мыши весом 20 — 30 г. Операцию резекции печени проводили с соблюдением правил септики и антисептики под поверхностным эфирным наркозом в среднем 15 мин. Масса удаленной части печени составляла 2/3 исходной.
Выделение ядер проводили из печени дека-петированных животных, охлажденной в ледяном растворе 0,24 М сахарозы. Ткань тщательно измельчали и переносили в гомогенизатор Поттера — Эвельмана, затем фильтровали через четыре слоя марли. Добавляли равный объем буфера, содержащего 0,05 М трис-НС1 рН = 9,0 с 0,25 М сахарозы и 0,005 М СаС12. Применение такого буфера сводит к минимуму вероятность возникновения разрывов ДНК в процессе выделения ядер. Лизосо-
мальные протеазы ингибировали добавлением в буфер 20 мМ ЫН4С1. Затем подготовленные пробы центрифугировали при 1 000 ^ в течение 10 мин.
Дополнительную очистку ядер проводили в этом же буфере с 0,25 % тритоном "Х-100. При этом удаляется часть липидов оболочки ядра и выделились ядра, по существу свободные от загрязнения. Затем ядра осаждали центрифугированием через 1 М сахарозу при 1 000 £ в течение 10 мин при 4 °С. При таких условиях выделения и очистки ядер сводится к минимуму неконтролируемая фрагментация ДНК и протеолиз белков [3].
Частоту ядерной фракции контролировали
U
при помощи световой микроскопии.
Фракционирование хроматина проводили из ядер после кратковременной активации эндогенной Са2+/М^2+-ДНКазы. Для этого ядра помещали в 0,05 М трис-HCl буфер pH = 8,0 с 0,25 М сахарозы, 1мМ СаС12 и 10 мМ MgCl2. Через 15 мин инкубации при 30 °С из ядер экстрагировали хроматин, применяя буфер
ТМ (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5 с 0,2 мМ MgCl2).
Экстракцию проводили при ресуспендирова-нии при 4 °С. После осаждения ядер центрифугированием при 2 000 g в течение 20 мин при 4 °С получали первую фракцию растворимого хроматина (Хр-1). После повторной экстракции ядер в TM-буфере при 30 °С в течение 20 мин и осаждением при 2 000 g в течение 20 мин при 4 °С получали вторую фракцию растворимого хроматина (Хр-2) [1; 3]. Затем из ядер экстрагировали хроматин в ТМ-буфере с 2 М NaCl при 4 °С в течение 20 мин с последующим центрифугированием при 2 000 g при 4 °С в течение 20 мин и получали высокосолевую фракцию хроматина (Хр-ВС). После отмывания остатка в TM-буфере с 1 % Тритоном Х-100 и последующим центрифугированием при 2 000 g в осадке получали конечную фракцию хроматина, связанного с ядерным матриксом (Хр-ЯМ) [1; 3].
Количество общего белка определяли по методу Бредфорда. Белковый состав препаратов оценивали при помощи электрофореза в присутствии ДДС-Na в денатурирующих условиях по методу Леммли (Laemmli, 1970) с модификациями. Использовали прибор для вертикального электрофореза (ячейка для электрофореза Mini-PROTEAN, BIO-RAD, Швейцария). Разделение белков проводили в
мини-гелях толщиной 0,3 см. В качестве разделяющего геля использовали 15 % полиакри-ламидный гель, а в качестве концентрирующего — 7 % полиакриламидный гель. Электрофорез проводили в течение 10 мин при 45 В для вхождения белков в гель, а затем 1 — 1,5 ч при 130 В до начала выхода бромфенолового синего из геля.
Количество ДНК определяли с реактива Дише, РНК — с орциновым реактивом.
Выделение ДНК проводили с использованием набора реактивов DIAtomTM DNA Prep фирмы BlOcorn типа ДНК-сорб-В под ламина-ром для исключения перекрестного загрязнения образцов ДНК. Электрофорез ДНК проводили в агарозном геле с добавлением бромфенолового синего до конечной концентрации 0,5 мкг / мл и напряжении 5 — 10 В / см. Регистрацию ДНК проводили в проходящем УФ-свете с использованием системы видеосканирования DNA-Analiz фирмы ВЮсош. Липиды из фракций хроматина извлекали методом Блайя и Дайера [2].
Малоновый диалъдегид определяли в реакции с тиобарбитуровой кислотой. К 1 мл анализируемого образца добавляли 3 мл 1 % фосфорной кислоты, содержащей 0,5 мМ ЭДТА, и 1 мл 0,5 % раствора ТБК. После пере-
мешивания пробы инкубировали при 100 °С в течение 45 мин. Затем к охлажденным пробам для экстракции окрашенного комплекса
г. кУЛ A ft *Л - i^v V А
I
> Ш&ьШШШмШ^Ш
'^ vWy •• j TC-iC-- v »C У/. *
i Ii
•V
rr v ^ffiPy - -Г • ' <
«Й7/. A ¿Pye
»I
ШШ f
xT3f:
/V
г-- - »
•4- .
ШШ
•A.'/V АД
I
3
4
А
приливали 4 мл Н-бутанола, после перемешивания пробы центрифугировали в течение 15 мин при 1 500 g. В верхней бутанольной фазе измеряли оптическую плотность при 532 нм. Концентрацию ТБК-реактивных продуктов рассчитывали с учетом коэффициента молярного поглощения комплекса МДА-ТБК, равного 1,56 х 105моль/см (Hunter F. Е. et al., 1963).
Содержание диеновых и триеновых конъю-гатов определяли спектрофотометрическим методом, рассчитывая индексы окисленности
^232/^215 и ^275/^215'
Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Для изучения структурных компонентов, входящих в состав хроматина на разных уровнях организации, часто используют нуклеазы неспецифического действия. В настоящей работе с этой целью использовалась Са2+/М^2+-зависимая ДНКаза, которая позволяет применять ограниченный гидролиз хроматина при низкой ионной силе, вызывая разрыв линкерной ДНК с интервалом 200 п. н. [3]. Считается, что Са2+/М£2+-зависимая нуклеаза на начальных
этапах расплетает транскрипционно активный хроматин [1]. Выделение ядер в условиях, максимально сохраняющих нативность ДНК, позволило нам производить контролиру-
Б
Рисунок 1
Электрофореграмма белков (А) и электрофореграмма ДНК (Б), изолированных из хроматинов, различающихся прочностью прикрепления к ядерному матриксу:
1) Хр-1; 2) Хр-2; 3) Хр-ВС; 4) Хр-ЯМ.
ющие разрушение хроматина эндогенной Са2+/М£2+-ДНКазой in vitro.
Использование ТМ-буфера, обладающего высокой способностью к растворению хроматина и, по данным П. Я. Байкова [3], сохраняющего нативность нуклеосом, дает возмож-
ф
ность фракционировать петли хроматина по принципу прочности их связывания с ядерным матриксом и выявлять активные фракции хроматина в виде относительно натив-ных структур. Изложенная схема фракционирования хроматина позволила получить четыре фракции растворимого хроматина: хроматин 1 (Хр-1), хроматин 2 (Хр-2), хроматин вы-сокосолевый (Хр-ВС), хроматин, прочно связанный с ядерным матриксом (Хр-ЯМ).
Анализируя данные электрофореза разделения ДНК и белка из полученных фракций хроматина, приведенных в данной работе, и анализа литературных данных, можно сказать, что в процессе выделения фракций хроматина Хр-1 и Хр-2 они сохраняют нативную нук-леосомную организацию хроматина в виде мононуклеосом и их олигомеров длиной около 20 — 40 тыс. п. н., «практически чистый нуклеогистон» [1].
Отметим, что при экстракции ядер в услови-
ях низкои ионнои силы практически все не-гистоновые белки уходят с матриксом и ядерными оболочками во фракцию осадка. Белки фракций хроматина Хр-1 и Хр-2 представлены всеми пятью гистонами и очень незначительным количеством негистоновых белков. Отмечено присутствие двух белков: белка «А» и «Р42,5», имеющих молекулярные массы около 25 ООО и 42 500 соответственно.
Фракции хроматина Хр-1 и Хр-2 различаются не только последовательностью и условиями экстракции (4 °С и 30 °С соответственно), но и, как было установлено ранее [3], содержат разный набор негистоновых белков, включая активную РНК-полимеразу II. Возможно, фракции Хр-1 и Хр-2 представляют собой активированный домен хроматина, содержащий функционально связанные гены быстрого ответа.
Хр-ВС (высокосолевый) составляет 5 — 20 % от основного хроматина, связанного со скелетными структурами ядра, и содержит в норме протоонкогены. Экстракция 2 М №С1 убирает гистоны и часть негистоновых белков, поэтому во фракции осадка остается хро-
матин, прочно связанный с ядерным матриксом (Хр-ЯМ).
Хр-ЯМ составляет 5 — 15 % от основного хроматина, и эта фракция обогащена негисто-новыми белками, такими как НМС14 и НМ017. С этой фракцией также связаны РНК-полимераза I и II, топоизомераза II. Репликация ДНК начинается именно во фракции хроматина, прочно связанного с матриксом [11; 12; 13]. Данный хроматин локализован в примем-бранной зоне, и именно здесь начинается инициация транскрипции и репликации.
В работе представлены данные, характеризующие динамику изменения содержания биополимеров в ядрах клеток регенерирующей печени мышей.
В печени после частичной гепатэктомии отмечается несколько периодов, характеризующихся максимальным накоплением РНК, белков, ДНК. Так, максимальный уровень РНК приходится на 3-й час после гепатэктомии. При этом уровень РНК возвращается к контрольным показателям только к 21,5 часу после гепатэктомии (рис. 2).
В период интенсивной транскрипции, приходящейся к 1 — 3-му часу регенерации, отмечены изменения в содержании общих био-
%800
I Т-1-г
Норма 1 час 3 час 14:30 час 21-30 час
Рисунок 2
щ
Динамика изменения уровня РНК в клетках печени после частичной гепатэктомии (в % от контроля)
полимеров и окисленности липидов анализируемых фракций хроматина. В первой фракции хроматина уровень ДНК повышался к 1-му часу после гепатэктомии на 75 ,% по сравнению с контролем и имел максимальные значения спустя 3 ч, возрастая на 200 %.
Содержание белка в данной фракции хроматина возрастало на 400 % к 1-му часу и на 780 % к 3-му часу после гепатэктомии. К 1-му часу регенерации также происходило повышение уровня триеновых конъюгатов на 20 %, при этом к 3-му часу их уровень при-
Таблица 1
Изменение окисленности липидов хроматина фракции Хр-1
в динамике процесса регенерации
ИОтк
Контроль 1 ч 3 ч 14,5 ч 21,5 ч
0,113 ±0,001 0,136 ±0,003 0,115 ±0,01 0,094 ±0,004 0,075 ±0,001
ИОдк
0,254 ± 0,022 1 0,239 ± 0,007 1 0,214 ± 0,008 | | 0,198 ±0,007 Г 0,176 ±0,001
ТБК-активные продукты,мкМ/л
5,3 ±0,009 11,35 ±0,009 5,5 ± 0,005 | 6,25 ±0,006 [ 10,12 ±0,003
ближается к контрольным показателям. Уровень диеновых конъюгатов к 1 — 3-му часу регенерации достоверно снижался в среднем на 10 %. Количество ТБК-активных продуктов во фракции Хр-1 к 1-му часу регенерации увеличивалось по сравнению с контролем на 114 %, а к 3-му часу понижалось до контрольного уровня.
Во фракции хроматина Хр-2 к 1 — 3-му часу регенерации уровень ДНК повышался в среднем на 40 %, а количество белка возрастало соответственно на 100 и 170 % от контрольного уровня. Во фракции Хр-2 происходило резкое увеличение триеновых конъюгатов к 1-му часу регенерации более чем на 445 %, а к 3-му часу происходило относительное снижение количества триеновых конъюгатов. Количество диеновых конъюгатов к 1-му часу возрастало более чем на 335 % по сравнению с контролем. Отмечено также повышение уровня ТБК-активных продуктов в периоды активной транскрипции в среднем на 400 % по сравнению с контролем.
Во фракции хроматина ХР-ВС уровень ДНК к 1 — 3-му часу регенерации повышался в среднем на 100 % по сравнению с контро-
40
30
20
10
0
Хр-1
Хр-2
Хр-ВС Хр-ЯМ
1 час ПЗчас □ 14,5 час ■ 21,5 час
Рисунок 3 Динамика изменения уровня ДНК во фракциях хроматина после частичной
гепатэктомии (мкг / мл)
лем, тогда как уровень белка в эти временные периоды возрастал в среднем на 200 % по отношению к контролю (рис. 3, 4).
Количество триеновых конъюгатов во фракции Хр-ВС к 1 — 3-му часу регенерации увеличивалось в среднем на 40 % по отношению к контролю, в то время как содержание диеновых конъюгатов оказалось не подверженным значительным колебаниям.
Уровень ТБК-реактивных продуктов в данной фракции хроматина к 1-му часу превышал контрольные значения на 100 %, а к 3-му часу снижался на 19 %.
Во фракции хроматина Хр-ЯМ содержание ДНК к 1-му часу наблюдения возрастало по сравнению с контролем на 126 %, а к 3-му часу на 600 %. Уровень белка в хроматино-вой фракции Хр-ЯМ был повышен на всех этапах наблюдения (рис. 4). Количество триеновых конъюгатов во фракции Хр-ЯМ к 3-му часу регенерации увеличивалось на 70 %, а уровень диеновых конъюгатов оставался близким к контрольным величинам. Уровень ТБК-реактивных продуктов в данной фракции хроматина к 1-му часу наблюдения превышал контрольные показатели на 164 %.
% 1000 -г
800 600 400 200
0
Хр-1
Хр-2
Хр-ВС Хр-ЯМ
ШНорма ■ 1 час ПЗчас [1314,5 час И21,5час
Рисунок 4 Динамика изменения уровня белка во фракциях хроматина после частичной гепатэктомии (в % от контроля)
Таблица 2
Изменение окисленности липидов хроматина фракции Хр-2
в динамике процесса регенерации
ИОтк
Контроль 1 ч 3 ч 14,5 ч 21,5 ч
0,089 ±0,001 0,488 ± 0,003 0,289 ±0,01 0,344 ± 0,004 0,095 ±0,001
ИОдк
0,191 ±0,004 0,831 ±0,016 0,468 ± 0,009 0,661 ±0,001 | 0,198 ±0,014
ТБК-активные продукты мкМ/л
1,640 ±0,015 11,35 ±0,007 5,51 ±0,006 6,25 ± 0,002 10,12 ±0,003
В период интенсивной репликации, происходящей на 14 — 21-м часе регенерации, отмечены следующие изменения общих биополимеров и окисленности липидов фракций хроматина.
В первой фракции хроматина Хр-1 уровень ДНК повышался к 14-му часу на 100 % и спустя 21 час после гепатэктомии возрастал на 160 %. Содержание белка в данной фракции хроматина возрастало на 200 % по сравнению с контролем к 14-му часу и на 137 % — к 21-му часу после гепатэктомии. В эти периоды отмечено то, что к 14-му часу регенерации происходило понижение триеновых кронъюгатов на 20 %, притом к 21 часу уровень данных метаболитов продолжал снижаться. Уровень диеновых конъюгатов на протяжении 14 — 21-го часа регенерации достоверно снижался в среднем на 20 %. Количество ТБК-активных продуктов в Хр-1 на 14-м часе регенерации увеличивалось по сравнению с контролем на 17 %, а к 21-му часу превышало контрольный уровень на 90 %.
Во фракции хроматина Хр-2 на 14 — 21-м часу регенерации уровень ДНК повышался в среднем на 100 %. Количество белка фрак-
I
ции Хр-2 к 14-му часу превышало контрольные показатели на 300 %, а к 21-му часу достигало контрольного уровня. Во фракции Хр-2 отмечалось резкое увеличение содержания триеновых коньюгатов к 14-му часу регенерации более чем на 286 %, а к 21-му часу
происходило относительное понижение их содержания. Количество диеновых конъюгатов
на 14-м часе регенерации возрастало более чем
/ | •
на 246 %, а к 21-му часу снижалось до контрольного уровня. Отмечено также повышение уровня ТБК-активных продуктов в периоды активной репликации в среднем на 400 %.
Во фракции хроматина ХР-ВС уровень ДНК к 14 — 21-му часу регенерации повышался в среднем на 300 % и на 200 % к 21,5 часу соответственно, тогда как уровень белка в эти временные периоды возрастал в среднем 30 % (рис. 3; 4). Количество триеновых конъюгатов в Хр-ВС к 14-му и 21-му часу регенерации увеличивалось в среднем на 20 % по отношению к контролю, а уровень диеновых конъюгатов изменялся незначительно. Уровень ТБК-реактивных продуктов данной фракции хроматина к 1-му часу после гепатэктомии возрос на 71 % по сравнению с контролем, а к 21-му часу отмечалось его повышение в среднем на 60 %.
В хроматине Хр-ЯМ содержание ДНК к 14 — 21-му часу регенерации оказалось значительно выше контрольных значений. Уровень белка в хроматиновой фракции Хр-ЯМ резко повышался к 14-му часу регенерации, а к 21-му часу регенерации отмечалось относительное понижение его уровня (см рис. 4).
Количество триеновых конъюгатов во фракции Хр-ЯМ к 14-му и 21-му часу регенерации увеличивалось в среднем на 200 % по
Таблица 3
Изменение окисленности липидов хроматина фракции Хр-ВС
в динамике процесса регенерации
ИОтк
Контроль 1 ч 3 ч 14,5 ч 21,5ч
0,073 ±0,001 0,104 ±0,06 0,102 ±0,013 0,091 ±0,017 0,078 ± 0,006
ИОдк
0,209 ± 0,005 0,202 ±0,012 0,247 ± 0,003 0,213 ±0,004 1 0,159 ±0,016
ТБК-активные продукты мкМ / л
3,0 ±0,020 5,870 ±0,001 2,460 ± 0,002 2,150 ±0,002 | 4,790 ± 0,010
Таблица 4
Изменение окисленности липидов хроматина фракции Хр-ЯМ
ИОтк
Контроль 1 ч 3 ч 14,5 ч 21,5 ч
0,080 ±0,001 0,143 ±0,003 0,069 ±0,011 0,294 ±0,015 0,178 ±0,051
ИОдк
0,211 ±0,009 0,239 ±0,008 I 0,176 ±0,004 0,683 ±0,011 | 0,330 ±0,015
ТБК-активные продукты, мкМ/л
6,76 ± 0,005 17,94 ±0,001 5,0 ± 0,003 11,84 ±0,031 9,120 ±0,021
отношению к контрольному уровню. Уровень диеновых конъюгатов к 14-му часу наблюдения превышал контрольные значения на 225 %, а к 21,5 часу наблюдения отмечалось его относительное понижение. Уровень ТБК-актив-ных продуктов данной фракции хроматина к 14-му часу после гепатэктомии превышал контрольные показатели на 74 %.
Таким образом, при частичной гепатэктомии содержание ДНК, РНК и белка в разные периоды наблюдения колеблется в весьма широких пределах. Подчеркнем, что динамика изменения содержания ДНК характеризует I репликативную активность хромосом, а дина-! мика изменения содержания РНК и белка — | транскрипционную активность хроматина. Генетические процессы в данной экспериментальной модели регенерирующей печени характеризуются определенной периодичностью, которая выявляется в опытах по изучению количественного состава биополимеров во фракциях хроматина, различающихся прочностью прикрепления к ядерному матриксу. Нами выявлена приоритетность в вовлечении в транскрипционный процесс фракций хроматина Хр-1
и Хр-2, в то время как фракции хроматина Хр-ВС и Хр-ЯМ первыми вовлекаются в процесс репликации. Нами также показано, что анализируемые фракции хроматина различаются по качественному и количественному составу липидов (данные не приводятся). Однако, безусловно, важно то, что липиды фракций хроматина, различающихся прочностью прикрепления к ядерному матриксу, характеризуются разной степенью окисленности. При этом наиболее высокое содержание начальных и вторичных продуктов пероксидации липидов отмечается в период активной транскрипции и репликации в соответствующих фракциях хроматина. Подчеркнем, что существует зависимость между генетической активностью хроматина и уровнем окисленности липидов. Очевидно, что последнее связано с конформационными перестройками ДНК, хроматина, входящих в их состав липидов, вследствие чего усиливаются процессы пероксидации липидов. Последнее может играть важную роль в изменении активности генетических процессов, поскольку липиды сами по себе могут влиять на конфор-мацию ДНК.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Борисова Н. П. Двойственный характер действия эндогенных ДНКаз на транскрипционно активный и неактивный хроматин / Н. П. Борисова / / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 135, № 3. С. 294 — 298.
2. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / М. Кейтс. | М.: Мир, 1975. 322 с.
I 3. Бойков П. Я. Концентрирование протоонкогенов в ядрах гепатоцитов / П. Я. Бойков // Мо-
_ _
лекулярная биология. 1995. Т. 29, № 5. С. 1137 — 1144.
4. Левицкий Е. Л. Коррекция поражений ядерного генома антиоксидантами в условиях токсического повреждения печени // Пробл. соврем, токсикологии. 1998. № 2. С. 38 — 40. \ 5. Левицкий Е. Л. Биохимическая характеристика фракций транскрипционно активного и репрессиро-\ ванного хроматина печени крыс / Е. Л. Левицкий // Биополимеры и клетка. 1993. Т. 9, № 6. С. 13 — 21. \ 6. Левицкий Е. Л. Свободнорадикальные повреждения ядерного гентического аппарата клетки / ! Е. Л. Левицкий // Укр. биохим. журн. 1994. Т. 66, № 4. С. 18 — 30.
7. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 543 с.
8. Стручков В. А. ДНК-связанные липиды: состав и возможные функции / В. А. Стручков, Н. Б. Стражевская // Биохимия. 1993. Т. 58, № 8. С. 1154 — 1175.
9. Стручков В. А. Структурные и функциональные аспекты ядерных липидов нормальных и опухолевых клеток / В. А. Стручков // Биохимия. 2000. Т. 65, № 5. С. 620 — 643.
10. Diacylglycerol kinases in nuclear lipid-dependent signal transduction pathways / A. M. Martelli, R. Bortul, G. Tabellini [et al.]. // Cell. Mol. Life. Sci. 2002. V. 59. № 7. P. 1129 — 1137.
11. Lipid and DNA oxidative damage in experimentally induced hepatic porphyria in C57BL/l0ScSn mice. Z / M. E. Horvath, S. P. Faux, A. Blazovics [et al.] // Gastroenterol. 2001. V. 39, № 6. P. 453 — 458.
12. Nuclear lipids: New functions for old molecules Tabellini / A. M. Martelli, P. Borgatti, R. Bortul [et al.] //J. Cell Biochem. 2003. V. 88. № 3. P. 455 — 461.
13. Specific natural DNA-bound lipids in post-genome era. The lipid conception of chromatin organization / V. A. Struchkov, N. B. Strazhevskaya, R. I. Zhdanov // Bioelectrochemistry. 2002. V. 56, № 1. P. 195 — 198.
Поступила 18.10.06.
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА АРОВ В ЭКЗОНЕ 29 У ЛЮДЕЙ С СЕРДЕЧНОСОСУДИСТЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ В РМ
Е. А. Иванова (Саранск),
В. А. Трофимов, доктор биологических наук (Саранск),
М. В. Ромашкина (Саранск),
\
О. Г. Радайкина (Саранск)
!
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) развитие ИМ [3]. Сведения о полиморфизме
генов-кандидатов ССЗ в популяциях России ограничены результатами немногих работ,
являются одной из ведущих причин смертности в развитых странах мира. Инфаркт миокарда (ИМ) как острое проявление ишеми-ческой болезни сердца (ИБС) все чаще встречается в молодом возрасте, при этом принципиально важным фактором риска выступает артериальная гипертензия (АГ). Нарушения липидного гомеостаза, связанные с увеличенным содержанием в плазме крови ности, нельзя не признать актуальность этих
исследования ассоциации проведены по некоторым полиморфным маркерам небольшого числа генов в отдельных популяциях [2]. Принимая во внимание высокий уровень заболеваемости сердечно-сосудистой патологией и обусловленный ею уровень смерт-
холестерола, триацилглицеролов, липопротеи-ны низкой плотности (ЛПНП), увеличивают риск развития ССЗ.
К настоящему времени известно много генетических факторов, которые могут быть ассоциированы с увеличенным риском заболеваний сердечно-сосудистой системы — это гены ренин-ангиотензиновой системы, калликреин-кининового пути, гемостаза, структуры миокарда, а именно: АРОВ,
АРОЕ, 1Р1, СЕРТ, БЯЕВР, ¥11, ГУ и многие другие. Популяционные исследования этих наследственно обусловленных факторов дали убедительные доказательства их влияния на
исследовании и для населения нашей республики.
В настоящем исследовании проведена оценка полиморфизма (частоты генотипов, аллелей, гетерозиготность) гена АРОВ в экзо-не 29 у больных ССЗ, проживающих в Республике Мордовия. Аполипопротеин В выполняет центральную роль в метаболизме и транспорте триацилглицеролов и холестерола в составе липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), является лигандом для рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDLR) [10]. Дефекты в гене АРОВ приводят к нарушению связывания ЛПНП с рецепторами, в
© Е. А. Иванова, В. А. Трофимов, М. В. Ромашкина О. Г. Радайкина, 2007
