CC BY
6
© Коллектив авторов, 2023
Бязрова М.Г.1-3, Михайлов А.А.1' 2, Сухова М.М.1 2, Прилипов А.Г.1' 4,
Филатов А.В.1, 2
Биохимическая и функциональная характеристика мультимеризованных белков, содержащих рецепторный домен CD40L
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», 119234, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов имени П. Лумумбы» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. В процессах активации В-лимфоцита важную роль играет взаимодействие рецептора CD40, экспрессированного на поверхности В-лимфоцита, и его лиганда CD40L, расположенного на поверхности Т-хелпера. CD40L в наибольшей степени проявляет свою стимулирующую активность, когда находится в тримеризованном состоянии, которое обеспечивается при экспрессии белка на поверхностной мембране. Для создания бесфидерной системы стимуляции В-лимфоцитов необходимо получить реком-бинантный мультимеризованный CD40L.
Цель исследования - получить растворимый олигомеризованный белок CD40L человека, пригодный для олигоклональной стимуляции В-лимфоцитов in vitro.
Материал и методы. Методами молекулярного клонирования были получены две генетические конструкции, кодирующие рецепторную часть молекулы CD40L, слитую с двумя типами мультимеризующих последовательностей. В одном случае для этого использовался Fc-фрагмент IgG1 человека, соединенный с тримеризующим изолейци-новым зиппером. Эта конструкция получила название LIF. В другом случае для муль-тимеризации применялась последовательность коллагеноподобного домена адипонек-тина. Эта конструкция получила название LA. Плазмиды, кодирующие LIF и LA, были трансфецированы в клетки HEK293 и наработаны соответствующие растворимые реком-бинантные белки. Молекулярную массу белков определяли с помощью иммунопреци-питации с последующим вестерн-блоттингом. Функциональную активность белков LIF и LA определяли в условиях бесфидерной стимуляции В-лимфоцитов in vitro.
Результаты. При временной трансфекции в клетки HEK293 наблюдалась внутриклеточная экспрессия белков LIF и LA, а также секреция этих белков в культуральный супернатант. После иммунопреципитации и последующего вестерн-блоттинга препарат LIF мигрировал при электрофорезе полосой ~ 55 кДа в редуцирующих и 100 кДа в нере-дуцирующих условиях. В аналогичных условиях препарат LA мигрировал полосами, соответствующими 30 и 85 кДа. В присутствии экзогенного интерлейкина (ИЛ)-21 препарат LA обеспечивал пролиферацию В-лимфоцитов, сравнимую с наблюдаемой в фидерной системе. Индекс пролиферации В-лимфоцитов под действием ИЛ-21 и LIF был в 3 раза ниже, чем в фидерной системе. Стимуляция с помощью LA приводила к образованию большего количества плазмабластов, чем с применением LIF. Кроме того, LA обеспечивал дифференцировку части стимулированных В-лимфоцитов в плазматические клетки. На 20-й день стимуляции В-лимфоцитов в бесфидерной системе с помощью LA в супернатантах наблюдалась секреция IgM и IgG даже в культурах, изначально содержавших единичные В-клетки.
Заключение. Рекомбинантные мультимеризованные белки, содержащие рецеп-торный домен CD40L, обладают хорошей стимулирующей активностью в отношении В-лимфоцитов периферической крови. CD40L, мультимеризованный за счет слияния с коллагеноподобным доменом адипонектина, проявляет более высокую физиологичес-
Для корреспонденции
Филатов Александр Васильевич -доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
кую активность по сравнению с CD40L, мультимеризованным с помощью Fc-фрагмента IgG и тримеризующего изолейцинового зиппера. Слитый белок адипонектин-CD40L можно использовать для бесфидерной стимуляции единичных В-клеток или олигокло-нальных популяций В-лимфоцитов.
Ключевые слова: В-лимфоциты; стимуляция in vitro; молекула CD40L; гексамеризация; изолейциновый зип-пер; коллагеноподобный домен адипонектина; культуры единичных В-лимфоцитов
Статья получена 10.08.2023. Принята в печать 20.09.2023.
Для цитирования: Бязрова М.Г., Михайлов А.А., Сухова М.М., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Биохимическая и функциональная характеристика мультимеризованных белков, содержащих рецепторный домен CD40L. Иммунология. 2023; 44 (6): 697-708. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-697-708
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-25-00486 (https://rscf.ru/project/23-25-00486).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Сбор и обработка материала - Бязрова М.Г., Михайлов А. А., Сухова М.М.; написание текста, редактирование, окончательный вариант и целостность текста - Прилипов А.Г., Филатов А.В.
Byazrova M.G.1-3, Mikhailov A.A.1 2, Sukhova M.M.1 2, Prilipov A.G.1 4, Filatov A.V.1' 2
Biochemical and functional characterization of multimerized proteins containing the CD40L receptor domain
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 M.V. Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow, Russian Federation
3 Рeoples' Friendship University of Russia named after P. Lumumba of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation
4 Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. In the processes of B-lymphocyte activation and regulation of its activity, an important role is played by the interaction of the CD40 receptor expressed on the surface of the B-lymphocyte and its ligand CD40L located on the surface of the T-helper. The signaling activity of CD40L is most pronounced in the trimerized state, which is provided when the protein is expressed on the surface membrane. To create a feeder-free system for stimulating B-lymphocytes, it is necessary to obtain recombinant multimerized CD40L.
The aim of the study was to produce a soluble oligomerized human CD40L protein suitable for oligoclonal stimulation of B-lymphocytes in vitro.
Material and methods. Two genetic constructs encoding the receptor part of the CD40L molecule fused with two types of sequences were obtained by molecular cloning methods. In one case, it was a human IgG1 Fc fragment coupled to an isoleucine zipper, which was named LIF. In another case, it was the sequence of the collagen like domain of adiponectin, this construct was named LA. Plasmids encoding LIF and LA were transfected into HEK293 cells and the corresponding soluble recombinant proteins were generated. The molecular weight of proteins was determined by immunoprecipitation followed by Western blotting. The functional activity of LIF and LA proteins was determined under conditions of feeder-free stimulation of B-lymphocytes in vitro.
Results. In transiently transfected HEK293 cells, intracellular expression of LIF and LA proteins were observed, as well as the secretion of these proteins into the culture supernatant. After immunoprecipitation and following Western blotting, the LIF preparation migrated on electrophoresis as a band of ~ 55 kDa under reducing and 100 kDa under non-reducing conditions. Under appropriate conditions, the LA preparation migrated as 30 and 85 kDa correspondingly. In the presence of exogenous IL-21, the LA preparation provided B-lymphocyte proliferation comparable to that observed in the feeder system. The B-lymphocyte proliferation index under
For correspondence
Alexander V. Filatov -Dr.Sci., PhD, Professor, Head of the Immunochemistry Laboratory of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
the action of IL-21 and LIF was three times lower than in the feeder system. Stimulation with LA resulted in a higher proportion of plasmablasts than with LIF. In addition, LA ensured the differentiation of some of the stimulated B-lymphocytes into plasma cells. On the 20th day of stimulation of B lymphocytes in a feeder-free system with LA, secretion of IgM and IgG was observed in supernatants even in cultures containing single B cells.
Conclusion. Recombinant multimerized proteins containing the CD40L receptor domain have good stimulatory activity against peripheral blood B-lymphocytes. CD40L multimerized by fusion with the collagen-like domain of adiponectin exhibits higher physiological activity compared to CD40L multimerized by an IgG Fc-fragment and an isoleucine zipper. The adiponectin-CD40L fusion protein can be used for feeder-free stimulation of single or oligoclonal populations of B-lymphocytes.
Keywords: B-lymphocytes; stimulation in vitro; CD40L; hexamerization; isoleucine zipper; collagen-like domain of adiponectin; cultures of single B-lymphocytes
Received 10.08.2023. Accepted 20.09.2023.
For citation: Byazrova M.G., Mikhailov A.A., Sukhova M.M., Prilipov A.G., Filatov A.V. Biochemical and functional characterization of multimerized proteins containing the CD40L receptor domain. Immunologiya. 2023; 44 (6): 697-708. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-697-708 (in Russian)
Funding. The study was supported by the grant of Russian Science Foundation (RSF) No. 23-25-00486 (https://rscf. ru/project/23-25-00486).
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Collection and processing of material - Byazrova M.G., Mikhailov A.A., Sukhova M.M.; text writing, editing, the final version of the text - Prilipov A.G., Filatov A.V.
Введение
Важным показателем напряженности иммунитета является наличие в крови антиген-специфических В-клеток памяти [1]. В отличие от наивных В-лимфо-цитов, В-клетки памяти уже встречались с антигеном, в результате этого их гены ]£ уже претерпели мутагенез и соответствующие антитела прошли фазу созревания аффинности [2]. В-клетки памяти формируют пул лимфоцитов, которые могут быстро рекрутироваться для образования плазматических клеток и секреции антител при вторичном иммунном ответе. Для прогнозирования вторичного иммунного ответа особую важность представляет информация о количестве и репертуаре В-клеток памяти на клональном уровне, однако подсчет и идентификация антиген-специфических В-клеток памяти имеет некоторые трудности [3]. Это связано с тем, что В-клетки памяти являются покоящимися клетками, которые не проли-ферируют и не секретируют антитела. Для того, чтобы добиться того и другого, необходимо их простимулировать. Для стимуляции используют различные комбинации лимфокинов [4]. Такая стимуляция активирует В-клетки памяти и довольно быстро приводит их в состояние плазматических клеток, которые активно секретируют антитела.
Ранее нами была отработана система стимуляции В-лимфоцитов с использованием экзогенного интерлейкина(ИЛ)-21 и фидерной линии клеток А549, стабильно трансфецированных полноразмерным СБ40Ь [5]. Сочетанное действие ИЛ-21 и СБ40Ь в некоторой степени воспроизводит условия, которые создаются
в герминативных центрах лимфоузлов, в тех нишах, в которых in vivo В-лимфоциты проходят созревание и дифференцировку. Ранее было показано, что система СБ40Ь/ИЛ-21-стимуляции характеризуется высокой эффективностью [6].
Фидерные клетки для предотвращения пролиферации предварительно обрабатывают митомицином или облучают рентгеновскими лучами. Это приводит к тому, что при культивировании в течение > 1 нед фидерные клетки массово погибают. Для восполнения погибших фидерных клеток необходимо подсаживать свежие, однако это увеличивает трудоемкость процесса. Главное неудобство использования фидерных клеток состоит в том, что в культуре накапливаются погибшие клетки и их фрагменты, которые значительно затрудняют наблюдение за стимулированными В-клетками. Лиганд СБ40-рецептора имеет некоторые особенности. Он относится к суперсемейству ФНО-белков, общим свойством которых является тримеризация или гексамери-зация на поверхности экспрессируемых клеток [7]. При замене фидерных клеток на растворимый рекомби-нантный CD40L необходимо учитывать, что для поддержания функциональной активности молекула CD40L должна находится в тримеризованной или олигомери-зованной форме [8].
В настоящей работе были получены и охарактеризованы два препарата растворимого рекомбинантного мультимеризованного CD40L, которые подходят для использования в бесфидерной стимуляции В-лимфо-цитов. Гексамеризация CD40L в одном случае достигалась за счет введения в слитый рекомбинантный белок Fc-фрагмента IgG и тримеризующего изолейцинового
зиппера (препарат получил условное название LIF), а в другом случае за счет слияния с юллагеноподобным доменом адипонектина (препарат получил условное название LA). Нами было определено, что препараты LIF и LA могут использоваться в бесфидерной стимуляции В-лимфоцитов.
Материал и методы
Выделение лимфоцитов. В исследовании были использованы образцы крови здоровых доноров. Исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого». Письменное информированное согласие было получено от каждого участника исследования перед выполнением каких-либо процедур исследования. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Этическим комитетом Института иммунологии (протокол № 3-1, 11 марта 2020 г.).
Образцы цельной крови собирали в гепаринизиро-ванные вакутейнерные пробирки (Sarstedt, Германия). Мононуклеарные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (р = 1,077 г/см3). B-лимфоциты обогащали методом отрицательной иммуномагнитной сепарации с использованием набора Dynabeads Untouched human B cell kit («Thermo Fisher Scientific», США). Чистота выделенных В-лимфоцитов составляла не менее 98 % [9].
Молекулярное клонирование. Ген, кодирующий полипептид LIF, собирали на основе плазмиды pFUSE-hIgG1-Fc2 (Invivogen, США), которая кодирует сигнальный пептид ИЛ-2, состоящий из 20 аминокислотных остатков, и следующий за ним Fc-фраг-мент IgG. В состав Fc-фрагмента входила шарнирная область [APLEPKSS], а также CH2- и СН3-домены IgG1 человека. Синтез нуклеотидной последовательности, которая кодировала тримеризующий изолейциновый зиппер, фланкированный гибкими линкерами [LGGGS] и [GHGGGS], заказывали в Synbio Technologies (Китай). Нуклеотидную последовательность внеклеточного домена CD40L (а. к. 112-261) амплифицировали из плазмиды EX-G0117-Lv105-CD40L (Genecopoeia, США). Тримеризующий изолейциновый зиппер и внеклеточный домен CD40L методом ПЦР с удлинением перекрытия добавляли на З'-конец открытой рамки считывания вектора pFUSE-hIgG1-Fc2.
Ген, кодирующий полипептид LA, собирали на основе вектора pCMVpA, предназначенного для временной экспрессии целевого гена в клетках млекопитающих. В векторе сайты множественного клонирования расположены между CMV-промотором и сигналом полиаденилирования (polyA) из позднего антигена вируса SV40. В качестве сигнальной последовательности слитого LA использовали сигнальный пептид адипонектина [MLLLQALLFLLILPSHA], за которым следовала гистидиновая метка, состоявшая из 8 последовательно расположенных остатков гистидина. Затем
следовала нуклеотидная последовательность адипонектина мыши (а. к. 18-111). Синтез этой части гена LA заказывали в Synbio Technologies (Китай). Нуклеотидную последовательность внеклеточного домена CD40L (а. к. 116-261) амплифицировали из плазмиды EX-G0117-Lv105-CD40L (Genecopoeia, США). Фрагмент адипонектина и CD40L сливали в одну последовательность методом ПЦР с удлинением перекрытия и клонировали на З'-конец открытой рамки считывания вектора pCMVpA. Корректность полученных генов определяли путем секвенирования по Сэнгеру. Для выделения плазмид использовали наборы NucleoBond Xtra Midi («Marcherey-Nagel», США).
Получение рекомбинантных белков. Транс-фекцию клеток HEK293 проводили в 10 см чашках Петри (Costar, США). 3,6 • 106 клеток в среде DMEM с добавлением 10 % ЭТС трансфецировали 30 мкг плаз-мидной ДНК. Для этого экспрессионные плазмиды, кодирующие LIF или LA, разводили стерильной водой до 675 мкл. К полученному раствору добавляли 75 мкл 2,5 мM CaCl2 и 750 мкл раствора, содержавшего 50 мM HEPES, 1,5 мM Na2HPO4, 280 мM NaCl, 10 мM KCl и 12 мM сахарозы. Полученную смесь общим объемом 1500 мкл распределяли по поверхности чашки Петри, перемешивая содержимое несколькими орбитальными движениями. Через 5-8 ч среду меняли на свежую бессывороточную среду FreeStyle 293 (Gibco, США). Через 5 дней культивирования культуральный супер-натант собирали, концентрировали на патроне Amicon Ultracel - 50K (Merck, США) в 20 раз и использовали в качестве источника LIF и LA.
Иммунопреципитация, ДСН-ПААГ-электрофорез и вестерн-блоттинг. Иммунопреципитацию проводили путем добавления 1 мл клеточного супернатанта к 20 мкл сефарозы с протеином А (Thermo Fisher Scientific, США) с преформированным на ней комплексом преципитирующего антитела против CD40L (клон LGF3 был ранее получен в нашей лаборатории [9]) и последующей инкубации в течение ночи при 4 °C. Иммунопреципитаты отмывали трижды, каждый раз добавляя по 1 мл PBS. Связавшиеся белки элюи-ровали с носителя прогреванием иммунопреципитатов с буфером образца для электрофореза в течение 5 мин при 95 °C. Элюированные белки разделяли электрофорезом в 12 % полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) в редуцирующих и нередуцирующих условиях в буферной системе Лэммли. Разделенные белки полусухим методом переносили из геля на PVDF-мембрану (Merck, США). Мембрану обрабатывали первичными антителами против IgG человека (клон CH1 был ранее получен в нашей лаборатории [9]) или против HisTag (BioLegend, США). Далее комплекс антиген-антитело проявляли вторичными антителами против IgG мыши, меченными пероксидазой хрена (GE Healthcare, США). Визуализацию блотов проводили на приборе ChemiDoc XRS (Bio-Rad, США) с использованием реагентов для хемилюминесценции (Merck, США).
В качестве стандартов молекулярной массы использовали набор предокрашенных маркеров Prestained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Fisher Scientific, США).
Стимуляция лимфоцитов in vitro. Выделенные В-лимфоциты культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (все «Панеко», Россия). При бесфидерной стимуляции В-лимфоциты культивировали 7 дней в присутствии 25 нг/мл ИЛ-21 и препарата LIF или LA в разведении 1 : 10. В условиях фидерной стимуляции вместо препаратов LIF или LA использовали фидерные клетки A549, несущие CD40L и обработанные 10 мкг/мл митоми-цина-С («Киова Хакко Когио», Япония) [10]. При оли-гоклональной бесфидерной стимуляции В-лимфоциты культивировали 20 дней в присутствии смеси лимфо-кинов, состоявшей из 10 нг/мл ИЛ-21, 10 нг/мл ИЛ-4, 50 нг/мл ИЛ-2, 10 нг/мл BAFF (все Peprotech, США) и LA в разведении 1 : 10. Культивирование проводили при 37 °C в 5 % CO2.
Проточная цитометрия. Для окрашивания лимфоцитов использовали следующие моноклональные антитела: CD3-FITC (клон TB3), CD14-FITC (клон LT14), CD16-FITC (клон LNK16), CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), а также антитело против IgG человека (клон CH1). Указанные моноклональные антитела ранее были получены в нашей лаборатории [11]. Использовали также моноклональные антитела CD40L-PE (клон 24-31, BioLegend, США), CD138-APC (клон MI15, Sony, США), TACI-PECy7 (клон 1A1, Sony, США). Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цито-метра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного двумя диодными лазерами (488 и 561 нм). Клетки сортировали на проточном сортировщике SH800S (Sony Biotechnology, США). Обработку цитофлуориметриче-ских данных проводили при помощи программы FlowJo X 10.0.7 (Becton Dickinson, США).
Определение Ig методом иммуноферментного анализа (ИФА). IgG и IgM человека определяли с помощью наборов Total Uncoated ELISA Kit (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя. Оптическую плотность при 450 нм измеряли с помощью фотометра BioRad iMark Microplate Absorbance Reader (BioRad, США). Данные анализировали с помощью программы Zemfira 4.0 (BioRad, США).
Статистическая обработка. Статистическая обработка данных проведена с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версия 8.4.3 (GraphPad, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью критерия Краскела-Уол-лиса и теста Данна. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p < 0,05. Данные на гистограммах показывают среднюю арифметическую величину. Разбросы показаны как среднеквад-ратические отклонения.
Результаты
Биохимическая характеристика рекомбинантных белков, содержащих рецепторный домен CD40L
Для получения растворимых рекомбинантных белков, содержащих рецепторный домен СБ40Ь, нами были созданы 2 плазмиды, кодирующие внеклеточную часть СБ40Ь (а. о. 116-261). СБ40Ь относится к трансмембранным белкам типа II, у которых С-конец обращен в межклеточное пространство. Чтобы у реком-бинантного СБ40Ь сохранить правильную ориентацию, мультимеризующие домены были слиты с М-концом СБ40Ь. Для получения гексамеризованных форм СБ40Ь мы использовали 2 конструкции.
В первой конструкции М-конец рецепторной части СБ40Ь сливали с С-концом Рс-фрагмента человека. S-S-связи в шарнирной области Рс-фрагмента должны обеспечивать димеризацию СБ40Ь. Между Рс-фрагментом и рецепторной частью СБ40Ь дополнительно вводили тримеризующий изолейциновый зиппер. В результате конечная конструкция, которая получила условное обозначение Ь1Р, должна находиться в гексамеризованном состоянии (рис. 1 А). В другой конструкции М-конец рецепторной части СБ40Ь сливали с С-концом коллагеноподобного домена сывороточного адипонектина мыши (а. о. 18-111), который имеет склонность к образованию тримеров, гексамеров и олиго-меров более высокого порядка [12]. Согласно рент-геноструктурным данным, коллагеноподобный домен приводит к образованию мультимеров в виде букета [13, 14]. Конструкция адипонектин-СБ40Ь получила условное обозначение ЬА (рис. 1Б).
Соответствующие плазмиды были временно транс-фецированы в клетки НЕК293. Через 2 дня после транс-фекции клетки при внутриклеточном окрашивании демонстрировали высокую экспрессию рецепторного домена СБ40Ь (рис. 1В). При трансфекции Ь1Р клетки также экспрессировали Рс-фрагмент (рис. 1В). Через 5 дней после трансфекции культуральные супер-натанты собирали и анализировали с помощью вес-терн-блоттинга. При прямом блоттинге интенсивность полос была довольно слабая, поэтому для увеличения чувствительности перед вестерн-блоттингом проводили иммунопреципитацию. Белок Ь1Р после иммуно-преципитации на сефарозе с протеином А мигрировал в ДСН-ПААГ-электрофорезе в редуцирующих условиях в виде полосы, которая соответствовала белку с молекулярной массой (ММ) ~ 55 кДа (рис. 1Г), что было несколько выше, чем расчетное значение 47,4 кДа. Возможно, это превышение связано с гликозилированием белка Ь1Р. В нередуцирующих условиях Ь1Р мигрировал как белок с ММ 100 кДа (рис. 1Г), что примерно соответствовало димерной форме этого белка. В присутствии ДСН тримеризующий изолейциновый зиппер не работает и гексамеризованная форма Ь1Р распадается.
Аналогичные результаты были получены для белка ЬА. После выделения белка на сефарозе с антителом против СБ40Ь и последующего электрофореза в реду-
Э
SP
Fc-фрагмент IgG
ILZ
N
HR
э
HisTag N|—rr-
SP
Аципонектин
J
100 80 60 40 20 0
LIF
0 104
106
CD40L-РЕ
LIF
кДа
120 90
50
34
LIF 448 a. o.
47,4 кДа
CD40L
LA 256 a. o.
26 кДа
100 80 60 40 20 0
55
CD40L
Fc-фрагмент
S-S-связи
HisTag
LIF
LA
100 80 60 40 20 0
104 CD40L-PE
106
LA
100
кДа 120 90
50 34 26
WB: анти-IgG
30
WB: анти-HisTag
85
Рис. 1. Вестерн-блоттинг рекомбинантных белков, содержащих рецепторный домен CD40L
А, Б - слитые конструкции белков LIF (А) и LA (Б), а также схематическое изображение гексамеризованных форм LIF и LA; В - иммунофлуоресцентное окрашивание белков LIF и LA после пермеабилизации трансфецированных клеток и обработки антителами против CD40L и IgG; Г, Д - иммунопреципитация белков LIF (Г) и LA (Д) с последующим ДСН-ПААГ-электрофоре-зом в редуцирующих (+) и нередуцирующих (-) условиях. Проявление осуществлялось с помощью антител против IgG и HisTag. SP - сигнальный пептид; HR - шарнирная область (hinge region); HisTag - гистидиновая метка; ILZ - изолейциновый зиппер; а. о. - аминокислотные остатки; WB - вестерн-блоттинг.
0
+
Э
7 день
т
8 1
5
д 6 -
й
&
<и
- 4 -
О
&
С
о
и
<и
ч я 2 -
5
0 ^
^ 4
э
ЬЛ
105
104
103
■103
80
40
105
СШ38-ЛРС
105
ТЛС1-РЕ-Су7
105
104
103
0 9
-103
Л549.40Ь
80
40
105
80
40
105
Л549.40Ь
105
104
103
0 а
-103
СШ8
Рис. 2. Сравнение стимуляции В-лимфоцитов в бесфидерной системе с помощью препаратов ЫБ и ЬЛ, а также в культуре, содержавшей фидерные клетки Л549.40Ь, экспрессирующие природный СБ40Ь
А - индекс пролиферации В-лимфоцитов на 7-й день культивирования; Б - доля плазмабластов (СВ27+СВ38+); В - доля плазматических клеток (СБ138+) и доля клеток, несущих рецептор ТАС1.
*
0
0
0
5
0
0
0
0
0
цирующих или нередуцирующих условиях и проявления с помощью анти-HisTag антитела ЬЛ обнаруживался в районе 30 и 85 кДа соответственно (рис. 1Д). Эти полосы примерно соответствовали его мономерной и тримерной форме. При ДСН-ПААГ-электрофорезе мы не наблюдали более мультимеризованных форм ЬЛ. Вероятно, они неустойчивы в присутствии ДСН и после прогрева образцов перед электрофорезом [15]. Таким образом, полученные рекомбинантные белки по своим биохимическим свойствам соответствовали заявленным конструкциям.
Функциональная характеристика рекомбинантных белков, содержащих рецепторный домен СБ40Ь
В-лимфоциты получали методом магнитной сепарации. Чистота полученных В-лимфоцитов состав-
ляла не менее 98 %. В-лимфоциты высевали в лунки 96-луночных планшетов по 5000 клеток на лунку. К клеткам добавляли препараты ЫБ и ЬЛ в разведении 1 : 10. В контроле клетки высевали на фидерные клетки Л549, экспрессирующие на своей поверхности СБ40Ь. Во все культуры добавляли экзогенный ИЛ-21 (25 нг/мл). К сожалению, мы не располагали тест-системой для количественного определения ЫБ и ЬЛ. В предварительных экспериментах при титровании ЫБ и ЬЛ были подобраны разведения, которые обеспечивали выход на плато по стимулирующей активности. Препарат ЬЛ на 7-й день культивирования обеспечивал пролиферацию В-лимфоцитов примерно на уровне фидерной системы (рис. 2). Препарат ЫБ по сравнению с фидерной системой в 3 раза хуже стимулировал рост
IgM
IgG
A 0,8 0,6 0,8 0,7 0,7 0,5
B 0,9 0,5 0,1 0,7 0,1 0,4
C 0,1 0,03 0,7 0,3 0,0 0,05
D 0,04 0,01 0,1 0,2 0,0 0,03
E 0,0 0,01 0,1 0,2 0,0 0,0
F 0,0 0,0 0,0 0,0 0,02 0,0
G 0,0 0,0 0,01 0,0 0,0 0,0
H 0,0 0,0 0,01 0,0 0,0 0,0
I 0,0 0,0 0,05 0,0 0,0 0,0
1 2 3 4 5 6
i x
256 128 64 32 16 8 4 1 1
AB-CDE-FGHI-
0,6 0,6 0,8 0,9 0,8 0,7
0,8 0,7 0,2 0,9 0,7 0,6
0,1 0,5 0,6 0,01 0,02 0,6
0,01 0,2 0,2 0,5 0,0 0,3
0,2 0,4 0,01 0,3 0,0 0,2
0,0 0,04 0,04 0,0 0,3 0,0
0,0 0,01 0,0 0,0 0,0 0,0
0,0 0,01 0,03 0,0 0,0 0,0
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Рис. 3. Секреция IgM (слева) и IgG (справа) в лунках с В-лимфоцитами при бесфидерной стимуляции
В середине указано исходное количество клеток на лунку. Цифрами указаны оптические плотности, полученные при определении общего IgG или IgM.
клеток. На 7-й день культивирования доля плазмаблас-тов (CD27+CD38+) в культуре с LA достигала 43 % и была выше, чем в культуре с фидерными клетками (26 %) или при бесфидерной стимуляции с помощью LIF (22 %). Доля плазматических клеток (CD138+) при бесфидерной стимуляции с LA была ниже, чем в фидерной культуре (26 против 43 %), однако эти культуры не отличались между собой по экспрессии маркера активированных В-лимфоцитов молекуле TACI (Transmembrane activator and CAML interactor), которая является рецептором лимфокинов APRIL и BAFF [16]. Таким образом, препарат LA по физиологическим характеристикам не уступал природному CD40L, экспрессированному на поверхности фидерных клеток, и намного превышал препарат LIF. Для дальнейших экспериментов мы использовали препарат LA.
Бесфидерная стимуляция олигоклональных культур В-лимфоцитов
В-лимфоциты выделяли с помощью проточного цитометра по фенотипу CD19+CD3CD14CD16-. Чистота полученных В-лимфоцитов составляла не менее 95 %. Клетки пересчитывали, делали серийные разведения с шагом в 2 и переносили в лунки 384-луноч-ного планшета, рассевая от 250 и до 1 клетки на лунку. В каждую лунку также добавляли белок LA в разведении 1 : 10 и коктейль цитокинов, содержавший рИЛ-21 (10 нг/мл), рИЛ-2 (50 нг/мл), рИЛ-4 (10 нг/мл), rBAFF (10 нг/мл). На 20-й день стимуляции супернатанты клеточных культур собирали и секрецию IgG и IgM антител оценивали методом ИФА (рис. 3).
По мере уменьшения количества В-клеток на лунку пропорционально падала оптическая плотность при определении уровня секретированного IgG и IgM. Начиная с некоторой концентрации клеток, обнаруживались лунки
с фоновыми значениями оптической плотности. С уменьшением количества клеток доля «нулевых» лунок увеличивалась, однако даже при рассеве по 1 клетке на лунку обнаруживались лунки с оптической плотностью выше фона. Обращает на себя внимание, что в лунках с малой плотностью клеток положительные сигналы для и IgM регистрировались альтернативно. Исключением являлась только лунка Н3, которая имела положительный сигнал как по ^в, так и по ^М. При визуальном контроле в лунках с положительным сигналом отмечался рост клонов. Учитывая распределение Пуассона, а также тот факт, что в рядах от Б до I встречаются негативные лунки, можно утверждать, что в позитивных лунках этих рядов с высокой вероятностью присутствовали единичные клоны. Полученные данные демонстрируют, что растворимый рекомбинантный СБ40Ь, мультимеризованный путем слияния с коллагеноподобным доменом адипонек-тина, обеспечивал бесфидерную стимуляцию В-лимфо-цитов в олигоклональных и даже в моноклональных условиях.
Обсуждение
Белок СБ40Ь принадлежит к ФНО-суперсемей-ству, в которое входят также такие важные сигнальные молекулы, как 0Х40Ц FasL, СБ27Ь, СБ30Ь, вгть, СБ137Ь и некоторые другие. Все они относятся к трансмембранным белкам типа II, которые характеризуются внеклеточным С-концом и имеют внеклеточный ФНО-подобный домен [7]. Молекулы из ФНО-суперсе-мейства играют решающую роль в поддержании иммунного гомеостаза, например, подавая костимулирующие сигналы соседним антиген-презентирующим клеткам и лимфоцитам или, напротив, посылая сигналы апоптоза избыточно активированным иммунным клеткам [17].
Ключевая особенность этого типа белков заключается в том, что для функциональной активности они должны находиться в мультимеризованном состоянии. Эти молекулы уже давно рассматриваются в качестве основы для создания иммунотерапевтических препаратов [18], однако при их получении и использовании необходимо учитывать, что адекватной функциональной активности можно добиться, только получив тримеры или олигомеры этих лигандов. Как правило, олигомеризация этих молекул повышает их активность на несколько порядков. Олигомеризация достигается за счет использования различных приемов. Самым простым способом, который применялся в ранних работах, являлось кросс-линкирование с помощью антител против пептидной последовательности, включенной в его состав [19]. Однако в общем случае такой подход оказался малоэффективным.
Более успешный пример мультимеризации - включение в состав лиганда изолейцинового зиппера. Ранее прием мультимеризации за счет изолейцинового зип-пера был использован для одного из белков этого семейства - лиганда рецептора ФНО, индуцированного глюкокортикоидами (GITRL) человека [20]. Мульти-меризация рекомбинантного белка GITRL приводила к многократному повышению его цитотоксической активности по сравнению с мономерной формой [21]. Далее тримерный FasL, полученный с помощью изо-лейцинового зиппера, был дополнительно гексамери-зован за счет слияния с Fc-фрагментом IgG человека
[22]. Этот же прием был использован для гексамери-зации OX40L - другого белка из ФНО-суперсемейства
[23]. Была также предпринята попытка мультимеризации CD40L с использованием в качестве пентамери-зующего каркаса спирального домена белка хрящевого олигомерного матрикса (COMP) [24], однако функциональная активность такого рекомбинантного белка была невысокой.
Ранее было отмечено, что рецепторные домены молекул ФНО-суперсемейства имеют структурную гомологию с C-концевым коллагеноподобным доменом белка адипонектина, который, в свою очередь, принадлежит к семейству белков первого компонента комплемента C1q. Адипонектин представляет собой сывороточный белок, секретируемый адипоцитами, который стимулирует сжигание жирных кислот и взаимодействует с инсулином при регуляции гликемии [13]. Интересно, что коллагеноподобный домен адипонектина проявляет склонность к олигомеризации. На основании структурной гомологии адипонектина и молекул ФНО-суперсемейства было сделано предположение о том, что адипонектин может представлять удобный и естественный каркас для гексамеризации молекул ФНО-суперсемейства. Впервые эта идея была использована для мультимеризации молекулы Fas-лиганда (FasL) [22].
Для гексамеризации CD40L мы использовали ранее высказанные идеи мультимеризации за счет совместного действия Fc-фрагмента IgG и тримеризующего
изолейцинового зиппера, а также за счет фибриллярного домена адипонектина. Оба подхода дали функционально активные рекомбинантные белки, однако было обнаружено, что LA обладал более высокой физиологической активностью, чем LIF. Возможно, это связано с тем, что адипонектин может приводить к образованию не только гексамеров, но и мультимеров более высокого порядка [25], которые обладают повышенной функциональной активностью. Нельзя исключить, что в молекуле LA геометрия расположения доменов рецепторной части CD40L более способствует корректному взаимодействию с рецептором CD40, чем в молекуле LIF.
Последние годы были ознаменованы значительными успехами в получении и функциональном анализе кратковременных клонов В-лимфоцитов. Такая работа в значительной степени была стимулирована интенсивными исследованиями, связанными с пандемией COVID-19 и SARS-CoV-2 инфекцией [26]. Это направление исследований даже получило самостоятельное название -single-cell multiomics [27]. Блок-схему методики можно описать следующим образом: выделение антиген-специфических В-клеток памяти; стимуляция В-клеток in vitro; получение кратковременных клонов В-лимфоцитов; тестирование моноклональных антител в тестах на связывание с панелью антигенов, а также в функциональных тестах по вирус-нейтрализации; отбор наиболее интересных клонов; секвенирование генов Ig; получение моноклональных антител с хорошим терапевтическим потенциалом [28].
Пользуясь этой методикой, некоторые лаборатории уже получили многие сотни человеческих монокло-нальных антител [27]. Наша работа была сосредоточена на получение препаратов, пригодных для бесфидерной стимуляции В-лимфоцитов. Нами были получены препараты растворимого рекомбинантного CD40L с высокой физиологической активностью. Это открывает возможности для получения кратковременных клонов В-лимфоцитов и изучения репертуара В-кле-точных рецепторов. Предполагается, что в последующем эту методику можно будет использовать для изучения тонкой антигенной специфичности полученных клонов, а также для секвенирования генов Ig.
Заключение
Рекомбинантные мультимеризованные белки, содержащие рецепторный домен CD40L, обладают хорошей стимулирующей активностью в отношении В-лимфоцитов периферической крови. CD40L, мультимеризо-ванный за счет слияния с коллагеноподобным доменом адипонектина, проявляет более высокую физиологическую активность, чем CD40L, мультимеризованный с помощью Fc-фрагмента IgG и тримеризующего изолейцинового зиппера. Слитый белок адипонектин-CD40L можно использовать для бесфидерной стимуляции единичных или олигоклональных популяций В-лимфоцитов.
■ Литература
1. Inoue T., Kurosaki T. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 2023. DOI: https://doi.org/10.1038/s41577-023-00897-3
2. Cancro M.P., Tomayko M.M. Memory B cells and plasma cells: The differentiative continuum of humoral immunity. Immunol. Rev. 2021; 303: 72-82. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.13016
3. Boonyaratanakornkit J., Taylor J.J. Techniques to study antigen-specific B cell responses. Front. Immunol. 2019; 10: 1694. DOI: https:// doi.org/10.3389/fimmu.2019.01694
4. Henn A.D., Rebhahn J., Brown M.A., Murphy A.J., Coca M.N., Hyrien O., Pellegrin T., Mosmann T., Zand M.S. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. J. Immunol. 2009; 183: 3177-87. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.0804233
5. Byazrova M., Yusubalieva G., Spiridonova A., Efimov G., Mazurov D., Baranov K., Baklaushev V., Filatov A. Pattern of circulating SARS-CoV-2-specific antibody-secreting and memory B-cell generation in patients with acute COVID-19. Clin. Transl. Immunol. 2021; 10 (2): e1245. DOI: https://doi.org/10.1002/cti2.1245
6. Byazrova M.G., Kulemzin S.V., Astakhova E.A., Belove-zhets T.N., Efimov G.A., Chikaev A.N., Kolotygin I.O., Gorchakov A.A., Taranin A.V., Filatov A.V. Memory B Cells Induced by Sputnik V vaccination produce SARS-CoV-2 neutralizing antibodies upon ex vivo restimulation. Front. Immunol. 2022; 13: 840707. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2022.840707
7. Kucka K., Wajant H. Receptor oligomerization and its relevance for signaling by receptors of the tumor necrosis factor receptor superfamily. Front. Cell. Dev. Biol. 2021; 8: 615141. DOI: https://doi. org/10.3389/fcell.2020.615141
8. Naito M., Hainz U., Burkhardt U.E., Fu B., Ahove D., Stevenson K.E., Rajasagi M., Zhu B., Alonso A., Witten E., Matsuoka K., Neuberg D., Duke-Cohan J.S., Wu C.J., Freeman G.J. CD40L-Tri, a novel formulation of recombinant human CD40L that effectively activates B cells. Cancer Immunol. Immunother. 2013; 62: 347-57. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-012-1331-4
9. Бязрова М.Г., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Васильева Ю.В., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Стимуляция В-лимфо-цитов человека in vitro с помощью HH-21/CD40L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (6): 501-10. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-501-510
10. Астахова Е.А., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Бязрова М.Г., Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Стимуляции В-клеток в системе ИЛ-21/CD40L в норме и у пациентов с общей вариабельной иммунной недостаточностью. Иммунология. 2021; 41 (6): 631-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640
11. Лушова А.А., Жеремян Э.А., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Бязрова М.Г., Филатов А.В. Субпопуляции В-лимфоцитов: функции и молекулярные маркеры. Иммунология. 2019; 40 (6) 63-75. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16009
12. Wang Y., Lam K.S.L., Chan L., Chan K.W., Lam J.B.B., Lam M.C., Hoo R.C., Mak W.W., Cooper G.J., Xu A. Post-translational modifications of the four conserved lysine residues within the colla-genous domain of adiponectin are required for the formation of its high molecular weight oligomeric complex. J. Biol. Chem. 2006; 281: 16391400. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M513907200
13. Achari A., Jain S. Adiponectin, a therapeutic target for obesity, diabetes, and endothelial dysfunction. Int. J. Mol. Sci. 2017; 18: 1321. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms18061321
14. Wang Y., Lam K.S.L., Yau M., Xu A. Post-translational modifications of adiponectin: mechanisms and functional implications. Biochem. J. 2008; 409: 623-33. DOI: https://doi.org/10.1042/BJ20071492
15. Ruotsalainen H., Risteli M., Wang C., Wang Y., Karppinen M., Bergmann U., Kvist A.P., Pospiech H., Herzig K.H., Myllyla R. The activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3) regulate the amount and oligo-merization status of adiponectin. PLoS ONE. 2012; 7: e50045. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050045
16. Mackay F., Schneider P. TACI, an enigmatic BAFF/APRIL receptor, with new unappreciated biochemical and biological proper-
ties. Cytokine Growth Factor Rev. 2008; 19: 263-76. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cytogfr.2008.04.006
17. Locksley R.M., Killeen N., Lenardo M.J. The TNF and TNF receptor superfamilies. Cell. 2001; 104: 487-501. DOI: https://doi. org/10.1016/S0092-8674(01)00237-9
18. Dostert C., Grusdat M., Letellier E., Brenner D. The TNF family of ligands and receptors: communication modules in the immune system and beyond. Physiol. Rev. 2019; 99: 115-60. DOI: https://doi. org/10.1152/physrev. 00045.2017
19. Schneider P., Holler N., Bodmer J.-L., Hahne M., Frei K., Fontana A., Tschopp J. Conversion of membrane-bound Fas(CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity. J. Exp. Med. 1998; 187: 1205-13. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.187.8.1205
20. Cui D., Wang S., Chen Y., Tong J., Ma J., Tang L., Yang X., Shi Y., Tian J., Lu L., Xu H. An isoleucine-zipper motif enhances costi-mulation of human soluble trimeric GITR ligand. Cell. Mol. Immunol. 2010; 7: 316-22. DOI: https://doi.org/10.1038/cmi.2010.7
21. Han J.H., Moon A.R., Chang J.H., Bae J., Choi J.M., Lee S.H. et al. Potentiation of TRAIL killing activity by multimerization through isoleucine zipper hexamerization motif. BMB Reports. 2016; 49: 282-7. DOI: https://doi.org/10.5483/BMBRep.2016.49.5.245
22. Holler N., Tardivel A., Kovacsovics-Bankowski M., Hertig S., Gaide O., Martinon F., Tinel A., Deperthes D., Calderara S., Schul-thess T., Engel J., Schneider P., Tschopp J. Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex. Mol. Cell. Biol. 2003; 23: 1428-40. DOI: https://doi. org/10.1128/MCB.23.4.1428-1440.2003
23. Morris N.P., Peters C., Montler R., Hu H.-M., Curti B.D., Urba W.J., Weinberg A.D. Development and characterization of recombinant human Fc:OX40L fusion protein linked via a coiled-coil trimeri-zation domain. Mol. Immunol. 2007; 44: 3112-21. DOI: https://doi. org/10.1016/j.molimm.2007.02.004
24. Holler N., Kataoka T., Bodmer J.-L., Romero P., Romero J., Deperthes D., Engel J., Tschopp J., Schneider P. Development of improved soluble inhibitors of FasL and CD40L based on oligome-rized receptors. J. Immunol. Methods. 2000; 237: 159-73. DOI: https:// doi.org/10.1016/S0022-1759(99)00239-2
25. Dadson K., Liu Y., Sweeney G. Adiponectin Action: a combination of endocrine and autocrine/paracrine effects. Front. Endocrin. 2011; 2. DOI: https://doi.org/10.3389/fendo.2011.00062
26. Zost S.J., Gilchuk P., Chen R.E., Case J.B., Reidy J.X., Trivet-te A., Nargi R.S., Sutton R.E., Suryadevara N., Chen E.C., Binsh-tein E., Shrihari S., Ostrowski M., Chu H.Y., Didier J.E., MacRena-ris K.W., Jones T., Day S., Myers L., Eun-Hyung Lee F., Nguyen D.C., Sanz I., Martinez D.R., Rothlauf P.W., Bloyet L.M., Whelan S.P.J., Baric R.S., Thackray L.B., Diamond M.S., Carnahan R.H., Crowe J.E. Rapid isolation and profiling of a diverse panel of human monoclonal antibodies targeting the SARS-CoV-2 spike protein. Nat. Med. 2020; 26: 1422-7. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-0998-x
27. Sokal A., Barba-Spaeth G., Hunault L., Fernández I., Bro-keta M., Meola A., Fourati S., Azzaoui I., Vandenberghe A., Lagouge-Roussey P., Broutin M., Roeser A., Bouvier-Alias M., Crickx E., Languil-le L., Fournier M., Michel M., Godeau B., Gallien S., Melica G., Nguyen Y., Canoui-Poitrine F., Pirenne F., Megret J., Pawlotsky J.M., Filla-treau S., Reynaud C.A., Weill J.C., Rey F.A., Bruhns P., Mahévas M., Chappert P. SARS-CoV-2 Omicron BA.1 breakthrough infection drives late remodeling of the memory B cell repertoire in vaccinated individuals. Immunity. 2023; 56 (9): 2137-51.e7. DOI: https://doi. org/10.1016/j.immuni.2023.07.007
28. Kotaki R., Adachi Y., Moriyama S., Onodera T., Fukushi S., Nagakura T., Tonouchi K., Terahara K., Sun L., Takano T., Nishiya-ma A., Shinkai M., Oba K., Nakamura-Uchiyama F., Shimizu H., Suzuki T., Matsumura T., Isogawa M., Takahashi Y. SARS-CoV-2 Omicron-neutralizing memory B cells are elicited by two doses of BNT162b2 mRNA vaccine. Sci. Immunol. 2022; 7: eabn8590. DOI: https://doi. org/10.1126/sciimmunol.abn8590
■ References
1. Inoue T., Kurosaki T. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 2023. DOI: https://doi.org/10.1038/s41577-023-00897-3
2. Cancro M.P., Tomayko M.M. Memory B cells and plasma cells: The differentiative continuum of humoral immunity. Immunol Rev. 2021; 303: 72-82. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.13016
3. Boonyaratanakornkit J., Taylor J.J. Techniques to study antigen-specific B cell responses. Front Immunol. 2019; 10: 1694. DOI: https:// doi.org/10.3389/fimmu.2019.01694
4. Henn A.D., Rebhahn J., Brown M.A., Murphy A.J., Coca M.N., Hyrien O., Pellegrin T., Mosmann T., Zand M.S. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. J Immunol. 2009; 183: 3177-87. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.0804233
5. Byazrova M., Yusubalieva G., Spiridonova A., Efimov G., Mazurov D., Baranov K., Baklaushev V., Filatov A. Pattern of circulating SARS-CoV-2-specific antibody-secreting and memory B-cell generation in patients with acute COVID-19. Clin Transl Immunol. 2021; 10 (2): e1245. DOI: https://doi.org/10.1002/cti2.1245
6. Byazrova M.G., Kulemzin S.V., Astakhova E.A., Belove-zhets T.N., Efimov G.A., Chikaev A.N., Kolotygin I.O., Gorchakov A.A., Taranin A.V., Filatov A.V. Memory B Cells Induced by Sputnik V vaccination produce SARS-CoV-2 neutralizing antibodies upon ex vivo restimulation. Front Immunol. 2022; 13: 840707. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2022.840707
7. Kucka K., Wajant H. Receptor oligomerization and its relevance for signaling by receptors of the tumor necrosis factor receptor superfamily. Front Cell Dev Biol. 2021; 8: 615141. DOI: https://doi. org/10.3389/fcell.2020.615141
8. Naito M., Hainz U., Burkhardt U.E., Fu B., Ahove D., Stevenson K.E., Rajasagi M., Zhu B., Alonso A., Witten E., Matsuoka K., Neuberg D., Duke-Cohan J.S., Wu C.J., Freeman G.J. CD40L-Tri, a novel formulation of recombinant human CD40L that effectively activates B cells. Cancer Immunol Immunother. 2013; 62: 347-57. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-012-1331-4
9. Byazrova M.G., Astakhova E.A., Spiridonova A.B., Vasil'e-va Yu.V., Prilipov A.G., Filatov A.V. IL-21/CD40L stimulation of human B-lymphocytes in vitro and their characteristics. Immunologiya. 2020; 41 (6): 501-10. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-501-510 (in Russian)
10. Astakhova E.A., Frolov E.A., Shilkina A.B., Byazrova M.G., Latysheva E.A., Latysheva T.V., Filatov A.V. Stimulation of B cells in the IL-21/CD40L system in healthy donors and in patients with common variable immunodeficiency. Immunologiya. 2021; 41 (6): 631-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640 (in Russian)
11. Lushova A.A., Zheremyan E.A., Astakhova E.A., Spiridono-va A.B., Byazrova M.G., Filatov A.V. B-lymphocyte subsets: functions and molecular markers. Immunologiya. 2019; 40 (6): 63-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16009 (in Russian)
12. Wang Y., Lam K.S.L., Chan L., Chan K.W., Lam J.B.B., Lam M.C., Hoo R.C., Mak W.W., Cooper G.J., Xu A. Post-translational modifications of the four conserved lysine residues within the colla-genous domain of adiponectin are required for the formation of its high molecular weight oligomeric complex. J Biol Chem. 2006; 281: 16391400. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M513907200
13. Achari A., Jain S. Adiponectin, a therapeutic target for obesity, diabetes, and endothelial dysfunction. Int J Mol Sci. 2017; 18: 1321. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms18061321
14. Wang Y., Lam K.S.L., Yau M., Xu A. Post-translational modifications of adiponectin: mechanisms and functional implications. Biochem J. 2008; 409: 623-33. DOI: https://doi.org/10.1042/BJ20071492
15. Ruotsalainen H., Risteli M., Wang C., Wang Y., Karppinen M., Bergmann U., Kvist A.P., Pospiech H., Herzig K.H., Myllylä R. The activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3) regulate the amount and oligo-merization status of adiponectin. PLoS ONE. 2012; 7: e50045. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050045
16. Mackay F., Schneider P. TACI, an enigmatic BAFF/APRIL receptor, with new unappreciated biochemical and biological proper-
ties. Cytokine Growth Factor Rev. 2008; 19: 263-76. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cytogfr.2008.04.006
17. Locksley R.M., Killeen N., Lenardo M.J. The TNF and TNF receptor superfamilies. Cell. 2001; 104: 487-501. DOI: https://doi. org/10.1016/S0092-8674(01)00237-9
18. Dostert C., Grusdat M., Letellier E., Brenner D. The TNF family of ligands and receptors: communication modules in the immune system and beyond. Physiol. Rev. 2019; 99: 115-60. DOI: https://doi. org/10.1152/physrev. 00045.2017
19. Schneider P., Holler N., Bodmer J.-L., Hahne M., Frei K., Fontana A., Tschopp J. Conversion of membrane-bound Fas(CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity. J Exp Med. 1998; 187: 1205-13. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.187.8.1205
20. Cui D., Wang S., Chen Y., Tong J., Ma J., Tang L., Yang X., Shi Y., Tian J., Lu L., Xu H. An isoleucine-zipper motif enhances costi-mulation of human soluble trimeric GITR ligand. Cell Mol Immunol. 2010; 7: 316-22. DOI: https://doi.org/10.1038/cmi.2010.7
21. Han J.H., Moon A.R., Chang J.H., Bae J., Choi J.M., Lee S.H., et al. Potentiation of TRAIL killing activity by multimerization through isoleucine zipper hexamerization motif. BMB Reports. 2016; 49: 282-7. DOI: https://doi.org/10.5483/BMBRep.2016.49.5.245
22. Holler N., Tardivel A., Kovacsovics-Bankowski M., Hertig S., Gaide O., Martinon F., Tinel A., Deperthes D., Calderara S., Schul-thess T., Engel J., Schneider P., Tschopp J. Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex. Mol Cell Biol. 2003; 23: 1428-40. DOI: https://doi. org/10.1128/MCB.23.4.1428-1440.2003
23. Morris N.P., Peters C., Montler R., Hu H.-M., Curti B.D., Urba W.J., Weinberg A.D. Development and characterization of recombinant human Fc:OX40L fusion protein linked via a coiled-coil trimeri-zation domain. Mol Immunol. 2007; 44: 3112-21. DOI: https://doi. org/10.1016/j.molimm.2007.02.004
24. Holler N., Kataoka T., Bodmer J.-L., Romero P., Romero J., Deperthes D., Engel J., Tschopp J., Schneider P. Development of improved soluble inhibitors of FasL and CD40L based on oligomerized receptors. J Immunol Methods. 2000; 237: 159-73. DOI: https://doi. org/10.1016/S0022-1759(99)00239-2
25. Dadson K., Liu Y., Sweeney G. Adiponectin Action: a combination of endocrine and autocrine/paracrine effects. Front Endocrin. 2011; 2. DOI: https://doi.org/10.3389/fendo.2011.00062
26. Zost S.J., Gilchuk P., Chen R.E., Case J.B., Reidy J.X., Trivet-te A., Nargi R.S., Sutton R.E., Suryadevara N., Chen E.C., Binsh-tein E., Shrihari S., Ostrowski M., Chu H.Y., Didier J.E., MacRenaris K.W., Jones T., Day S., Myers L., Eun-Hyung Lee F., Nguyen D.C., Sanz I., Martinez D.R., Rothlauf P.W., Bloyet L.M., Whelan S.P.J., Baric R.S., Thackray L.B., Diamond M.S., Carnahan R.H., Crowe J.E. Rapid isolation and profiling of a diverse panel of human monoclonal antibodies targeting the SARS-CoV-2 spike protein. Nat Med. 2020; 26: 1422-7. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-0998-x
27. Sokal A., Barba-Spaeth G., Hunault L., Fernández I., Broke-ta M., Meola A., Fourati S., Azzaoui I., Vandenberghe A., Lagouge-Roussey P., Broutin M., Roeser A., Bouvier-Alias M, Crickx E., Languil-le L., Fournier M., Michel M., Godeau B., Gallien S., Melica G., Nguyen Y., Canoui-Poitrine F., Pirenne F., Megret J., Pawlotsky J.M., Filla-treau S., Reynaud C.A., Weill J.C., Rey F.A., Bruhns P., Mahévas M., Chappert P. SARS-CoV-2 Omicron BA.1 breakthrough infection drives late remodeling of the memory B cell repertoire in vaccinated individuals. Immunity. 2023; 56 (9): 2137-51.e7. DOI: https://doi. org/10.1016/j.immuni.2023.07.007
28. Kotaki R., Adachi Y., Moriyama S., Onodera T., Fukushi S., Nagakura T., Tonouchi K., Terahara K., Sun L., Takano T., Nishiyama A., Shinkai M., Oba K., Nakamura-Uchiyama F., Shimizu H., Suzuki T., Matsumura T., Isogawa M., Takahashi Y. SARS-CoV-2 Omicron-neutra-lizing memory B cells are elicited by two doses of BNT162b2 mRNA vaccine. Sci Immunol. 2022; 7: eabn8590. DOI: https://doi.org/10.1126/ sciimmunol.abn8590
Сведения об авторах
Бязрова Мария Георгиевна - науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; аспирант каф. иммунологии биол. факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова; ассистент каф. иммунологии ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9858-7596
Сухова Мария Михайловна - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; аспирант каф. иммунологии биол. факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4572-1878
Михайлов Артем Андреевич - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент каф. иммунологии биологического факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8356-8077
Прилипов Алексей Геннадьевич - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной генетики ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8755-1419
Филатов Александр Васильевич - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии биологического факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Authors' information
Maria G. Byazrova - Researcher of the Immunoche-mistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; PhD student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU; Assistant of Immunology Chair, RUDN named after P. Lumumba of the MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9858-7596
Maria M. Sukhova - Technician at the Lab. of Immuno-chemistry, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; PhD Student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4572-1878
Artem A. Mikhailov - Technician at the Immunoche-mistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8356-8077
Alexei G. Prilipov - Dr. Sci., PhD, Head of the Molecular Genetics Lab., N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8755-1419
Alexander V. Filatov - Dr. Sci., PhD, Prof., Head of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
