CC BY
30
© Коллектив авторов, 2023
Бязрова М.Г.1-3, Михайлов А. А.1' 2, Сухова М.М.1 2, Бардина М.В.4 5, Шмидт А.А.4,5, Прилипов А.Г.1,6, Филатов А.В.12
Трансдукция В-лимфоцитов человека с помощью аденоассоциированных вирусов различных серотипов
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», 119234, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы» (РУДН) Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация
4.Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук, Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, 119334, г. Москва, Российская Федерация
5 OOO «Марлин Биотех», 354340, г. Москва, Российская Федерация
6 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) являются ведущей платформой для генной терапии при лечении различных заболеваний человека. Доставка генов в В-лимфоциты человека с использованием AAV-векторов представляет значительные сложности, так как В-клетки устойчивы к инфекции AAV. Проводятся исследования с целью поиска эффективных методов для преодоления этой проблемы.
Цель исследования - разработка метода доставки генов с помощью AAV-векторов в В-лимфоциты человека in vitro.
Материал и методы. В-лимфоциты выделяли из периферической крови здоровых доноров путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина с дальнейшим обогащением методом отрицательной селекции с использованием магнитных микросфер. В-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью смеси лимфокинов, в состав которой входили ИЛ-2, ИЛ-4, BAFF, ИЛ-21 и мультимеризованный CD40L (mCD40L). Через 24 ч стимулированные В-лимфоциты инфицировали рекомбинантным AAV, несущим репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Были протестированы 3 серотипа: AAV2, AAV6 и AAV-DJ. Через 48 ч после инфекции определяли долю трансдуцированных В-лимфоцитов. Через 7 дней методом проточной цитометрии определяли количество и фенотип стимулированных В-лимфоцитов, а с помощью имму-ноферментного анализа оценивали секрецию Ig в супернатант культивируемых клеток. В качестве контроля трансдукции использовали клетки HEK293T.
Результаты. Серотипы AAV2, AAV6 и AAV-DJ эффективно и в равной степени транс-дуцировали клетки HEK293T. Нестимулированные В-лимфоциты были резистентными к действию AAV и не обнаруживали заметной флуоресценции репортерного белка GFP. В-лимфоциты, стимулированные смесью, содержащей ИЛ-2, ИЛ-4, BAFF, ИЛ-21 и mCD40L, были эффективно трансдуцированы с помощью AAV2, AAV6 и AAV-DJ. Наиболее высокую экспрессию трансгена обеспечивал серотип AAV6. Трансдуциро-ванные В-лимфоциты продолжали активно пролиферировать, приобретали фенотип плазмабластов и секретировали Ig в супернатант. По своим функциональным свойствам трансдуцированные В-лимфоциты не отличались от контрольных клеток, которые не подвергались инфекции. Таким образом, в умеренных дозах AAV-инфекция не оказывала токсического действия на В-лимфоциты и не влияла на физиологические параметры В-клеток. Эффективная трансдукция наблюдалась в обеих субпопуляциях В-клеток памяти - как с переключенным (IgG+CD27+), так и непереключенным (IgM+CD27+) синтезом Ig.
Заключение. Стимуляция с помощью смеси лимфокинов имеет решающее значение для эффективного переноса трансгена в В-лимфоциты человека с помощью векторов rAAV. Для трансдукции В-лимфоцитов наиболее эффективен серотип AAV6.
Для корреспонденции
Филатов Александр Васильевич -доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Ключевые слова: аденоассоциированный вирус (rAAV); серотипы AAV; перенос генов; В-лимфоциты; транс-дукция; GFP; стимуляция В-лимфоцитов
Статья получена 15.06.2023. Принята в печать 04.08.2023.
Для цитирования: Бязрова М.Г., Михайлов А.А., Сухова М.М., Бардина М.В., Шмидт А.А., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Трансдукция В-лимфоцитов человека с помощью аденоассоциированных вирусов различных се-ротипов. Иммунология. 2023; 44 (4): 443-454. DOI: https://www.doi.Org//10.33029/0206-4952-2023-44-4-443-454
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда № 23-15-00289 (https://rscf.ru/project/23-15-00289/).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Сбор и обработка материала - Бязрова М.Г., Михайлов А.А., Сухова М.М., Шмидт А.А.; написание текста, редактирование - Бардина М.В., Филатов А.В.; окончательный вариант и целостность текста - Прилипов А.Г., Филатов А.В.
Byazrova M.G.1-3, Mikhailov A.A.1 2, Sukhova M.M.1 2, Bardina M.V.4 5, Shmidt А.А.4' 5, Prilipov A.G.1 6, Filatov A.V.1 2
Transduction of human B-lymphocytes using adeno-associated viruses of various serotypes
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 M.V. Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow, Russian Federation
3 Peoples' Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation
4 Institute of Gene Biology of the Russian Academy of Sciences, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 119334, Moscow, Russian Federation
5 Marlin Biotech LLC, 354340, Moscow, Russian Federation
6 Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Adeno-associated virus (AAV) vectors are the leading platform for gene therapy in the treatment of various human diseases. Gene delivery to human B-lymphocytes using AAV vectors presents significant challenges, as they are resistant to AAV infection. Researches is being carried out to find effective methods to overcome this problem.
The aim of the study was to develop a method for delivering genes using AAV vectors to human B-lymphocytes in vitro.
Material and methods. B-lymphocytes were isolated from the peripheral blood of healthy donors by Ficoll-Verografin density gradient centrifugation with further enrichment by negative selection using magnetic beads. B-lymphocytes were stimulated in vitro with a lymphokine mixture containing IL-2, IL-4, BAFF, IL-21 and multimerized CD40L (mCD40L). After 24 hours, stimulated B-lymphocytes were infected with recombinant AAV carrying the green fluorescent protein reporter gene (GFP). 3 serotypes AAV2, AAV6 and AAV-DJ have been tested. 48 hours after infection, the proportion of transduced B-lymphocytes was determined. After 7 days, the number and phenotype of stimulated B-lymphocytes were determined by flow cytometry, and the secretion of Ig into the supernatant of cultured cells was assessed using the enzyme-linked immunosorbent assay. HEK293T cells were used as a transduction control.
Results. Serotypes AAV2, AAV6 and AAV-DJ efficiently and equally transduced HEK293T cells. Unstimulated B-lymphocytes were resistant to the action of AAV and did not show a noticeable fluorescence of the GFP reporter protein. B-lymphocytes stimulated with a mixture of lymphokines, which included IL-2, IL-4, BAFF, IL-21 and mCD40L, were efficiently transduced with AAV2, AAV6 and AAV-DJ. The highest expression of the transgene was provided by the AAV6 serotype. The transduced B-lymphocytes continued to actively proliferate, acquired the plasmablast phenotype and secreted Ig into the supernatant. In terms of their functional properties, the transduced B-lymphocytes did not differ from the control cells that were not exposed to infection. Thus, at moderate doses, AAV infection did not have a toxic effect on B-lymphocytes and did not affect the physiological parameters of B-cells. Efficient transduction was observed in both subpopulations of memory B-cells, both with switched (IgG+CD27+) and non-switched (IgM+CD27+) Ig synthesis.
For correspondence
Alexander V. Filatov -Dr.Sci., PhD, Professor, Head of the Immunochemistry Laboratory, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Conclusion. Stimulation with a mixture of lymphokines is critical for efficient transgene transfer into human B-lymphocytes using rAAV vectors. In the transduction of B-lymphocytes the AAV6 serotype is the most effective.
Keywords: adeno-associated virus (rAAV); AAV serotypes; gene transfer; B-lymphocytes; transduction; GFP; B lymphocyte stimulation
Received 15.06.2023. Accepted 04.08.2023.
For citation: Byazrova M.G., Mikhailov A.A., Sukhova M.M., Bardina M.V., Shmidt A.A., Prilipov A.G., Filatov A.V. Transduction of human B-lymphocytes using adeno-associated viruses of various serotypes. Immunologiya. 2023; 43 (4): 443-54. DOI: https://www.doi.org/710.33029/0206-4952-2023-44-4-443-454 (in Russian)
Funding. The study was supported by the grant of Russian Science Foundation (RSF) No. 23-15-00289 (https://rscf. ru/project/23-15-00289/).
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Collection and processing of material - Byazrova M.G., Mikhailov A.A., Sukhova M.M., Shmidt A.A.; text writing, editing - Bardina M.V., Filatov A.V.; the final version of the text - Prilipov A.G., Filatov A.V
Введение
Последние годы были отмечены значительными успехами в области генной терапии, которая стала использоваться для лечения как генетических, так и приобретенных заболеваний. Примером успешного применения генной терапии при лечении иммуноде-фицитных состояний является препарат «Стримвелис» (Strimvelis, GlaxoSmithKline, Великобритания), который показал хорошие результаты при лечении врожденной недостаточности аденозиндезаминазы [1].
Дальнейшее развитие генной терапии в значительной степени сдерживается проблемами в эффективной доставке трансгенов. Для клеток человека с этой целью наиболее часто используются вирусные векторы, среди которых наибольшее распространение получили конструкции на основе ретровирусов, лентиви-русов, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов. Эти вирусы способны эффективно заражать клетки-мишени и доставлять в них целевые гены. Каждая из отмеченных платформ имеет свои преимущества, но не лишена недостатков.
В последние годы значительную популярность получили векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) [2]. AAV стали ведущей платформой для доставки генов при лечении некоторых заболеваний человека. Наиболее известным примером является использование AAV для лечения наследственного заболевания спинальной мышечной атрофии с помощью препарата «Золгенсма» [3], который эффективно переносит в нейроны функциональную копию гена SMN1. К настоящему времени более 200 препаратов на основе AAV проходят клинические испытания и вскоре они могут пополнить рынок биотехнологических лекарственных препаратов. К преимуществам AAV относится то, что они биологически безопасны и обеспечивают высокую экспрессию трансгена. К недостаткам AAV можно отнести их невысокую емкость в отношении трансгена.
Клетки различных тканей отличаются по восприимчивости к инфекции AAV. Тропизм AAV в отношении
определенных клеток-мишеней в основном определяется серотипом вируса. К настоящему времени открыто 12 основных серотипов AAV, которые отличаются по тропизму к клеткам различных тканей. Определены серотипы, которые наилучшим образом подходят для трансдукции клеток мышц, почек, нейронов, пигментного эпителия сетчатки и некоторых других типов клеток.
Значительно меньше известно о трансгенезе с помощью AAV в В-клетки человека. В ранних работах утверждалось, что В-лимфоциты резистентны к AAV-инфекции, однако недавно было показано, что В-клетки, активированные вирусом Эпштейна-Барр, приобретают восприимчивость к инфекции AAV некоторых серотипов [4]. Имеются также другие сообщения, которые показывают, что восприимчивость к AAV-инфекции повышается при активации В-лимфо-цитов [5].
В настоящей работе было проведено сравнение эффективности инфекции В-лимфоцитов с помощью AAV различных серотипов. Для тестирования нами были выбраны 3 серотипа: 2 природных варианта (AAV2 и AAV6) и один генно-инженерный вариант (AAV-DJ). AAV2 можно охарактеризовать как вирус с медленной и низкой экспрессией трансгена, в то время как AAV6 относится к группе вирусов с быстрой по кинетике и средней по интенсивности экспрессии трансгена [6]. Выбранные серотипы отличаются также по тропизму к различным тканям [7]. Мы подобрали условия AAV-опосредованной доставки модельного трансгена GFP в В-лимфоциты человека in vitro. Мы показали, что трансдукции подвержены только активированные, но не покоящиеся В-лимфоциты.
Материал и методы
Доноры. В исследуемую группу были включены 5 здоровых добровольцев (2 женщины и 3 мужчин, средний возраст - 25 лет, в диапазоне от 21 до 27 лет). Исследование было выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассо-
циации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого». Письменное информированное согласие было получено от каждого участника исследования перед выполнением каких-либо процедур исследования. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Этическим комитетом ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (№ 3-1, 11 марта 2020 г.).
Выделение лимфоцитов. Образцы цельной крови собирали в гепаринизированные вакуумные пробирки (Sarstedt, Cat. No. 04.1927, Германия). Мононукле-арные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (р = 1,077 г/см3). B-лимфоциты обогащали методом отрицательной иммуномагнитной сепарации с использованием набора Dynabeads Untouched human B cell kit (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 11351D, США). Чистота выделенных В-лимфоцитов составляла > 98 %. Субпопуляции В-клеток памяти с переключенным (IgG+CD27+) и непереключенным (IgM+CD27+) синтезом Ig выделяли с помощью проточного сортировщика клеток SH800S (Sony Biotechnology, США) как описано ранее [8].
Стимуляция лимфоцитов in vitro. Выделенные В-лимфоциты культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (все «ПанЭко», Россия). Клетки стимулировали смесью лимфокинов, состоявшей из 10 нг/мл ИЛ-21, 10 нг/мл ИЛ-4, 50 нг/мл ИЛ-2, 10 нг/мл BAFF и 10 нг/мл mCD40L (Peprotech, США) при 37 °C в 5 % CO2 [9].
Наработка и очистка вирусов AAV. Конструкция вектора AAV-eGFP подробно была описана ранее [10]. Векторная конструкция spAAV/eGFP, содержавшая ген, кодирующий улучшенный зеленый флуоресцентный белок GFP под контролем промотора цитомегаловируса, и ген устойчивости к ампициллину, была получена из AddGene (#49055, США).
Рекомбинантные AAV получали с помощью системы AAV Helper-Free System (Agilent, США) в культуре клеток HEK293T. Вирусы различных серотипов нарабатывали с использованием плазмидных конструкций, кодирующих белки Rep и Cap, - pAAV-RC2 (Agilent, США), pAAV-RC6 и pAAV-DJ (Cell Biolabs, США). Вирусные частицы очищали с помощью центрифугирования в градиенте плотности йодиксанола. Титр вирусных частиц на всех стадиях продукции, очистки и конечного концентрированного препарата контролировали методом количественной полимеразной цепной реакции. Отсутствие белковых примесей подтверждали электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием Кумасси (Coomassie Brilliant blue, G250, Helicon, Россия). Титр AAV-eGFP составлял от 1 до 5 • 1010 копий/мл.
Вирусная трансдукция. Клетки-мишени HEK293T или выделенные стимулированные В-лимфоциты высевали в 96-луночные планшеты по 15 000 и 2 500 клеток
на лунку соответственно. После 24 ч культивирования при 37 °C в 5 % CO2 к клеткам добавляли очищенный препарат вируса из расчета 1 • 105 геномных копий на клетку. После инфекции клетки инкубировали при 37 °C в 5 % CO2 в течение 48 ч, после чего анализировали экспрессию GFP или культивировали 7 дней и анализировали пролиферацию и фенотип клеток, а также секрецию Ig.
Проточная цитометрия. Для окрашивания лимфоцитов использовали следующие конъюгаты антител с флуорохромами: CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), против человеческого IgG-FITC (клон CH1) и IgM-FITC (клон MA2). Указанные антитела ранее были получены в нашей лаборатории [11]. Окрашивание производили в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки 2 раза отмывали в физиологическом растворе, забу-ференном фосфатами. Перед измерением клеточную суспензию пропускали через сито с диаметром пор 40 мкм. Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного двумя диодными лазерами 488 и 561 нм. Обработку цитофлуоримет-рических данных проводили при помощи программы FlowJo (Becton Dickinson, США).
Определение Ig методом иммуноферментного анализа (ИФА). Антитела против человеческого IgG (клон G4A5) и IgM (клон CH2) в концентрации 10 мкг/мл сорбировали в лунках 96-луночных планшетов (Greiner, Германия), внося в лунку по 100 мкл раствора антител в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ). Планшеты инкубировали ночь при 4 °С, после чего трижды отмывали буфером ФСБ)/ Tween-20. Лунки блокировали добавлением ФСБ, содержавшего 1 % бычьего сывороточного альбумина, инкубировали в течение часа и 3 раза отмывали c помощью ФСБ)/Tween-20. Образцы культуральных суперна-тантов серийно разводили от 1 : 2 до 1 : 200 раз в буфере для образцов. Планшеты инкубировали с образцами в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки планшеты дополнительно инкубировали в течение 1 ч со вторичными антителами против IgG или IgM человека, конъюгированными с пероксидазой хрена. Далее планшеты промывали 7 раз и проявляли в течение 10 мин с помощью 100 мкл раствора хромогена TMB (Хема, Россия). Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 M H2SO4 и оптическую плотность при 450 нм измеряли с помощью фотометра BioRad iMark Microplate Absorbance Reader (BioRad, США). Данные анализировали с помощью программы Zemfira 4.0 (BioRad, США).
Статистическая обработка. Статистическая обработка данных проведена с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версия 8.4.3 (GraphPad, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью критерия Вилкоксона. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p < 0,05. Данные на гистограммах показывают медиану.
Результаты
Трансдукция клеток HEK293T с помощью различных серотипов AAV
Для того чтобы оценить качество полученных препаратов AAV для начала мы проверили их способность трансдуцировать клетки HEK293T. Эти клетки легко поддаются как трансфекции, так и трансдукции, поэтому они являются удобным объектом для оценки инфекционной активности препаратов AAV.
Клетки HEK293T инфицировали вирусами в дозе 50 • 1010 частиц/мл и наблюдалась интенсивная зеленая флуоресценция клеток (при множественности инфекции 106 геномных копий на клетку). Эффективность инфекции оценивали по уровню экспрессии репортерного гена GFP. Флуоресценция GFP хорошо детектировалась на 2-й день после инфекции (рис. 1А). Практически все клетки приобретали зеленую флуоресценцию (рис. 1Б). При увеличении дозы вируса в диапазоне от 0,2 до 108 • 1010 частиц/мл наблюдалось дозозависимое увеличение экспрессии белка GFP. Все 3 серотипа (AAV2, AAV6 и AAV-DJ) обладали примерно равными уровнями трансдукции (рис. 1 В).
Проведенные эксперименты продемонстрировали, что полученные препараты AAV-GFP на контрольных клетках HEK293T обладают хорошей инфицирующей активностью, трансдуцируют основную часть клеток и обеспечивают высокий уровень экспрессии гена GFP. Таким образом, полученные препараты AAV-GFP можно использовать для изучения трансдукции целевых клеток, которыми в нашем исследовании являлись В-лимфоциты крови.
Трансдукция В-лимфоцитов с помощью различных серотипов AAV
Из периферической крови здоровых доноров выделяли мононуклеарные клетки, далее методом магнитной сепарации обогащали фракцию мононуклеарных клеток В-лимфоцитами. Свежевыделенные В-лимфо-циты, полученные от 5 разных здоровых доноров, были стимулированы в бесфидерной системе и на 2-й день были инфицированы векторами rAAV, полученными из трех различных серотипов (AAV2, AAV6 и AAV-DJ).
При дозе вирусов 30 • 1010 частиц/мл у большей части В-лимфоцитов наблюдалась интенсивная зеленая флуоресценция. Флуоресценция появлялась на 2-й день и достигала максимума на 7-й день культивирования (рис. 2А). Интересно, что нестимулированные В-лимфо-циты не трансдуцировались под действием вируса и в них не обнаруживалось заметной флуоресценции (данные не приведены). У стимулированных В-лимфоцитов наблюдалась характерная морфология активированных В-лимфоцитов. В процессе активации они приобретали неправильную форму с псевдоподиями, клетки вступали в гомотипическую адгезию и образовывались плотные агрегаты (рис. 2Б). Кроме того, клетки приобретали подвижность. Экспрессия трансгена имела выраженный дозозависимый характер от количества вируса, использованного для трансдукции. Детекти-
руемое количество GFP+-клеток наблюдалось при дозе вируса 9 • 1010 частиц/мл. Максимальная интенсивность флуоресценции достигалась при дозе вируса 81 • 1010 частиц/мл. При этом серотип AAV6 обеспечивал более чем 5-кратный уровень флуоресценции по сравнению с серотипами AAV2 и AAV-DJ. Жизнеспособность В-лимфоцитов не зависела от дозы AAV6 и немного снижалась при максимальных дозах AAV2 и AAV-DJ (рис. 2Г). Как было отмечено ранее [8], при ИЛ-21/ CD40L-стимуляции значительная часть В-лимфоцитов дифференцируется и приобретает фенотип плазма-бластов. В условиях вирусной трансдукции В-лимфо-циты сохраняли способность к дифференцировке в плаз-мабласты. При дозе вируса 81 • 1010 частиц/мл > 30 % В-лимфоцитов приобретало фенотип CD27+CD38+ (рис. 2Д).
Функциональная характеристика В-лимфоцитов, трансдуцированных с помощью AAV серотипа 6 (AAV6)
Для более полной характеристики влияния AAV-инфекции на функциональные характеристики В-лимфоцитов дальнейшие эксперименты были проведены с субпопуляциями В-клеток памяти: В-лимфоциты с переключенным (IgG+CD27+) и непереключенным (IgM+CD27+) фенотипом. Эти субпопуляции выделяли из общего пула В-лимфоцитов с помощью проточного сортировщика. Далее каждую субпопуляцию стимулировали in vitro смесью для активации В-клеток, на 2-й день культивирования добавляли AAV-GFP и на 7-й день анализировали клетки и культуральные суперна-танты. Поскольку в предварительных опытах AAV6 показал наиболее высокую трансдуцирующую активность, в последующих экспериментах мы использовали только AAV6.
В опытных образцах (в условиях инфекции вирусом AAV6-GFP) стимуляция смесью лимфокинов приводила к 5- и 4-кратному увеличению количества В-клеток в субпопуляциях IgG+CD27+ и IgM+CD27+ соответственно (рис. 3A, верхний ряд). В отрицательном контроле (без добавления вируса) соответствующие индексы стимуляции в среднем равнялись 6 и 3 (рис. 3A, верхний ряд). Сравнение стимуляции в присутствии вируса и без его добавления показало отсутствие статистически значимой разницы между индексами стимуляции в присутствии и без AAV (n = 5; p = 0,44, p = 0,07 для IgG+CD27+- и IgM+CD27+-субпопуляций соответственно).
Другим проявлением стимуляции В-лимфоцитов являлась дифференцировка B-клеток памяти в плазма-бласты с фенотипом CD19+CD27+CD38+. В опытных образцах с добавлением вируса в субпопуляциях IgG+CD27+ и IgM+CD27+ 70 и 35 % клеток соответственно приобретали фенотип плазмабластов (рис. 3Б, средний ряд). Примерно такие же уровни плазмаблас-тов наблюдались в отрицательном контроле (n = 5; p = 0,81, p > 0,99 для IgG+CD27+- и IgM+CD27+-субпопу-ляций соответственно).
Э
т
i
100 80 60 40 20 0
100 80 60 40 20 0
100 80 60 40 20 0
Э
AAV6-GFP
GFP
э
104
106
х104
+
Рч Рч
о
400
300
200
100
AAV2-GFP
ш*
Л
AAV-DJ-GFP
_ А 4
тмш A v
шшлйгчт ^
А
• * т
w л ш ИПВЯВ1
HEK293
AAV2 AAV6 AAV-DJ
0,7 1,4 2,8 5,6 11,3 22,5 45 90 180 360 AAV, количество геномных копий на клетку
х104
0
0
Рис. 1. Трансдукция клеток HEK293T с помощью различных серотипов AAV
А — экспрессия GFP на клетках HEK293T, трансдуцированных с помощью AAV-GFP серотипов AAV6, AAV2 и AAV-DJ; Б — флуоресцентная микроскопия клеток HEK293T, трансдуцированных с помощью AAV6, AAV2 и AAV-DJ; В — интенсивность флуоресценции клеток HEK293T, трансдуцированных с помощью AAV6, AAV2 и AAV-DJ, в зависимости от дозы вируса. Клетки HEK293T высевали по 15 000 клеток на лунку.
100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0
100 80 60 40 20 0
40
3 20-
10 -
GFP
50 -,
Э
AAV6-GFP
104
106
Э
104
106
-Щ- AAV2 ^^
AAV2 AAV6 AAV-DJ
2 6 18 54 162
AAV, количество геномных копий на клетку
х105
щ я
+ а.
Рч
О
х104 60 -,
40 -
20 -
2 6 18 54 162
AAV, количество геномных копий на клетку
45 -,
Q 40-
U
D
и
+
г-
2 D
и
35 -
30 -
25
AAV2 AAV6 ■ AAV-DJ
х105
AAV2 AAV6 ■ AAV-DJ
2 6 18 54 162
AAV, количество геномных копий на клетку
х105
Рис. 2. Трансдукция В-лимфоцитов с помощью различных серотипов AAV
А — экспрессия GFP на В-лимфоцитах, трансдуцированных с помощью AAV-GFP серотипов AAV6, AAV2 и AAV-DJ; Б — флуоресцентная микроскопия В-лимфоцитов, трансдуцированных с помощью AAV6-GFP. Верхняя фотография — флуоресценция клеток, нижняя фотография — изображение клеток в светлом поле. Изображения получены с помощью инвертированного микроскопа Olympus 1X71, объектив х60; В — кривые дозозависимости интенсивности флуоресценции В-лимфоцитов, трансдуцированных с помощью AAV6, AAV2 и AAV-DJ; Г — доля живых клеток в культуре В-лимфоцитов после трансдукции с помощью AAV-GFP в зависимости от дозы вируса; Д — доля плазмабластов в культуре В-лимфоцитов после трансдукции с помощью AAV-GFP в зависимости от дозы вируса. Пунктирные линии показывают количество живых клеток и % плазмабластов в контрольной культуре без добавления AAV. Стимулированные В-лимфоциты высевали по 2500 клеток на лунку.
0
0
0
и
* 30-
0
При стимуляции В-лимфоциты приобретали способность секретировать IgG и IgM. В опытных образцах на 7-й день культивирования в культуральных суперна-тантах IgG+CD27+- и IgM+CD27+-клеток в среднем регистрировался уровень 1116 нг/мл IgG и 687 нг/мл IgM соответственно (рис. 3В, нижний ряд). В контрольных образцах уровень секреции IgG и IgM практически не отличался (n = 4, p = 0,25, p = 0 ,25 для IgG+CD27+-и IgM+CD27+-субпопуляций соответственно). Вполне ожидаемо мы не обнаружили заметной секреции в куль-туральный супернатант IgM и IgG в образцах, содержавших клетки IgG+CD27+ и IgM+CD27+ соответственно (результаты не показаны).
Полученные результаты продемонстрировали, что вирусная инфекция с помощью AAV6 заметным образом не влияла на такие функциональные характеристики стимулированных В-лимфоцитов, как пролиферация, дифференцировка в плазмабласты и секреция Ig.
Обсуждение
Доставка трансгенов с помощью AAV является перспективным направлением в инженерии В-лимфо-цитов человека [12]. Широкому использованию этого подхода препятствует высокая резистентность покоящихся В-лимфоцитов к AAV-инфекции. Эффективность AAV-трансдукции зависит от таких факторов, как наличие необходимых рецепторов на клеточной поверхности, эндоцитоз и внутриклеточный процессинг, а также синтез комплементарной цепи ДНК [13].
Считается, что первичными рецепторами для AAV являются гепарансульфатпротеогликаны (HSPGs). После прикрепления к клетке AAV интернализуется путем клатрин-опосредованного эндоцитоза с участием молекул интегринов. Роль корецептора при проникновении AAV в клетки-мишени выполняет молекула рецептора 1 фактора роста фибробластов (FGFR-1). Клетки, которые не экспрессируют ни HSPG, ни FGFR-1, не способны связывать AAV и устойчивы к инфекции AAV [14].
Тканевый тропизм AAV определяется с одной стороны экспрессией определенных рецепторов, а с другой стороны - разновидностью капсида AAV [15]. За последние десятилетия были идентифицированы 12 серо-типов AAV и более 100 их вариантов. Серотипы AAV2, AAV3, AAV5, AAV6 обнаруживаются в клетках человека, а серотипы AAV1, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12 встречаются в клетках нечеловекообразных приматов [16]. В дополнении к природным серотипам генно-инженерными методами были созданы искусственные AAV, которые несут химерные капсиды [17]. Такие гибридные AAV обладают более эффективной трансдукцией целевых тканей и ограниченным тропизмом по отношению к посторонним клеткам. В частности, к химерным векторам принадлежит серотип AAV-DJ с капсидом, который получен сочетанием восьми природных серотипов [18].
Для сравнительного исследования нами были выбраны 3 серотипа (AAV2, AAV6 и AAV-DJ), которые
существенно отличались по тканевому тропизму. Если на клетках HEK293T все 3 тестированных серотипа (AAV2, AAV6 и AAV-DJ) обладали примерно равными уровнями трансдукции, то на В-лимфоцитах AAV6 обеспечивал более эффективную трансдукцию, чем серотипы AAV2 и AAV-DJ.
Одним из решающих условий трансдукции клеток-мишеней является их пролиферация. Так, для В-лимфо-цитов при хроническом лимфолейкозе было показано, что увеличение до 5 % доли клеток, находящихся в S-фазе, приводило к возрастанию эффективности транс-дукции до 97 % [14]. Можно предположить, что для эффективной AAV-трансдукции нормальных В-лимфо-цитов необходимо перевести их из покоящегося состояния в пролиферирующее. Нами была установлена основная закономерность - эффективная трансдукция В-лимфоцитов возможна только после их стимуляции. В качестве стимулирующего агента мы использовали смесь лимфокинов, состоявшую из ИЛ-2, ИЛ-4, BAFF, ИЛ-21 и мультимеризованного CD40L. Не исключено, что другие стимулирующие агенты, например ИЛ-2, ИЛ-6, CpG-содержащие олигонуклеотиды (CpG-ODNs) [5], лиганды Толл-подобных рецепторов TLR7/ TLR8 [19], антитела против IgM [4], наконец, бактерии Staphylococcus aureus, несущие поверхностный ProtA, а также другие факторы могут приводить В-лимфоциты в состояние восприимчивости к AAV-инфекции. Интересно отметить, что активация В-лимфоцитов под действием вируса Эпштейна-Барр также может переводить клетки в состояние чувствительности к AAV [20]. Для стимуляции В-лимфоцитов мы использовали смесь, состоявшую из 5 лимфокинов. Не исключено, что для эффективной AAV-трансдукции достаточно использовать смесь, содержащую меньшее число лимфокинов.
Нами было обнаружено, что в умеренных дозах AAV-инфекция не оказывала токсического действия и не влияла на такие физиологические параметры В-клеток человека, как пролиферация В-клеток памяти, созревание плазмабластов, продукция и секреция Ig. В качестве гена-репортера мы использовали GFP, который характеризуется высоким уровнем экспрессии. Вследствие этого наше исследование имеет некоторое ограничение. Реальные целевые гены могут проявлять свою функциональную активность при более низком уровне экспрессии, соответственно для трансдукции потребуются меньшие дозы AAV.
При AAV-трансдукции трансген не интегрируется в ДНК клетки-хозяина и существует в клеточном ядре в виде эписомы, которая не может независимо реплицироваться. При последовательных делениях клетки эписома со временем элиминируется, а экспрессия трансгена исчезает. Более надежным методом перепрограммирования клетки является интеграция трансгена в геном с использованием гомологичной рекомбинации. Для этого также можно использовать AAV-инфекцию. Сначала с помощью AAV-вектора в клетку доставляют донорскую матрицу с плечами гомологии. Затем под действием дополнительно введенной нуклеазы Cas9
э
50 000 -,
я 40 000 -
S s
30 000 -
20 000 -
« 10 000 -
Медиана
K- AAV6 15 848 13 097
40 000 -,
30 000 -
д 20 000 -
10 000 -
Медиана
K-
8721
AAV6 9849
IgGCD27+
IgMCD27+
пъ
0
0
э
а
и
а
и
а
и
100-,
90-
80-
70-
60-
50
\
Медиана
K- AAV6 73 69,5
а
и
а
и
а
и
80-,
60-
40-
20-
Медиана
K-35
AAV6 35
IgGCD27+
IgMCD27+
пъ
ns
0
Рис. 3. Функциональные характеристики В-клеток памяти с переключенным (IgG+CD27+) и непереключенным (IgM+CD27+) синтезом Ig, стимулированных с помощью смеси для активации В-клеток, при добавлении AAV6-GFP или без добавления вируса (К-) А - количество В-лимфоцитов в культурах клеток на 7-й день стимуляции; Б - доля плазмабластов среди всех В-лимфоцитов; В, Г - секреция IgG или IgM в культуральный супернатант. Пунктирные линии показывают исходное количество клеток в лунках (2500 клеток на лунку).
в цепи ДНК будет образован разрыв, в который может встраиваться трансген. Недавно этот прием с успехом был использован для редактирования генома плазматических клеток [12]. Были получены В-клетки, активно секретирующие фактор IX (FIX) и фактор активации В-клеток (BAFF).
Таким образом, нами были отработаны условия для эффективной трансдукции В-лимфоцитов с помощью AAV. Этот протокол может найти применение при перепрограммировании В-лимфоцитов ex vivo и дальнейшем использовании в клинической практике.
Заключение
Стимулированные В-лимфоциты восприимчивы для трансдукции аденоассоциированными вирусами
■ Литература
1. Shahryari A., Saghaeian Jazi M., Mohammadi S., Razavi Nikoo H., Nazari Z., Hosseini E.S., Burtscher I., Mowla S.J., Lickert H. Development and Clinical Translation of Approved Gene Therapy Products for Genetic Disorders. Front. Genet. 2019; 10: 868. DOI: https://www.doi.org/10.3389/ fgene.2019.00868
2. Wang D., Tai P. W.L., Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat. Rev. Drug. Discov. 2019; 18: 358-78. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9
3. Keeler A.M., Flotte T.R. Recombinant adeno-associated virus gene therapy in Light of Luxturna (and Zolgensma and Glybera): where are we, and how did we get here? Annu. Rev. Virol. 2019; 6: 601-21. DOI: https:// www.doi.org/10.1146/annurev-virology-092818-015530
4. Wendtner C-M., Kofler D., Mayr C., Bund D., Hallek M. The potential of gene transfer into primary B-CLL cells using recombinant virus vectors. Leukemia & Lymphoma. 2004; 45: 897-904. DOI: https://www. doi.org//10.1080/10428190310001638896
5. Theiss H.D., Kofler D.M., BUning H., Aldenhoff A-L., Kaess B., Decker T. et al. Enhancement of gene transfer with recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors into primary B-cell chronic lymphocytic leukemia cells by CpG-oligodeoxynucleotides. Exp. Hematol. 2003; 31: 1223-9. DOI: https://www.doi.org//10.1016/j.exphem.2003.09.010
6. Zincarelli C., Soltys S., Rengo G., Rabinowitz J.E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol. Ther. 2008; 16: 1073-80. DOI: https://www.doi. org//10.1038/mt.2008.76
7. Haery L., Deverman B.E., Matho K.S., Cetin A., Woodard K., Cepko C., Guerin K.I., Rego M.A., Ersing I., Bachle S.M., Kamens J., Fan M. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Front. Neuroanat. 2019; 13: 93. DOI: https://www. doi.org//10.3389/fnana.2019.00093
8. Бязрова М.Г., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Васильева Ю.В., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью HH-21/CD40L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (1): 18-27. DOI: https://www.doi.org/Z10.33029/0206-4952-2020-41-6-00-00
9. Астахова Е.А., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Бязрова М.Г., Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Стимуляции В-клеток в системе HH-21/CD40L в норме и у пациентов с общей вариабельной иммунной недостаточностью. Иммунология. 2021; 41 (6) 631-40. DOI: https://www.doi.org//10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640
10. Лунев Е.А., Шмидт А.А., Васильева С.Г., Савченко И.М., Логинов В.А., Марина В.И., Егорова Т.В., Бардина М.В. Эффек-
■ References
1. Shahryari A., Saghaeian Jazi M., Mohammadi S., Razavi Nikoo H., Nazari Z., Hosseini E.S., Burtscher I., Mowla S.J., Lickert H. Development and Clinical Translation of Approved Gene Therapy Products for Genetic Disorders. Front Genet. 2019; 10: 868. DOI: https://www.doi.org/10.3389/ fgene.2019.00868
серотипов ЛЛУ2, ЛЛУб и ЛЛУ-Б1, из них наиболее эффективен ЛЛУб. Предварительная стимуляция В-лимфоцитов является необходимым условием для последующей трансдукции. Инфекция В-лимфоцитов с помощью ЛЛУб не меняет такие функциональные характеристики В-клеток, как пролиферация, диф-ференцировка в плазмабласты и секреция ЛЛУб можно рассматривать как основу для создания векторов для переноса генов в В-лимфоциты.
Благодарности. Мы благодарим за предоставленное оборудование Центр высокоточного редактирования генома и генетических технологий для биомедицины (ФГБУН ИБГ РАН Минобрнауки России), развиваемый при поддержке Минобрнауки России.
тивная вирусная доставка в нейрональную культуру генетических конструкций для моделирования и генной терапии GNAO1-энцефалопатии. Мол. биол. 2022; 56 (4): 631-40. DOI: 10.31857/ S0026898422040061
11. Лушова А. А., Жеремян Э.А., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Бязрова М.Г., Филатов А.В. Субпопуляции В-лимфоцитов: функции и молекулярные маркеры. Иммунология. 2019; 40 (6) 63-75. DOI: https://www.doi.org//10.24411/0206-4952-2019-16009
12. Hung K.L., Meitlis I., Hale M., Chen C-Y., Singh S., Jackson S.W., Miao C.H., Khan I.F., Rawlings D.J., James R.G. Engineering Protein-Secreting Plasma Cells by Homology-Directed Repair in Primary Human B Cells. Mol. Ther. 2018; 26(2): 456-67. DOI: https://www.doi.org/10.1016/ j.ymthe.2017.11.012
13. Wu Z., Asokan A., Samulski R.J. Adeno-associated virus sero-types: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 2006; 14: 316-27. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.ymthe.2006.05.009
14. Wendtner C-M., Kofler D.M., Theiss H.D., Kurzeder C., Buhmann R., Schweighofer C. et al. Efficient gene transfer of CD40 ligand into primary B-CLL cells using recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Blood. 2002; 100: 1655-61. DOI: https://www.doi.org/10.1182/blood. V100.5.1655.h81702001655_1655_1661
15. Vandenberghe L.H., Wilson J.M., Gao G. Tailoring the AAV vector capsid for gene therapy. Gene Ther. 2009; 16: 311-9. DOI: https://www. doi.org/10.1038/gt.2008.170
16. Gao G., Vandenberghe L.H., Alvira M.R., Lu Y., Calcedo R., Zhou X. et al. Clades of adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J. Virol. 2004; 78: 6381-8. DOI: https://www.doi. org/10.1128/JVI.78.12.6381-6388.2004
17. Hauck B., Chen L., Xiao W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Mol. Ther. 2003; 7: 419-25. DOI: https://www.doi.org/10.1016/S1525-0016(03)00012-1
18. Grimm D., Lee J.S., Wang L., Desai T., Akache B., Storm T.A., Kay M.A. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multi-species interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 2008; 82 (12): 5887-911. DOI: https://www.doi.org/10.1128/JVI.00254-08
19. Lanzavecchia A. Dissecting human antibody responses: useful, basic and surprising findings. EMBO Mol. Med. 2018; 10: e8879. DOI: https://www.doi.org/10.15252/emmm.201808879
20. Wendtner C-M., Kofler D., Mayr C., Bund D., Hallek M. The potential of gene transfer into primary b-cll cells using recombinant virus vectors. Leukemia & Lymphoma. 2004; 45: 897-904. DOI: https://www. doi.org/10.1080/10428190310001638896
2. Wang D., Tai P.W.L., Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019; 18: 358-78. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9
3. Keeler A.M., Flotte T.R. Recombinant adeno-associated virus gene therapy in Light of Luxturna (and Zolgensma and Glybera): where are we,
and how did we get here? Annu Rev Virol. 2019; 6: 601-21. DOI: https:// www.doi.org/10.1146/annurev-virology-092818-015530
4. Wendtner C-M., Kofler D., Mayr C., Bund D., Hallek M. The potential of gene transfer into primary B-CLL cells using recombinant virus vectors. Leukemia & Lymphoma. 2004; 45: 897-904. DOI: https://www. doi.org//10.1080/10428190310001638896
5. Theiss H.D., Kofler D.M., Buning H., Aldenhoff A-L., Kaess B., Decker T., et al. Enhancement of gene transfer with recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors into primary B-cell chronic lymphocytic leukemia cells by CpG-oligodeoxynucleotides. Exp Hematol. 2003; 31: 1223-9. DOI: https://www.doi.org/Z10.1016/j.exphem. 2003.09.010
6. Zincarelli C., Soltys S., Rengo G., Rabinowitz J.E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 2008; 16: 1073-80. DOI: https://www.doi. org//10.1038/mt.2008.76
7. Haery L., Deverman B.E., Matho K.S., Cetin A., Woodard K., Cepko C., Guerin K.I., Rego M.A., Ersing I., Bachle S.M., Kamens J., Fan M. Adeno-Associated Virus Technologies and Methods for Targeted Neuronal Manipulation. Front Neuroanat. 2019; 13: 93. DOI: https://www. doi.org//10.3389/fnana.2019.00093
8. Byazrova M.G., Astakhova E.A., Spiridonova A.B., Vasil'eva Yu.V., Prilipov A.G., Filatov A.V. IL-21/CD40L stimulation of human B-lympho-cytes in vitro and their characteristics. Immunologiya. 2020; 41 (6): 18-27. DOI: https://www.doi.org//10.33029/0206-4952-2020-41-6-00-00 (in Russian)
9. Astakhova E.A., Frolov E.A., Shilkina A.B., Byazrova M.G., Latysheva E.A., Latysheva T.V., Filatov A.V. Stimulation of B cells in the IL-21/CD40L system in healthy donors and in patients with common variable immunodeficiency. Immunologiya. 2021; 41 (6): 631-40. DOI: https://www.doi.org//10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640 (in Russian)
10. Lunev E.A., Shmidt A.A., Vassilieva S.G., Savchenko I.M., Loginov V.A., Marina V.I., Egorova T.V., Bardina M.V. Effective viral delivery of genetic constructs to neuronal culture for modeling and gene therapy of GNAO1 encephalopathy. Mol. Biol. (Mosk). 2022; 56 (4): 604-18. DOI: https://www.doi.org//10.33029/0206-4952-2020-41-6-00-00 (in Russian)
11. Lushova A.A., Zheremyan E.A., Astakhova E.A., Spirido-nova A.B., Byazrova M.G., Filatov A.V. B-lymphocyte subsets: functions and molecular markers. Immunologiya. 2019; 40 (6): 63-76. DOI: https:// www.doi.org//10.24411/0206-4952-2019-16009 (in Russian)
12. Hung K.L., Meitlis I., Hale M., Chen C-Y., Singh S., Jackson S.W., Miao C.H., Khan I.F., Rawlings D.J., James R.G. Engineering Protein-Secreting Plasma Cells by Homology-Directed Repair in Primary Human B Cells. Mol. Ther. 2018; 26(2): 456-67. DOI: https://www.doi. org/10.1016/j.ymthe.2017.11.012
13. Wu Z., Asokan A., Samulski R.J. Adeno-associated virus sero-types: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 2006; 14: 316-27. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.ymthe.2006.05.009
14. Wendtner C-M., Kofler D.M.,Theiss H.D., Kurzeder C., Buhmann R., Schweighofer C., et al. Efficient gene transfer of CD40 ligand into primary B-CLL cells using recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Blood. 2002; 100: 1655-61. DOI: https://www.doi.org/10.1182/blood. V100.5.1655.h81702001655_1655_1661
15. Vandenberghe L.H., Wilson J.M., Gao G. Tailoring the AAV vector capsid for gene therapy. Gene Ther. 2009; 16: 311-9. DOI: https://www. doi.org/10.1038/gt.2008.170
16. Gao G., Vandenberghe L.H., Alvira M.R., Lu Y., Calcedo R., Zhou X., et al. Clades of adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol. 2004; 78: 6381-8. DOI: https://www.doi. org/10.1128/JVI.78.12.6381-6388.2004
17. Hauck B., Chen L., Xiao W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Mol Ther. 2003; 7: 419-25. DOI: https://www.doi.org/10.1016/S1525-0016(03)00012-1
18. Grimm D., Lee J.S., Wang L., Desai T., Akache B., Storm T.A., Kay M.A. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multi-species interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 2008; 8 2(12): 5887-911. DOI: https://www.doi.org/10.1128/JVI.00254-08
19. Lanzavecchia A. Dissecting human antibody responses: useful, basic and surprising findings. EMBO Mol Med. 2018; 10: e8879. DOI: https://www.doi.org/10.15252/emmm.201808879
20. Wendtner C-M., Kofler D., Mayr C., Bund D., Hallek M. The potential of gene transfer into primary b-cll cells using recombinant virus vectors. Leukemia & Lymphoma. 2004; 45: 897-904. DOI: https://www. doi.org/10.1080/10428190310001638896
Сведения об авторах
Бязрова Мария Георгиевна - науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; аспирант каф. иммунологии биол. факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова; ассистент каф. иммунологии ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9858-7596
Михайлов Артем Андреевич - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент каф. иммунологии биол. факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8356-8077
Сухова Мария Михайловна - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; аспирант каф. иммунологии биол. факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4572-1878
Authors' information
Maria G. Byazrova - Researcher of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; PhD student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V Lo-monosov MSU; assistant of Immunology Chair, RUDN named after P. Lumumba of the MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9858-7596
Artem A. Mikhailov - Technician of the Immunoche-mistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lo-monosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8356-8077
Maria M. Sukhova - Technician of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lo-monosov MSU; Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4572-1878
Бардина Марьяна Владимировна - канд. биол. наук, зав. лабораторией моделирования и терапии наследственных заболеваний ФГБУН ИБГ РАН Минобрнауки России, Москва; науч. сотр. OOO «Марлин Биотех», Сочи, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1976-4767
Шмидт Анна Андреевна - мл. науч. сотр. лаборатории моделирования и терапии наследственных заболеваний ФГБУН ИБГ РАН Минобрнауки России, Москва; научный сотрудник OOO «Марлин Биотех», Сочи, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-2658-6340
Прилипов Алексей Геннадьевич - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной генетики ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8755-1419
Филатов Александр Васильевич - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии биол. факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Mary anna V. Bardina - PhD., Head of the Lab. of modeling and gene therapy of hereditary diseases, IGB RAS of the MSHE of Russia, Moscow; Researcher, Marlin Biotech LLC, Sochi, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1976-4767
Anna A. Shmidt - Junior Researcher of the Lab. of modeling and gene therapy of hereditary diseases, IGB RAS of the MSHE of Russia, Moscow; Researcher, Marlin Biotech LLC, Sochi, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-2658-6340
Alexei G. Prilipov - Dr.Sci., PhD, Head of the Molecular Genetics Lab., N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8755-1419
Alexander V. Filatov - Dr.Sci., PhD, Prof., Head of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; professor of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation
e-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
