CC BY
3
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2023
Борисова О.Ю.1,4, Кадочникова В.В.2, Чагина И.А.1, Гадуа Н.Т.1, Пименова А.С.1, Орлова О.Е.3, Миронов А.Ю.1,5, Подопригора И.В.4
АПРОБАЦИЯ ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ
1ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского»
Роспотребнадзора, 125212, Москва, Россия;
2ООО «НПФ ДНК-Технология», 117587, Москва, Россия;
3ГБУЗ г. Москвы «Городская клиническая больница № 67 им. Л.А. Воробохова ДЗМ», 123423, Москва, Россия; 4ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы», 117198, Москва, Россия; ^Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России, 115682, Москва, Россия
Апробирован набор реагентов «C. diphtheriae Tox+» (ООО «ДНК-Технология ТС», Россия) для генодиагностики дифтерии. Использованы 15 типовых штаммов, в том числе токсигенный C. diphtheriae № 665, а также 285 штаммов и клинических образцов (мазки отделяемого из носо-, ротоглотки, кожных покровов), присланных в Референс-центр по мониторингу за корью, краснухой, эпидемическим паротитом, коклюшем и дифтерией ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Культивирование проводили по МУК 4.2.3065-13. Для выделения ДНК использован «РИБО-преп» (ФБУНЦНИИЭ Роспотребнадзора), «ПРОБА-НК», «ПРОБА-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), «ПРОБА-МЧ-РАПИД», «ПРОБА-ОПТИМА» (ООО «ДНК-Технология ТС», Россия). В качестве сравнительной тест-системы использована «АмплиСенс® Corynebacterium diphtheriae / tox-genes-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Амплификацию проводили на ДТпрайм, ДТлайт, ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология»). Аналитическая чувствительность апробируемого набора после проведения амплификации составила 5 копий ДНК (103 ГЭ/мл). Диагностическая чувствительность составила 100% (92,9-100), диагностическая специфичность - 100% (97,6-100). В ходе сравнительных исследований с набором реагентов «АмплиСенс® Corynebacterium diphtheriae/tox-genes-FL» совпадение результатов составило 100% с 95% доверительным интервалом 88,43-100%. Показано отсутствие перекрёстной реактивности в образцах биоматериала, содержащих другие микроорганизмы, выделенные из носо-, ротоглотки и с кожных покровов.
Ключевые слова: Corynebacterium diphtheriaе; ПЦР-РВ; набор реагентов; дифтерийная инфекция; биологический материал.
Для цитирования: Борисова О.Ю., Кадочникова В.В., Чагина И.А., Гадуа Н.Т., Пименова А.С., Орлова О.Е., Миронов А.Ю., Подопригора И.В. Апробация ПЦР-тест-системы в режиме реального времени для генодиагностики дифтерийной инфекции. Клиническая лабораторная диагностика. 2023; 68 (5): 305-312. DOI: https:// doi.org/10.51620/0869-2084-2023-68-5-305-312 Для корреспонденции: Миронов Андрей Юрьевич, д-р мед. наук, проф., рук. отдела микробиологии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского; е-mail: [email protected]
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование выполнено в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.
Поступила 07.04.2023 Принята к печати 14.04.2023 Опубликовано 15.05.2023
Borisova O.Yu.14, Kadochnikova V.V.2, ChaginaI.A.1, GaduaN.T.1, PimenovaA.S.1, Orlova O.E.3, MironovA.Yu.15, PodoprigoraI.V.4 DEVELOPMENT OF A PCR REAL-TIME FOR DIAGNOSTIC OF DIPHTHERIA INFECTION
1G. N. Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 125212, Moscow, Russia;
2LLC «DNA-technology», 117587, Moscow, Russia;
3GBUZ of Moscow «City Clinical hospital № 67 named L.A. Vorobokhova DZM»123423, Moscow, Russia;
4Peoples' Friendship University of Russia (RUDN University), 117198, Moscow, Russia;
5Federal scientific and clinical center for specialized types of medical care and medical technologies of the FMBA of Russia, 115682, Moscow, Russia
The results oftesting the ofreagent kit «C. diphtheriae Tox+» (DNA-Technologiya TS, Russia) for diagnostics ofdiphtheria are presented. 15 typical strains were used, including toxigenic C. diphtheriae № 665, 300 strains and clinical samples (nasal, oropharyngeal and skin swabs) sent to Reference Center for monitoring measles, rubella, mumps, whooping cough and diphtheria G. N. Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology. Cultivation was carried out according to MUK 4.2.3065-13. For DNA extraction - Ribo-prep (CRIE, Russia), Proba-NK, Proba-GS (DNA-Technologiya, Russia), Proba-MH-Rapid, Proba-Optima (DNA-Technologiya TS, Russia) were used. The comparative reagent kit was AmpliSens Corynebacterium diphtheriae/tox-genes-FL (CRIE, Russia). The analytical sensitivity of the reagent kit after amplification was 5 copies of DNA (103 GE/ml). Diagnostic sensitivity was 100% (92,9-100), diagnostic specificity was 100% (97,6-100). In comparative studies with the reagent kit AmpliSens Corynebacterium diphtheriae/tox-genes-FL, the results were 100% consistent with a 95% confidence interval of88,43-100%. The absence of cross-reactivity was show in biomaterial samples containing other microorganisms isolated from the naso-, oropharynx and skin.
Key words: Corynebacterium diphtheriaе; PCR-real time; reagent kit; diphtheria infection; biological material.
For citation: Borisova O.Yu., Kadochnikova V.V., Chagina I.A., Gadua N.T., Pimenova A.S., Orlova O.E., Mironov A.Yu., Podoprigora I.V. Development of a PCR real-time for diagnostic of diphtheria infection. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2023; 68 (5): 305-312 (in Russ.) DOI: https: //doi.org/10.51620/0869-2084-2023-68-5-305-312
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
For correspondence:MironovA.Yu., Dr. Sci. Med., Professor, Head of the Department for Microbiology; e-mail: [email protected] Information about authors:
Borisova O.Yu., https://orcid.org/0000-0001-6316-5046; Kadochnikova V.V., https://orcid.org/0000-0003-4920-7566; Chagina I.A., https://orcid.org/0000-0003-2867-9548; Gadua N.T., https://orcid.org/0000-0001-6247-6176;
Pimenova A.S., https://orcid.org/0000-0002-6914-3531; Orlova O.E., https://orcid.org/0000-0001-7210-11161;
Mironov A.Yu., https://orcid.org/0000-0002-8544-5230; Podoprigora I.V., https://orcid.org/0000-0003-4099-2967.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgment. The work was performed within the framework of the .sectoral program ofRospotrebnadzor.
Received 07.04.2023 Accepted 14.04.2023 Published 15.05.2023
Введение. В последние годы в Российской Федерации эпидемиологическая ситуация в отношении дифтерийной инфекции остается стабильно благополучной. В 2019 году зарегистрировано 5 случаев заболевания и 2 случая бактерионосительства, в 2020 г. - 1 случай заболевания, в 2021 г. - 4 случая заболевания дифтерией и 2 случая бактерионосительства. В 2022 году случаев заболевания или бактерионосительства токсигенных коринебактерий не зарегистрировано [1, 2].
По информации ВОЗ, в мире неблагополучие по данной инфекции сохраняется [19]. С начала 2022 года и по состоянию на 21 декабря 2022 года по данным Европейского центра профилактики и контроля заболеваний (ECDC) только в странах Европейского региона ВОЗ зарегистрировано 318 случаев дифтерии, в том числе в Австрии (61), Бельгии (25), Франции (14), Германии (116), Италии (2), Нидерландах (5), Норвегии (7), Испании (1), Швейцарии (25), Великобритании (62). В большинстве случаев наблюдались кожные (69,5%) и респираторные (14,5%) формы заболевания, в 8,8% случаев заболевание протекало бессимптомно. Все случаи вызваны токсигенными С. diphtheriae. Большинство зарегистрированных случаев заболевания выявлены у лиц мужского пола в возрасте от 8 лет до 49 лет, прибывших из Афганистана, Алжира, Камеруна, Пакистана, Сирии [2]. Сохраняются риски завоза дифтерии, в том числе на территорию Российской Федерации.
Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции на территории России осуществляется бактериологическим методом, порядок проведения которого регламентирован действующими нормативными1 и методическими2 документами. Основной задачей является идентификация возбудителя дифтерии в максимально сжатые сроки (3-5 дней от начала исследования) с помощью минимального набора диагностических тестов [19]. Учитывая широкое применение молекулярно-генетических методов и современную оснащённость лабораторий, несомненно актуальным
'СанПин 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней». Раздел XXXVIII «Профилактика дифтерии».
2МУ 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции».
является совершенствование лабораторной диагностики дифтерии в направлении разработки и внедрения генодиагностики, что позволяет поднять уровень клинической лабораторной диагностики при этой инфекции. Разработан проект нового нормативного документа по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции, в которую интегрирована ПЦР-диагностика для использования с диагностической целью параллельно с бактериологической диагностикой, а также с профилактической целью и по эпидемиологическим показаниям.
Цель работы - апробация разработанного «Набора реагентов для выявления ДНК Corynebacterium diph-theriae с дифференциацией токсигенных и нетокси-генных штаммов методом ПЦР в режиме реального времени (C. diphtheriae Tox+)» для генодиагностики дифтерийной инфекции.
Материал и методы. Для апробации методики генодиагностики использованы 15 типовых коллекционных штаммов микроорганизмов - токсигенный Corynebacterium diphtheriae биовара gravis № 665, Corynebacterium xerosis № 1911, Bordetella pertussis № 143, Bordetella parapertussis № 38б, Bordetella bronchiseptica № 9, Staphylococcus aureus Wood-46, S. aureus Cowan-1, Streptococcus pyogenes Dick («ГКПМ-ОБОЛЕНСК» ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора); токсигенный C. diphtheriae PW 8, Corynebacterium pseudodiphtheriticum «Соколов» (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава РФ); Corynebacterium minu-tissimum ATCC 23348, Corynebacterium jeikeium ATCC 43734, B. holmesii ATCC 51541, Candida albicans ATCC 10231, S. aureus ATCC 25923 (American Type Culture Collection).
Использованы 285 штаммов и 510 мазков отделяемого из носо-, ротоглотки, с кожных покровов, присланных в Референс-центр по мониторингу за корью, краснухой, эпидемическим паротитом, коклюшем и дифтерией ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора из бактериологических лабораторий медицинских организаций, Федеральных бюджетных учреждений здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии» (ФБУЗ ЦГиЭ) в субъектах РФ в соответствии с Приказом Роспотребнадзора от 01.12.2017 г. № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекци-
онных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации». Для оценки аналитической специфичности использована ДНК свежевыделенных микроорганизмов - 40 штаммов C. diphtheriae gravis Тох+, 20 штаммов C. diphtheriae mitis Тох+, 77 штаммов C. diphtheriae mitis Tox-, 75 штаммов C. diphtheriae gravis Tox-, 8 штаммов C. ulcerans Tox-, штаммы Corynebacterium accolens, Corynebacterium afermentas subsp. lipophilum, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium durum, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium imitans, Corynebacterium massil-ienses, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium paurometabolum, Corynebacterium propinqium, C. pseu-dodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium simulans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium ureicelerivorans, C. xerosis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus epidermidis, Streptococcus mitis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus sanguinis, Streptococcus salivarius, Staphy-lococcus aureus, S. caprae, S. hominis, B. pertussis,
B. parapertussis, B. bronchiseptica, Candida albicans,
C. glabrata, Neisseria meningitidis, Neisseria mucosa, Neisseria subflava, Rothia dentocariosa, Rothia muci-laginosa, Actinomyces oral, Bacillus cereus, Bifidobacterium bifidum, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Burkholderia spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Acinetobacter spp., Enterococcus spp. (рабочая коллекция лаборатории диагностики дифтерийной и коклюшной инфекции ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора).
Штаммы C. diphtheriae выращивали на кровяном теллуритовом агаре (КТА) на основе 2% агара (ГРМ-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) с добавлением 7% крови крупного рогатого скота (ООО «ЛейТран», Москва) и 0,02% теллурита калия (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) с инкубацией при температуре +(37±1) °С в течение 24-48 часов. Идентификацию микроорганизмов по токсигенным и биохимическим свойствам проводили согласно МУК 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» с помощью набора реагентов для биохимической идентификации «ДС-ДИФ-КОРИНЕ» (НПО «Диагностические системы», Н. Новгород). Для проверки аналитической специфичности использована ДНК штаммов различных микроорганизмов с концентрацией матриц не ниже 109 ГЭ/мл. Оценка аналитической чувствительности проведена с помощью линейки серийных десятикратных разведений (10М09) типового контрольного токсиген-ного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665, концентрацию исходной взвеси измеряли по стандартному образцу мутности 10 единиц (ОСО 42-28-86 П), с последующим высевом на КТА и инкубированием 48 ч при 37 °С. Контаминацию мазков из носо-, ротоглотки, с кожных покровов проводили путём нанесения на них приготовленной бактериальной суспензии.
Для выделения ДНК использовали наборы реагентов для выделения нуклеиновых кислот - «РИБО-
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), «ПРОБА-НК», «ПРОБА-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), «ПРОБА-МЧ-РАПИД», «ПРОБА-ОПТИ-МА» (ООО «ДНК-Технология ТС», Россия) в соответствии с инструкциями производителей. В качестве анализируемой тест-системы использован «Набор реагентов для выявления ДНК Corynebacterium diphtheriae с дифференциацией токсигенных и не-токсигенных штаммов методом ПЦР в режиме реального времени (C. diphtheriae Tox+)» (ООО «ДНК-Технология ТС», Россия). В качестве сравнительной тест-системы - «АмплиСенс® Corynebacterium diphtheriae / tox-genes-FL. - качественное определение ДНК Corynebacterium diphtheriae и обнаружение генов, кодирующих токсины Corynebacterium diphtheriae и Corynebacterium ulcerans (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Постановка ПЦР-РВ проводилась с использованием трёх амплификаторов - ДТпрайм, ДТлайт, ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология»), руководствуясь инструкцией производителя.
Апробация набора реагентов проведена согласно ГОСТ 3 4 5.
Результаты. Апробируемый набор реагентов предназначен для выявления ДНК и дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae в биологическом материале человека (отделяемое со слизистой оболочки носо- и ротоглотки, отделяемое с поражённых участков кожи, чистые культуры бактерий) методом ПЦР-РВ. Интерпретация результатов производится следующим образом: в образцах биологического материала, содержащих ДНК C. diphtheriae, регистрируются положительные результаты амплификации специфического продукта (фрагмент ДНК C. diphtheriae); в образцах биологического материала, содержащих ДНК токсигенных C. diphtheriae, - положительные результаты амплификации специфических продуктов (фрагменты ДНК C. diphtheriae и гена токсина - C. diphtheriae tox+); в образцах биологического материала, не содержащих ДНК C. diphtheriae, при проведении амплификации - отрицательные результаты амплификации и положительный результат амплификации внутреннего контроля.
Для оценки аналитической чувствительности апробируемого набора готовили три линейки серийных десятикратных разведений контрольного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665: 10М01 м.к. в 1 мл. Из 100 мкл каждого разведения суспензий выделяли ДНК с помощью двух наборов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и «ПРОБА-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Параллельно с этим, для определения общего количества жизнеспособных микроорганизмов в 1 мл бактериальной
3ГОСТ Р 53022.3-2008 «Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов».
4ГОСТ Р ЕН 13612-2010 «Оценка функциональных характеристик медицинских изделий для диагностики in vitro».
5ГОСТ Р 51352-2013 «Медицинские изделия для диагностики ин ви-тро. Методы испытаний».
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
взвеси, из каждого разведения производили высев по 100 мкл на кровяной теллуритовый агар и инкубировали при 37 °С. Через 48 часов подсчитывали число выросших колоний (КОЕ/мл) (табл. 1).
После проведения амплификации аналитическая чувствительность апробируемого набора составила 5 копий ДНК на амплификационную пробирку, что соответствует 103 ГЭ/мл.
Проведена оценка диагностических характеристик апробируемых наборов с установлением показателей диагностической чувствительности и специфичности. Диагностическая чувствительность (ДЧ) рассчитывалась по формуле:
ДЧ=ИП/(ИП+ЛО) х 100%, где: ИП - истинно положительные результаты и ЛО - ложноотрицательные результаты в случае отрицательного результата, полученные на испытуемом наборе реагентов и в сравнительным методе.
Диагностическая специфичность (ДС) рассчитывалась по формуле:
ДС=ИО/(ИО+ЛП) х 100%, где: ИО - истинно отрицательные результаты и ЛП - ложноположительные результаты в случае положительного результата, на испытуемом наборе реагентов и в сравнительным методе, 95% доверительный интервал для чувствительности и специфичности рассчитывали на основании распределения %2 [3].
Taблицa 1
Разведения и учёт КОЕ/мл токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665
Разведение условное Количество м. к. в 1 мл взвеси бактериальной культуры Число колониеобразую-щих единиц в 1 мл взвеси бактериальной культуры (КОЕ/мл)
Исходная 109 Сплошной рост
-1 108 Сплошной рост
-2 107 Сплошной рост
-3 106 Густой рост
-4 105 Множественный рост
-5 104 4,5х102
-6 103 ЗДхШ1
-7 102 2
-8 101 Рост отсутствует
Эффективность набора при исследовании штаммов определяли путём оценки количества идентично воспроизведённых результатов исследования по сравнению с набором реагентов для идентификации «ДС-ДИФ-КОРИНЕ» (НПО «Диагностические системы», Н. Новгород) (табл. 2).
С учётом статистической неопределённости согласно Методическим рекомендациям по порядку проведения и экспертизы качества, эффективности и безопасности медицинских изделий ФГБУ ВНИИ-ИМТ Росздравнадзора 2013 г. определяли долю истинных результатов (Рист) с доверительной вероятностью 90% по формуле:
Р =0,11/N,
ист
где: N - количество проведённых исследований.
При оценке диагностических характеристик (диагностической чувствительности и диагностической специфичности) использовано количество правильно определённых штаммов C. diphtheriae, выявляемых с использованием испытываемого набора реагентов «C. diphtheriae Tox+». Диагностические характеристики рассчитаны для каждого штамма C. diphtheriae (токсигенного или нетоксигенного) по отдельности по следующим формулам: истинно положительными (ИП) результатами считалось обнаружение в биологическом материале ДНК C. diphtheriae нетоксиген-ных штаммов (tox) апробируемым набором реагентов при наличии в образце нетоксигенного штамма C. diphtheriae, подтверждённого биохимической тест-системой; ложноположительными (ЛП) результатами считалось обнаружение в биологическом материале ДНК C. diphtheriae нетоксигенных штаммов (tox) апробируемым набором реагентов и отсутствие в образце нетоксигенного штамма C. diphtheriae, подтверждённого биохимической тест-системой; истинно отрицательными (ИО) результатами считалось получение отрицательного результата (не обнаружена ДНК C. diphtheriae) апробируемым набором реагентов и отсутствие в образце нетоксигенного штамма C. diphtheriae, подтверждённого биохимической тест-системой; ложно отрицательным (ЛО) результатом считалось получение отрицательного результата (не обнаружена ДНК C. diphtheriae) апробируемым набором реагентов при наличии в образце нетоксигенного штамма C. diphtheriae, подтверждённого биохимиче-
Taблицa 2
Детекция ДНК C. diphtheriae с помощью набора реагентов «С. diphtheriae Tox+» и штаммов C. diphtheriae с помощью набора реагентов «ДС-ДИФ-КОРИНЕ»
Биоматериал
Всего образцов
Набор реагентов «C. diphtheriae Tox+»
Набор реагентов ДC-ДИФ-КOPИHE
C. diphtheriae HTШ C. diphtheriae TШ
Штаммы 212 Обнаружено ДНК C. diphtheriae НТШ (tox) 152 0
Обнаружено ДНК C. diphtheriae ТШ (tox+) 0 60
Мазки из носо- и ротоглотки, Обнаружено ДНК C. diphtheriae НТШ (tox) 152 0
контаминированные 260 Обнаружено ДНК C. diphtheriae ТШ (tox+) 0 60
микроорганизмами Не обнаружена ДНК C. diphtheriae 0 0
Мазки с поражённых участков Обнаружено ДНК C. diphtheriae НТШ (tox) 152 0
кожи, контаминированные 250 Обнаружено ДНК C. diphtheriae ТШ (tox+) 0 60
микроорганизмами Не обнаружена ДНК C. diphtheriae 0 0
Примечание. HTШ - нетоксигенные штаммы, TШ - токсигенные штаммы.
ской тест-системой. Выявлено 60 истинно-положительных и 152 истинно-отрицательных результатов.
Диагностическая чувствительность и специфичность набора реагентов «C. diphtheriae Tox+» при исследовании токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, мазков отделяемого со слизистой оболочки носо- и ротоглотки, кожных покровов, кон-таминированных токсигенными и нетоксигенными штаммами C. diphtheriae, представлена в табл. 3.
В рамках проведения апробации проведены сравнительные исследования образцов биоматериала, полученные с использованием испытуемого набора реагентов и набора реагентов для диагностики in vitro «АмплиСенс® Corynebacterium diphtheriae/tox-genes-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзо-ра, Россия). Для исследования использованы 10 мазков отделяемого из ротоглотки, контаминированных токсигенным штаммом C. diphtheriae биовара gravis № 665, 10 мазков отделяемого из ротоглотки, конта-минированных нетоксигенным штаммом C. diphtheriae биовара gravis, по 10 штаммов этих же микроорганизмов. Воспроизводимость оценивалась по проценту совпадений полученных результатов с 95% доверительным интервалом (табл. 4).
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ходе сравнительных исследований совпадение результатов составило 100% с 95% доверительным интервалом 88,43-100%.
Оценка воспроизводимости результатов, полученных с использованием апробируемого набора реагентов «C. diphtheriae Tox+», проведена с использованием различных наборов реагентов для выделения ДНК и разных амплификаторов. Для выделения ДНК из образцов применены четыре набора реагентов: «ПРОБА-НК», «ПРОБА-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), «ПРОБА-МЧ-РАПИД», «ПРОБА-ОПТИМА» (ООО «ДНК-Технология ТС», Россия). В качестве испытуемых образцов использованы 5 мазков из ротоглотки, контаминированных токсигенным штаммом C. diphtheriae биовара gravis № 665, 5 мазков из ротоглотки, контаминированных нетоксигенным штаммом C. diphtheriae биовара gravis, по 10 штаммов этих же микроорганизмов. Воспроизводимость оценивалась по проценту совпадений полученных результатов с 95% доверительным интервалом (табл. 5).
Результаты исследования образцов с использованием всех четырёх наборов реагентов для выделения ДНК показали воспроизводимость результатов - со-
Таблица 3
Диагностические характеристики набора реагентов «С. diphtheriae Tox+»
Биоматериал Всего образцов Результаты исследования набора реагентов Результаты исследования набор реагентов «ДС-ДИФ-КОРИНЕ» Эффективность
«С. diphtheriae Тох+» C. diphtheriae НТШ C. diphtheriae ТШ
Штаммы 50 Обнаружено ДНК С. diphtheriae (^х) Обнаружено ДНК С. diphtheriae (Ох+) 25 0 0 25 100% (Р =91,2 %) V ист ' ' 100% (Рист=91,2%)
Суммарная эффективность 100% (Рист=95,5%)
C. diphtheriae НТШ (tox) C. diphtheriae ТШ (tox+)
Биоматериал Диагностическая Диагностическая Диагностическая Диагностическая
чувствительно сть специфичность чувствительность специфичность
Мазки отделяемого со слизистой оболочки носо- и ротоглотки 100% (92,9-100) 100% (97,6-100) 100% (92,9-100) 100% (97,6-100)
Мазки отделяемого с поражённых 100% (92,9-100) 100% (97,6-100) 100% (92,9-100) 100% (97,6-100)
участков кожи
Вид образца Количество «C. diphtheriae Tox+» «АмплиСенс® Corynebacterium diphtheriae/tox-genes-FL» Вывод
Мазок отделяемого из ротоглотки + C. diphtheriae (Тох+) 10 C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) Совпадает
Мазок отделяемого из ротоглотки + C. diphtheriae (Тох-) 10 C. diphtheriae C. diphtheriae Совпадает
Штамм C. diphtheriae (Тох+) 10 C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) Совпадает
Штамм C. diphtheriae (Тох-) 10 C. diphtheriae C. diphtheriae Совпадает
Мазок из ротоглотки 10 Отрицательно Отрицательно Совпадает
Штамм S. aureus 10 Отрицательно Отрицательно Совпадает
Штамм C. pseudodiphtheriticum 10 Отрицательно Отрицательно Совпадает
Штамм S. pneumoniae 10 Отрицательно Отрицательно Совпадает
Количество совпадений результатов исследования 90 из 90
Примечание. НТШ - нетоксигенные штаммы, ТШ - токсигенные штаммы.
Таблица 4
Исследование образцов биоматериала с использованием испытуемого набора реагентов и набора реагентов «АмплиСенс® СогупеЬа^епит dгphtherгae/tox-genes-FL»
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
Таблица 5
Исследование образцов ДНК, выделенных с помощью разных наборов реагентов для выделения
Набор реагентов для выделения нуклеиновых кислот
Вид образца Количество ПРОБА-НК ПРОБА-ГС ПРОБА-МЧ-РАПИД ПРОБА-ОПТИМА Вывод
Мазок отделяемого из ротоглотки + C. diphtheriae (Тох+) 5 C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) Совпадает
Мазок отделяемого из ротоглотки + C. diphtheriae (Тох-) 5 C. diphtheriae C. diphtheriae C. diphtheriae C. diphtheriae Совпадает
Штамм C. diphtheriae (Тох+) 10 C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) Совпадает
Штамм C. diphtheriae (Тох-) 10 C. diphtheriae C. diphtheriae C. diphtheriae C. diphtheriae Совпадает
Таблица 6
Апробация набора реагентов с использованием разных амплификаторов
Вид образца Количество Амплификатор Вывод
ДТпрайм ДТлайт ДТ-96
Мазок отделяемого из ротоглотки + C. diphtheriae (Тох+) 5 C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) Совпадает
Мазок отделяемого из ротоглотки + C. diphtheriae (Тох-) 5 C. diphtheriae C. diphtheriae C. diphtheriae Совпадает
Штамм C. diphtheriae (Тох+) 5 C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) C. diphtheriae (tox+) Совпадает
Штамм C. diphtheriae (Тох-) 5 C. diphtheriae C. diphtheriae C. diphtheriae Совпадает
Количество совпадений результатов исследования 20 из 20
впадение составило 100% с 95% доверительным интервалом 83,16-100%.
В качестве используемых амплификаторов применены амплификаторы - ДТпрайм, ДТлайт, ДТ-96. Для исследования готовили по 10 мазков отделяемого из ротоглотки, контаминированных токсигенным штаммом C. diphtheriae биовара gravis № 665 и нетоксигенным штаммом C. diphtheriae биовара gravis, по 10 бактериальных культур этих же штаммов. Каждый образец исследован в трёх повторах. Воспроизводимость оценена по проценту совпадений полученных результатов с 95% доверительным интервалом (табл. 6).
В результате проведённого исследования 20 образцов (по 3 повтора каждого образца, итого 60 образцов) с использованием токсигенного и нетоксигенного штаммов C. diphtheriae биовара gravis и различных амплифи-каторов (ДТпрайм, ДТлайт, ДТ-96) получена воспроизводимость результатов - совпадение составило 100% с 95% доверительным интервалом 88,43-100%.
Оценка аналитической специфичности проведена в два этапа. На первом этапе в качестве матрицы использована ДНК свежевыделенных штаммов микроорганизмов различных видов с концентрацией не ниже 109 ГЭ/мл - C. accolens, C. afermentas subsp. li-pophilum, C. amycolatum, C. aurimucosum, C. coyleae, C. durum, C. flavescens, C. imitans, C. massilienses, C. mucifaciens, C. paurometabolum, C. propinqium, C. pseudodiphtheriticum, C. pseudotuberculosis, C. simu-lans, C. striatum, C. tuberculostearicum, C. ulcerans tor, C. ureicelerivorans, C. xerosis, S. agalactiae, S. angino-sus, S. epidermidis, S. mitis, S. parasanguinis, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. salivarius, S. aureus, S. caprae,
S. hominis, B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchisep-tica, C. albicans, C. glabrata, N. meningitidis, N. mucosa, N. subflava, R. dentocariosa, R. mucilaginosa, Actinomyces oral, B. cereus, B. bifidum, H. influenzae, Streptococcus sanguinis, Escherichia coli, Burkholderia spp., K. pneumoniae, Proteus spp., M. morganii, P. aeruginosa, E. cloacae, Acinetobacter spp., Enterococcus spp. Выделение ДНК проведено с использованием комплекта «ПРОБА-НК». Показано отсутствие перекрёстной реактивности с микроорганизмами, которые могут контаминировать образцы биоматериала. На втором этапе оценка аналитической специфичности проведена с использованием 15 образцов биоматериала (мазки отделяемого со слизистой оболочки носо- и ротоглотки), не содержащих C. diphtheriae. Образцы биоматериала разделены на две равные аликвоты. В 15 аликвот добавлены культуры микроорганизмов (S. aureus, S. pyogenes, S. mitis, S. sanguinis, N. meningitidis, N. mucosa, E. coli, Burkholderia spp., K. pneumoniae, Proteus spp., M. morganii, P. aeruginosa, E. cloacae, Acinetobacter spp., Enterococcus spp.) в объёме, не превышающем 10% от исходного объёма аликво-ты. В 15 аликвот, используемых в качестве контроля, добавлен физиологический раствор в объёме 10% от исходного объёма аликвоты. Выделение ДНК проведено с использованием комплекта ПРОБА-НК. Продемонстрировано отсутствие перекрёстной реактивности в образцах исследованного биоматериала, содержащих другие виды микроорганизмов.
Обсуждение. Развитие методов генодиагностики дифтерии прошло значительный путь от ДНК-ДНК гибридизации до ПЦР-РВ и изотермической ампли-
фикации. В 1990-х годах за рубежом появились первые публикации, посвящённые вопросу о возможности использования методов генодиагностики для детекции токсигенных C. diphtheriae. В 1991 году впервые применён метод ПЦР с целью детекции гена tox у C. diphtheriae [4]. После этого ПЦР в классическом варианте стала широко использоваться для проведения аналогичных исследований как отечественными, так и зарубежными исследователями [5-11]. Все эти работы направлены на определение токсигенных свойств у C. diphtheriae, выделенных в чистой культуре, поэтому использование молеку-лярно-генетических методов на тот момент не позволило сократить время проведения исследования и обнаружить возбудителя дифтерии в клиническом образце. В конце 1990-х годов коллективом авторов МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского разработан способ ПЦР-диагностики дифтерии с электрофоретиче-ской детекцией продуктов амплификации, дающий возможность в клиническом материале в течение 5-6-ти часов выявить фрагмент гена tox размером 340 п.н. [12]. Разработанный метод ПЦР позволял осуществлять ускоренную лабораторную диагностику при обследовании больных с подозрением на дифтерию с целью своевременной постановки диагноза и проведения лечебных мероприятий, выявления контактных лиц и бактерионосителей в очагах инфекции, для идентификации нетоксигенных токс-несущих (НТТН) штаммов С. diphtheriae и изучения их значимости в эпидемическом процессе дифтерийной инфекции. Одновременно в ФБУН ЦНИИЭ Ро-спотребнадзора предложен набор реагентов для выявления ДНК токсигенных штаммов C. diphtheriae в клиническом материале «АмплиСенс® Corynebac-terium diphtheriae - EPh», позволяющий выявить фрагмент гена tox размером 360 п.н. Применение этого набора не позволяло дифференцировать ген tox у токсигенных штаммов C. diphtheriae от «молчащего» гена tox у НТТН-штаммов C. diphtheriae. С 2000-х годов развитие ПЦР-диагностики дифтерийной инфекции шло в направлении разработки ПЦР-РВ [13-15]. С помощью предложенных вариантов ПЦР детекция гена, кодирующего дифтерийный токсин, осуществлялась в чистой культуре коринебак-терий. Только в двух работах предприняты попытки детекции гена tox с помощью ПЦР-РВ на ограниченном числе иммитантов и клинических образцов [16, 17]. Для ПЦР-диагностики дифтерии стали создавать мультиплексные варианты ПЦР, позволяющие детектировать не только ген tox у C. diphtheriae и C. ulcerans, но и диффeрeнцировать эти виды микроорганизмов между собой [18, 20, 21]. На данный момент разработано два варианта, один из которых дифференцирует токсигенные и нетоксигенные штаммы C. diphtheriae, а другой дополнительно дифференцирует виды C. ulcerans и C. pseudotu-berculosis. Ни одна из предложенных технологий, а также зарегистрированный набор реагентов «Ам-плиСенс® Corynebacterium diphtheriae/tox-genes-FL» и апробируемая тест-система не позволяют дифференцировать токсигенные штаммы C. diphtheriae от
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
НТТН-штаммов C. diphtheriae, циркуляция которых в конце 1990-х и начале 2000-х годов достигала 30%. В связи с этим, в проекте нового нормативного документа по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции обращено внимание на то, что при получении положительного ПЦР-результата необходимо будет проводить повторное взятие биологического материала и проведение бактериологического исследования с постановкой пробы на токсигенность, которая позволяет дифференцировать токсигенные и нетоксигенные токснесущие штаммы C. diphtheriae, а первичный материал (тампоны от больного) и положительный ДНК-образец направляются в Референс-центр по мониторингу за корью, краснухой, эпидемическим паротитом, коклюшем и дифтерией ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора (Москва, ул. Адмирала Макарова, 10) для верификации.
Заключение. Отечественный набор реагентов для генодиагностики дифтерии «C. diphtheriae Tox+» производства ООО «ДНК-Технология ТС» (Россия) позволяет детектировать ДНК C. diphtheriae в биоматериале и дифференцировать токсигенные и не-токсигенные штаммы C. diphtheriae. Аналитическая чувствительность набора «C. diphtheriae Tox+» составляет 5 копий ДНК (103 ГЭ/мл); диагностическая чувствительность - 100% (92,9-100); диагностическая специфичность - 100% (97,6-100). У набора реагентов «C. diphtheriae Tox+» отсутствует перекрёстная реактивность в образцах биоматериала, содержащих другие виды микроорганизмов, выделенные из носо-, ротоглотки и с кожных покровов. Набор реагентов «C. diphtheriae Tox+» не позволяет дифференцировать токсигенные штаммы C. diphtheriae от НТТН-штаммов C. diphtheriae.
ЛИТЕРАТУРА (пп . 3, 4, 6-10, 13-17, 20, 21 см . REFERENCES)
1. О заболеваемости дифтерией, мониторинге за возбудителем и состоянием антитоксического противодифтерийного иммунитета населения России в 2021 году. Информационное письмо Роспотребнадзора от 08.12.2022 № 02/23785-2022-27.
2. Об эпидситуации и мерах профилактики дифтерии на территории Российской Федерации. Информационное письмо Роспотребнадзора от 16.01.2023 г. № 02/455-2023-27.
5. Нарвская О.В., Мокроусов И.В. Применение полимеразной цепной реакции для диагностики дифтерии и изучения возбудителя: пособие для врачей. СПб: НИИЭМ им. Пастера;1995.
11. Ценёва Г.Я., Щедеркина Е.Е. Применение полимеразной цепной реакции в диагностике дифтерийной инфекции. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии; 2000; 5: 72-4.
12. Комбарова С., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Соков Б.Н., Смердов Г.Н. и др. Усовершенствование методики постановки полимеразной цепной реакции для выявления гена дифтерийного токсина. Проблемы инфекционных болезней. 2000; 1: 47-52.
18. Васильев Д.А., Мастиленко А.В., Борисова О.Ю., Полетаева Т.Н., Макшанова Н.В. Разработка системы молекулярно-генети-ческой идентификации Corynebacterium ulcerans на основе ПЦР в режиме реального времени. Молекулярная диагностика. 2014; 2(27): 487-8.
19. Харсеева Г.Г., Алутина Э.Л., Гасретова Т.Д., Дятлов И.А. Дифтерия: микробиологические и иммунологические аспекты. М.: Практическая медицина; 2014. ISBN 978-5-98811-277-8.
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
REFERENCES
1. On the incidence of diphtheria, monitoring of the pathogen and the state of antitoxic antidiphtheria immunity of the Russian population in 2021. Information letter of Rospotrebnadzor dated 08.12.2022. № 02/23785-2022-27. (in Russian)
2. On the epidemiological situation and measures to prevent diphtheria in Russian Federation. Information letter of Rospotrebnadzor dated 16.01.2023. № 02/455-2023-27. (in Russian)
3. Statistical Methods for Rates and Proportions (2nd ed.) Section 5.6 (by Joseph L. Fleiss). Pub.: John Wiley & Sons, New York; 1981.
4. Pallen M.J. Rapid screening for toxigenic Corynebacterium diph-theriae by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 1991; 44(12): 1025-6.
5. Narvskaya O.V., Mokrousov I.V. The use of polymerase chain reaction for the diagnosis of diphtheria and the study of the pathogen: a manual for doctors. St. Petersburg: Institute mikrobiologii I epide-miologii imeni Pastera; 1995. (in Russian)
6. Aravena-Roman M., Bowman R., O'Neill G. Polymerase chain reaction for the detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae. Pathology. 1995; 27(1): 71-3.
7. Efstratiou A., Engler K.H., Dawes C.S., Sesardic D. Comparison of phenotypic and genotypic methods for detection of diphtheria toxin among isolates of pathogenic corynebacterial. Journal of Clinical Microbiology. 1998; 36(11): 3173-7.
8. Mikhailovich V.M., Melnikov V.G., Mazurova I.K., Wachsmuth I.K., Wenger J.D., Wharton M. et al. Application of PCR for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains isolated during the Russian diphtheria epidemic, 1990 through 1994. Journal of Clinical Microbiology. 1995; 33(11): 3061-3.
9. Nakao H., Popovic T. Development of a direct PCR assay for detection of the diphtheria toxin gene. Journal of Clinical Microbiology. 1997; 35(7): 1651-5.
10. Pallen M.J, Hay A.J., Puckey L.H., Efstratiou A. Polymerase chain reaction for screening clinical isolates of corynebacteria for the production of diphtheria toxin. Journal of Clinical Pathology; 1994; 47(4): 353-6.
11. Tseneva G.Ya., Shederkina E.E. Use of polymerase chain reaction in diagnosis of diphtheria infection. Zhurnal mikrobiologii, epide-miologii i immunobiologii. 2000; 5: 72-4. (in Russian)
12. Kombarova S.Yu., Mel'nikov V.G., Borisova O.Yu., Platonova T.V., Sokov B.N, Smerdov G.N. et al. Improvement of polymerase chain
reaction procedure for detection of diphtheria toxin gene. Problemy infektsionnykh bolezney. 2000; 1: 47-52. (in Russian)
13. Cassiday P.K., Pawloski L.C., Tiwari T., Sanden G.N., Wilkins P.P. Analysis of toxigenic Corynebacterium ulcerans strains revealing potential for false-negative real-time PCR results. Journal of Clinical Microbiology. 2008; 46(1): 331-3.
14. Schuhegger R., Lindermayer M., Kugler R., Heesemann J., Bursch U., Sing A. Detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans strains by a novel real-time PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2008; 46(8): 2822-3.
15. Sing A., Berger A., Schneider-Brachert W., Holzmann T., Reischl U. Rapid detection and molecular differentiation of toxigenic Cory-nebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans strains by LightCycler PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2011; 49(7): 2485-9.
16. Mancini F., Monaco M., Pataracchia M., von Hunolstein C., Pan-tosti A., Ciervo A. Identification and molecular discrimination of toxigenic and nontoxigenic diphtheria Corynebacterium strains by combined real-time polymerase chain reaction assays. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2012; 73(2): 111-20.
17. Mothershed E.A., Cassiday P.K., Pierson K., Mayer L.W., Popovic T. Development of a real-time fluorescence PCR assay for rapid detection of the diphtheria tox in gene. Journal of Clinical Microbiology. 2002; 40(12): 4713-9.
18. Vasil'ev D.A., Mastilenko A.V., Borisova O.Yu., Poletaeva T.N., Makshanova N.V. Development of the molecular genetic identification system Corynebacterium ulcerans based on real-time PCR. Molekulyarnaya diagnostika. 2014; 2(27): 487-8. (in Russian)
19. Kharseeva G.G., Alutina E.L., Gasretova T.D., Dyatlov I.A. Diphtheria: microbiological and immunological aspects. Moscow: Prakticheskaya meditsina; 2014. ISBN 978-5-98811-277-8. (in Russian)
20. Pimenta F.P., Hirata Jr., Rosa A.C., Milagres L.G., Mattos-Guaraldi A.L. A multiplex PCR assay for simultaneous detection of Corynebacterium diphtheriae and differentiation between non-toxigenic and toxigenic isolates. Journal of Medical Microbiology. 2008; 57(11): 1438-9.
21. Torres Lde.F., Ribeiro D., Hirata Jr.R., Pacheco L.G., Souza M.C., dos Santos L.S. et al. Multiplex polymerase chain reaction to identify and determine the toxigenicity of Corynebacterium spp. with zoonotic potential and an overview of human and animal infections. Memorias doInstituto Oswaldo Cruz. 2013; 108(3): 272-9.
