CC BY
78
РАЗДЕЛ III
УДК 579.871.1
НАБЛЮДЕНИЕ ЗА ЦИРКУЛЯЦИЕЙ ШТАMMОB CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ПРИЗНАКУ ТОКСИГЕННОСТИ
С.Ю. Комбарова1, О.Ю. Борисова1, B.r. Мельников2, Л.С. Наумов1,
O.B. Нарвская3, M.B. Мокроусов3, H.B. Bоложaнuев4, M.B. Новокшонова5, И.К. Мазурова1,
1 ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, г. Москва, 2Международный научно-технический центр, г. Москва,
3 Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург, 4 ФГУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск,
5 ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии», г. Москва
Комбарова Светлана Юрьевна - 125212 г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.
Раб. тел.: (495) 459-21-46, e-mail: [email protected]
Проведено наблюдение за токсигенными и нетоксигенными штаммами С. diphtheriae, выделенными в России с 1945 г. по настоящее время. Установлены особенности их распространения в динамике эпидемического процесса дифтерии. Изучены молекулярно-генетические свойства - особенности генов рРНК, гена tox, dtxR, айВ-сайтов. Проведены эксперименты по лизогенной конверсии нетоксигенных С. diphtheriae в токсигенные. Полученные результаты свидетельствуют о взаимодействии в процессе циркуляции штаммов, принадлежащих к одному виду - С. diphtheriae, но различающихся по признаку токсигенности. Очевидно, что одной из составляющих такого взаимодействия может быть приобретение признака токсигенности в процессе фаговой конверсии. Не исключена вероятность утраты способности к токсинообразованию при выключении экспрессии гена tox вследствие мутаций, включения в его состав инсерционного элемента или «вырезания» токсигенного профага из хромосомы С. diphtheriae. В референс и региональных центрах по мониторингу возбудителя дифтерии целесообразно проводить наблюдения за циркуляцией как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов С. diphtheriae. Такие исследования особенно актуальны в периоды низкой и спорадической заболеваемости дифтерией, когда возможно формирование новых эпидемических штаммов возбудителя дифтерии.
Ключевые слова: эпидемический процесс, дифтерия, С. Diphtheriae, токсигенность, циркуляция
штаммов, фаговая конверсия, экспрессия гена tox.
Observation of toxigenic and non toxigenic C. diphtheriae strains found in Russia since 1945 up to the present day was carried out. Peculiarities of the disease spread were determined in the dynamics of diphtheria epidemical process. Molecular-genetic properties - peculiarities of the genes tox, dtxR, attB-sites were studied. Experiments on lysogenic conversion of non toxigenic C. Diphtheriae into toxigenic ones were made. The received data show interaction during the process of circulation of strains belonging to the same type - C. diphtheriae, that differ in toxigenicity character. It is evident that one of composing things of such interaction can be obtainment of toxi-genicity character in the process of phage conversion. It is possible that loss of toxin production capability will take place in case of exclusion of tox gene expression as the result of mutations, inclusion of insertion element in its composition or “cutting” toxigenic prophage out of chromosome C. diphtheriae. In reference and regional centers for monitoring of diphtheria activator it is reasonable to make observation of circulation of both toxigenic and non toxigenic C. diphtheriae strains. Such studies are especially topical during the periods of low and sporadic diphtheria rate when there is a possibility of formation of new epidemic strains of diphtherial activator.
Key words: epidemical process, diphtheria, C. diphtheriae, toxigenicity, circulation of strains,
phage conversion, tox gene expression.
Введение
Система эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией в России предусматривает наблюдение за биологическими свойствами возбудителя дифтерии - токсигенны-ми С. diphtheriae. Hетоксигенные С. diphtheriae не вызывают дифтерию, тем не менее, вопрос об их роли в эпидемическом процессе дискутируется в течение многих лет и до сих пор не получен однозначный ответ на этот вопрос. Hетоксигенные С. diphtheriae способны приобретать ген дифтерийного токсина (tox) вследствие лизогенизации бактериальной клетки токси-генным коринефагом (фаговой конверсии). В результате приобретения функционально активного гена tox нетоксигенные С. diphtheriae становятся способными продуцировать токсин. Известно о явлении рекомбинации неконвертирующих фагов с дефектными генами tox, приводящей к образованию функционального гена tox [1, 2]. ^блюдения за нетоксигенными штаммами расширят представление о механизмах формирования популяции возбудителя дифтерии.
Цель исследования. Провести сравнительный анализ циркуляции и биологических свойств токсигенных и нетоксиген-ных С. diphtheriae.
Материалы и методы. Изучено 1915 штаммов С. diphtheriae (847токсигенных и Ю68 нетоксигенных), выделенных в России с 1945 г. по настоящее время. Среди токсигенных штаммов к биовару gravis принадлежало 689 штаммов, к биовару mitis -158 штаммов. Среди нетоксигенных штаммов к биовару gravis принадлежало 313 штаммов, к биовару mitis - 755 штаммов. Микробиологическое исследование культур проводили согласно [3]. Распространение С. diphtheriae на территории России оценивали, анализируя удельный вес биоваров gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных С. diphtheriae и показатели выделяемости (ПВ) токсигенных и нетоксигенных штаммов (количество положительных находок на 1QQQ лиц, обследованных с целью выявления С. diphtheriae). Выявление гена дифтерийного токсина проводили с помощью ПЦР, используя коммерческую тест-систему «Ампли-Сенс-ПЦР» (производство ЦHИИЭ, г. Москва). Риботипирование (типирование по особенностям генов рРHК) проводили по [4]. Секвенирование генов tox и dtxR осуществляли по методике [5], а также с помощью олигонуклеотидных праймеров, разработанных в процессе исследования [6]. Эксперименты по фаговой конверсии нетоксигенных С. diphtheriae в токсигенные проводили согласно [7] в нашей модификации. Выявление сайтов прикрепления токсигенных коринефагов к хромосоме С. diphtheriae осуществляли с помощью метода ДHК-ДHК гибридизации [8].
Результаты и их обсуждение. Изучение распространения С. diphtheriae проведено на 65 территориях семи федеральных округов России. По каждой территории построены графики, отражающие особенности изменения ПВ токсигенных и неток-сигенных С. diphtheriae в динамике эпидпроцесса. Поскольку графики имели сходный характер, то были высчитаны средние ПВ токсигенных и нетоксигенных С. diphtheriae, циркулирующих на всей территории России (рис.).
РИС.
Распространение токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae на территории России.
Полученные данные свидетельствуют о более интенсивной
циркуляции нетоксигенных С. diphtheriae по сравнению с ток-сигенными. Динамика распространения как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов соответствовала динамике показателей заболеваемости дифтерией.
При анализе удельного веса биоваров штаммов С. diphtheriae выявлены периоды доминирования одного из биоваров - gravis или mitis [9]. Однако во время преобладания биовара gravis среди токсигенных штаммов среди нетоксигенных штаммов, напротив, доминировал биовар mitis.
У токсигенных и нетоксигенных С. diphtheriae обнаружен ген dtxR, ответственный за синтез белка DtxR, который является железозависимым регулятором метаболизма С. diphtheriae
[10]. В частности, под контролем DtxR происходит экспрессия дифтерийного токсина у токсигенных штаммов. Учитывая наличие гена dtxR у нетоксигенных штаммов, можно полагать, что при условии лизогенизации токсигенным коринефагом данные штаммы приобретут способность продуцировать токсин.
Среди нетоксигенных С. diphtheriae с помощью метода ПЦР обнаружено 16,8% штаммов, имеющих в геноме неэкспресси-рующийся («молчащий») ген дифтерийного токсина (нетокси-генные токонесущие штаммы - НТТН-штаммы). Все НТТН-штаммы принадлежали к биовару mitis, среди которого они составляли 23,9%. Распространены они практически повсеместно (г.г. Москва, Санкт-Петербург, Калининград, Смоленск, Пенза, Астрахань, Красноярск, Челябинск, Анадырь). Вместе с тем, в последние годы спорадической заболеваемости (20062008 гг.) НТТН-штаммы не регистрировали.
Установлено два механизма блокирования гена tox у НТТН-штаммов. Обнаружена делеция в гене tox одного из нуклеотидов G в положении 52-55. Последняя приводит к сдвигу открытой рамки считывания и образованию стоп-кодона в положении 112. Вместо «полноценной» молекулы ДТ, которая состоит из 560 аминокислотных остатков, продуктом гена tox является пептид, состоящий из 37 аминокислот [6]. Второй
РАЗДЕЛ III
механизм связан с наличием в составе гена tox инсерционного элемента.
Генетическая структура С. diphtheriae гетерогенна - зарегистрирован 31 риботип (таблица). При этом 23 риботипа объединяли токсигенные штаммы, 20 риботипов - нетоксигенные штаммы, 13 риботипов включали как токсигенные, так и нетоксигенные штаммы. Иными словами, между токсигенными и нетоксигенными С. diphtheriae существует филогенетическая связь. Особо обращает внимание принадлежность некоторых нетоксигенных штаммов к риботипам 'Sankt-Pterburg/Rossija', доминирующих среди токсигенных штаммов биовара gravis, а также наличие нетоксигенных штаммов в риботипе 'Otchakov', доминирующего среди токсигенных штаммов биовара mitis
[11]. Из 12 риботипов, объединяющих токсигенные и нетоксигенные штаммы, 5 риботипов включали в том числе и НТТН-штаммы ('Otchakov', 'Cluj', 'Dagestan', 'Londinium', 'Shchwarzenberg').
таблица.
Филогенетическая связь между представителями С. diphtheпae, различающихся по признаку токсигенности
вида
Риботип Регистрация риботипов среди штаммов с. diphtheriae
токси- генных нетоксигенных
«истинно» нетоксигенных нетоксигенных токснесущих
1. 'Sankt-Peterburg'(G 1) + +
2. 'Rossija' (G 4) + +
З. 'Buzau' (G 3) + +
4. 'Vladimir7 (G 4v) + +
5. 'Otchakov'(M 1,M 1v) + + +
6. 'var. Preston' (M 7) + +
7. 'Atlanta' (M 8) + +
8. 'Schwarzenberg' + + +
9. 'Cluj' (M 13) + + +
10. 'Londinium' + + +
11. 'Dagestan' + + +
12. M 14 + +
1З. 'Lyon' (M 11) + +
14. 'Kaliningrad' (M 2) +
15. 'Vladimir 711' (M 3) +
16. 'Colindale' (M 4) +
17. 'Vladimir 713' (M 5) +
18. Washington' (M 6) +
19. 'Mogilev' (M 9) +
20. 'Pakistan' +
21. 'Ras-el-Ma +
22. 'Vrancea' +
2З. M 15 +
24. 'Atlanta 767' (M 12) +
25. 'Moskva' + +
26. 'Iasi' + +
27. 'Versailes' + +
28. 'Burinum' +
29. NTTB 1 'var Ras-el-Ma' + +
ЗО. NTTB 2 +
З1. NTTB 3 + +
Изучено географическое распространение штаммов, объединенных одним риботипом, но различающихся по признаку токсигенности. Циркуляция одноименных риботипов токсигенных и нетоксигенных С. diphtheriae отмечена в ряде регионов (г.г. Москве, С.-Петербурге, Калининграде, Владимире, Пензе, Красноярском крае).
Отмечена также циркуляция одноименных риботипов нетоксигенных и НТТН-штаммов в г. Москве ('Iasi', 'Cluj', 'Londinium', 'Dagestan'), г. С.-Петербурге (Versailes'), г. ^ли-нинграде ('Cluj'), г. Пензе ('Cluj'), г. Красноярске ('Moskva'). Во Владимирской области зарегистрированы НТТН-штаммы и токсигенные шт. риботипа Londinium. Риботип 'Londinium', включающий токсигенные, нетоксигенные и НТТН-штаммы, не регистрировали до 2001 г. Однако в 2001-2003 гг. среди токси-генных штаммов недоминирующих риботипов его удельный вес был самым высоким (10, 3%) и зарегистрирован он был на значительной части территории России - в Центральном и Северо-Западном федеральных округах. Несомненно, штаммы риботипа 'Londinium' представляют интерес как возможный резервуар формирования новых доминирующих штаммов возбудителя дифтерии, т. к. с помощью экспериментов по фаговой конверсии продемонстрирована способность штаммов риботипа 'Londinium' приобретать ген tox и продуцировать дифтерийный токсин. Конвертанты стабильно продуцировали токсин в течение срока наблюдения - 6 месяцев.
Нельзя также исключить вероятность «вырезания» токсиген-ного коринефага из хромосомы C. diphtheriae. Известно, что на хромосоме как токсигенных, так и нетоксигенных C. diphtheriae имеются сайты прикрепления коринефага - attB1 и attB2. В то же время, у некоторых нетоксигенных штаммов, принадлежащих к риботипу 'Sankt-Peterburg/Rossija (доминирующему среди токсигенных штаммов), обнаружен только один сайт прикрепления - attB2. Можно предположить, что данные нетоксигенные штаммы происходят от токсигенных штаммов. В процессе вырезания профага, в результате ошибки, могла произойти его элиминация вместе с attB-сайтом, в который профаг был интегрирован.
Выводы. Установленные особенности распространения токсигенных и нетоксигенных штаммов, генов рРНК, tox, dtxR, attB-сайтов свидетельствуют о взаимодействии в процессе циркуляции штаммов, принадлежащих к одному виду -С. diphtheriae, но различающихся по признаку токсигенности. Очевидно, что одной из составляющих такого взаимодействия может быть приобретение признака токсигенности в процессе фаговой конверсии. Не исключена вероятность утраты циркулирующими токсигенными штаммами способности к токси-нообразованию при выключении экспрессии гена tox вследствие мутаций, включения в его состав инсерционного элемента, или «вырезания» токсигенного профага из хромосомы С. diphtheriae. В референс и региональных центрах по мониторингу возбудителя дифтерии целесообразно проводить наблюдения за циркуляцией как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae. Такие исследования особенно
актуальны в периоды низкой и спорадической заболеваемости дифтерией, когда возможно формирование новых эпидемических штаммов возбудителя дифтерии.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Groman N. Conversion by corynepphages and its role in the natural history of diphtheria. J. Hyg., 1984. Vol. 93. № 3. P. 405-412.
2. Groman N.B., Cianciotto N. A beta related corynebacteriophages wich lack a tox allele that can acquire it by recombination with converting phage. Infect. Immun., 1985. Vol. 49. № 1. P. 32-35.
3. Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Жилина Н.Я. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания. МУ 4.2.698-98. М.: Интэрсэн, 1998. 47 с.
4. Regnault B., Grimont F., Grimont PAD. Universal ribotyping method using a chemically labeled oligonucletide prope mixture. Res. Microbiol., 1997. Vol. 148. № 8. P. 649-659.
5. Nakao H., Mazurova I.K., Glushkevich T., Popovic T. Analysis of heterogeneity Corynebacterium diphtheriae toxin gene, tox, and its regulatory element, dtxR, by direct sequencing. Res. Microbiol., 1997. Vol. 148. № 1. P. 45-54.
6. Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Воложанцев Н.В., Веревкин В.В., Волковой К.И., Мазурова И.К Характеристика нетоксигенных штаммов Oorynebacterium diphtheriae, несущих ген дифтерийного токсина. Журн. микробиол., 2004. № 1. С. 3-7.
7. Адамс М. Бактериофаги. М.: ИЛ, 1961. 527 с.
8. Rappuoli R., Ratti G. Physical map of the chromosomal region of Corynebacterim diphtheriae containing corynephage attachment sites attB1 and attB2. J. Bacteriol., 1984. Vol. 158. № 1. P. 325-330.
9. Мазурова И.К. Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерии: Автореф. дис. докт. мед. наук. М, 1993.
10. Love J.F., vanderSpek J.R., Marin V., Guerrero L., Logan T.M., MurphyJ.R. Genetic and biophysical studies of diphtheria toxin repressor (DtxR) and the hyperactive mutant DtxR (E175K) support a multistep model activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004. Vol. 101. № 8. P. 2506-2511.
11. Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г., Костюкова Н.Н., Волковой К.И., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Efstratiou A. Генетическая структура штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России при разной интенсивности эпидемического процесса дифтерии. Журн. микробиол., 2001. № 3. С. 3-8.
РАЗДЕЛ III
