CC BY
73
Мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции
И.К. Мазурова1, С.Ю. Комбарова1, О.Ю. Борисова1, В.Г. Мельников2,
Н.М. Максимова1, Н.Т. Гадуа1, Л.С. Наумов1, Н.В. Воложанцев3
1 ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии
и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора ([email protected])
2 Международный научно-технический центр, Москва ([email protected])
3 ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора ([email protected])
Резюме
Представлен микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг штаммов Corynebacterium diphtheriae. Показаны их фено- и генотипическая изменчивость, гетерогенность биологических свойств, создающие широкие адаптационные возможности для возбудителя дифтерийной инфекции. Выявлены мутации в ^х-гене токсигенных штаммов и нетокси-генных токсинесущих штаммов С. diphtheriae. Обсуждаются возможные механизмы повышения продукции дифтерийного токсина возбудителя дифтерии, имевшего широкое распространение в эпидемии 90-х годов и в 70% случаев - в последние годы. Установлены связи между токсигенными, нетоксигенными и нетоксигенными токсинесущими штаммами С. diphtheriae.
Ключевые слова: дифтерия, фено- и генотипическая изменчивость, tox-ген, токсигенные, нетоксигенные токсинесущие и нетоксигенные штаммы С. diphtheriae
Abstraot
Monitoring of Corynebacterium Diphtheriae Strains
K. Mazurova1, S.Yu. Kombarova1, O.Yu. Borisova1, V.G. Melnikov2, N.M. Maximova1, N.T. Gadua1, L.S. Naumov1, N.V. Volozhancev3
1 Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology & Microbiology ([email protected])
2 International Science and Technology Center, Moscow (istcinfo@ istc.ru)
3 Federal State Institution of Science State research Center for Applied Microbiology & Biotechnology ([email protected])
The data on microbiological and molecular-genetic monitoring of C. diphtheriae strains were presented in this article. The authors showed their phenotyping and genotyping polymorphism and heterogeneity of biological properties that create wide adaptation possibilities for the existence of the diphtheria causative agent. The mutations in tox-gene of toxigenic strains and non toxigenic tox-bearing (NTTB) C. diphtheriae strains were discovered. A special attention was given to possible mechanisms of increasing production of diphtheria toxin by causative agent which circulated during the epidemics of 1990s and caused 70% of cases in recent years. The links between toxigenic, non-toxigenic and non-toxigenic tox-bearing C. diphtheriae strains were demonstrated.
Key words: diphtheria, phenotypic and genotyping polymorphism, tox-gene, toxigenic, non-toxigenic tox-bearing and non-toxigenic C. diphtheriae strains
В настоящее время заболеваемость дифтерией в России стабилизировалась на спорадическом уровне. Ее показатели на 100 тыс. населения в 2007 и 2008 годах составили 0,06 и 0,04 соответственно. В прошлом году заболело 50 человек (11 - дети, 4 - подростки, 35 - взрослые). Однако современное состояние эпидемического процесса не позволяет ослабить внимание к этой инфекции. Остается стабильно высокой доля непривитых среди заболевших, главным образом за счет взрослых. Сохраняются высокими процент тяжелых форм и особенно - летальность, что указывает на недостатки в выявлении больных легкими формами дифтерии и в клинической и лабораторной диагностике.
Высокий уровень охвата прививками населения (дети - 98,3%, подростки - 99,8%, взрослые - 95,8%) подтвержден результатами серологи-
ческого мониторинга - показатели защищенности населения от дифтерии находятся в соответствии с уровнем иммунизации. Однако на отдельных территориях уровень антитоксического противодифтерийного иммунитета ниже официальных сведений об охвате прививками. Это свидетельствует о серьезных недостатках вакцинопрофилактики на этих территориях и является прогностически тревожным сигналом.
Для дифтерийной инфекции характерна периодичность эпидемических подъемов. Со времени введения массовой иммунизации детского населения в 1959 году зарегистрирован только один межэпидемический период - в 70 - 80-х годах длительностью 18 лет (с некоторой интенсификацией эпидемического процесса в середине 80-х годов). После завершения последнего эпиде-
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009
мического цикла дифтерии 90-х годов (в 1993 г. -26,9 на 100 тыс. населения) низкий уровень заболеваемости дифтерией сохраняется последние девять лет, с небольшими подъемами в 2001 и 2002 годах на отдельных территориях. Дифтерийный анатоксин, защищая от заболевания, не препятствует носитель-ству возбудителя дифтерии и не всегда защищает от легких форм этой инфекции [8, 10, 13, 16]. Популяция возбудителя дифтерии гетерогенна, что способствует его сохранению в меняющихся условиях существования [2, 5, 10, 17, 24, 26].
Цель настоящего исследования - оценка адаптационных возможностей возбудителя дифтерии на этапе массовой вакцинопрофилактики. В работе обобщены результаты многолетних наблюдений за фенотипическими и генотипическими свойствами штаммов Corynebacterium diphtheriae, циркулировавших в России в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции [2, 5, 6, 10, 14, 21, 23, 24]. Основное внимание сфокусировано на характеристике штаммов, выделенных во время последнего эпидемического подъема дифтерии 90-х годов (1990 - 1995 гг.) и спада заболеваемости на фоне иммунизации детей и взрослых (1996 - 2003 гг.). Периодами сравнения стали предыдущие циклы дифтерийной инфекции: период высокой заболеваемости до введения в 1958 году планомерной массовой иммунизации детей дифтерийным анатоксином и спада заболеваемости на фоне иммунизации (40 - 70-е годы); период спорадической заболеваемости (80-е годы), включающий некоторую активизацию эпидемического процесса в 1983 - 1985 годах при сравнительно невысоких показателях заболеваемости.
Штаммы бактерий
Изучено 3193 штамма С. diphtheriae (токсиген-ных - 2162, нетоксигенных - 1031), выделенных на территориях семи федеральных округов России (Центрального, Северо-Западного, Приволжского, Южного, Уральского, Сибирского, Дальневосточного). Уровень токсинообразования (УТ) в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) установлен у 2162 штаммов, в риботипировании изучено 1068 штаммов, в энзимтипировании - 222 штамма, структура гена tox определена у 48 штаммов, гена dtxR - у 53 штаммов.
Микробиологическое исследование культур С. diphtheriae проводили согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции» [11].
Распространение С. diphtheriae на территории России оценивали, анализируя удельный вес био-варов gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных штаммов и показатели выделяемости (ПВ) токсигенных и нетоксигенных С. diphtheriae (количество положительных находок на 1000 лиц, обследованных с целью выявления С. diphtheriae). Исследование проводили на 65 территориях семи вышеназванных федеральных округов.
РНГА проводили с помощью коммерческого эри-троцитарнного дифтерийного диагностикума [11]. Ежегодно высчитывали среднеарифметический показатель обратных титров РНГА. Соответственно штаммы подразделяли на три группы по уровню токсинообразования:
• высокий (УТ 32 - 128);
• средний (УТ 8 - 16);
• низкий (УТ 2 - 4).
Риботипирование проводили в соответствии с рекомендациями [18, 23, 25]. С помощью ри-ботипирования штаммы C. diphtheriae объединяли в группы (риботипы) по общности генов рРНК.
Энзимтипирование проводили по методу [23].
Секвенирование генов tox и dtxR. Амплификацию генов tox и dtxR осуществляли по методике [21], а также с помощью олигонуклеотидных праймеров, разработанных в процессе исследования [14]. Секвенирование выполнено в фирме «Пинни» с помощью ABI PRISM BigDye Terminator Cycle sequencing ready reaction kit на ABI DNA-секвенаторе jerkin Elmer Applied Biosystems).
Эксперименты по фаговой конверсии нетоксигенных С. diphtheriae в токсигенные проводили согласно [1] в нашей модификации. Выявление сайтов прикрепления токсигенных коринефагов к хромосоме C. diphtheriae осуществляли с помощью метода ДНК-ДНК-гибридизации [22].
Структура популяции возбудителя дифтерии
Высокий уровень внутривидового биологического разнообразия C. diphtheriae определяется гетерогенностью генетической структуры. Так, среди штаммов С. diphtheriae, циркулирующих в России, зарегистрирован 31 риботип. Однако распределение различных вариантов (генотипов) в популяции возбудителя дифтерии не хаотично, а имеет определенную структуру, зависящую от периода и стадии развития эпидемического процесса (рис. 1).
В 40 - 70-х годах XX века доминировали штаммы биовара gravis риботипа Lyon (84,6%), в 80-х годах при преобладании биовара mitis популяция была гетерогенна по риботипам (не менее шести риботипов). По удельному весу выделялись штаммы биовара mitis риботипа Otchakov (29,4%) и биовара gravis риботипов Sankt-Peterburg/Rossija (23,5%). Во время эпидемического подъема 90-х годов штаммы био-вара gravis риботипов Sankt-Peterburg/Rossija абсолютно доминировали на всей территории страны (75 - 96,1%). С помощью метода популяционного анализа (энзимтипирования) установлено, что риботипы Sankt-Peterburg/Rossija принадлежали к единой клональной группе штаммов (энзимтипы комплекса 8), что является доказательством происхождения из единого источника [19, 23, 24].
Доминирование риботипов Sankt-Peterburg/ Rossija сохранялось и при снижении интенсивности
Рисунок 1.
Структура популяции токсигенных С. diphtheriae, выделенных в России в различные периоды эпидемического процесса
ю
о
ф
СП
_0
I
_о
4s
£
% 200 180 -160 -
00
£140
СО
§ 120
100 -80 -60 -40 -20 -
Удельный вес биовара gravis Удельный вес биовара mitis
Показатели заболеваемости дифтерией на 100 тыс. населения
Биовар gravis,
CD т- СО
CD О О
CD О О
122
Годы
эпидемического процесса, однако с 1997 года в популяции возбудителя дифтерии отмечены изменения. Постепенно снижался удельный вес риботипов Sankt-Peterburg/Rossija (до 72,1% в 2003 г.), удельный вес риботипа Otchakov, напротив, увеличивался (до 17 в 2003 г.). Помимо риботипа Otchakov зарегистрировано еще десять риботипов, большинство из которых (семь из десяти) принадлежало к биовару mitis. Ряд риботипов (Londinium, Vrancea, Pakistan, Schwarzenberg и Ras-el-Ma) зарегистрированы впервые только в период снижения уровня заболеваемости в 2001 - 2003 годах.
Показано, что в периоды эпидемических подъемов популяция гомогенна по штаммовому составу (биоварам, риботипам, энзимтипам), а в период спорадической заболеваемости - приобретает гетерогенную структуру. Высокий уровень гетерогенности позволяет популяции возбудителя дифтерии «выдвигать» определенные варианты (эпидемические штаммы), способные к инфицированию большого числа людей, у которых к этим штаммам не сформирована антиколонизационная резистентность.
Патогенные свойства возбудителя дифтерии. Структура генов, ответственных за синтез дифтерийного токсина
В течение периода массовой иммунизации не произошло «сапрофитизации» дифтерийного микроба, напротив, имеется тенденция к усилению его патогенности [2, 10, 15]. Несомненно, высокий уровень коллективного антитоксического иммунитета,
защищая от заболевания, ограничивает распространение токсигенных штаммов С. diphtheriae. Вместе с тем можно предположить, что давление антитоксического иммунитета может быть одной из причин изменения токсических свойств возбудителя.
Уровень токсинообразования у штаммов возбудителя дифтерии, распространенных в 80-х и 90-х годах, был высоким. Вместе с тем зарегистрированы различия в показателях УТ штаммов этих двух периодов. В период спорадической заболеваемости дифтерией в середине 80-х годов среднестатистические показатели УТ равны 43,0 - 44,0. Однако к 1987 году УТ снизился до 27,0 (разница статистически достоверна). В последующие два года, несмотря на снижение показателей заболеваемости, наблюдалось увеличение показателей УТ до 45,0 и 53,3 соответственно. Это свидетельствовало о начале перестройки популяции возбудителя дифтерии с селекцией высокотоксигенных штаммов. В период эпидемического подъема при доминировании штаммов эпидемической клональной группы (биовара gravis риботипов Sankt-Peterburg/Rossija, энзимти-пов комплекса 8) показатели УТ достигли высоких значений - 56,9 - 59,0. Во время снижения уровня заболеваемости дифтерией высокотоксигенные штаммы продолжали циркулировать [2, 7, 15].
За способность продуцировать дифтерийный токсин отвечает ген дифтерийного токсина (tox), находящийся в составе профага. Уровень продукции токсина (экспрессия структурного гена tox) регулируется хромосомальным геном dtxR, ответственным за синтез регуляторного железозависи-
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009
мого белка-репрессора DtxR. В операторе гена О имеется участок ДНК, с которым взаимодействует белок-репрессор, препятствуя считыванию tox-мРНК и, следовательно, продукции дифтерийного токсина. При дефиците железа белок-репрессор инактивируется и начинается синтез токсина [20].
Структуру генов О и dtxR, определенную с помощью секвенирования, у циркулирующих штаммов сравнивали с нуклеотидной последовательностью данных генов у российского производственного вакцинного штамма PW8. Несоответствия нуклеотидов у изучаемых штаммов со штаммом PW8 расценивали как мутации. По сочетанию мутаций установлено семь аллельных вариантов по гену О и десять аллельных вариантов по гену dtxR [6, 7, 21].
Отличительной особенностью структуры гена dtxR штаммов риботипов Sankt-Peterburg/Rossija, доминировавших во время эпидемии дифтерии в России в 90-х годах и во время снижения заболеваемости, было наличие мутации в нуклеотидной последовательности в положении 440 (С ^ Т), соответствующей замене аланина на валин (А147V) в аминокислотной последовательности регуляторного белка DtxR.
В экспериментах по химическому мутагенезу гена dtxR установлено, что мутация А147V способна нарушать функцию белка DtxR и приводить к повышенной экспрессии гена О [28]. Мутация A147V расположена в области богатого пролином «мостика», связывающего N и С-терминальные домены. Более того, в положении 147 находится последняя, 23-я аминокислота этого «мостика», примыкающая непосредственно к С-терминальному домену. Данная структура («мостик») участвует в связывании С- и ^терминальных доменов друг с другом при активации белка DtxR с помощью ионов железа [20]. Учитывая более низкую подвижность валина по сравнению с аланином, можно предположить недостаточно эффективное связывание С- и ^терминальных доменов у мутантного белка DtxR штаммов эпидемической клональной группы. Следствием мутации могло стать снижение активности белка DtxR, что привело к повышению продукции токсина. Вместе с тем описаны и другие механизмы повышения уровня токсинообразования у циркулирующих штаммов С. diphtheriae, например мутации в промоторной области гена О [4].
Таким образом, повышенный уровень токси-нообразования циркулирующих штаммов усиливает опасность современного возбудителя дифтерии для непривитых лиц. Итоги эпидемии 90-х годов ХХ века стали ярким свидетельством этого утверждения. В 90-х годах по сравнению с предыдущим периодом (80-е годы) наблюдали более тяжелое течение дифтерии: возрастание числа манифестных форм и появление гипертоксической дифтерии. Критерием диагностики последней стала 100%-ная летальность [9, 15].
Существует опасность качественных изменений структуры дифтерийного токсина, продуцируемого
современными штаммами. Выявлена мутация в положении 1252 (G ^ С) в консервативном гене дифтерийного токсина (tox). Такая перестановка соответствует замене гидрофобной аминокислоты глицин на гидрофильную аминокислоту аргинин (G393R) в аминокислотной последовательности дифтерийного токсина. Именно такие контрастные замены, изменяя конформацию белковых молекул, влияют на функциональное состояние белков. Данная замена локализована в домене R фрагмента B дифтерийного токсина, осуществляющего взаимодействие токсина с чувствительной эукариотической клеткой. Фрагмент В содержит основные антигенные детерминанты, к которым вырабатываются антитоксические антитела.
Накопление подобных мутаций в дальнейшем может привести к появлению штаммов с измененной структурой дифтерийного токсина, против которых современный анатоксин может оказаться неэффективным.
Циркуляция токсигенных и нетоксигенных С. diphtheriae
Вид С. diphtheriae включает не только токси-генные микроорганизмы, но и нетоксигенные, которые не вызывают дифтерию. Описаны и так называемые нетоксигенные токсинесущие штаммы (НТТН-штаммы), имеющие в геноме ген tox, но не продуцирующие токсин [10]. Установлено два механизма блокирования гена tox у НТТН-штаммов. Обнаружена делеция в гене tox одного из нуклеотидов G в положении 52 - 55. Последняя приводит к сдвигу открытой рамки считывания и образованию стоп-кодона в положении 112. Вместо «полноценной» молекулы ДТ, которая состоит из 560 аминокислотных остатков, продуктом гена tox является пептид, состоящий из 37 аминокислот [14]. Второй механизм связан с наличием в составе гена tox инсерционного элемента.
Удельный вес циркулирующих НТТН-штаммов непостоянен, максимальное их количество зарегистрировано на этапе снижения заболеваемости после эпидемического подъема 90-х годов [2, 6, 14]. Установлены особенности циркуляции токсиген-ных, нетоксигенных и НТТН-штаммов. Показано, что циркуляция нетоксигенных С. diphtheriae более интенсивна по сравнению с токсигенными. При этом динамика распространения как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов соответствует динамике показателей заболеваемости дифтерией. При анализе удельного веса биоваров нетоксигенных штаммов выявлена противоположная тенденция, а именно доминирование биовара mitis нетоксигенных штаммов при доминировании биовара gravis среди токсигенных [6, 12]. Таким образом, среди нетоксигенных С. diphtheriae преобладает биовар, который, вероятно, будет доминировать в следующем эпидемическом цикле среди токсигенных С. diphtheriae.
У нетоксигенных штаммов обнаружен ген dtxR. Это указывает на наличие в хромосоме нетокси-
генных С. diphtheriae системы негативной регуляции экспрессии гена tox, при отсутствии последнего у нетоксигенных С. diphtheriae [6, 21].
Циркулирующие токсигенные и нетоксигенные штаммы С. diphtheriae характеризуются общими особенностями структуры генов рРНК. Так, из 31 зарегистрированного риботипа 12 (38,7%) -включали как токсигенные, так и нетоксигенные штаммы. Из этих 12 риботипов пять содержали в том числе и НТТН-штаммы. В экспериментах по фаговой конверсии продемонстрирована возможность современных циркулирующих штаммов ри-ботипа Londinium приобретать ген дифтерийного токсина и способность продуцировать токсин.
Нельзя также исключить вероятность «вырезания» токсигенного коринефага из хромосомы С. diphtheriae. На хромосоме как токсигенных, так и нетоксигенных С. diphtheriae имеются сайты прикрепления коринефага - аПВ1 и аПВ2. В то же время у некоторых нетоксигенных штаммов, принадлежащих к риботипам Sankt-Peterburg/Rossija (доминирующим среди токсигенных штаммов), обнаружен только один сайт прикрепления - аПВ2 (рис. 2, линии 4, 5). Можно предположить, что данные нетоксигенные штаммы происходят от токсигенных штаммов. В процессе «вырезания» профага в результате ошибки могла произойти его элими-
нация вместе с attB-сайтом, в который профаг был интегрирован.
Итак, результаты многолетних наблюдений свидетельствуют о высоких адаптационных возможностях возбудителя дифтерии, который продолжает циркулировать среди людей, иммунизированных дифтерийным анатоксином. С биологических позиций существование возбудителя при колонизации слизистой ротоглотки человека на фоне высокого уровня антитоксических антител является оптимальным способом сохранения его в природе, так как гибели хозяина при бактерионосительстве и легкой локализованной дифтерии не происходит и это «выгодно» возбудителю.
Выявлена гетерогенность ряда биологических свойств C. diphtheriae - генетических, токсигенных, биохимических - генов рРНК (31 рибо-тип), гена tox (7 аллельных вариантов), гена dtxR (10 аллельных вариантов), биоваров (gravis и mitis), токсигенных свойств (штаммы высокого, среднего и низкого УТ). Однако при нарушении равновесия в паразитарной системе «человек -возбудитель дифтерии» вследствие накопления количества неиммунных лиц, скрытого бактерионосительства, невыявленного при бактериологическом обследовании, заноса ранее не циркулировавшего штамма, изменчивости возбудителя,
Рисунок 2.
ДНК-ДНК-гибридизация с зондом к attB-сайтам C. diphtheriae
1.
2.
3.
4.
10.
11.
12.
13.
Нетоксигенный штамм C. diphtheriae С7 (-)
Токсигенный штамм C. diphtheriae С7 (р) (коринефаг внедрен в attB2-cam)
Производственный вакцинный штамм PW8 (коринефаг внедрен в оба attB-сайта)
388-97 - нетоксигенный штамм, не несущий гена tox, биовара gravis риботипа Rossija, выделенный в Калининграде (отсутствует attBI- сайт)
148-97 - нетоксигенный штамм, не несущий гена tox, биовара gravis риботипа Sankt-Peterburg, выделенный в Москве (отсутствует attBI- сайт)
196-93 - токсигенный штамм биовара gravis риботипа Sankt-Peterburg, выделенный в Санкт-Петербурге (коринефаг внедрен в attBI-сайт)
58-96 - токсигенный штамм биовара gravis риботипа Rossija, выделенный в Москве (коринефаг внедрен в attBI-сайт)
381-96 - токсигенный штамм биовара mitis риботипа Otchakov, выделенный в Санкт-Петербурге (коринефаг внедрен в attBI-сайт) 13-97 - нетоксигенный штамм, несущий ген tox, биовара mitis риботипа Moskva, выделенный в Челябинске (коринефаг внедрен в attB2-сайт)
243-97 - нетоксигенный штамм, несущий ген tox, биовара mitis риботипа Moskva, выделенный в Москве (коринефаг внедрен в attB2-сайт) 10-96 - нетоксигенный штамм, несущий ген tox, биовара mitis риботипа Moskva, выделенный в Калининграде (коринефаг внедрен в attB2-сайт)
170-97 - нетоксигенный штамм, несущий ген tox, биовара mitis риботипа Moskva, выделенный в Москве (коринефаг внедрен в attB2-сайт) C. diphtheriae С7 (-)
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009
ухудшения социально-экономических и экологических условий жизни людей возможны новый эпидемический подъем и повсеместное распространение эпидемического варианта возбудителя дифтерии. Так, в 90-х годах ХХ века доминировала клональная группа энзимтипов комплекса 8, риботипов Sankt-Peterburg/Rossija биовара gravis высокого уровня токсинообразования.
В течение периода массовой иммунизации не произошло ослабления патогенных свойств возбудителя дифтерии или его «сапрофитизации», как полагали некоторые исследователи, напротив, наблюдается тенденция к их усилению, что особенно опасно для непривитых.
После завершения эпидемического цикла дифтерийной инфекции 90-х годов в популяции возбудителя дифтерии зарегистрированы изменения в структуре генов патогенности - tox и dtxR, отражающиеся на аминокислотном уровне - в структуре дифтерийного токсина и белка DtxR, который является регулятором токсинообразования.
Особенности распространения токсигенных и нетоксигенных С. diphtheriae, общность их генетической структуры, наличие у нетоксигенных штаммов гена dtxR, аНВ-сайтов, способность современных нетоксигенных штаммов приобретать признак токсигенности и, напротив, «терять» ток-сигенный коринефаг свидетельствуют о наличии взаимодействия между токсигенными и неток-сигенными С. diphtheriae в процессе их циркуляции и об участии последних в формировании популяции возбудителя дифтерии.
Развитие исследований по наблюдению за распространением С. diphtheriae, получение новых знаний по биологическим свойствам других, помимо токсина, факторов патогенности, в частности связанных с фимбриальными структурами и ами-лазной активностью [3, 27], позволит в дальнейшем создать новые средства для иммунопрофилактики, лечения бактерионосителей и лабораторной диагностики дифтерийной инфекции.
Литература
1. Адамс М. Бактериофаги. - М.: ИЛ, 1961. - 527 с.
2. Борисова О.Ю. Патогенные и молекулярно-генетические свойства штаммов С.diphtheriae, циркулирующих на территории России в течение 1994 - 1998 гг.: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 1999. - 29.
3. Борисова О.Ю. Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях: Автореф. дис. . докт. мед. наук. - М., 2009. - 49 с.
4. Колодкина В.Л., Титов Л.П., Шарапа Т.Н. и др. Сайты точечных мутаций промоторной области tox-гена и гена регулятора dtxR, ассоциированные с уровнем токсинопродукции Corynebacterium diphtheriae, изолированных в Беларуси // Мол. ген. микробиол. и вирусол. 2007. № 1. С. 22 - 29.
5. Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г. и др. Генетическая структура штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России при разной интенсивности эпидемического процесса дифтерии // Журн. микробиол. 2001. № 3. С. 3 - 8.
6. Комбарова С.Ю. Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции: Автореф. дис. . докт. биол. наук. - М., 2007. - 49 с.
7. Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников В.Г. и др. Полиморфизм генов tox и dtxR у циркулирующих штаммов Corynebacterium diphtheriae // Журн. микробиол. 2009. № 1. С. 7 - 11.
8. Костюкова Н.Н. Уроки дифтерии // Журн. микробиол. 1999. № 2. С. 92 - 96.
9. Корженкова М.П. Клиника дифтерии в период высокой и низкой заболеваемости // Вакцинация. 2006. № 1 ( 43). С. 4 - 6.
10. Мазурова И.К. Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерии: Автореф. дис. . докт. мед. наук. - М., 1993. - 60 с.
11. Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю. и др. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания МУ 4.2.698-98. - М.: Интэрсэн, 1998. - 47 с.
12. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю. и др. Некоторые особенности циркуляции биоваров gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных штаммов С. diphtheriae // Проблемы инфекционных болезней. Ч. 1: Сб. науч. трудов Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского / Под ред. В.А. Алешкина. - М., 2000. С. 52 - 55.
13. Маркина С.С., Максимова Н.М., Черкасова В.В., Кошкина Н.И. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии в настоящее время // Вакцинация. 2006. № 1 (43). С. 7 - 11.
14. Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю. и др. Характеристика нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae, несущих ген дифтерийного токсина // Журн. микробиол. 2004. № 1. С. 3 - 7.
15. Платонова Т.В., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г. Биологические свойства C. diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в условиях различной интенсивности эпидемического процесса // Проблемы инфекционных болезней. Ч. 1: Сб. науч. трудов Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского / Под ред. В.А. Алешкина. - М., 2000. С. 55 - 59.
16. Шмелева Е.А., Макарова С.И., Батурина И.Г. и др. Специфические антитела и их роль в формировании противодифтерийного иммунитета // Журн. микробиол. 2005. № 1. С. 38 - 43.
17. Mokrousov I.V. Corynebacterium diphtheriae: genome diversity, population structure and genotyping perspectives // Infect. Genet. Evol. 2009. V. 9 (1). P. 1 - 15.
18. Grimont P.A.D., Grimont F., Efstratiou A. et al. International nomenclature for Corynebacterium diphtheriae ribotypes // Res. Microbiol. 2004. V. 155 (3). P. 162 - 166.
19. Kombarova S.Yu., Kim Ch., Melnikov V.G. et al. Rapid identification of Corynebacterium diphtheriae clonal group associated with diphtheria epidemic, Russian Federation // Emerg. Inf. Dis. 2001; 7: P. 133 - 136.
20. Love J.F., Vanderspek J.R., Marin V. et al. Genetic and biophysical studies of diphtheria toxin repressor (DtxR) and the hyperactive mutant DtxR (E175K) support a multistep model activation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101 (8). P. 2506 - 2511.
21. Nakao H., Mazurova I.K., Glushkevich T., Popovic T. Analysis of heterogeneity Corynebacterium diphtheriae toxin gene, tox, and its regulatory element, dtxR, by direct sequencing // Res. Microbiol. 1997. V. 148 (1). P. 45 - 54.
22. Rappuoli R., Ratti G. Physical map of the chromosomal region of Coryne-bacteruim diphtheriae containing corynephage attachment sites attBl and attB2 // J. Bacteriol. 1984. V (1). P. 325 - 330.
23. Popovic T., Kombarova S., Reeves M.W. et al. Molecular epidemiology of diphtheria in Russia, 1985 - 1994 // J. Infect. Dis. 1996. V. 174. P. 1064 - 1072.
24. Popovic T., Mazurova I.K., Efstratiou A. et al. Molecular epidemiology of diphtheria // J. Infect. Dis. 2000. V. 181. (Suppl. 1). P. S168 - S177.
25. Regnault B., Grimont F., Grimont PA.D. Universal ribotyping method using a chemically labeled oligonucleotide probe mixture // Res. Microbiol. 1997. V. 148 (8). P. 649 - 659.
26. Titov L., Kolodkina V., Dronina A. et al. Genotypic and phenotypic characterizations of Corynebacterium diphtheriae starins isolated from Belarus during an epidemic period // J. Clin. Microbiol. 2003. V. 41 (3). P. 1285 - 1288.
27. Ton-That H., Marrafini L., Schneewind O. Sortases and pilin elements involved in pilus assembly of Corynebacterium diphtheriae // Mol. Microbiol. 2004. V. 53 (1). P. 251 - 261.
28. Wang Z., S^mirt M.P., Holmes R.K. Characterization of mutations that inactivate the diphtheria toxin repressor gene (dtxR) // Infect. Immun. 1994. V. 62 (5). P 1600 - 1608.
