CC BY
22
йО! 10.29254/2077-4214-2018-1-1-142-384-388 УДК 612.649.011.87.014.3:615.014.41:547.569.2 Макашова О. е., Зубова О. Л., Зубов П. М., Бабйчук Л. О.
АНАЛ1З СТРУКТУРНО-ФУНКЦЮНАЛЬНОГО СТАНУ ГЕМОПОЕТИЧНИХ
ПРОГЕН1ТОРНИХ КЛ1ТИН КОРДОВОГ КРОВ1 ЛЮДИНИ П1СЛЯ
КР1ОКОНСЕРВУВАННЯ З ДМСО I АНТИОКСИДАНТАМИ ТА ПЕРЕНЕСЕННЯ
ДО УМОВ, ЩО МОДЕЛЮЮТЬ Ф1ЗЮЛОПЧН1
1нститут проблем крюбюлопГ i крiомедицини НАН УкраГни (м. Харкiв)
Зв'язок публ1кацГГ з плановими науково-до-сл1дними роботами. Дана робота виконана у вщ-повщност з плановою тематикою науково-дослщно! роботи вiдцiлу крiоцитологiI «Вивчення механiзмiв модифiкацiI структурних параметрiв та метаболiчно-го стану яцровмiсних клiтин кордово! та еритроцитiв донорсько! кровi пщ впливом рiзних крiозахисних розчинiв та низьких температур», № державно! ре-естраци0114Ш01320.
Вступ. Використання гемопоетичних проге-нiторних кгмтин (ГПК) корцово! кровi (КК) люцини мiцно увмшло в практичну медицину розвинутих кра!н свiту як ефективний метод лкування патоло-гiй кровi, iмунно! системи, порушень обмiну речо-вин, онколопчних та iнших захворювань [5]. Завцяки !! унiкальним властивостям, вiцноснiй простой та безпецi заготiвлi, КК стала одним iз найбiльш за-требуваних джерел ГПК [12]. Щорiчно юльюсть про-ведених трансплантацiй збiльшуеться, а показання до даного виду терапи розширюються. Пiцвищення частоти застосування КК в кл^чнм практицi зумо-вили необхщнють створення !! запасiв i тривалого зберiгання. Розрив у час мiж моментом заготiвлi КК i введенням !! в органiзм рецитента визначае необ-хiцнiсть застосування технолопй, що дозволяють зберiгати матерiал в бюлопчно повноцiнному станi. Вирiшення цього завдання можливе лише при дов-гостроковому зберiганнi КК в замороженому стан [3]. Iснуючi протоколи низькотемпературного кон-сервування ГПК заснованi на використанн проника-ючого крiопротектора ДМСО в рiзних концентрацiях. Проте вщомо, що пiц час крiоконсервування спосте-рiгаеться пригнiчення роботи антиоксидантно! системи, порушення впоряцкованостi структури мемб-рани та вихiц глутатiону з органел, що призводить до збтьшення рiвня АФК у клiтинах пюля перенесення !х у кровоносне русло та розвитку перекисного окис-лення лтщв [9]. До того ж, юнують припущення, що в початковий перюд пiсля вiцiгрiвання рiвень ПОЛ л^ мiтуеться структурними антиоксидантами глутатюн-пероксидазно! системи. У зв'язку з цим, для пщви-щення ефективност крiоконсервування препаратiв кордово! кровi важливим завданням е не тiльки про-ведення !х оцiнки вiцразу пюля розморожування, а
й визначення вщстроченого виживання клiтин пiсля перенесення до фiзiологiчних умов, а додавання до крюзахисного середовища антиоксицантiв може знизити штенсивнють утворення АФК при крюкон-сервуваннi та розвиток негативних процеЫв в клгги-нах [6].
Виходячи з цього, метою роботи було проана-лiзувати структурно-функцiональний стан ГПК КК, крюконсервованих у захисних розчинах, що мютять рiзнi концентрацi! ДМСО та антиоксидан^в, пiсля перенесення до умов, що моделюють фiзiологiчнi.
Об'ект I методи досл1джень. У робот викорис-товували КК людини, збiр яко! проводили пiсля отри-мання Сформовано! згоди у вагiтно!, з попередым проведенням ретельного допологового скриншгу на наявнiсть протипоказань до донорства. Ексфузт кровi зцiйснювали закритим шляхом у систему для забору кровi з 25 мл антикоагулянту з пупково! вени пщ час природних полопв пiсля народження дитини й в^тення !! вiц плаценти.
Видтення фракцi! ЯВК iз цiльно! КК проводили методом седиментацп в пол^люкн (6%-й розчин декстрану (ОАО «Бюфарма», Укра!на) з молекуляр-ною масою 60000). Для цього спочатку до кровi додавали полiглюкiн у стввщношены 1:1, потiм вщ-стоювали до чтеого розпоцiлу еритроцитарного шару та фракци яцровмiсних клiтин. Час седиментацп складав вiц 30 до 50 хв, пюля чого супернатант вщбирали та центрифугували протягом 5-7 хв. при 1000 об/хв для отримання концентрату ЯВК.
У клггинну суспензт вносили 25%-й розчин ДМСО до юнцевих концентрацм у пробi 5; 7,5 та 10%. Суспензп клггин обробляли крiопротектором при низьюй позитивнiй температурi (0-4°С). Перед змшуванням суспензiю клiтин i розчини крюпротек-тора доводили до вщповщних температур; ДМСО додавали крапельно при постмному перемiшуваннi.
Антиоксиданти вносили на етап обробки крю-протектором в наступних концентра^ях: аскорбшо-ва кислота - 0,1 та 0,15 мМ; Ы-ацетил-Ьцистеш - 10 та 15 мМ; глутатюн - 1 i 3 мМ («Э1д ma-Aldrich», США).
Зразки крюконсервували в програмному замо-рожувачi «Огуозоп» (Нiмеччина) зi швидюстю 1-3 град/хв до -80°С з наступним зануренням у рщкий
Таблиця.
Збереженють та життездатшсть гемопоетичних прогенiторних клiтин кордовоУ KpoBi, крюконсервованих в розчинах i3 рiзною концентрацieю ДМСО, пiсля перенесення до умов, що моделюють фiзiологiчнi, %
Конц. ДМСО, % Гемопоетичш прогешторш кл^ини (CD34+)
Збереженють Життездатнiсть
5 А 70,1±2,4 80,1±3,2
Б 41,2±3,1* 50,2±2,4*
7,5 А 78,3±3,1 82,6±2,4
Б 59,8±2,2* 65,4±1,9*
10 А 79,1±2,9 81,4±2,1
Б 62,3±1,5* 61,8±2,7*
Прим1тка: Данi представлено у вiдсотках, у виглядi M±SE. А -даы, отриманi одразу пiсля розморожування; Б - даы, отриманi пiсля крюконсервування та перенесення до умов, що моделюють фiзiологiчнi;
* - рiзниця статистично значуща по вiдношенню до контрольних значень, отриманих одразу пюля розморожування; р<0,05.
азот (-196°С) [1]. Вiдiгрiвання здiйснювали за тем-ператури 37-40°С на водянiй банi при постмному погойдуваннi до зникнення твердо!' фази.
Абсолютну кiлькiсть клiтин пщраховували в ка-мерi Горяева згщно зi стандартно! методики [7]. Збереженють кл^ин визначали як вiдсоток ктькост клiтин у дослiджуваному зразку по вщношенню до початковоУ ïx ктькост до будь-якого впливу (нкуба-щя з крiопротектором, заморожування-вiдiгрiв).
Життездатнiсть С034+-кл^ин оцiнювали за стан-дартним протоколом ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering) з викорис-танням моноклональних антитiл CD45FITC, CD34PE i ДНК-барвника 7-амiноактиномiцину D (7AAD) [15] методом проточно)' цитофлуориметрп. Для цього до 50 мкл цты-ioï KpoBi додавали по 10 мкл реаген^в. Перемшува-ли й нкубували 15 хв за кiмнатноï температури в темрявк Для лiзису еритроци^в до кожно) пробiрки додавали 1 мл розчину хлориду амоню («BD», США). Аналiзували проби за допомогою програмно-го забезпечення «CELLQuest Proс («BD»).
Моделювання трансфузiï проводили шляхом перенесення кл^ин у розчин Хенкса i нкуба-цiï )х при 37еС протягом годи-ни. Розведення складало 1:10. ^сля iнкубацiï клiтинноï суспен-зп в розчинi Хенкса проводили центрифугування при 1000 об/хв (ОПН-3) протягом 5 хв з подаль-шим видаленням супернатанту.
Статистичну обробку результат проводили методом Стью-
дента-Фшера з використанням програми «Excel» («Microsoft Office», США), пюля встановлення нормальной розподту. Данi представлено як M±m. Вiдмiнностi вважали статистично значущими при р<0,05.
Результати дослiджень та Ух обговорення.
Осктьки в наших роботах [2,10] було показано, що пщ час крюконсервування ядровмюы кл^ини, до складу яких входять гемопоетичш прогенiторнi, пщ-даються значному окисному стресу, що в подаль-шому може призвести до зниження ефективност препара^в КК, нами була проведена оцЫка вщстро-ченоï збереженостi та життездатност клiтин пiсля розморожування. Для цього ми застосували тдхщ iз моделювання трансфузiï. В експериментi застосували просту модель, вщтворюючи лише основы принципи трансфузп: розведення деконсервованоï клiтинноï суспензiï, яке вiдбуваеться природним чином у кровоносному русл рецитента, iзоосмотич-нiсть середовища та температуру нкубацп (370С). Пiдтримання температури 370С протягом усього перiоду iнкубацiï кл^ин — важливий фактор, що до-зволяе виявити порушення метаболiзму, осктьки збереження кл^ин в умовах бтьш низьких температур маскуе можливий дисбаланс у кл^инному мета-болiзмi в силу уповiльнення практично вах процесiв зi зниженням температури. При моделюванн транс-фузiï було прийнято 10-кратне розведення суспензiï крiоконсервованиx ЯВК.
Таким чином, дана модель умов, що моделюють фiзiологiчнi, забезпечуе контроль основних пара-метрiв середовища для оцнки стабiльностi крюкон-сервованих ЯВК.
Отриман результати пiсля годинноï нкубацп показали, що найбiльшi показники збереженост та життездатностi ГПК були у пробах iз ДМСО в концен-трацiяx 7,5% та 10%, хоча й у даних групах спосте-р^алось достовiрне зниження даних показниюв на 20% порiвняно з даними, отриманими одразу тсля розморожування (табл.). У пробах, крюконсервованих iз 5% ДМСО, життездатнють була на рiвнi 50%.
Рис. 1. Збереженють та життездаттсть гемопоетичних прогетторних кттин кордовоГ кровi, крiоконсервованих в розчинах i3 рiзною концентрацiею ДМСО i аскорбшово'Г кислоти, пiсля перенесення до умов, що моделюють фiзiологiчнi.
Примiтка: Данi представлено у вщсотках, у виглядi M±SE. * - рiзниця статистично значуща по вщношенню до вщповщних контрольних значень без додавання антиоксиданта; р<0,05.
Рис. 2. Збережешсть та життeздатнiсть гемопоетичних прогенiторних клiтин кордовоГ KpoBi, крiоконсервованих в розчинах i3 рiзною концентрацieю ДМСО i Ы-ацетил-Ь-цистеТна, шсля перенесення до умов, що моделюють
фiзiологiчнi.
Примiтка: Данi представленi у вщсотках, у виглядi M±SE. * - pi3Hi/i^ статистично значуща по вщношенню до вiдповiдних контрольних значень без додавання антиоксиданта; р<0,05.
АК необхщно ретельно п1дбирати 11 концентрацию.
Анал1з даних щодо збереже-ност1 Ой34+-кл1тин п1сля перенесення до умов, що моделюють ф1зюлопчн1, показав достов1рне зб1льшення р1вня досл1джуваного показника в ус1х досл1джуваних зразках 1з концентрац1ями АК 0,1 та 0,15 мМ (рис. 1). Це може бути пов'язано напряму з антиокси-дантним ефектом дано! кислоти, який обумовлений перехоплен-ням АФК I !х вщновленням [8]. Причому важливо вщзначити, що додавання дано! бюлопчно активно! речовини до ДМСО у низькм концентрацп (5%) також здатне пщвищити збережен1сть ГПК на-в1ть п1сля перенесення !х до умов, що моделюють ф1зюлопчн1. Ана-л1з к1лькост1 життездатних ГПК (рис. 1) показав, що збшьшення даного показника на 4-6% спо-стер1галось в групах, як1 були крю-консервован1 п1д захистом ДМСО в концентрацп 5 та 7,5% у комб1-наци з аскорб1новою кислотою в концентрацп 0,1 I 0,15 мМ.
Даш л1тератури показують, що Ы-ацетил-Ьцистеш (АЦ) зца-тен значно знизити р1вень АФК, запоб1гти зниженню м1тохонцр1-ального мембранного потенц1а-лу та життездатност1, захистити вщ апоптотичних зм1н у кл1тинах, а також зменшити перекисне окислення л1п1д1в п1сля крюкон-сервування [11]. Тому наступним антиоксидантом, який було вико-ристано в робот1 став Ы-ацетил-Ь цисте!н. Анал1з даних, отриманих
„ „ гпсля перенесення ГПК, крюкон-
Рис. 3. Збережешсть та життездатнють гемопоетичних прогешторних кл1тин ^ пгл/^гл
кордовоГ кров1, кр1оконсервованих в розчинах !з р1зною концентрац1ею ДМСО сервованих п1д захист°М ДМСО
I глутат1ону, п1сля перенесення до умов, що моделюють ф1зюлопчш. та антиоксиданта АЦ у концен-
Примггка: Дан1 прецставлено у вщсотках, у вигляд М±БЕ. * - р1зниця статистично значуща трацИ 10 мМ та 15 мМ, д° умов, по в1цношенню цо вщповщних контрольних значень без цоцавання антиоксиданта; р<0,05. що моделюють ф1з1олог1чн1 (рис.
2), процемонстрував цостов1р-не пщвищення р1вня збереженост1 в ус1х експери-ментальних групах та, особливо в пробах !з ДМСО в концентрацп 7,5% (71,7%±4,1 та 76,4%±3,7) I 10% (74,6%±2,6 та 77,2%±3,2).
Застосування розчишв (10 та 15 мМ) даного ан-тиоксицанту сприяло збшьшенню р1вня життезцат-ност1 в ус1х пробах. Додавання даних концентрац1й до 7,5 та 10% ДМСО здатне зберегти в життездатно-му стаж цо 70% Ой34+-кл1тин, а в групах 1з 5% ДМСО - цо 57%.
Оскшьки важливою склацовою антиоксидант-ного захисту е система глутатюну, що нейтрал1зуе перекиси л1п1ц1в I п1цтримуе у вщновленому стан1 БИ-групи б1лк1в, забезпечуючи !х функц1ональну ак-тивн1сть [13], на наступному етап1 було цосл1цжено
У зв'язку з цим, доцшьно було провести цосл1-цження з оц1нки ефективност1 внесення антиокси-цант1в у крюзахисш розчини з метою запоб1гання розвитку окисного стресу в кл1тинах п1сля кр1окон-сервування.
1снують цан1, що п1ц час кр1оконсервування ас-корб1нова кислота (АК) покращуе крютолерантнють кл1тин та п1цвищуе прол1ферац1йну та м1тохонцр1-альну активн1сть, а також експрес1ю ген1в антиокси-цантних фермент1в СОД I глутат1онпероксицази та значно знижуе р1вн1 внутр1шньокл1тинного перокси-цу [4]. 1нш1 цан1 св1цчать, що висою концентрац1! АК 1нцукують потк И202 в присутност1 1он1в катал1тично-го металу, що призвоцить цо окислювального стресу в кл1тинах та апоптозу [14]. Тому при використанш
вплив глутатюну на вiдстрочену в 4aci загибель де-консервованих гемопоетичних прогеыторних клiтин кордово! кровi.
Аналiз збереженостi CD34+-клiтин пiсля перене-сення до умов, що моделюють фiзiологiчнi, проде-монстрував пiдвищення рiвня даного параметра у групах, крюконсервованих i3 додаванням глутатiону (рис. 3). Використання глутатюну у концентра^ях 1 та 3 мМ у комбiнацiI з ДМСО в концентра^ях 7,5% i 10% дозволяло зберiгати до 85% CD34+-клiтин в життездатному станi, що на 25% бтыше порiвняно з контрольними значеннями. Слiд зазначити, що ре-зулытати крiоконсервування CD34+-клiтин в розчи-нах, що мiстяты 5% ДМСО та ефективн концентрацiI глутатюну були на рiвнi даних, отриманих iз загаль-новживаними концентрацiями ДМСО (7,5% i 10%) без застосування антиоксиданту.
Висновки. Отриман резулытати свщчать про те, що iнкубацiя протягом години деконсервованих ГПК в умовах, що моделюють фiзiологiчнi, призводиты до зниження показниюв збереженостi й життездат-ностi порiвняно з даними, отриманими одразу пюля крiоконсервування. Тобто, стан клггин, визначений
одразу пiсля розморожування не може дати повну оцЫку якостi препаратiв кордово! кровi.
Додавання до крюзахисного середовища анти-оксидан^в забезпечувало достовiрне пiдвищення збереженостi та життездатност ГПК. При цьому додавання аскорбшово! кислоти до проб з 7,5-10% ДМСО пщвищувало кiлыкiсты життездатних клггин до 62-70%, використання АЦ - до 66-70%. Найбтыший цитопротекторний ефект мав глутатюн, який сприяв пщвищенню рiвня збереженостi та життездатност ЯВК КК до 80-85% пюля перенесення до умов, що моделюють фiзiологiчнi.
Перспективи подальших дослiджень. Оскть-ки надлишкове накопичення АФК в клгтинах здат-не привести до подальшо! загибелi клiтин шляхом апоптозу або некрозу, доцтьно буде провести до-слiдження впливу антиоксидантiв на кшькють ядров-мiсних клiтин, до складу яких входять гемопоетич-н прогенiторнi клiтини, якi перебувають на рiзних стадiях апоптозу/некрозу пiсля крюконсервування з ДМСО та перенесення !х до умов, що моделюють фiзiологiчнi.
Лiтература
1. Armitage S. Cord blood banking standards: autologous versus altruistic. Front Med (Lausanne). 2015;2:94.
2. Babijchuk LA, Makashova EE, Zubova OL, Zubov PM. Evaluation of the antioxidant properties of ascorbic acid at cryopreservation of cord blood nucleated cells with DMSO. Transplantation - present, past and future; 2014 Nov 7; Kyiv. Klitynna ta organna transplantologiya. 2015;2(2):166.
3. Ballen KK. New trends in umbilical cord blood transplantation. Blood. 2005;105:3786-92.
4. Castillo-Martin M, Bonet S, Morato R, Yeste M. Supplementing culture and vitrification-warming media with l-ascorbic acid enhances survival rates and redox status of IVP porcine blastocysts via induction of GPX1 and SOD1 expression. Cryobiology. 2014;68(3):451-8.
5. Chakraborty SK, Banu LA, Rahman MF, Paul S. Cord blood stem cells - a dream for future medicine. Mymensingh Med J. 2014;23(3):614-20.
6. Cheng Н, Gao Y, Shi M, Hu L. Antioxidant N-acetyl-L-cysteine increases engraftment of human hematopoietic stem cells in immune-deficient mice. Blood. 2014;124(20):45-8.
7. Davis JM, editor. Basic cell culture. A practical approach. Oxford University Press, Oxford; 2002. 382 р.
8. Garcia-Krauss A, Ferrada LA, Astuya N, Salazar K, Cisternas P, Martinez F, et al. Dehydroascorbic acid promotes cell death in neurons under oxidative stress: a protective role for astrocytes. Mol Neurobiol. 2016;53(9):5847-63.
9. Maeshima Y, Makino H. Molecular mechanism of cell injury. Contrib Nephrol. 2003;139:32-43.
10. Mykhailova OY, Makashova OY, Zubov PM, Babijchuk LA. Improving of cryoprotectant media for human cord blood nucleated cells cryopreservation. IIR Workshop on cold Applications in Life Sciences; 2016 Sept 8-9; Dresden; 2016. р. 131-4.
11. Partyka A, Nizanski W, Bajzert J, Lukaszewicz E, Ochota M. The effect of cysteine and superoxide dismutase on the quality of post-thawed chicken sperm. Cryobiology. 2013;67(2):132-6.
12. Rocha V, Gluckman E. Eurocord-Netcord registry and European blood and marrow transplant group. Improving outcomes of cord blood transplantation: HLA matching, cell dose and other graft- and transplantation-related factors. Br J Haematol. 2009;147(2):262-74.
13. Schafer FQ, Buettner GR. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Biol Med. 2001;30:1191-212.
14. Wang L, Luo X, Li C, et al. Triethylenetetramine synergizes with pharmacologic ascorbic acid in hydrogen peroxide mediated selective toxicity to breast cancer cell. Oxid Med Cell Longev. 2017;2017:3481710.
15. Zembruski NC, Schmid I, Stache V, Weiss J. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 2012;429(1):79-81.
АНАЛ1З СТРУКТУРНО-ФУНКЦЮНАЛЬНОГО СТАНУ ГЕМОПОЕТИЧНИХ ПРОГЕН1ТОРНИХ КЛ1ТИН КОРДОВО'1' КРОВ1 ЛЮДИНИ П1СЛЯ КРЮКОНСЕРВУВАННЯ З ДМСО I АНТИОКСИДАНТАМИ ТА ПЕРЕНЕСЕННЯ ДО УМОВ, ЩО МОДЕЛЮЮТЬ Ф1ЗЮЛОПЧН1
Макашова О. €., Зубова О. Л., Зубов П. М., Бабшчук Л. О.
Резюме. У po6oTi проведено порiвняльний аналiз впливу крюпротекторних сумшей, що мютяты pi3Hi концентраци проникаючого крюпротектора ДМСО та антиоксидан^в, при крюконсервуваны гемопоетичних прогеыторних кгмтин кордово! кровi людини та пюля перенесення !х до умов, наближених до фiзiологiчних. Показано, що додавання до крюзахисного середовища аскорбЫово! кислоти, N-ацетил-L-цисте!на або глутатюна сприяе пщвищенню показниюв збереженост та життездатност гемопоетичних прогеыторних клггин пюля перенесення !х до умов, що моделюють фiзiологiчнi. Найбтыший цитопротекторний ефект спостер^аетыся в пробах, крюконсервованих i3 7,5 i 10% ДМСО з додаванням глутатюну в концентраци 1 та 3 мМ, де збер^аетыся до 80% гемопоетичних клгтин в життездатному стаы, порiвняно з двома шшими анти-оксидантами в оптималыних концентра^ях, як забезпечуюты життездатнюты клгтин до 70%.
Ключовi слова: гемопоетичнi прогенiторнi клiтини кордово! кровi, крiоконсервування, ДМСО, аскорбшова кислота, N-ацетил-L-цисте!н, глутатiон.
АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК КОРДОВОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ С ДМСО И АНТИОК-СИДАНТАМИ И ПЕРЕНЕСЕНИЯ В УСЛОВИЯ, МОДЕЛИРУЮЩИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ
Макашова Е. Е., Зубова О. Л., Зубов П. М., Бабийчук Л. А.
Резюме. В работе проведен сравнительный анализ влияния криопротекторных смесей, содержащих различные концентрации непроникающего криопротектора ДМСО и антиоксидантов, при криоконсер-вировании гемопоэтических прогениторных клеток кордовой крови и после переноса их в условия, приближенные к физиологическим. Показано, что добавление к криозащитной среде аскорбиновой кислоты, N-ацетил^-цистеина или глутатиона способствует повышению показателей сохранности и жизнеспособности гемопоэтических прогениторных клеток после переноса их в условия, моделирующие физиологические. Наибольший цитопротекторный эффект наблюдается в пробах, криоконсервированных с 7,5 и 10% ДМСО с добавлением глутатиона в концентрации 1 и 3 мМ, где сохраняется до 80% гемопоэтических клеток в жизнеспособном состоянии, по сравнению с двумя другими антиоксидантами в оптимальных концентрациях, которые обеспечивают жизнеспособность только до 70% клеток.
Ключевые слова: гемопоэтические прогениторные клетки кордовой крови, криоконсервирование, ДМСО, аскорбиновая кислота, ^ацетил^-цистеин, глутатион.
ANALYSIS OF THE STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STATE OF HUMAN CORD BLOOD HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS AFTER CRYOPRESERVATION WITH DMSO AND ANTIOXIDANTS AND TRANSFER TO CONDITIONS CLOSE TO PHYSIOLOGICAL
Makashova O. Ye., Zubova O. L., Zubov P. M., Babijchuk L. A.
Abstract. The use of cord blood (CB) hematopoietic progenitor cells (HPCs) for the past 15 years has been firmly establishing in practical medicine as an effective treatment for diseases of various origins. In this regard, it remains relevant for the development of protocols for cells storage at low temperature. Most of them are based on the use of penetrating cryoprotectant DMSO in effective concentrations. However, they do not take into account that during cryopreservation HPCs are subjected to a significant stress, resulting in the decrease of the antioxidant system work, disruption of the membrane structure and the glutathione release from the organelles, which leads to an increase in the level of ROS in cells after transferring them to the bloodstream and the development of lipid peroxidation. In addition, there are suggestions that in the initial period after warming, the level of lipid peroxidation is limited by the structural antioxidants of the glutathione peroxidase system.
In this regard, to increase the efficiency of cryopreservation of cord blood preparations, an important task is not only to evaluate them immediately after thawing, but also to determine the delayed survival of cells after transport them to conditions close to physiological. The addition of antioxidants to the cryoprotective medium can improve the preservation rate and viability of HPCs both immediately after cryopreservation and after transfer to conditions that are close to physiological.
Based on this, the aim of the work was to analysis of the structural and functional state of human cord blood hematopoietic progenitor cells after cryopreservation with cryoprotectant DMSO and antioxidants and transfer to conditions close to physiological
The efficacy of ascorbic acid, N-acetyl-L-cysteine and glutathione application in combination with DMSO in cryopreservation of HPCs has been evaluated. It has been shown that in the process of cryopreservation with DMSO and after transferring to conditions that are close to physiological, the preservation and viability of HPCs decreases on 20% in the samples, cryopreserved with 7.5-10% DMSO. One of the reasons for this may be the accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cells during freezing. The addition of antioxidants to the cryoprotective medium can significantly increase the stability of the HPCs against the effects of cryopreservation factors and improve the preservation and viability indices. A comparative analysis of antioxidants revealed that ascorbic acid at concentrations of 0.1 and 0.15 mM and N-acetyl-L-cysteine (10 and 15 mM) in combination with 7.5% and 10% DMSO increased the number of preserved viable HPCs up to 70% in comparison to the samples without adding the antioxidants. Addition of glutathione at a concentration of 1 and 3 mM to cryoprotective medium with 7.5% and 10% DMSO was able to maintain a viable state of up to 80% of the HPCs. This may be due to the fact that glutathione reduced the number of cells with excess content of ROS after transferring the cells to conditions that are close to physiological.
Key words: cord blood hematopoietic progenitor cells, cryopreservation, DMSO, ascorbic acid, N-acetyl-L-cysteine, glutathione.
Рецензент - проф. МИщенко I. В.
Стаття надшшла 27.01.2018 року
