CC BY
26
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
в селекции NK-клеток, наиболее подходящих для потенциальной адоптивной иммунотерапии.
Работа выполнена при поддержке РНФ (грант № 1615-00309).
ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДНОЙ ТЕРАПИИ НА АКТИВНОСТЬ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА В ЛЕГКИХ (НА МОДЕЛИ ХОБЛ У КРЫС)
Суркова Е.А., Лебедева Е.С., Кузубова Н.А.
ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Согласно современным представлениям, эпителиоциты бронхов являются ключевыми эффектор-ными клетками в патогенезе хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), инициируя иммунную и воспалительную реакции, гиперсекрецию слизи и продукцию активных форм кислорода. Стимулирование эндогенных регенеративных возможностей для восстановления поврежденного эпителия при ХОБЛ может обеспечить длительный терапевтический эффект по сравнению с использованием традиционных кортикостероидов.
Цель. Оценить противовоспалительный и регенеративный эффект низкомолекулярной пептидной терапии на модели ХОБЛ у крыс.
Материалы и методы. Модель формирования ХОБЛ выполнена на крысах-самцах линии Вистар с помощью ингаляционного воздействия диоксида азота. Пептидную терапию проводили в течение месяца, используя препарат Бронхоген (ООО ХБО при РАН «Фирма Вита») — синтезированный тетрапетид, соответствующий полипептиду из слизистой бронхов животных. В пробах бронхоальве-олярной лаважной жидкости (БАЛЖ) определяли содержание TNFa, IL-8, нейтрофильной эластазы, матрикс-ной металлопротеиназы-12 (ММР-12), химазы тучных клеток, секреторного иммуноглобулина А (sIgA), сурфак-тантного протеина В (SP-B) методом ELISA.
Результаты. В БАЛЖ животных, не получавших пептидную терапию (контрольная группа), содержание нейтрофилов в 5 раз превышало интактное значение (25,9±4,1 и 5,2±0,5% соответственно, р < 0,05), а число лимфоцитов было в 2 раза больше, чем у интактных крыс (18,5±2,4 и 9,1±1,9% соответственно, р < 0,05). В лаважной жидкости контрольных крыс определялись повышенные концентрации провоспалительных цитокинов (TNFa и IL-8) нейтрофильной эластазы, ММР-12 и химазы тучных клеток, действие которой значительно усиливает деструктивный эффект на легочные структуры. Под влиянием применения Бронхогена происходило восстановление цитологического профиля БАЛ, который незначительно отличался от интактной группы: процентное содержание нейтрофилов снижалось по сравнению с контролем и составляло 9,0±1,2% (р < 0,05), возрастала доля макрофагов (76,5±2,02%, р < 0.05). Концентрации TNFa, IL-8, а также нейтрофильной эластазы и ММР-12 практически не отличались от показателей интактной группы, а уровень хи-мазы тучных клеток оказался в 2 раза ниже интактного. Нормализовалось содержание SP-B, что могло быть отражением восстановления секреторной функции альве-олоцитов 2-го типа. Значительно возрастала интенсив-
ность синтеза sIgA, превышая аналогичный показатель и в контрольной, и в интактной группе.
Заключение. Под влиянием пептидной терапии наблюдалось снижение активности нейтрофильного воспаления, которое сопровождалось восстановлением функциональной активности бронхиального эпителия, предупреждением аномального ремоделирования легочной ткани и связанных с ним тяжелых осложнений ХОБЛ.
АЛЬВЕОЛЯРНЫЕ МАКРОФАГИ И СУРФАКТАНТ ЛЕГКИХ ПРИ ДИСБАЛАНСЕ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ НЕЙРОТРАНСМИССИИ
Тимофеева М.Р., Лукина С.А.
ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия», Ижевск, Россия
Введение. Дисфункция дофаминергической системы является основой патогенеза нейродегенеративных и нервно-психических заболеваний, висцеропатий, сопровождающихся изменениями иммунного статуса организма (Крыжановский Г.Н. и соавт., 2010) и метаболических функций легких (Тимофеева М.Р. и соавт., 2015). Установлено, что альвеолярные макрофаги участвуют в реализации механизмов врожденного и адаптивного иммунитета, в катаболизме сурфактанта легких (Череш-нев В.А. и соавт., 2002). Вместе с тем, фосфолипиды сурфактанта стимулируют фагоцитарную активность альвеолярных макрофагов (Грачева Л., 1996; Ипатова О.М., 2005), а сурфактант-ассоциированные протеины модулируют их участие в иммунном ответе и секреции провос-палительных цитокинов (Sano H. et al., 2005).
Цель. Изучение фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов и фосфолипидов сурфактанта при дисбалансе дофаминергической нейротрансмиссии, моделируемой введением допамина в боковой желудочек мозга и активацией стриатума без и при введении амантадина.
Материалы и методы. Опыты выполнены на наркотизированных крысах-самцах в соответствии с этическим кодексом (n = 77), в том числе ложнооперированных, с церебровентрикулярным введением допамина (в дозе 1,6 мкМ, через день, три недели) посредством канюль: P = 0,8; L = 1,5; V = 3,6, с имплантацией нанокобальта в стриатум: А = 1,7; L = 2,5; V = 5,5 и в сочетании с введением амантадина (ПК-Мерц, Германия; 1 мг/кг, через день, 2 недели, в/брюшинно). После окончания экспериментов определяли содержание фосфолипидов (Комаров Ф.И. и соавт., 1981) в бронхоальвеолярных смывах (БАС) и их поверхностную активность (метод Вильгельми), клеточный состав смывов и фагоцитарную активность альвеолярных макрофагов (АМ) по поглощению частиц монодисперсного латекса (01,5 мкм) с расчетом фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа. Фракционирование фосфолипидов проводили методом тонкослойной хроматографии. Статистический анализ выполнен в программе SPSS 17 с использованием критерия Шапиро— Уилка и U-критерия Манна—Уитни.
Результаты. Дисбаланс допаминергической системы, индуцированный введением допамина в боковой желудочек мозга, сопровождался повышением продукции фосфолипидов (p = 0,03) за счет фракции лизофос-фатидилхолина (p = 0,001), и фосфатидилэтаноламина (p = 0,02), фосфатидной кислоты (p = 0,001), что привело к снижению поверхностной активности сурфактанта (p = 0,001), но стимулировало фагоцитарную активность
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
АМ (р = 0,01). При моделировании очага патологической активности в стриатуме, характеризующегося высокой плотностью дофаминовых рецепторов, увеличился оборот фосфолипидов (р = 0,001) и активность механизмов врожденного иммунитета, о чем свидетельствовало повышение фагоцитарного индекса (р = 0,006) и фагоцитарного числа (р = 0,001). При введении ПК-Мерц, стимулирующего высвобождение дофамина и блокирующего NMDA-рецепторы глутамата, увеличилась продукция фосфолипидов (р = 0,001) с низкими поверхностно-активными свойствами (р = 0,001), как и при активации стриатума, но способность АМ к фагоцитозу снизилась (р = 0,001) по сравнению с воздействием на стриатум, а фагоцитарное число соответствовало контролю.
Заключение. При дисбалансе дофаминергической нейротрансмиссии сопряженность изменения состава фосфолипидов сурфактанта и фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов определяет эффективность механизмов врожденного иммунитета легких и органной резистентности.
ВЛИЯНИЕ АНГИОТЕНЗИНА-М НА ЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МНОЖЕСТВЕННО МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Толпыго С.М.1, Шойбонов Б.Б.1 2, Лагутина Л.В.1
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина», Москва, Россия
2 ФГБУ«Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Общепризнано, что эндогенные множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ммЛНП) и ангиотензин-П (А-11) — основной эффектор-ный пептид ренин-ангиотензиновой системы — играют ведущую роль в развитии сосудистой эндотелиальной дисфункции и запуске иммунных процессов при атеросклерозе. Показано также, что ммЛНП оказывают ци-тотоксическое действие на эндотелий сосудов, вызывая воспаление и фиброз. Ранее нами разработан способ определения литической активности ммЛНП и иммунных комплексов, содержащих ммЛНП (ИК-ммЛНП), позволяющий определить патогенность, т.е. атерогенность, данных соединений. Определение литической активности основано на наличии лизофосфатидилхолина и фос-фолипазы А2 в составе ммЛНП, которые вызывают лизис собственных эритроцитов.
Эксперименты проведены на 40 крысах-самцах популяции ""Маг (по 10 особей в группе) с массой тела 320350 г. Животным однократно вводили: 1 группа — конъюгат А-11 с ммЛНП (в дозе 300 мкг/кг по А-11 и 200 мкг/кг по носителю в 0,5 мл физиологического раствора); 2 группа — белок-носитель — ммЛНП (в дозе 200 мкг/кг в 0,5 мл физиологического раствора); 3 группа — смесь А-11, ммЛНП и физиологического раствора; 4 группа — 0,5 мл физиологического раствора. Конъюгирование А-11 и ммЛНП осуществляли карбодиимидным методом, при этом 1 молекула ммЛНП связывалась с 10-12 молекулами А-11. Использовали естественно модифицированные окислением ЛНП, выделенные из сыворотки крови больных атеросклерозом с применением разработанного нами метода. Через 5-6 месяцев после однократного введения веществ у животных
1-4 групп в сыворотке крови определяли содержание эндогенных ммЛНП, ИК-ммЛНП, а также оценивали их литическую активность. Тест литической активности проводили в 96-луночных плоскодонных иммунологических планшетах по 3 повтора. Сыворотки крови крыс обрабатывали 20% раствором поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000) при объемном соотношении сыворотка: ПВП (1:0,84), инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре. Агрегаты ммЛНП осаждали центрифугированием, тщательно декантировали и осадок ммЛНП растворяли в буфере без ПВП. Вначале по 10 мкл (х 3) ммЛНП или ИК-ммЛНП вносили в лунки, потом добавляли 60 мкл (х 3) буфера VBS2+ и 30 мкл (х 3) суспензии стандартизованных в этом же буфере эритроцитов барана. Параллельно ставили контроли: 3 контроля на полный лизис (30 мкл суспензии аутологичных эритроцитов + 70 мкл Н2О); 3 контроля на спонтанный лизис эритроцитов (30 мкл аутологичных эритроцитов + 70 мкл буфера VBS2+). Тщательно перемешивали и сразу измеряли оптическую плотность на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 620 нм (бланк устанавливали против воздуха). После измерения планшеты герметично заклеивали пленкой и оставляли на 48 часов при комнатной температуре, затем планшету тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность при тех же условиях, по калибровочному графику определяли степень лизиса и при лизисе более 10% констатировали повышенную литическую активность ммЛНП или ИК-ммЛНП.
Получены следующие данные об атерогенности ммЛНП. В 1-ой группе (комплекс ммЛНП с А-11) и 3-ей группе (смесь ммЛНП с А-11) литическая активность повышена у 70% крыс (у 7 из 10 животных в группе). Во 2 группе (ммЛНП) также наблюдается повышение литической активности в 50% случаев. В 4-ой группе (введение физиологического раствора) литическая активность повышается только у 20% животных. Таким образом, даже после однократного введения комплекса А-11 с ммЛНП, ммЛНП, смеси А-11 и ммЛНП через 5-6 месяцев их эндогенные ммЛНП в сыворотке крови характеризуются повышенной патогенностью (атеро-генностью).
При оценке литической активности ИК-ммЛНП обнаружено, что в 1-ой группе (комплекс ммЛНП с А-11) у 40% крыс ИК-ммЛНП утрачивают литическую активность, в 10% — даже увеличивают ее (с 21% для ммЛНП до 30% в составе ИК-ммЛНП). Показано, что у всех животных
2-ой (ммЛНП) и 3-ей (смесь ммЛНП с А-11) групп патогенность ИК-ммЛНП полностью отсутствует. У части (20%) крыс 4-ой группы (физиологический раствор) литическая активность ИК-ммЛНП снижается (с 30% для ммЛНП до 13% в составе ИК-ммЛНП), у остальных контрольных животных не изменяется. Полученные данные свидетельствуют о протективной роли ИК-ммЛНП при развитии аутоиммунного ответа на ммЛНП в организме и функциональной гетерогенности образующихся при этом аутоантител. А-11, по-видимому, за счет своей выраженной прооксидантной и провоспалительной активности обуславливает дополнительную модификацию ммЛНП, увеличивая тем самым их патогенность и про-грессирование атеросклеротического процесса.
