АКТИВНіСТЬ ОКИСНИХ ПРОЦЕСіВ і ВИЖИВАННЯ СПЕРМіїВ БУГАїВ ЗА Дії ВіДНОВЛЕНОї ФОРМИ ГЛУТАТіОНУ Текст научной статьи по специальности «Животноводство и молочное дело»

УДК 636.2:631.147.611-013.11

Кава С.Й. Дмитр1в О.Я. 1вашк1в P.M. ©

Лъв\всъкый нацюналъныйутеерсытет ветерынарногмедыцыны i бютехнологт iмет С.З. Гжицъкого Осташв Д.Д., Яремчук I.M.

1нститут б1ологИ'тварынНААН

АКТИВШСТЬ ОКИСНИХ ПРОЦЕС1В I ВИЖИВАННЯ СПЕРМПВ БУГА1В ЗА Д11 В1ДН0ВЛЕН01 ФОРМИ ГЛУТАТЮНУ

Вивчали вплыв вгдновлено! формы глутатюну у склаЫ розргджувача еякулят1в бугагв на актывшстъ фермент1в антыоксыдантного захысту, eMicm ТБК-актывных сполук (МДА) i выжывання спермпв. Встановлено, що еякуляты бугагв характерызуютъся об'емом 4,3 ± 0,18 мл, концентращею 1,09 ± 0,11 х 109 /мл спермпв, выжыванням статевых клгтын затемпературы 0 - 4°С - 110,5 ± 5,70 год, актывшстю каталазы - 1,1 ± 0,25 мкМ Н202/мл/с та глутатюнпероксыдазы - 7,2 ± 0,44 мкМ ГБ-БГ/мг быка/хв, вмктомМДА - 27,5 ± 2,20 нМ/мл. Выкорыстання в склаЫ розргджувача спермы вгдновлено! формы глутатюну стымулюе актывшстъ каталазы, глутат1онпероксыдазы св1жоотрыманогспермы в концентрацИ 2,5 та 5,0 мМ та збереженогпротягом 24 год - пры 5,0 мМ i галъмуе утворення ТБК-актывных сполук. За додавання у лактозо-жовтково-глщерыновый розргджувач вгдновлено! формы глутатюну в концентрац1ях, eidnoeidno, 1,25, 2,5 та 5,0 мМвыжывання спермпв пры 0 - +4°С выще на 16,1 - 23,6 % (25,9 - 39,3 год), пор1вняно до контролю.

Ключое1 слова: вгдновленый глутатюн, глутатюнпероксыдаза, каталаза, малоновый дгалъдеггд, сперма, еякулят, бугай

Вщомо, що технолопчну придатшсть еякулят1в для крюконсервування й використання у практищ штучного оаменшня найповшше характеризуют окисш процеси, ix баланс в cnepMi. Однак, ф1зюлопчно нормальний nepe6ir окисних процеЫв порушуеться при пщготовщ до заморожування та теля розморожування еперми [1]. Вказаш технолопчш процеси супроводжуються активуванням мембранозв'язаних фермент1в та пщвищенням процеЫв вшьнорадикального окиснення жирних кислот i, як наслщок, руйнування лшопротешових комплекав й мембран кл1тин [2, 3]. Вказаш змши призводять до зниження резистентное^ i рухливост1, втрати ochobhoi здатност1 спермпв -заплщнювати ооцит. Запоб1гають неконтрольованим процесам окиснення присутш в еякулятах природш антиоксиданти (вщновлена форма глутатюну, аскорбшова кислота, в1тамш Е та ш.) та ферменти антиоксидантного захисту (супероксиддисмутаза, глутатюнпероксидаза, каталаза). Проте, в процеЫ технолопчно! пщготовки сперми до крюконсервацп, антиоксидантний захист послаблюеться, а окрем1 його ланки втрачаються. Дефщит сполук з

© Кава С.Й. Дмитр1в О.Я. 1вашшв P.M., Остап1в Д.Д., Яремчук I.M., 2012

100

антиоксидантними властивостями поповнюють шляхом ix додаванням у розрщжувач1 еякулят1в та середовищадля розморожування сперми [4, 5, 6].

Мета дослщжень - вивчити актившсть фермент1в антиоксидантного захисту та виживання спермив за додавання вщновлено! форми глутатюну в розрщжувач еякулят1в буга!в.

Матер1али та методи дослщжень. Дослщження проведен! у Льв1вському нацюнальному ушверситет1 ветеринарно! медицини та бютехнологш ¿меш С.З. Гжицького та Льв1вському науково-виробничому центр! «Захщплемресурси». Еякуляти отримували на штучну вапну з режимом використання буга!в дуплетна садка два рази на тиждень. У св1жоотриманих еякулятах, оцшених за об'емом (мл) i концентрацш спермив (109 кл1тин/мл), визначали виживання статевих кл1тин у розрщженш лактозо-жовтково-глщериновим розрщжувачем (ЛЖТР) для розбавлення i заморожування сперми бугая у форм1 гранул при температур! 0 - +4°С до припинення прямол1н1йно-поступального руху (год); активн1сть глутат1онпероксидази (ГП) - за швидюстю перетворення в1дновлено! форми глутатюну у окиснену за дп H202 (мкМ TS-Sr/хв/мг б1лка/хв; активн1сть каталази (КАТ) - з використанням амон1ю мол1бдату (мкМ Н202/мл/с); вм1ст ТБК-активних сполук (малонового д1альдегща; МДА) - з використанням тюбарб1турово! кислоти (нМ/мл)[7]. Вплив в1дновлено! форми глутатюну на окисш процеси вивчали у св1жоотриманих розр1джених 1:10 ЛЖТР та через 24 год шкубування еякулятах. В розрщжену сперму вносили вщновлену форму глутат1ону (Г-SH) в концентрациях - 1,25, 2,5 i 5,0 мМ. Статистичний анал1з отриманого матер1алу проведено за М. О. Плохшським [8] з використанням комп'ютера та розроблених програм (програмне забезпечення Clipper).

Результати досл1джень. Еякуляти буга!в характеризуються об'емом 4,3 ± 0,18 мл та концентрацию cnepMii'B 1,09 ± 0,11 х 109кл1тин /мл, а статев1 кл1тини у св1жоотриманих еякулятах проявляють високе виживання за температури 0 - 4°С - 110,5 ± 5,70 год. Для сперми буга!в характерна активн1сть каталази - 1,1 ± 0,25 мкМ Н202/мл/с та глутат1онпероксидази - 7,2 ± 0,44 мкМ rS-Sr/мг бшка/хв, вм1ст МДА - 27,5 ± 2,20 нМ/мл.

Вивченням впливу вщновлено! форми глутат1ону у розр1джувач1 еякулят1в буга!в на активн1сть ГП, встановлено, що у контрол1 активн1сть ферменту впродовж 24 год ¿нкубування (збер1гання) майже не зм1нюеться (9,1 -10,1 мкМ TS-Sr/мг б1лка/хв; табл.). Вщновлена форма глутат1ону в розрщжувач1 сперми у доз1 1,25 мМ не впливае на активн1сть ГП (8,6 ± 1,15мкМ TS-Sr/мг бшка/хв), а у дозах 2,5 та 5,0 мМ стимулюе, в1дпов1дно, на 34,1 % та 64,8 %. Через 24 год концентращя вщновлено! форми глутатюну (1,25 мМ) гальмуе актившсть ГП на 50,0 %, 2,5 мМ - не змшюе величину значения (9,0 ± 2,32 мкМ rS-Sr/мг б1лка/хв), а 5,0 мМ - стимулюе на 50,0 % (р < 0,01).

Актившсть каталази у контрольних пробах в процеЫ ¿нкубування зростае з 0,13 мкМ Н202/мл/с у св1жоотриман1й до 0,17 мкМ Н202/мл/с через 24 год шкубування, р1зниця 30,7 % (р < 0,05). За присутност1 в розрщжувач! в1дновлено! форми глутат1ону 1,25 та 2,5 мМ активн1сть ферменту

101

св1жоотримано! розбавлено! сперми вище контролю на 61,5 % (р < 0,05), а за 5,0 мМ - у три рази (р < 0,001). У збереженш протягом 24 год сперм1 буга!в, вщновлена форма глутатюну проявляв залежну вщ дози дш: концентращя 1,25 мМ пщвищуе актившсть каталази на 23,5 %, 2,5 мМ - на 41,1 % (р < 0,001) та 5,0 мМ - на 70,5 % (р < 0,001), пор1вняно до контролю.

Таблиця

Актившсть фермент1в антиоксидантного захисту та вм1ст ТБК-активних __продукт1в у розрщженш сперм1 бугая_

Бюх1]шчт показники Сперма Контроль За дг1 Г-8Н, мМ

1,25 2,5 5,0

ГП, мкМ Г8-8Г/мг б1лка/хв св1жоотримана 9,1±0,78 8,6±1,15 12,2±3,48 15,0±2,60

збережена 10,1±2,51 5,1±1,29 9,0±2,32 20,2±1,56......

КАТ, мкМ Н202/ мл/с св1жоотримана 0,13±0,012 0,21±0,016* 0,21±0,007* 0,39±0,024*

збережена 0,17±0,012* 0,21±0,008 0,24±0,005* 0,29±0,007*

МДА, нмоль/мл св1жоотримана 18,4±4,31 9,1±2,16 12,7±1,98 11,8±1,14

збережена 14,5±2,80 10,7±2,33 9,6±2,64 3,7±0,30

* Примита: р1зниця статистично в1ропдна пор1вняно до контролю:* р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001.

Вмют ТБК-активних сполук (МДА) теля розбавлення та шкубування 24 год сперми у контрол1 в1рогщно не змшюеться (14,5 - 18,4 нМ/мл). Додавання до розрщжувача вщновлено! форми глутатюну у концентращях 1,25, 2,5 та 5,0 мМ знижуе вмкт ТБК-активних сполук у св1жоотриманш сперм1, вщповщно, у 2 рази, на 44,8 та на 55,9 %, а у збереженш протягом 24 год - на 35,5 %, 51,4 % та майже у 4 рази (р < 0,01).

Про позитивний вплив антиоксидант1в на якють спермпв св1дчить виживання статевих кл1тин у розрщжених еякулятах, у яких при розбавленш лактозо-жовтково-гл1цериновим розр1джувачем { збер1ганш сперми при 0 - +4°С виживання - 127,4±11,33 год, а з додаванням Г-8Н в концентрациях, в1дпов1дно, 1,25, 2,5 та 5,0 мМ - вище на 16,1 % (153,3±13,60 год), 23,6 % (166,7 ± 8,39 год) 1 22,8 % (165,0 ± 7,07 год).

Висновки:

1. Еякуляти буга!в характеризуються об'емом 4,3 ± 0,18 мл, концентращею 1,09 ± 0,11 х 109 /мл спермИв, виживанням статевих кл1тин за температури 0 - 4°С - 110,5 ± 5,70 год, активн1стю каталази - 1,1 ± 0,25 мкМ Н202/мл/с та глутат1онпероксидази - 7,2 ± 0,44 мкМ Г8-8Г/мг б1лка/хв, вмктом МДА - 27,5 ± 2,20 нМ/мл.

2. Використання в склад1 розр1джувача сперми в1дновлено! форми глутатюну стимулюе активн1сть каталази, глутат1онпероксидази св1жоотримано! сперми в концентрацИ 2,5 та 5,0 мМ та збережено! протягом 24 год - при 5,0 мМ I гальмуе утворення ТБК-активних сполук.

3. За додавання у лактозо-жовтково-глщериновий розрщжувач в1дновлено! форми глутатюну в концентращях, в1дпов1дно, 1,25, 2,5 та 5,0 мМ виживання спермив при 0 - +4°С вище на 16,1 - 23,6 % (25,9 - 39,3 год), пор1вняно до контролю.

102

Л1тература

1. Наук В. А. Структура и функции спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации / В. А. Наук— Кишинев: Штиинца, 1991. — 198 с.

2. Jones R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa: spermicidal effects of fatty acid peroxides and protective action of seminal plasma / R. Jones, T. Mann., R. Sherins // Fertil. Steril. — 1979. — Vol. 31. —P. 531-537

3. Significance of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in the Generation of Oxidative Stress in Spermatozoa / A. Koppers, G. De Iuliis, J. Finnie, R. Aitken // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. — 2007. -Vol. 93. — P. 3199-3207.

4. Slaweta R. The effect of glutathione on ihe motility and fertility of frocen sperm / R. Slaweta, T. Liaskowska // Anim. Reprod. Sci. — 1987. — Vol. 13. — P. 249-253.

5. Donnelly E. The effect of ascorbate and ■ i -tocopherol supplementation in vitro on DNA integrity and hydrogen peroxide-induced DNA damage in human spermatozoa / E. Donnelly, N. McClure // Mutagenesis — 1999. — Vol. 14. — P. 505-512.

6. Шаран M. M. Пщвищення ефективноси штучного оаменшня корАв i телиць / М. М. Шаран — Льв1в, 2009. — 38 с.

7. 0i3^oro-6ioxiMi4Hi методи дослщженьу бюлогп, твариннищш та ветеринарнш медициш /Довщник. пщ ред. В.В.ВлАзло - ЛьвАв, 2004. - 399с.

8. Плохинский Н. А. Руководство по биометрии для зоотехников /Н. А. Плохинский // М.: Колос, 1969. — 255с

Summary

ACTIVITY OF OXIDATIVE PROCESSES AND SURVIVAL OF BULL SPERMATOZOA FOR ACTION OF REDUCED FORM OF GLUTATHIONE

The effect of reduced glutathione within diluent of bull ejaculates on the activity of enzymes of antioxidant defense, content of TBA-active products (MDA) and spermatozoa survival were studied. It is found that bull ejaculates characterizes by volume 4,3 ± 0,18 ml, concentration 1,09 ± 0,11 x 109 /ml of spermatozoa, survival of sex cells by temperature 0 - 4°C - 110,5 ± 5,70 hours catalase activity - 1,1 ± 0,25 /mol H202/ml/s and glutathione peroxidase 7,2 ± 0,44 /mol GS-SG/mg protein/min, content of MDA - 27,5 ± 2,20 nmol/ml. The use of reduced glutathione in sperm diluent stimulates the activity of catalase, glutathione peroxidase of freshlyobtained semen in concentrations of 2,5 and 5,0 mM and in sperm that was kept by 24 h - at 5,0 mM it slowers formation of TBA-active compounds. By adding lactose-yolk-glycerol diluent reduced glutathione in concentrations, respectively, 1,25, 2,5 and 5,0 mM spermatozoa survival at temperature 0 - 4°C was higher on 16,1 - 23,6 % (25,9 - 39,3 h),comparing to control.

Key words: reduced glutathione, glutathione peroxidase, catalase, malonic dialdehyde, semen, ejaculate, bull.

Рецензент - д.вет.н., професор Стефаник В.Ю.

103