CC BY
12
УДК:636.2:591.463Л.
Кава С.Й. ©
Лье1еський нацюнальний утеерситет еетеринарног медицины та бютехнологш ¡мет С.З. Гжицького
ЗВ'ЯЗОК АКТИВНОСТ1 ФЕРМЕНТ1В АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ З ВМ1СТОМ ЛШОПРОТЕШ1В ТА МАЛОНОВОГО Д1АЛЬДЕГ1ДУ В СПЕРМ1 БУГА1В
Виечали кореляцгг м1ж актиетстю фермент1е антиоксидантного захисту, ем1стом малоноеого дгальдеггду та фракщями лтопротеше еякулят1е бугаге. Встаноелено, що для сперми бугаге характерн актиетсть глутатюнпероксидази (7,2 ± 0,44 мкМ ГS-SГ/мг быка/хе) г каталази (1,1 ± 0,25 мМ Н2О2/мл/с), емют малоноеого дгальдеггду (27,5 ± 2,20 нМ/мл) та фракщг лтопротеше: хгломгкрони (26,9±1,93 %), дуже низьког (10,4±0,44 %), низьког (18,3±1,84 %), еисоког (17,1±1,09 %) та дуже еисоког (26,8±1,94%) щыьност1. М1ж ферментами антиоксидантного захисту, емютом МДА та фракщями лтопротеше гснують р1зн за напрямком г силою корелящг. М1ж актиетстю глутатюнпероксидази та емютом хгломгкрон, лтопротегнами дуже низьког та низьког щыьност1 ¡снуе пряма корелящя, а з лтопротегнами еисоког та дуже еисоког щыьност1 - обернена. Для сперми бугаге характерна оптимальна актиетсть каталази (0,5 - 1,0 мМ Н2О2/мл/с) при якгй прояеляються максимальн ееличини лтопротеше дуже низьког, низьког та еисоког щыьност1. Для низького (менше 20,0 нМ/мл) та еисокого (быьше 60,0 нМ/мл) емюту МДА характерн низькг ееличини значень хгломгкрон, лтопротеше дуже низьког та еисоког щыьност1 I максимальн - лтопротеше дуже еисоког щыьност1.
Ключовi слова: лтопротегни, глутатюнпероксидаза, каталаза, малоноеий дгальдеггд, загальний бглок, сперма, еякулят, бугай
З початком спермюгенезу у ам'янику, дозрiванням i збер^анням спермив у придатку Ым'яника та тсля еякуляци, статевi кл^ини постшно знаходяться тд впливом ди як внутршньокл^инних, так i зовшшшх активних форм кисню (АФК) [1]. Негативна дiя АФК полягае в !х здатност окислювати лшщи й бшки мембранних структур спермив, що призводить до порушення обмшних процеЫв та зниження фiзiологiчних характеристик й заплщнюючо! здатност статевих кл^ини. Тому, у Ым'янику та його придатку, спермi й статевих кл^инах кнуе система антиоксидантного захисту: глутатюн, ензими глутатюнового циклу, каталаза i суперокиддисмутаза створюють ензиматичний, а в^амши А, Е 1 С - неензиматичний антиоксидантний захист кл^ин [2]. Антиоксидантний захист важливий для зниження окиснення лшвдв спермив i ДНК в процес технолопчно! тдготовки сперми до заморожування i
© Кава С.Й., 2009
69
розморожування, виживання у родових шляхах ^ вщповщно, забезпечення основно! функци - заплщнення ооцита та передачу без змш спадково! шформаци потомству [3, 4, 5 ]. Поряд з цим, в процес виживання та пщготовки до заплщнення статевi клiтини генерують АФК, яю в свою чергу сприяють модифжаци мембран при капацитаци та забезпечують проникнення спермiя в ооцит [6]. Отже, в спермi повинен кнувати оптимальний рiвень антиоксидантного захисту, який з одного боку забезпечив би фiзiологiчнi функци статевих кл^ин, а з iншого - не гальмував процесiв пiдготовки спермiя до заплщнення.
Метою дослщжень було вивчити зв'язок мiж активнiстю ферментiв антиоксидантного захисту, вмктом малонового дiальдегiду i фракцiями лшопроте!шв еякулятiв буга!в.
Матер1али та методи дослщжень. Дослiджували еякуляти буга!в, якi належать ТзОВ «Захщплемресурси». Сперму отримували на штучну вагшу з режимом використання буга!в дуплетна садка два рази на тиждень. Вивчали у свiжоотриманих еякулятах вмют загального бiлка (мг/мл) [7], якюний та кiлькiсний склад фракцiй лшопроте!шв методом електрофорезу в градieнтi 3,5%, 5,0% та 7,5% полiакриламiдного гелю (ПААГ) з використанням 0,1% розчину фарб Судан Ш + Судан IV (1:1) у 70% етиловому спирту актившсть глутатiонпероксидази (мкМ ^^Г/мг бiлка/хв), каталази (мМ Н2О2/мл/с), малонового дiальдегiду (нМ/мл)[8]. Статистичний аналiз отриманого матерiалу проведено за Плохiнським М.О. (1969) [9]
Результати дослщжень. Для сперми буга!в характерна актившсть глутатюнпероксидази - 7,2 ± 0,44 мкМ ^^Г/мг бiлка/хв, каталази - 1,1 ± 0,25 мМ Н2О2/мл/с, вмкт малонового дiальдегiду - 27,5 ± 2,20 нМ/мл та фракцiй лшопроте!шв (вiдповiдно до сироватки кровi): хшомжрон (ХМ) - 26,9±1,93 %, дуже низько! (пре-р; ЛПДНЩ) - 10,4±0,44 %, низько! (р-; ЛПНЩ) - 18,3±1,84 %, високо! (а-; ЛПВЩ) - 17,1±1,09 % та дуже високо! (лПДВЩ) - 26,8±1,94% щшьност^
4,0< 4,0 - 8,0 >8,0 мкМ/Г8-8Г/мг
бшка/хв
-ХМ —■—ЛПДНЩ--ЛПНЩ ♦ ЛПВЩ —*—ЛПДВЩ
Рис 1. Зв'язок активного глутатюнпероксидази з вмктом лтопротеУшв
70
При цьому, ан^з кореляцш мiж актившстю глутатюнпероксидази та лшопротешами свiдчить, що пiдвищення активност ферменту забезпечуе збереженiсть вмiсту грубодисперсних фракцш (рис. 1). Так, за активносп глутатiонпероксидази менше 4,0 мкМ ГS-SГ/мг бiлка/хв проявляеться низький вмкт хiломiкрон (14,8±2,65%), який зростае на 10,9% при 4,0 - 8,0 мкМ SГ/мг бiлка/хв i максимальний (29,5±2,78 мкМ ГS-SГ/мг бшка/хв) за активностi бiльше 8,0 мкМ ^^Г/мг бiлка/хв. Рiзниця мiж максимальним та мiнiмальним значенням становить 14,7% i статистично вiрогiдна (р < 0,001).
Аналопчну залежнiсть виявлено мiж активнiстю глутатiонпероксидази та вмiстом пре-р та р-лшопроте!шв. Зокрема, низькi значення вказаних фракцш, вщповщно, 7,3±0,95 та 11,0±1,86 % встановлено за активност ферменту менше 4,0 мкМ ге^Г/мг бiлка/хв, вищi на 3,6 (р < 0,05) та 6,9 % при 4,0 - 8,0 мкМ ГО-SГ/мг бшка/хв i максимальш (11,2±0,55 та 22,0±2,37 %; р < 0,001) за активност бшьше 8,0 мкМ ГS-SГ/мг бiлка/хв. Кореляцшне вiдношення за активнiстю глутатiонпероксидази та вмктом хiломiкрон, дуже низько! i низько! щiльностi лшопроте!шв знаходиться в межах п = 0,319 - 0,357.
1ншу залежнiсть встановлено при аналiзi кореляци мiж активнiстю ГП та лшопротешами високо! (а-ЛП) i дуже високо! щiльностi. Так, при низькш активностi ферменту (менше 4,0 мкМ ^^Г/мг бiлка/хв) вмiст а-ЛП становить 20,8±1,54 % i лшопроте!шв дуже високо! щiльностi 46,3±4,27 %. Зростання активност ферменту до 8,0 мкМ ^^Г/мг бiлка/хв характеризуеться майже однаковим, порiвняно з вихiдною величиною, вмютом а-ЛП (23,7±2,38 %) i зниженням на 25,0% (р<0,001) лшопроте!шв дуже високо! щiльностi. У еякулятах з максимальною величиною ГП (бшьше 8,0 мкМ ^^Г/мг бшка/хв) зменшуеться на 5,4 - 8,3 % (р<0,01) вмiст а-ЛП, а лшопроте!шв дуже високо! щiльностi залишаеться майже без змш (23,5±2,24 %). Кореляцшне вщношення за активнiстю ГП для а-ЛП становить п = 0,402, а для лшопроте!шв дуже високо! щшьност - п = 0,487.
Отже, в еякулятах буга!в юнуе межа активностi ГП за яко! забезпечуеться збереженiсть лiпопроте!нових комплексiв сперми. Зниження активност фермента (менше 4,0 мкМ ^^Г/мг бiлка/хв) призводить до руйнування (окиснення) високодисперсних фракцш (ХМ, лшопроте!шв дуже низько! i низько! щшьноси) i нагромадження лiпопроте!нiв з малими розмiрами молекул (лiпопроте!нiв високо! i дуже високо! щiльностi).
Актившсть каталази також проявляе зв'язок з вмктом лiпопроте!нiв (рис. 2). При цьому, вмкт хiломiкрон слабо залежить вiд активностi ферменту, величина величина знаходиться в межах 24,1±3,24 - 26,4±5,54% при змiнi каталази в еякулятах вщ мiнiмально! (менше 0,5 мМ Н2О2/мл/с) до максимально! (бшьше
I,0 мМ Н2О2/мл/с) величин. Кореляцшне вщношення за актившстю каталази для вмкту хшомжрон п = 0,032.
Однак, каталаза впливае на вмкт пре-р-ЛП , який низький (7,8±0,73 %) при мiнiмальнiй активностi (менше 0,5 мМ Н2О2/мл/с) i зростае на 3,3 - 4,0 % до
II,1 - 11,8 % при вищш активност ферменту (бшьше 0,5 мМ Н2О2/мл/с). Рiзниця мiж величинами значень статистично вiрогiдна (р<0,01). Кореляцiйне
71
вщношення за актившстю каталази для вмюту лшопроте!шв дуже низько! щiльностi п = 0,284.
ХМ —■—ЛПДНЩ--ЛПНЩ ♦ ЛПВЩ —*—ЛПДВЩ
Рис 2. Зв'язок активност каталази з вмпстом лшопротеТшв
Подiбну залежнiсть виявлено при аналiзi кореляцiй мiж активнiстю каталази та вмктом р-ЛП i а-ЛП. Вищi величини значень лшопроте!шв низько! (20,4±2,35 %) та високо! (23,3±1,76 %) щiльностi проявляються при 0,5 - 1,0 мМ Н2О2/мл/с каталази. При низькш активностi ферменту (менше 0,5 мМ Н2О2/мл/с) виявлений, порiвняно з максимальним, нижчий на 5,8 (р<0,05) та 6,7 % (р<0,01) вмiст, вiдповiдно, р-ЛП та а-ЛП. При високш aктивностi ферменту (бшьше 1,0 мМ Н2О2/мл/с) знижуеться на 2,1 % вмкт р-ЛП та на 1,5 % а-ЛП. Кореляцшне вщношення за актившстю каталази для лшопроте!шв низько! та високо! щшьноси, вщповщно, п = 0,304 та 0,287.
Анaлiз кореляцi! мiж актившстю каталази та вмктом лiпопроте!нiв дуже високо! щшьност свiдчить, що низька !х величина (21,1±5,63 %) проявляеться при aктивностi ферменту бiльше 1,0 мМ Н2О2/мл/с, а вищий вмкт вказано! фрaкцi!, на 1,4 та 13,8%, за активности вiдповiдно, 0,5 - 1,0 та менше 0,5 мМ Н2О2/мл/с. Кореляцшне вщношення за актившстю каталази для лшопроте!шв дуже високо! щшьност п = 0,290.
При вивченш зв'язку мiж вмктом малонового дiaльдегiду i фрaкцiями лшопроте!шв виявлено, що для 20,0 - 60,0 нМ/мл МДА характерний високий вмют хiломiкрон (27,9±3,54%) та лшопроте!шв дуже низько! щiльностi (10,0±0,61%; рис. 3). За низького (менше 20,0 нМ/мл) та високого (бшьше 60,0 нМ/мл) вмкту МДА кшькють хшомжрон нижча, вщповщно, на 10,7 (р<0,01) та 7,1%, а лшопроте!шв дуже низько! щшьност - на 3,0 (р<0,01) та 1,8 %. Кореляцшне вщношення за вмютом малонового дiaльдегiду для кiлькостi хiломiкрон - п = 0,308 та лiпопроте!нiв дуже низько! щшьност - п = 0,365.
Вмкт р-ЛП пропорцiйно зростае зi збiльшенням в еякулятах кшцевого продукту окиснення ненасичених жирних кислот. Так, за низького вмкту МДА (менше 20,0 нМ/мл) кшькють лшопроте!шв низько! щiльностi 18,2±2,24 %, за вмюту до 60,0 нМ/мл зростае на 4,3% i при максимальному значенш (бiльше
72
60,0 нМ/мл) становить 24,6±7,42 %, що вище вщ вихщного значення на 6,4 %. Кореляцшне вiдношення за вмiстом малонового дiальдегiду для лшопроте!шв низько! щшьносп - п = 0,204.
ХМ —■—ЛПДНЩ--ЛПНЩ » ЛПВЩ —*—ЛПДВЩ
Рис. 3. Зв'язок м1ж вм1стом малонового д1альдегщу 1 лтопроте'шамн сперми
Аналiз змiн а-ЛП вiдносно пiдвищення МДА в еякулятах буга!в свiдчить, що збiльшення вмкту кiнцевого продукту окиснення ненасичених жирних кислот з мммального значення (менше 20,0 нМ/мл) до 60,0 нМ/мл характеризуеться зменшенням кiлькостi лшопроте!шв високо! щiльностi на 2,5%, яка при максимальному значенш (бiльше 60,0 нМ/мл) на 5,3% нижча, порiвняно з вихщною величиною. Кореляцiйне вiдношення за вмктом МДА для лшопроте!шв високо! щшьносп - п = 0,165.
Для лшопроте!шв дуже високо! щшьносп характерне зниження !х значення з 36,8±2,58 % на 14,7% (р<0,001) при пiдвищеннi вмiсту МДА вщ мiнiмально! величини (менше 20,0 нМ/мл) до 60,0 нМ/мл. Наступне збшьшення малонового дiальдегiду в еякулятах (бшьше 60,0 нМ/мл) зумовлюе пiдвищення лшопроте!шв дуже високо! щiльностi на 10,7% (р<0,05), порiвняно з мiнiмумом, до 32,8±4,02 %. Кореляцiйне вiдношення за вмктом МДА для лiпопроте!нiв дуже високо! щшьносп - п = 0,327.
Внсновкн
1. Сперма буга!в характеризуеться актившстю глутатiонпероксидази (7,2 ± 0,44 мкМ ГS-SГ/мг бiлка/хв), каталази (1,1 ± 0,25 мМ Н2О2/мл/с), вмiстом малонового дiальдегiду (27,5 ± 2,20 нМ/мл) та фракцiй лшопроте!шв: хiломiкрон (26,9±1,93 %), дуже низько! (10,4±0,44 %), низько! (18,3±1,84 %), високо! (17,1±1,09 %) та дуже високо! (26,8±1,94%) щiльностi.
2. Мiж активнiстю глутатiонпероксидази та вмiстом хшомжрон, лiпопроте!нами дуже низько! та низько! щшьносп iснуе пряма кореляцiя, а з лшопротешами високо! та дуже високо! щшьносп - обернена.
73
3. Для сперми буга!в характерна оптимальна актившсть каталази (0,5 - 1,0 мМ Н2О2/мл/с) при якш проявляються максимальш величини лшопроте!шв дуже низько!, низько! та високо! щiльностi.
4. За низького (менше 20,0 нМ/мл) та високого (бшьше 60,0 нМ/мл) вмiсту МДА у еякулятах буга!в проявляються низью величини значень хiломiкрон, лшопроте!шв дуже низько! та високо! щшьносп i максимальнi -лшопроте!шв дуже високо! щшьностг
Л1тература
1. Vernet P., Aitken R.J., Drevet J.R. Antioxidant strategies in the epididymis // Mol. Cell Endocrinol. - 2004. -V. 216. - P. 31 -39
2. Cadenas E. Oxxidative stress and formation exited species /H. Sies. Oxidatyve stress. Academic Press., 1985. - P. 311-330
3. Alvarez J. G., Storey B. T. Role of glutathione peroxidase in protecting mammalian spermatozoa from loss of motility caused by spontaneous lipid peroxidation //Gamete Res. - 1989. -V. 23. - P. 77 - 90.
4. Muratori M., Maggi M., Spinelli S., Filimberti E., Forti G., Baldi E. Spontaneous DNA fragmentation in swim-up selected human spermatozoa during long term incubation //J. Androl. - 2003. -V. 24. -P. 253 - 262.
5. Coulter G.H. Antioxidants, aging and longevity / Pryor W.A. Free Radical in biology. New York: Academic Press., 1984. -T.6.—P.371-428.
6. de Lamirande E., Leclerc P., Gagnon C. Capacitation as a regulatory event that primes spermatozoa for the acrosome reaction and fertilization // Mol. Hum. Reprod. - 1997. -V. 3. -P. 175 -194
7. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin phenol reagent /Lowry O.H., Rosebrough N. J., Farr A.L., Randall R.S. //J. Biol. Chem. - 1951. -V. 193. -P. 265-271.
8. Фiзiолого-бiохiмiчнi методи дослщжень у бюлоги, тваринництвi та ветеринарнш медициш /Довщник тд ред. В.В. Влiзло, Р.С.Федорук, 1.А. Макар, 1.Б. Ратич та ш. Львiв, 2004. -399 с.
9. Плохинский Н.А. Руководство по биометрии для зоотехников. / Н.А.Плохинский — М.: Колос., 1969. — 255с.
Summary Kava S. Y.
THE CORRELATION BETWEEN ANTIOXIDANT ENZYMES ACTIVITY, LIPOPROTEIN CONTENT, AND MALONIC DIALDEHID IN BULLS' SPERM
Studied the correlation between activity of antioxidant enzymes, contents of malonic dialdehid fractions and lipoprotein bulls' ejaculates. Found that bulls' sperms have specific activity of glutationperoxidase (7,2 ± 0,44 ¡¡M GS-SG/mg protein / min) and catalase (1,1 ± 0,25 mM H2O2/ml/s), the contents of malonic dialdehid (27,5 ± 2,20 nM / ml) and lipoprotein fractions: chilomicron (26,9 ± 1,93%), very low (10,4 ± 0,44%), low (18,3 ± 1,84%), high (17,1 ± 1,09%) and very
74
high (26,8 ± 1,94%) density. Among antioxidant enzymes, MDA content and lipoprotein fractions are different in direction and strength of correlation. There is a direct correlation between activity and content glutationperoxidase chilomicron, lipoproteins of very low and low density, and with lipoproteins of high and very high density - the inverse. Bulls' sperm is characterized by the typical optimal catalase activity (0,5 - 1,0 mM H2O2/ml/s) at which the apparent maximum lipoprotein value of very low, low and high density. For low (less than 20,0 nM / ml) and high (more than 60,0 nM / ml) MDA content typical low magnitude of chilomicron values, lipoprotein and very low density and the maximum - lipoprotein of a very high.
Стаття надшшла до редакцИ 17.09.2009
75
