CC BY
29
УДК: 636.2:591.463.1.
KaBa С.Й., Дмитрiв О.Я., Kудлa I.M., OcraniB Д.Д., Яремчук I.M. ©
Львiвcькuй нaцioнaльнuй yнiверcumеm веmерuнaрнoï медuцuнu ma бiomехнoлoгiй iменi С.З. Гжuцькoгo
ЗАПЛЩНЮВАЛЬНА ЗДАТН1СТЬ СПЕРМПВ БУ^'В ПРИ ДОДАВАНН1 У РОЗР1ДЖУВАЧ ЕЯKУЛЯТIВ АНТИОKСИДАНТIВ
Buвчaлu вплт aнmuoкcuдaнmiв y рoзрiджyвaчi еякyляmiв нa вuжuвaння i зaплiднювaльнy здamнicmь cпермiïв бyгaïв. Bcmaнoвленo, щo вiднoвленa фoрмa глymamioнy y cклaдi рoзрiджyвaчa еякyляmiв cmuмyлюe aкmuвнicmь cyкцuнamдегiдрoгенaзu y cвiжoomрuмaнiй рoзбaвленiй ma iнкyбoвaнiй cпермi, a acкoрбiнoвa кucлoma 3mm:ye aкmuвнicmь ферменmy y cвiжoomрuмaнiй cпермi, a y iнкyбoвaнiй 24 гoд - npu кoнценmрaцiï 5,0 мМ. Пoeднaння вiднoвленoï фoрмu глymamioнy i acкoрбiнoвoï rn^omu y рoзрiджyвaчi cnермu в кoнценmрaцiях, вiдпoвiднo, 2,5+1,25 мМ cmuмyлюe aкmuвнicmь cyкцuнamдегiдрoгенaзu ma вuжuвaння термив нa 18,5 %, пiдвuщye зaплiднювaльнy здamнicmь термив нa 11,? %.
Ключоei слова: aнmuoкcuдaнmu, aкmuвнicmь cyкцuнamдегiдрoгенaзu, вuжuвaння термив, зaплiднювaльнa здamнicmь, cпермa, бyгaй.
Для штенсивного вiдтвоpення поголiв'я великое' pогaтоï важливе значення мае pозpоблення способiв забезпечення висо^ життездатност статевих кл^ин. Вказаш вимоги зyмовленi тим, що ^и пщготовщ до зaмоpожyвaння та тсля pозмоpожyвaння спеpми поpyшyеться метaболiзм спеpмiïв. Виявлено, що технолопчш опеpaцiï сyпpоводжyються aктивyвaнням мембpaнозв'язaних феpментiв та штенсивним вiльноpaдикaльним окисненням жиpних кислот, що pyйнyе лiпопpотеïновi комплекси й мембpaни статевих клiтин, знижyе pезистентнiсть та pyхливiсть спеpмiïв i, ïx головну фyнкцiю -зaплiднювaльнy здатшсть [1]. Зaпобiгaють неконтpольовaним пpоцесaм окиснення ^исутш в еякулятах пpиpоднi антиоксиданти (вiдновленa фоpмa глyтaтiонy, aскоpбiновa кислота, в^амш Е та iн.) та феpменти антиоксидантного захисту (сyпеpоксиддисмyтaзa, глyтaтiонпеpоксидaзa, каталаза). Пpоте, в пpоцесi теxнологiчноï пiдготовки спеpми до кpiоконсеpвaцiï, антиоксидантний захист послаблюеться, а окpемi його ланки втpaчaються. Дефiцит сполук з антиоксидантними властивостями поповнюють шляхом ïx додаванням y pозpiджyвaчi еякyлятiв та сеpедовищa для pозмоpожyвaння спеpми [2,3,4].
Мета pоботи - вивчити вплив антиоксиданив y pозpiджyвaчi еякyлятiв на виживання i заплщнювальну здaтнiсть спеpмiïв бyгaïв.
Maтерiaли i методи. Дослщження пpоведенi y лaбоpaтоpiï кaфедpи aкyшеpствa i штучного осiменiння сiльськогосподapськиx твapин iменi Г. В. Звеpевоï Львiвського нaцiонaльного yнiвеpситетy ветеpинapноï медицини та
© Кава С.Й., Дмш^в О.Я., Кудла I.M., Остатв Д.Д., Яpемчyк I.M., 2010
75
бютехнологш iMem С.З. Гжицького i Львiвському науково-виробничому ^rnpi «Захщплемресурси». Дослiджували сперму буга!в вжом вiд 3 до 10 роюв, яку отримували на штучну вапну з режимом використання буга!в дуплетна садка два рази на тиждень, через двi доби. Свiжоотриманi еякуляти оцiнювали за об'емом (мл), густотою тд мiкроскопом (в роздавлeнiй крапл^ i активнiстю (рухливiстю) спермив (бали). Визначали: концeнтрацiю спермпв за допомогою фотоелектроколориметра (109 клiтин/мл; 109/мл), виживання при тeмпeратурi +2 - +4°С до припинення прямолiнiйного поступального руху (год.) у спeрмi свiжоотриманiй та розрщженш лактозо-жовтково-глiцeриновим розрiджувачeм (ЛЖГР); актившсть сукцинатдeгiдрогeнази (СДГ) з використанням 2,3,5-трифeнiлтeтразолiю i натрiю сукцинату. Актившсть ферменту виражали в умовних одиницях екстинкци (од/(год • 0,1 мл сперми; С) [5]. В розрщжену сперму вносили вщновлену форму глутатюну (Г-SH) та аскорбiнову кислоту (AA) в концeнтрацiях 1,25, 2,5, 5,0 мМ, а також у поeднаннi, пiсля встановлення оптимальних доз.
Для вивчення заплщнювально! здатностi спермив еякуляти роздiляли на частини - контрольну (без антиоксидантсв) i дослiдну (з антиоксидантами у поеднанш Г-SH+AA - 2,5+1,25 мМ). Еякуляти розбавляли ЛЖГР згiдно з шструкщею. З пiддослiдних корiв сформували двi групи аналогiв за вшом (3 - 8 рокiв), переб^ом родiв (нормальнi) i пiсляродового перюду (до 30 днiв): контрольна (40 гол.) i дослiдна (30 гол.). Оаменшня проводили ректо-цeрвiкальним методом за наявност фeномeнiв тiчки i охоти. Заплiднeнiсть корiв визначали тсля першого осiмeнiння за вiдсутнiстю статевих циклiв протягом 60 - 90 дiб пiсля осiмeнiння, в сумшвних випадках - ректальним дослiджeнням. Статистичний аналiз отриманого цифрового матeрiалу проведено за М. О. Плохшським (1969)[6]. Рiзницю мiж сeрeднiми арифметичними значеннями вважали статистично вiрогiдною: * р < 0,05; *** p < 0,001.
Результати дослщжень. Еякуляти пщдослщних буга!в характеризуються об'емом 4,3±0,18 мл (lim 2,0 - 8,0 мл), концентращею спермив 1,09±0,11х109/мл (lim 0,4 - 1,60х109/мл), активнiстю - 7,4±0,16 бали (lim 2,0 - 8,0 бали), виживанням - 110,5±5,70 год. (lim 48 - 240 год), актившстю СДГ 24,7±2,79 од/(год • 0,1 мл С; lim 0 - 70,0 од/(год • 0,1 мл С ).
Вивченням впливу вщновлено! форми глутатюну i аскорбшово! кислоти, 1'х поеднання у розрiджувачi eякулятiв буга1'в на СДГ доведено, що в спeрмi буга1'в через 24 год шкубування активнiсть ферменту тдвищуеться на 81,4% (табл.). Додавання до розрщжувача Г-SH в концентращях 1,25, 2,5 та 5,0 мМ стимулюе у свiжоотриманiй розбавлeнiй спeрмi активнiсть СДГ, вiдповiдно, у 2,1, 2,7 та 5,2 рази (р < 0,05). Через 24 год шкубування рiзниця мiж контрольними та дослщними пробами менша i становить 42,5%, 2,0 та 2,5 рази.
Подiбнi змши виявлeнi при додаванш до свiжоотриманоl розбавлено! сперми АА. Однак, наростаючi дози вказаного антиоксиданта в складi розрiджувача знижують актившсть СДГ, порiвняно до контролю, на 7,6, 37,8% та майже у 5 разiв. 1нкубування розрiджeноl сперми протягом 24 год. з
76
додаванням АА в концентрацп 1,25 та 2,5 мМ майже не впливае на актившсть СДГ, яка становить 20,5±5,04 - 27,8±4,32 од/(год • 0,1 мл С), а при 5,0 мМ знижyеться y 2,7 рази, порiвняно до контролю.
Таблиця
Вплив антиоксидант1в на актившсть сукцинатдегвдрогенази у
Умови дослвду Актившсть ферменту в сперм^ од/(год • 0,1 мл С):
свiжоотримaнiй iнкyбовaнiй 24 год
Контроль (ЛЖГP) 11,3+4,27 20,5+5,04
Дослiд: ЛЖГP
+ Г-SH (мМ): 1,25 24,3+9,24 29,3+5,84
2,5 31,0+7,66* 42,3+6,80*
5,0 59,2+13,39* 50,8+4,32***
АА (мМ): 1,25 10,5+4,98 27,8+4,32
2,5 8,2+4,18 22,1+7,45
5,0 2,3+0,77 7,3+3,66
Г-SH + АА 2,5+1,25 29,8±4,97* 36,7±6,54
* Piзниця статистично вiрогiднa, порiвняно до контролю.(р < 0,05 та 0,001).
Поеднання Г-SH+AA в концентрaцiях 2,5+1,25 мМ y свiжоотримaнiй спермi, зaбезпечyе пiдвищення aктивностi СДГ y 2,6 рази (р < 0,05), а в iнкyбовaнiй протягом 24 год - стимyлюе актившсть СДГ на 79,0%.
Про вплив антиоксиданив на життездатшсть спермив свiдчить ïx виживання, яке при розбавленш ЛЖГP i збер^анш сперми при +2 - +4°С становить - 127,4±11,33 год., а з додаванням антиоксиданив - Г-SH+AA в концентраций вщповщно, 2,5+1,25 мМ - 156,3±14,56 год, що вище на 18,5%.
Pезyльтaти вивчення активност окисних ферментiв та виживання спермив за ди поеднання Г-SH i АА y розрiджyвaчi еякуляив, пiдтверджyються осiменiнням корiв. Так, вщ використання сперми з антиоксидантами T-SH+АА 2,5+1,25 мМ iз 30 корiв зaплiднились пiсля першого осiменiння 20 гол., що становить 66,7%. В контрольнш груш iз 40 гол. заплщнились 21 гол. - 55,0%, рiзниця - 11,7%.
Висновки.
1.Вщновлена форма глyтaтiонy y склaдi розрщжувача еякyлятiв стимулюе aктивнiсть сyкцинaтдегiдрогенaзи y свiжоотримaнiй розбaвленiй та iнкyбовaнiй сперма
2. Aскорбiновa кислота y розрiджyвaчi еякуляив буга1'в знижуе aктивнiсть сyкцинaтдегiдрогенaзи y свiжоотримaнiй спермi, a y шкубованш 24 год при концентрaцiяx 1,25 та 2,5 мМ - майже не змшюеться (20,5±5,04 - 27,8±4,32 од/(год • 0,1 мл С) i знижуеться y 2,7 рази при 5,0 мМ.
3.Поеднання вщновленох' форми глутатюну i aскорбiновоï кислоти y розрiджyвaчi сперми в концентращях, вiдповiдно, 2,5+1,25 мМ стимулюе актившсть сукцинатдегщрогенази та виживання спермив на 18,5 %.
4. Сумюне використання в розрiджyвaчi для сперми бугая вщновленох' форми глyтaтiонy i аскорбшовох' кислоти в концентрaцiяx, вiдповiдно, 2,5 мМ i
77
1,25 мМ пщвищуе заплщнювальну здатшсть спермпв на 11,7 %.
Л1тература
l.Jones R., Mann T., Sherins R.J. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa: spermicidal effects of fatty acid peroxides and protective action of seminal plasma // Fertil. Steril. -1979. -V.31. -Р. 531-537.
2.Slaweta R., Liaskowska Т. The effect of glutathione on ihe motility and fertility of frocen sperm // Anim. Reprod. Sci. -1987. -V.13., №4. -P. 249- 253.
3.Donnelly E. Т., McClure N.The effect of ascorbate and ^-tocopherol supplementation in vitro on DNA integrity and hydrogen peroxide-induced DNA damage in human spermatozoa //Mutagenesis. - 1999. - V. 14., № 5. - 505-512.
4.Шаран М.М. Пщвищення ефективност штучного оаменшня KopiB i телиць. - Львiв, 2009. - 38 с.
5.Чухрш Б.М., Клевець Л.О. До методики визначення активност окислювальних ферменив у cnepMi буга!в // Розведення та штучне ociмeнiння велико! рогато! худоби. - Ки!в, 1978. - Вип. 10. - С. 42-45.
б.Плохинский Н.А. Руководство по биометрии для зоотехников. М.: Колос., 1969. -255с.
Summary Kava S, et all.
Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnology name after. S. Z. Gzhicky Lviv, Ukraine FERTILIZING CAPACITY OF BULL'S SPERMATOZOA BY ADDING ANTIOXIDANTS IN EJACULATE DILUENT
The impact of antioxidants in the ejaculate diluent on survival and fertilizing capacity of bull's spermatozoa was studied. It was found that reduced form of glutathione in the ejaculate diluent stimulates the activity of succinate dehidrogenase in just obtained, diluted and incubated sperm, ascorbic acid lowers activity of enzyme in freshly obtained sperm, and in incubated by 24 h. - at concentration 5mM. Combining reduced form of glutathione and ascorbic acid in sperm diluent in concentration, respectively, 2,5+1,25 мМ stimulates activity of succinate dehidrogenase and survival of bull's spermatozoa on 18,5 %, it increases fertilizing capacity of bull's spermatozoa on 11,7 %.
Стаття надшшла до редакцИ 17.09.2010
78
