CC BY
107
Biochemical Analysis Methods [Biokhimicheskie metody analiza]. Moscow: Nauka; 2010: 91-135. (in Russian)
36. Lu F., Wang K.H., Lin Y. Rapid, quantitative and sensitive immunochro-matographic assay based on stripping voltammetric detection of a metal ion label. Analyst. 2005; 130 (11): 1513-7.
37. Fernández-Sánchez C., McNeil C.J., Rawson K., Nilsson O. Disposable noncompetitive immunosensor for free and total prostate-specific antigen based on capacitance measurement. Anal. Chem. 2004; 76 (19): 5649-56.
38. Lin Y.Y., Wang J., Liu G., Wu H., Wai C.M., Lin Y. A nanoparticle label/ immunochromatographic electrochemical biosensor for rapid and sensitive detection of prostate-specific antigen. Biosens. Bioelectron. 2008; 23 (11): 1659-65.
39. Yu Q., Li H., Li C., Zhang S., Shen J., Wang, Z. Gold nanoparticles-based lateral flow immunoassay with silver staining for simultaneous detection of fumonisin B 1 and deoxynivalenol. Food Control. 2015; 54: 347-52.
40. Shan S., Lai W., Xiong Y., Wei H., Xu H. Novel strategies to enhance lateral flow immunoassay sensitivity for detecting foodborne pathogens. J. Agric. Food Chem. 2015; 63 (3): 745-53.
41. Wong R., Tse H. Lateral Flow Immunoassay. New York: Humana Press; 2009.
immunology
42. Byzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Sveshnikov P.G., Dzantiev B.B. Pretreatment-free immunochromatographic assay for the detection of streptomycin and its application to the control of milk and dairy products. Anal. Chim. Acta. 2011; 701 (2): 209-17.
43. Urusov A.E., Kostenko S.N., Sveshnikov P.G., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Immunochromatographic assay for the detection of ochratoxin A. Zhurnal analiticheskoy khimii. 2011; 66 (8): 770-6. (in Russian)
44. Feng S., Caire R., Cortazar B., Turan M., Wong A., Ozcan A. Immunochromatographic diagnostic test analysis using google glass. ACS Nano. 2014; 8 (3): 3069-79.
45. Zvereva E.A., Byzova N.A., Sveshnikov P.G., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Cut-off on demand: adjustment of the threshold level of an immunochromatographic assay for chloramphenicol. Anal. Methods. 2015; 7 (15): 6378-84.
46. Dzantiev B.B., Byzova N.A., Urusov A.E., Zherdev A.V. Immunochromatographic methods in food analysis. Trends Anal. Chem. 2014; 55: 81-93.
Received 02.09.15
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2016 УДК 612.017.1.08
Кудрявцев И.Б.1, 2, Серебрякова М.К.1, 3, Тотолян А.А.4
ЗНАЧЕНИЯ НОРМЫ СУБПОПУЛЯЦИЙ Т-ХЕЛПЕРОВ РАЗЛИЧНОГО УРОВНЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
1ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», 197376, г. Санкт-Петербург, Россия; 2ФГАОУ БПО «Дальневосточный федеральный университет», 690950, г. Бладивосток, Россия; 3Университет ИТМО, 197101, г. Санкт-Петербург, Россия; 4ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, 197101, г. Санкт-Петербург, Россия
Цель исследования - формирование нормативных показателей по относительному и абсолютному содержанию основных популяций Т-хелперов (Th) в периферической крови условно здоровых доноров. Было обследовано 52 практически здоровых человека (29 мужчин и 23 женщину) в возрасте 18-65 лет (медиана 30 лет). Для проведения многоцветного цитофлуориметрического анализа была использована панель из следующих антител: CD45RA-FITC, CD62L-PE, CCR4-PerCP/Cy5.5, CCR6-PE/Cy7, CXCR3-APC, CD3-APC-AF750, CD4-Pacific Blue и CXCR5-Brilliant Violet 510™. Th1 были распределены по популяциям клеток с фенотипами CXCR5-CXCR3+CCR6-CCR4-, содержащими также Th9, и CXCR5-CXCR3+CCR6+CCR4-, обозначаемых как Th1/Th17. Th2 выявлялись на основании наличия CCR4 при отсутствии всех остальных хемокиновых рецепторов. Th17, помимо указанных выше Th1/Th17, были обнаружены в составе CXCR5-CXCR3-CCR6+CCR4- и CXCR5-CXCR3-CCR6+CCR4+, причем последняя популяция также содержала Th22. Фолликулярные Th, экспрессировавшие на своей поверхности CXCR5, формировали шесть клеточных популяций со следующими фенотипами: CXCR5+CXCR3-CCR6-CCR4- ("Tfh/Tfh2"), CXCR5+CXCR3-CCR6-CCR4+ ("Tfh2"), CXCR5+CXCR3-CCR6+CCR4- ("Tfh17"), CXCR5+CXCR3-CCR6+CCR4+ ("Tfh17"), CXCR5+CXCR3+CCR6-CCR4-("Tfh1") и CXCR5+CXCR3+CCR6+CCR4- ("Tfh1/Tfh17"). Было определено относительное и абсолютное содержание Т-хелперов указанных фенотипов как в рамках общей популяции CD3+CD4+ лимфоцитов, так и среди "наивных" Т-хелперов (CD45RA+CD62L+), Т-хелперов центральной (CD45RA-CD62L+) и эффекторной (CD45RA-CD62L-) памяти, а также "терминально-дифференцированных" CD45RA-позитивных клеток эффекторной памяти с фенотипом CD45RA+CD62L-. Полученные результаты могут быть использованы в качестве нормативных показателей при диагностике патологических состояний иммунной системы.
Ключевые слова: проточная цитометрия; хемокиновые рецепторы; субпопуляции Т-хелперов; CD45RA, CD62L.
Для цитирования: Кудрявцев И.В., Серебрякова М.К., Тотолян А.А. Значения нормы субпопуляций Т-хелперов различного уровня дифференцировки в периферической крови. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (3): 179-184.
DOI 10.18821/0869-2084-2016-3-179-184.
KudryavtsevI.V.12, SerebryakovaM.K.13, TotolyanA.A.4
THE STANDARD VALUES OF SUB-POPULATIONS OF T-HELPERS OF DIFFERENT LEVEL OF DIFFERENTIATION IN PERIPHERAL BLOOD
1The institute of experimental medicine, 197376 St. Petersburg, Russia; 2The Far-Eastern federal university, 690950 Vladivostok, Russia; 3The national research university of information technologies, mechanics and optics, 197101 St. Petersburg, Russia; 4The Pasteur research institute of epidemiology and microbiology, 197101 St. Petersburg, Russia
Для корреспонденции: Кудрявцев Игорь Владимирович, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. отд. иммунологии ФГБНУ "Институт экспериментальной медицины", e-mail: [email protected]
клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(3) doi 10.18821/0869-2084-2016-61-3-179-184
иммунология
The study was carried out to develop .standard indicators of relative and absolute content ofmain populations ofT-helpers in peripheral blood of conditionally healthy donors. The examination was implemented to sampling of 52 healthy individuals (29 males and 23 females) aged 18-65 years (median is 30 years). The multicolor cytofluorimetric analysis was applied using panel of following antibodies: CD45RA-FITC, CD62L-PE, CCR4-PerCP/Cy5.5; CCR6-PE/Cy7, CXCR3-APC, CD3-APC-AF750, CD4-Pacific Blue and CXCR5-Brilliant Violet 510TM. The T-helpersl were distributed in populations of cells with phenotypes CXCR5-CXCR3+CCR6-CCR4-, also containing Th9, and CXCR5-CXCR3+CCR6+CCR4- referred as Thl/Thl7. The Th2 were detected on the basis of availability of CCR4 at the absence of all other chemokin receptors. The Thi7, besides Thl/Thi7 mentioned above, were detected in composition of CXCR5-CXCR3-CCR6+CCR4- and CXCR5-CXCR3-CCR6+CCR4+. The last population also contained Th22. The follicular Th which expressed at their surface CXCR5, formed six cellular populations with following phenotypes: CXCR5+CXCR3-CCR6-CCR4- (Tfh/Tfh2), CXCR5+CXCR3-CCR6-CCR4+ (Tfh2), CXCR5+CXCR3-CCR6+CCR4- (Tfh17), CXCR5+CXCR3-CCR6+CCR4+ (Tfh17), CXCR5+CXCR3+CCR6-CCR4- (Tfhl) and CXCR5+CXCR3+CCR6+CCR4- (Tfh1/Tfh17). The relative and absolute content ofT-helpers of mentioned phenotypes was established both within the framework of total population CD3+CD4+ of lymphocytes and among "naive" T-helpers (CD45RA-CD62L+), T-helpers of central (CD45RA-CD62L+) and effector (CD45RA-CD62L-) memory and also "terminal-differentiated" CD45RA-positive cells of effe4ctor memory with phenotype CD45RA+CD62L-. The study results can be applied as standard indicators under diagnostic of pathologic conditions of immune system.
Keywords: flow cytometry, chemokin receptors; T-helpers sub-population; CD45RA; CD62L.
For citation: Kudryavtsev I.V., Serebriakova M.K., Totolyan A.A. The standard values of sub-populations of T-helpers of different level of differentiation in peripheral blood. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2016; 61 (3): 179-184. (in Russ.) DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-3-179-184.
For correspondence: Kudryavtsev I.V., candidate of biological sciences, senior research assistant of department of immunology. e-mail: [email protected]
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Financing. The study had no sponsor support
Received 01.10.2015 Accepted 15.12.2015
Среди всех клеток систем врожденного и приобретенного иммунитета Т-хелперы (Th) выделяются особенным разнообразием выполняемых функций, что выражается в крайне высокой гетерогенности данной популяции. Исходно на основании продукции цитокинов среди CD3+CD4+ лимфоцитов выделяли клетки, способные к синтезу интерферона-гамма (IFNy) и получившие название Т-хелперов 1-го типа (Th1), и клетки, названные Т-хелперами 2-го типа (Th2) и синтезировавшие IL-4 [1]. Несколько позднее были выявлены регу-ляторные Т-клетки, способные к синтезу TGFp и экспрессии транскрипционного фактора Foxp3 [2]. После обнаружения этой популяции клеток количество описанных типов Th начало неуклонно расти за счет появления новых популяций, к числу которых относятся Th17, фолликулярные Т-хелперы (Tfh), Th9, Th22. В литературе регулярно появляются работы, свидетельствующие о возможности перехода Th из одной популяции в другую в зависимости от микроокружения, типа получаемых цитокиновых сигналов и широчайшего спектра других факторов [3]. Анализ отдельных субпопуляций Th долгое время основывался на длительных и трудоемких процедурах, связанных с индукцией синтеза цитокинов в условиях in vitro или анализом экспрессии транскрипционных факторов, локализованных во внутриклеточных компартментах, что приводило к существенным различиям в получаемых результатах между отдельными лабораториями. Более того, оба эти подхода требовали от лабораторий определенного уровня технического оснащения, а от персонала, выполнявшего все эти многочисленные манипуляции с клетками в условиях in vitro, достаточно высокой квалификации и профессиональной подготовки.
Именно поэтому такое широкое применение в последнее время находит подход, основанный на определении уровня экспрессии хемокиновых рецепторов на поверхности лимфоцитов CD3+CD4+ для определения их принадлежности к тому или иному типу Th. Впервые прямая взаимосвязь между экспрессий CXCR3 и CCR4 как маркеров клеток, способных к преимущественной продукции IFNy и IL-4 соответственно, была установлена Rivino и соавт. [4]. При этом создатели работы специально подчеркивали, что обнаруженная взаимосвязь не является абсолютной, а популяции клеток, экспрессировав-
шие тот или иной набор хемокиновых рецепторов, были «преимущественно обогащены» клетками-продуцентами определенных цитокинов. Уже в рамках упомянутого выше исследования был описан принципиально новый тип экспрес-сировавших СХСЯ5, рецепторы «хоуминга» в лимфоидную ткань ССЯ7 и CD62L, а также способных к синтезу ШЧу и П-4. В ходе дальнейших исследований было показано, что этот тип клеток представлен Т&, основной функцией которых является участие в регуляции и запуске специфического гуморального ответа, опосредованного В-лимфоцитами, за счет синтеза П-21 [5]. Несколько позднее была обнаружена взаимосвязь между присутствием на поверхности CD3+CD4+ клеток хе-мокинового рецептора ССЯ6 и их способностью синтезировать П-17, что позволило описать новый тип № - ТЫ7 [6]. Следует также отметить, что экспрессия того или иного хемо-киного рецептора может быть связана с определенной стадией дифференцировки Т-хелпера. Так, «наивные» покинувшие тимус и не прошедшие антиген-зависимой дифференцировки в периферических лимфоидных органах, практически не несут всех указанных выше рецепторов. По мере созревания и дифференциации эффекторные клетки должны покинуть периферическую кровь и мигрировать в ткани для реализации своих функций [7, 8]. Поэтому целью данного исследования стал анализ уровня экспрессии хемокиновых рецепторов ССЯ4, ССЯ6, СХСЯ3 и СХСЯ5 CD3+CD4+ лимфоцитами, находящимися на различных уровнях дифференцирования, выявленных на основании экспрессии CD45RA и CD62L.
Материал и методы. Объектом работы служила венозная кровь условно здоровых доноров, полученная путем пункции периферической вены и собранная в вакуумные пробирки с содержанием К3ЭДТА. Все исследования проводились в день взятия крови. В ходе изучения было обследовано 52 практически здоровых человека (29 мужчин и 23 женщины) в возрасте 18-65 лет (медиана 30 лет). Подготовку образцов периферической крови и настройку проточного цитофлуориметра проводили в соответствии с национальными рекомендациями [9]. Для выявления № использовали антитела против CD3 (клон иСНТ1) и CD4 (клон 13В8.2), для разделения CD3+CD4+ лимфоцитов на отдельные субпопуляции использовали антитела против CD45RA (клон 2Н4LDН11LDB9 (2Н4)) и CD62L
(клон DREG56). Субпопуляция «наивных» (N) Th обладала фенотипом CD45RA+CD62L+, клетки с фенотипами CD45RA-CD62L+ и CD45RA-CD62L- соответствовали Th центральной (СМ) и эффекторной (ЕМ) памяти, а «терминально-дифференцированные» CD45RA-позитивные эффекторные Th (TEMRA) определялись как CD45RA+CD62L-. На всех указанных выше субпопуляциях CD3+CD4+ лимфоцитов, находящихся на разных стадиях дифференцировки, при помощи моноклональных антител анализировали уровень экспрессии следующих хемокиновых рецепторов: CCR4 (CD194, клон L291H4), CCR6 (CD196, клон G034E3), CXCR3 (CD183, клон G025H7) и CXCR5 (CD185, клон J252D4). Окраску антителами производили в соответствии с рекомендациями производителей. Подбор оптимальных комбинаций антител и конъюгированных с ними флуорохромов производили на основании принципов, изложенных в литературе [10, 11]. В работе использовали антитела против cD3, cD4, cD45RA и CD62L, конъюгированные с APC-AF750, Pacific Blue, FITC и РЕ соответственно (Beckman Coulter, США), а антитела против ccR4, ccR6, cXcR3 и cXcR5 были конъюгированы с PerCP/Cy5.5, РЕ/Су7б АРС и Brilliant Violet 510™ соответственно (Biolegend, США). Удаление эритроцитов из образцов проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего раствора VersaLyse (Beckman Coulter, США), к 975 мкл которого ex tempore добавляли 25 мкл фиксирующего раствора IOTest 3 Fixative Solution (Beckman Coulter, США). После разрушения эритроцитов образцы однократно отмывали избытком физиологического раствора при 330g в течение 7 мин, после чего надосадок удаляли, а клеточный осадок ресу-спендировали в физиологическом растворе с рН 7,2-7,4, содержащим 2% параформальдегида (Sigma-Aldrich, США). Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре Navios™ (Beckman Coulter, США), оснащенном тремя диодными лазерами 405, 488 и 638 нм. Обработку цитофлуориметрических данных проводили при помощи программ Navios Software v.1.2 и Kaluza™ v.1.2 (Beckman Coulter, США). При проведении статистической обработки использовали программное обеспечение Statistica 8.0 (StatSoft, США) и GraphPad Prism 4.00 for Windows (GraphPad Prism Software Inc., США). Нормальность распределения проверяли по критерию согласия Пирсона хи-квадрат. Результаты выражали в процентах позитивных клеток от искомой популяции, приводили медиану и интерквартильный размах (25%; 75%).
Результаты. Как уже отмечалось ранее, анализ экспрессии хемокиновых рецепторов позволяет судить не только о направлении миграции Th из кровотока, но и может выступать в качестве одного из методических приемов для определения поляризации клеток CD3+CD4+ в сторону того или иного типа Th. Такой подход возможен только в случае использования многоцветного цитофлуориметрического анализа, позволяющего одновременно исследовать несколько поверхностных антигенов на одной клетке. При анализе полученных результатов, приведенных в табл. 1 и 2, все Th исходно были разделены нами на CXCR5-негативные и CXCR5-позитивные клетки, так как последние формируют отдельную и весьма гетерогенную популяцию фолликулярных T-хелперов. На основании экспрессии оставшихся трех антигенов - CXCR3, CCR6 и CCR4 - можно выделить основные популяции T-хелперов - Th1, Th2 и Th17.
Главным признаком Th1 является наличие на поверхности клетки CXCR3 при условии отсутствия CCR4 и CXCR5, поэтому основное количество этих клеток будет содержаться в популяции Th с фенотипом CXCR5 -CXCR3 +CCR6 -CCR4-. Отчасти это может служить следствием того, что у данного хе-мокинового рецептора имеется антагонист - CCL3, синтез которого осуществляется Th2 и эозинофилами. Лиганды CXCR3 в свою очередь являются антагонистами CCR3, уровень экс-
immunology
прессии которого весьма высок на Th2. Наличие такого рода антагонистических отношений между лигандами хемокиновых рецепторов, характерных для Th1 и Th2, были положены в основу теории о ключевой роли хемокинов, синтезируемых клетками Т-зависимых зон лимфатических узлов, в регуляции поляризации «наивных» Th [12]. В рамках общей популяции Th эти клетки являются одними из самых многочисленных, составляя 11,20% (8,95; 15,77). Тогда как среди «наивных» Th обнаружено чуть более 3% клеток данного фенотипа (см. табл. 1). По мере дифференцировки № в клетки СМ, ЕМ и TEMRA наблюдалось постепенное увеличение относительного содержания CXCR5-CXCR3+CCR6-CCR4-Th.
CCR4 экспрессируется на поверхности Th2, регуляторных Т-клеток, а также Т-клеток, мигрирующих в кожные покровы. Уровень Th2 в циркуляции весьма низок вне зависимости от способов их определения: по экспрессии хемокиновых рецепторов, по наличию на поверхностной мембране CD294 или по индуцированной продукции IL-4 [13]. По нашим данным CCR4+ Th составляют лишь около 3% от общей популяции Th, а среди «наивных» клеток практически не обнаруживались, однако среди Т-хелперов центральной памяти они составляли около 8% (см. табл. 1). В рамках анализа популяций ЕМ и TEMRA CXCR5-CXCR3-CCR6-CCR4+ образовали 1-2%. С другой стороны, часть Th2 может входить в состав популяций CXCR5-
cXcR3+ccR6-ccR4+ и cXcR5-cXcR3+ccR6+ccR4+,
обладающих «смешанным» или «переходным» фенотипом и содержащихся в весьма существенном количестве как среди CD3+CD4+ лимфоцитов, так и в рамках Th центральной и эффекторной памяти. Считается, что именно такие клетки центральной и эффекторной памяти, но не «терминально-дифференцированные» или «наивные» Th, способны менять свою поляризацию и спектр продуцируемых цитокинов [3].
Наличие CCR6 (при отсутствии CXCR5 или ряда других хе-мокиновых рецепторов) на поверхности клетки обычно связано со способностью к продукции IL-17A. Поэтому Th периферической крови, экспрессирующие CCR6, традиционно рассматриваются в качестве Th17, которые являются весьма гетерогенной популяцией клеток [6]. Поэтому в рамках использованной нами панели антител против хемокиновых рецепторов Th17 могут входить в состав клеточных популяций с фенотипами CXCR5-CXCR3-CCR6+CCR4- (фенотип полностью соответствует Th17), CXCR5-CXCR3-CCR6+CCR4+ (помимо Th17, в состав этой популяции могут входить Th22, экспрессирующие еще и CCR10), а также CXCR5-CXCR3+CCR6+CCR4-. Последняя представляет наибольший интерес, так как эта группа Th способна к продукции как IL-17A, так и IFNy, что и послужило поводом для ее обозначения как Th1/Th17. Содержание клеток, экспрессирующих исключительно CCR6, среди всех исследованных популяций находится в пределах 1-3% (см. табл. 1). Th, экспрессирующие CCR6 и CCR4, практически отсутствуют среди клеток CD45RA+CD62L+, но утрата CD45RA сопровождается почти 16-кратным приростом содержания данной популяции, тогда как снижение экспрессии еще и CD62L приводит к увеличению количества этих клеток до 11% от общего числа ЕМ Th. Более того, Th указанного фенотипа обнаруживаются и среди TEMRA клеток, где составляют около 6% всей популяции. Что же касается CXCR5-CXCR3+CCR6+CCR4-, то максимальное их содержание обнаружено в рамках клеток эф-фекторной памяти (33% от общего количества ЕМ), тогда как среди «наивных» Th1/Th17 практически не встречаются, а в популяциях СМ и TEMRA составляют около 12-14%.
Как уже отмечалось выше, наличие на поверхности CXCR5 свидетельствует о способности клеток направленно мигрировать в В-зависимые зоны лимфатических узлов по градиенту концентрации хемокина CXCL13, поэтому CXCR5+CD4+CD3+ рассматриваются в качестве фолликулярных Th [14]. Более того, Tfh обычно несут CD62L и CCR7 -
клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(3) сю! 10.18821/0869-2084-2016-61-3-179-184
иммунология
Таблица 1
Анализ экспрессии хемокиновых рецепторов CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5 CD3+CD4+ лимфоцитами, находящимися на различных уровнях дифференцировки, выявленных на основании CD45RA и CD62L (п = 52, Me ^25; Q75), % от целевой популяции)
CD3+CD4+ N СМ ЕМ ТЕМЯА
СХСК5-СХСК3-ССК6-ССК4- 39,09 (32,44; 45,35) 91,80 (89,11; 93,31) 13,36 (10,47; 17,79) 0,71 (0,28; 1,18) 15,23 (9,74; 25,40)
СХСК5-СХСК3-ССК6-ССК4+ ("ТЬ2") 3,20 (2,53; 4,93) 0,54 (0,32; 0,82) 7,11 (5,72; 10,03) 1,51 (0,98; 2,27) 0,96 (0,30; 1,85)
СХСК5-СХСК3-ССК6+ССК4-("ТЫ7") 1,95 (1,48; 2,41) 0,46 (0,36; 0,72) 2,95 (2,49; 3,98) 2,38 (1,21; 3,24) 1,65 (0,82; 3,26)
СХСК5-СХСК3-ССК6+ССК4+ ("ТЫ7 и ТЬ22") 5,72 (4,26; 6,94) 0,02 (0,00; 0,09) 8,09 (6,76; 8,83) 11,39 (9,31; 14,99) 5,30 (1,58; 7,85)
СХСК5-СХСК3+ССК6-ССК4- ("Th1 и ТО") 11,20 (8,95; 15,77) 3,27 (2,45; 4,28) 13,40 (11,42; 15,26) 19,73 (12,42; 30,86) 35,05 (25,95; 52,89)
СХСК5-СХСК3+ССК6-ССК4+ 2,93 (2,18; 3,50) 0,06 (0,04; 0,14) 4,32 (3,56; 5,39) 5,55 (4,52; 6,60) 1,33 (0,30; 3,00)
СХСК5-СХСК3+ССК6+ССК4-("ТЬ1/ТЬ17") 12,17 (7,85; 15,28) 0,06 (0,03; 0,11) 11,97 (8,64; 15,01) 33,31 (24,76; 38,28) 11,52 (4,87; 20,97)
СХСК5-СХСК3+ССК6+ССК4+ 3,87 (3,11; 4,90) 0,02 (0,00; 0,03) 5,09 (4,20; 6,43) 8,82 (7,11; 10,32) 1,11 (0,48; 3,07)
СХСК5+СХСК3-ССК6-ССК4- ("Т&/ Т&2") 3,39 (2,48; 3,81) 2,20 (1,70; 2,97) 5,61 (4,74; 6,78) 1,02 (0,72; 1,49) 3,21 (1,44; 4,76)
СХСК5+СХСК3-ССК6-ССК4+ ("Тй2") 0,58 (0,43; 0,74) 0,02 (0,00; 0,04) 1,18 (1,04; 1,56) 0,57 (0,38; 0,78) 0,00 (0,00; 0,14)
СХСК5+СХСК3-ССК6+ССК4-("ТШ7") 2,83 (2,38; 3,46) 0,21 (0,12; 0,34) 5,70 (4,88; 7,07) 2,08 (1,70; 2,76) 2,00 (0,83; 2,88)
СХСК5+СХСК3-ССК6+ССК4+ ("ТШ7") 1,54 (1,21; 2,04) 0,00 (0,00; 0,03) 3,02 (2,46; 4,04) 2,17 (1,51; 2,69) 0,44 (0,00; 1,01)
СХСК5+СХСК3+ССК6-ССК4-("ТШ") 3,74 (3,18; 4,56) 0,61 (0,45; 0,90) 7,47 (6,56; 9,04) 3,49 (2,88; 4,25) 3,68 (2,00; 5,56)
СХСК5+СХСК3+ССК6-ССК4+ 0,50 (0,36; 0,74) 0,00 (0,00; 0,02) 0,84 (0,60; 1,05) 0,92 (0,68; 1,36) 0,00 (0,00; 0,14)
СХСК5+СХСК3+ССК6+ССК4-("ТШ/ТШ7") 1,94 (1,54; 2,46) 0,05 (0,02; 0,08) 3,74 (3,30; 4,68) 2,00 (1,61; 2,69) 0,76 (0,00; 1,43)
СХСК5+СХСК3+ССК6+ССК4+ 0,46 (0,36; 0,61) 0,00 (0,00; 0,02) 0,85 (0,69; 1,14) 0,57 (0,46; 0,79) 0,00 (0,00; 0,24)
Таблица 2
Анализ экспрессии хемокиновых рецепторов CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5 CD3+CD4+ лимфоцитами, находящимися на различных уровнях дифференцировки, выявленных на основании CD45RA и CD62L (п = 52, Me ^25; Q75), количество клеток в 10 мкл цельной венозной крови)
CD3+CD4+ N СМ ЕМ ТЕМЯА
СХСК5-СХСК3-ССК6-ССК4- 3184 (2183; 4579) 2265 (1625;3670) 423 (309; 737) 12 (5; 26) 7 (2; 15)
СХСК5-СХСК3-ССК6-ССК4+ ("ТЬ2") 253 (197; 404) 15 (9; 20) 234 (172; 343) 30 (17; 45) 0(0; 1)
СХСК5-СХСК3-ССК6+ССК4- ("ТЫ7") 157 (115; 198) 13 (8; 20) 90 (71; 120) 38 (25; 64) 1 (0; 1)
СХСК5-СХСИ3-ССК6+ ССИ6- ССИ6-ССИ4+ ("ТЫ7 и ТЬ22") 432 (349; 585) 1 (0; 2) 237 (193; 312) 218(159; 304) 2(1; 3)
СХСК5-СХСК3+ССК6-ССК4- ("ТЫ и ТО") 946 (639; 1498) 94 (55; 126) 408 (338; 611) 385 (211; 685) 13 (6; 38)
СХСК5-СХСК3+ССК6-ССК4+ 229 (171; 308) 2 (1; 3) 137 (99; 178) 109 (67; 150) 0(0; 1)
СХСК5-СХСК3+ССК6+ССК4- ("ТЫ/ТЫ7") 946 (673; 1226) 2 (1; 3) 386 (303; 508) 618 (404; 786) 4 (2; 7)
СХСИ5- СХСК3-СХСК3+ССК6+ССК4+ 334 (234; 444) 0 (0; 1) 176 (131; 228) 178 (123; 220) 0(0; 1)
СХСК5+СХСК3-ССК6-ССК4- ("Тй/Тй2") 252 (210; 337) 62 (38; 90) 176 (145; 236) 21 (14; 24) 1(1; 3)
СХСК5+СХСК3-ССК6-ССК4+ ("Т&2") 46 (38; 65) 1 (0; 1) 42 (29; 57) 10 (7; 15) 0 (0; 0)
СХСК5+СХСК3-ССК6+ССК4- ("ТШ7") 214 (166; 322) 6 (2; 10) 175 (144; 274) 44 (28; 55) 1 (0; 1)
СХСК5+СХСК3-ССК6+ССК4+ ("ТШ7") 138 (88; 180) 0 (0; 1) 103 (70; 149) 39 (25; 53) 0 (0; 0)
СХСК5+СХСК3+ССК6-ССК4- ("ТШ") 308 (239; 367) 17 (11; 27) 245 (182; 305) 64 (55; 83) 1 (0; 2)
СХСК5+СХСК3+ССК6-ССК4+ 39 (31; 59) 0 (0; 1) 25 (20; 38) 16 (13; 29) 0 (0; 0)
СХСК5+СХСК3+ССК6+ССК4- ("ТШ/ТШ7") 157(114; 234) 1 (1; 2) 124 (88; 179) 41 (30; 53) 0 (0; 0)
СХСК5+СХСК3+ССК6+ССК4+ 38 (30; 54) 0 (0; 1) 32 (22; 42) 11 (8; 17) 0 (0; 0)
russian clinical laboratory diagnostics. 2016; 61(3) doi 10.18821/0869-2084-2016-61-3-179-184
молекулы, необходимые для проникновения в периферические лимфоидные органы через венулы с высоким эндотелием, что и соответствует выявленной нами максимальной экспрессии CXCR5 именно на клетках центральной памяти с фенотипом CD45RA-CD62L+. Однако помимо Tfh, локализованных в лимфоидной ткани, в периферической крови обнаруживаются «циркулирующие» Tfh, способные синтезировать широкий спектр цитокинов, к числу которых, помимо IL-21, относятся IFNy, IL-17 и IL-4, играющие ведущую роль в процессах переключения класса синтезируемых В-клетками антител [15]. По аналогии со способностью к синтезу цитокинов, свойственных другим популяциям Т-хелперов, Tfh несут сходный репертуар хемокиновых рецепторов. Так, на основании фенотипа CXCR5+CXCR3+CCR6-CCR4- можно выделить Tfhl, обладающие рядом свойств Th1, к числу которых относятся высокий уровень экспрессии транскрипционного фактора T-bet и способность к продукции IFNy в ответ на стимуляцию. Более того, в условиях in vitro эти клетки не усиливали продукцию иммуноглобулинов «наивными» В-лимфоцитами, что и послужило одной из причин для их определения как Tfh1 [15]. Чаще всего клетки данного фенотипа встречались среди cD3+cD4+ центральной памяти, где они составили около 7,5%. Дальнейшая дифференцировка Т-хелперов сопровождалась снижением Tfhl среди ЕМ и TEMRA (см. табл. 1).
Tfh, не экспрессирующие CXCR3 и CCR6, рассматриваются в качестве Tfh2, причем можно определить два их основных фенотипа: CXCR5+CXCR3-CCR6-CCR4- и CXCR5+CXCR3-CCR6-CCR4+. Среди «наивных» Th клетки, экспрессирующие только CXCR5, составляют чуть более 2%, однако при переходе к популяции СМ их число увеличивается почти в 2 раза (см. табл. 1). Следовые количества Tfh отмечены при анализе фенотипа клеток эффекторной памяти, но среди эффекторных клеток популяции TEMRA их содержание вновь повышается. Клетки с фенотипом CXCR5+CCR4+ в основном обнаруживаются среди Т-хелперов центральной памяти, тогда как среди остальных популяций они практически не выявляются. Это может быть связано с их преимущественной локализацией в лимфоидной ткани, так как в ответ на стимуляцию они способны синтезировать IL-4, IL-5 и IL-13, а также транскрипционный фактор GATA3. Более того, при сокультивировании cXcR3-ccR6- клеток с «наивными» В-лимфоцитами последние усиливали продукцию всех основных классов иммуногло-булиновых молекул - IgM, IgG, IgA и IgE [15].
Что же касается фолликулярных Т-хелперов, экспресси-рующих одновременно CXCR5 и CCR6, то они были способны к синтезу и секреции цитокинов, свойственных Th17 (в частности, IL-17A и IL-22), а также содержали транскрипционный фактор RORyT. В условиях in vitro Tfh17 усиливали продукцию нескольких классов синтезируемых антител «наивными» В-лимфоцитами, за исключением IgE, однако максимальный эффект имел место в случае индукции синтеза IgA [15]. В ходе проведенного исследования Tfh17 можно было отнести к популяциям с фенотипами CXCR5+CXCR3-ccR6+ccR4- и cXcR5+cXcR3-ccR6+ccR4+. Причем, максимальное содержание этих клеток было отличительной чертой CD45RA-CD62L+ Th (см. табл. 1 и 2). Более того, нами выделена группа клеток, которую можно охарактеризовать как Tfh1/Tfh17, потому что она имела фенотип CXCR5+CXCR3+CCR6+CCR4-. В рамках СМ они составляли почти 4%, тогда как при переходе к ЕМ их относительное содержание уменьшалось.
Обсуждение. Таким образом, примененный нами подход позволил выявить основные типы Т-хелперов среди CD4+ Т-лимфоцитов, находящихся на различных стадиях диффе-ренцировки. Полученные нами результаты по относительному (см. табл. 1) и абсолютному (см. табл. 2) содержанию данных популяций могут быть использованы в ходе дальнейших
immunology
клинико-иммунологических и лабораторных исследований в качестве контрольной группы. Более того, в настоящее время важность изучения основных типов Т-хелперов показана при весьма широком круге заболеваний, где их содержание может являться клинически-значимым маркером для определения тяжести патологических состояний и оценки эффективности применяемой терапии [13, 16]. Так, при анализе периферической крови больных системной красной волчанкой в активной фазе заболевания отмечено почти трехкратное снижение уровня Th1 с фенотипом CXCR5-CXCR3+CCR6-CD45RA-CD4+ по сравнению с группой контроля на фоне увеличения уровня Th17 и Th2, что, по мнению авторов, может являться одним из важнейших диагностических признаков данного заболевания [17]. Что же касается Tfh у данной группы больных, то относительное содержание Tfhl находилось в обратной зависимости от активности заболевания, тогда как уровень Tfh2 в периферической крови высоко коррелировал с индексом активности SLEDAI. При исследовании сахарного диабета 2-го типа было отмечено почти двукратное увеличение уровня Tfh с фенотипом CD4+CXCR5+ в циркуляции [18]. Более того, в рамках Tfh было отмечено резкое увеличение Tfh17 и снижение Tfh1 по сравнению со значениями, полученными для контрольной группы условно здоровых доноров. Сходные изменения в популяции фолликулярных Т-хелперов наблюдались в периферической крови пациентов с идиопатиче-скими воспалительными миопатиями, когда относительное увеличение числа этих клеток было связано со значительным приростом клеток с фенотипами CXCR5+CXCR3-CCR6- и CXCR5+CXCR3-CCR6+, соответствовавших Tfh2 и Tfh17 [19]. При наблюдении за больными с рассеянным склерозом анализ субпопуляций Т-хелперов, экспрессирующие различные хемокиновые рецепторы (в первую очередь CXCR3 и CCR4), может служить важнейшим критерием при оценке эффективности терапии [20]. В качестве признака, характеризующего успешное применение препаратов на основе IFNß, авторы предлагают рассматривать увеличение уровня CD4+CXCR3+ и CD4+CCR4+ лимфоцитов в периферической крови больных. Столь же перспективно и значимо исследование этих популяций при патологических процессах, связанных с хроническими вирусными инфекциями такими как ВИЧ или хронический вирусный гепатит С. Инфицирование же вирусом гепатита С сопровождалось увеличением относительного содержания CXCR3+CCR6- среди эффекторных Т-клеток памяти с фенотипом CD45RA-CD62L- и снижением субпопуляции CXCR3-CCR6+ среди популяций Т-хелперов, прошедших антиген-зависимую дифференцировку в периферических лимфоидных органах [21]. При ВИЧ-инфекции снижение уровня ccR6+cD4+ клеток в периферической крови тесно связано с прогрессированием заболевания [22].
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-6, 11-12, 14-15, 17-20, 22 см. REFERENCES)
7. Кудрявцев И.В. Т-клетки памяти: основные популяции и стадии дифференцировки. Российский иммунологический журнал. 2014; 8
(4): 947-64.
8. Сохоневич Н.А., Хазиахматова О.Г., Юрова К.А., Шуплетова В.В., Литвинова Л.С. Фенотипическая характеристика и функциональные особенности Т- и В-клеток иммунной памяти. Цитология. 2015; 57
(5): 311-8.
9. Хайдуков С.В., Байдун Л.А., Зурочка А.В., Тотолян А.А. Стандартизованная технология "исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов". Российский иммунологический журнал. 2014; 8 (4): 974-92.
10. Кудрявцев И.В., Субботовская А.И. Опыт измерения параметров иммунного статуса с использованием шестицветного цитофлуориме-рического анализа. Медицинская иммунология. 2015; 17 (1): 19-26.
клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(3) doi 10.18821/0869-2084-2016-61-3-184-187
иммунология
13. Зурочка А.В., Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А.
Проточная цитометрия в медицине и биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН; 2013.
16. Тотолян А.А. Роль хемокинов и их рецепторов в иммунорегуляции.
Иммунология. 2001; (5): 7-15. 21. Елезов Д.С., Кудрявцев И.В., Арсентьев Н.А., Басин В.В., Эсауленко Е.В., Семенов А.В. и др. Анализ популяций Т-хелперных клеток памяти, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015; 160 (8): 204-8.
Поступила 01.10.15
REFERENCES
1. Murphy K.M., Reiner S.L. The lineage decisions of helper T cells. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2 (12): 933-44.
2. Sakaguchi S., Yamaguchi T., Nomura T., Ono M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 2008; 133 (5): 775-87.
3. Geginat J., Paroni M., Maglie S., Alfen J.S., Kastirr I., Gruarin P. et al. Plasticity of human CD4 T cell subsets. Front. Immunol. 2014; 5: 630.
4. Rivino L., Messi M., Jarrossay D., Lanzavecchia A., Sallusto F., Geginat J. Chemokine receptor expression identifies Pre-T helper (Th)1, Pre-Th2, and nonpolarized cells among human CD4+ central memory T cells. J. Exp. Med. 2004; 200 (6): 725-35.
5. Crotty S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Ann. Rev. Immunol. 2011; 29: 621-63.
6. Annunziata F., Cosmi L., Santarlasci V., Maggi L., Liotta F., Mazzinghi B. et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J. Exp. Med. 2007; 204 (8): 1849-61.
7. Kudryavtsev I.V. Memory T cells: major populations and stages of differentiation. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2014; 8 (4): 947-64. (in Russian)
8. Sokhonevich N.A., Khaziakhmatova O.G., Yurova K.A., Shupletsova V.V., Litvinova L.S. Phenotypic characterization and functional features of memory T- and B-cells. Tsitologiya. 2015; 57 (5): 311-8. (in Russian)
9. Khaydukov S.V., Baydun L.A., Zurochka A.V., Totolyan A.A. The standardised technique "Study subpopulations of peripheral blood lymphocytes by using flow cytometry". Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2014; 8 (4): 974-92. (in Russian)
10. Kudryavtsev I.V., Subbotovskaya A.I. Application of six-color flow cytometric analysis for immune profile monitoring. Meditsinskaya immu-nologiya. 2015; 17 (1): 19-26. (in Russian)
11. Mahnke Y.D., Roederer M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin. Lab. Med. 2007; 27 (3): 469-85.
12. Sallusto F., Lanzavecchia A. Understanding dendritic cell and T-lympho-cyte traffic through the analysis of chemokine receptor expression. Immunol. Rev. 2000; 177: 134-40.
13. Zurochka A.V., Khaydukov S.V., Kudryavtsev I.V., Chereshnev V.A. Flow Cytometry in Medicine and Biology. [Protochnaya tsitometriya v meditsine i biologii]. Ekaterinburg: RIO UrO RAN; 2013. (in Russian)
14. Schaerli P., Willimann K., Lang A.B., Lipp M., Loetscher P., Moser B. CXC chemokine receptor 5 expression defines follicular homing T cells with B cell helper function. J. Exp. Med. 2000; 192 (11): 1553-62.
15. Morita R., Schmitt N., Bentebibel S.E., Ranganathan R., Bourdery L., Zurawski G. et al. Human blood CXCR5(+)CD4(+) T cells are counterparts of T follicular cells and contain specific subsets that differentially support antibody secretion. Immunity. 2011; 34 (1): 108-21.
16. Totolyan A.A. Role of chemokines and their receptors in immunoregulation. Immunologiya. 2001; (5): 7-15. (in Russian)
17. Le Coz C., Joublin A., Pasquali J.L., Korganow A.S., Dumortier H., Mon-neaux F. circulating TFH subset distribution is strongly affected in lupus patients with an active disease. PLoS One. 2013; 8 (9): e75319.
18. Wang Q., Zhai X., Chen X., Lu J., Zhang Y., Huang Q. Dysregulation of circulating CD4+CXCR5+ T cells in type 2 diabetes mellitus. APMIS. 2015; 123 (2): 146-51.
19. Espinosa-Ortega F., Gomez-Martin D., Santana-De Anda K., Romo-Tena J., Villasenor-Ovies P., Alcocer-Varela J. Quantitative T cell subsets profile in peripheral blood from patients with idiopathic inflammatory myopathies: tilting the balance towards proinflammatory and pro-apoptotic subsets. Clm. Exp. Immunol. 2015; 179 (3): 520-8.
20. Andalib A., Doulabi H., Najafi M., Tazhibi M., Rezaie A. Expression of chemokine receptors on Th1/Th2 CD4+ lymphocytes in patients with multiple sclerosis. Iran. J. Immunol. 2011; 8 (1): 1-10.
21. Elezov D.S., Kudryavtsev I.V., Arsent'ev N.A., Basin V.V., Esaulenko E.V., Semenov A.V. et al. The analysis of T helper memory cells populations expressing the chemokine receptors CXCR3 and CCR6 in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C. Byulleten' eksperimental 'noy biologii i meditsiny. 2015; 160 (8): 204-8. (in Russian)
22. Lecureuil C., Combadiere B., Mazoyer E., Bonduelle O., Samri A., Au-tran B. et al. Trapping and apoptosis of novel subsets of memory T lymphocytes expressing CCR6 in the spleen of HIV-infected patients. Blood. 2007; 109 (9): 3649-57.
Reseived 01.10.15
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.981.455-078.33
Еремкин А.В., Елагин Г.Д., Печенкин Д.В., Фоменков О.О., Богачева Н.В., Кытманов А.А., Куклина Г.В., Тихвинская О.В.
РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ И ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ
Филиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, 610017, г. Киров, Российская Федерация
Осуществлен подбор моноклональных антител, обладающих иммунохимической активностью к антигенам Francisella tularensis, на их основе разработаны иммуноферментная и иммунохроматографическая тест-системы для выявления возбудителя туляремии. Оценка чувствительности и специфичности разработанных тест-систем показала, что образцы обеспечивали выявление штаммов F. tularensis в концентрации от 5,0105м.к.см-3 до 1,010м.к.см-3 и не давалилож-ноположительныхрезультатов при исследовании гетерологичныхмикроорганизмов в концентрации 1,0108м.к.^см-3.
К л ю ч е в ы е с л о в а: Francisella tularensis; моноклональные антитела; иммуноферментный анализ; иммунохромато-графический анализ.
Д л я ц и т и р о в а н и я : ЕремкинА.В., Елагин Г.Д., Печенкин Д.В., Фоменков О.О., Богачева Н В., Кытманов А.А., Куклина Г.В., Тихвинская О.В. Разработка иммуноферментной и иммунохроматографической моноклональных тест-систем для выявления возбудителя туляремии. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (3): 184-187. DOI 10.18821/0869-2084-2016-61-3-184-187.
Для корреспонденции: Еремкин Андрей Валентинович, мл. науч. сотр. научно-исследовательского отдела, E-mail: andreieremkin@ gmail.com
