CC BY
475 Краснопеева И.Ю. Определение конституциональных особенностей человека методом иридодиагностики при проведении медицинских осмотров // Сибирский медицинский журнал. - 2005. - № 6. Т. 55. - С. 67-70.
6 Краснопеева И.Ю., Сизых Т.П. Иридодиагностика как скрининг-метод в клинике внутренних болезней // Сибирский медицинский журнал. - 1998. - № 1. - Т. 12. - С. 34-44.
7 Максименюк А.В., Червоный И.Ф. Иридодиагностика - метод контроля состояния организма человека // Научный взгляд в будущее. - 2018. - Вып. 9. - Т. 1. - С. 50-63.
Рукопись получена: 6 августа 2019 г. Принята к публикации: 19 августа 2019 г.
УДК 616-07; 616.31-085
ЗНАЧЕНИЕ ПРЕАНАЛИТИЧЕСКОЙ СТАДИИ ИССЛЕДОВАНИЯ
ДЕСНЕВОЙ ЖИДКОСТИ
© 2019 Н.Б. Захарова1, Л.Ю. Островская1, А.В. Лысов1, А.В. Перов2, Г.П. Гладилин1
1ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов
2ГУЗ Саратовская государственная поликлиника № 10, Саратов
Актуальность. В качестве основного метода определения концентрации цитокинов в десневой жидкости в большинстве исследований последних лет использован твердофазный иммуноферментный анализ. Различия в результатах исследования уровня цитокинов связаны с использованием разных методов метода забора и хранения проб десневой жидкости. Цель исследования: установить значение преаналитического этапа получения и хранения десневой жидкости при обследовании пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта. Материалы и методы. Обследовано 20 женщин, в возрасте от 40 до 55 лет, в том числе: 10 - хроническим паро-донтитом легкой степени тяжести (ХП) и адентией; 10 практически здоровых пациентов с адентией и без патологических изменений тканей пародонта. При экстракции полученных образцов десневой жидкости использовали 0,155М раствор хлорида натрия, содержащий 0,2 % биоцида ProClin серии 300. Результаты. Использование среды с антимикробной активностью для экстракции десневой жидкости сразу после её забора бумажным штифтом позволяет обеспечить стабильность определения истиной концентрации основной группы цитокинов. Преимуществом такого биоцида, как ProClin является блокада разрушения содержащихся в отделяемом десне-вом канале разнообразных форм микроорганизмов. Выводы. Введение в раствор для экстракции и последующего хранения десневой жидкости«РшС1ш 300» может быть использовано для повышения чувствительности и специфичности всей группы исследованных цитокинов в диагностике воспалительных заболеваний пародонта.
Ключевые слова: преаналитический этап, десневая жидкость, цитокины, пародонтит.
Общепризнанный этиологический фактор развития воспалительных заболеваний пародонта, микробная биопленка, вовлекает в патогенетический круг иммунные механизмы защиты. Нарушение баланса между бактериальной инвазией и иммунных защитных систем ротовой полости считается ведущей причиной развития деструкции тканей пародонта [1, 2]. Компоненты клеточных стенок анаэробных пародонтопатогенов взаимодействуя с паттерн-распознающими рецепторами TLR-4 активируют выброс провоспалительных цитокинов, запускающих комплекс защитных механизмов врожденного и приобретенного локального иммунного ответа. Активированные микробными продуктами нейтрофилы вызывают одновре-
менно вместе с разрушением микробных агентов деструкцию пародонтальных тканей [2, 3]. При их нарастании и увеличении глубины пародонтальных каналов происходит разрушение опорных структур зубов, то есть тканей десны, пародонта и альвеолярной кости. Одним из достоверных источников в исследованиях воспалительных процессов при заболеваниях пародонта считается десневая жидкость [4, 5].
Десневая жидкость относится к биологическим жидкостям, при участии которых в слюну поступают слущенные эпителиальные клетки, лейкоциты (95-97 % нейтрофилов, 1-2 % лимфоцитов, 2-3 % моноцитов), микроорганизмы, белки, ферменты. Также в ней содержится микрофлора - стрептококки, стафилококки, фузобатерии, спирохеты, простейшие.
В десневой жидкости, контактирующей со средой, в которой происходят метаболические и патологические процессы в тканях пародонта, содержится высокая концентрация растворимых биологически активных медиаторов клеток, цитокинов, вовлеченных в иммунный ответ. При воспалительных заболеваниях пародонта их секреция происходит в «ворота» инфекции или в десневую жидкость [4, 5, 6]. Цитокины секретируются в основном лимфоцитами, моноцитами и макрофагами, но взаимодействуют с огромным числом клеток, связываясь со специфическими мембранными рецепторами. Это вызывает снижение или увеличение экспрессии мембранных протеинов, рост клеток, пролиферацию, изменение дифференциров-ки и секреции эффекторных молекул. ГЬ-1 и Т№-а относят к провоспалительным цитокинам из-за их вездесущности, раннего и интенсивного ответа на инвазирующие агенты (бактерии или токсины). Повышенная экспрессия ГЬ-1р запускает развитие воспалительного ответа и стимулирует выделение других провоспалительных цитокинов. Продукция провоспалитель-ных цитокинов и хемокинов (ГЬ-1р, ГЬ-6, ГЬ-8) при пародонтитах включением в регуляцию иммунного ответа эпителиальных клеток [5, 6, 7].
В качестве основного метода определения концентрации цитокинов в десневой жидкости в большинстве исследований последних лет использован твердофазный иммунофер-ментный анализ. Вместе с тем результаты исследования имеют значительные различия. Это прежде всего связано с различиями метода забора, последующего хранения до начала исследования проб десневой жидкости.
Цель исследования: установить значение преаналитического этапа получения и хранения десневой жидкости при обследовании пациентов с воспалительными заболеваниями па-родонта.
Материалы и методы. Обследовано 20 женщин, в возрасте от 40 до 55 лет, в том числе: 10 - хроническим пародонтитом легкой степени тяжести (ХП) и адентией; 10 практически здоровых пациентов с адентией и без патологических изменений тканей пародонта. Критерии включения: старше 40 лет, с дефектами зубного ряда, возникшими на разных сроках после удаления зубов, подписавшие протокол информированного согласия о цели и характере работы.
Критерии исключения: моложе 40 лет, с нарушениями коагуляции и гемостаза, заболеваниями иммунной системы, хроническими инфекционными, психическими, онкологическими заболеваниями (туберкулез, актиномикоз), с ВИЧ инфекцией, женщины в период беременности и лактации, при отказе больного от обследования.
Для оценки влияния преаналитического этапа забора десневой жидкости на концентрацию определяемых цитокинов десневой жидкости у 10 практически здоровых лиц и 10 пациентов с ХП десневую жидкость собирали одновременно двукратно.
Метод сбора десневой жидкости. После очищения зубов и прилегающих к ним десны от зубного налета, их изолировали от слюны ватными валиками и высушивали. Забор материала из десневой борозды проводили с помощью специальных мишеней в виде бумажных, абсорбирующих, стерильных эндодонтических штифтов (Absorbent Paper Points, № 25), которые применяются в терапевтической стоматологии для высушивания корневого канала перед пломбированием. Штифты стерильны, изготовлены из бумаги высокой абсорбирующей способности, не содержащей примесей связующих веществ, идеальной плотности для введения в десневую борозду. При аналитическом взвешивании 30 бумажных пинов, введенных в десневые пародонтальные карманы и выдержанных до полного пропитывания, установлено, что среднее количество сорбируемой ими десневой жидкости составляет 5,0 ± 0,05 мг. С помощью пинцета и стоматологической гладилки последовательно 2 штифта погружают в дес-невую борозду. Каждый из них в течение 100-120 с полностью пропитывается десневой жидкостью и переносился в две пробирки типа Eppendorff. В одной из них содержалось 1000 мкл 0,155М раствора хлорида натрия. В другой 0,2 % биоцида ProClin серии 300 [8]. В результате получали образцы десневой жидкости с разведением 1:200, которые замораживали при -40 °С и хранили до проведения анализа.
Концентрацию цитокинов IL-1P, IL-8, МСР-1, VEGF, IL-1RA в образцах десневой жидкости определяли методом иммуноферментного анализа с помощью соответствующих наборов реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Для статистической обработки результатов исследований использовали набор программ «Statistica v6.0». При сравнении результатов использовали непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни в программе Multi ExperimentViewer (Р < 0,05).
Результаты и их обсуждение. Полученные результаты представлены с табл. 1.
Результаты исследования (табл. 1) показали, что состав десневой жидкости у лиц без патологии пародонта и с ХП имеет значительные различия, основой которого является высокое содержание таких провоспалительных цитокинов, как IL-1P (в 5,0, Р < 0,05 ), IL-6 (в 23,8, Р < 0,05), IL-8 (в 4,2 , Р < 0,05), МСР-1 (в 1,9, Р < 0,05), TNFa (в 1,5). Подъем их концентрации обусловлен вовлечением в воспалительный процесс одновременно всех клеток иммунной защиты десневой борозды (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты, эпителиоциты).
Представленные различия степени нарастания содержания основной группы провоспа-лительных цитокинов в десневой жидкости у больных ХП получены при использовании среды для экстракции десневой жидкости с ProClin 300. Содержание цитокинов было значительно выше в десневой жидкости, экстрагированной 0,155М раствором хлорида натрия вместе с 0,2 % ProClin 300. В меньшей степени данная среда оказывала влияние на уровень основных провоспалительных цитокинов десневой жидкости практически здоровых лиц. Значимое сохранение концентрации в ней отмечено для: IL-8 - в 1,49 (Р < 0, 05); МСР-1 -в 1,67 (Р < 0,05); TNFa - в 2,3 (Р < 0,05). У пациентов ХП в среде, содержащей ProClin 300, был сохранен подъем всей основной группы провоспалительных медиаторов. Подъем уровня медиаторов в десневой жидкости составил: IL-1P - в 1,95 (Р < 0,05); IL-6 - в 2,13 (Р < 0,05); IL-8 - в 2,23 (Р < 0,05); МСР-1 - в 2,35 (Р < 0,05) ; TNFa - в 2,98 (Р < 0,05). То есть использование среды с антимикробной активностью для экстракции десневой жидкости сразу после её забора бумажным штифтом позволяет обеспечить стабильность определения истиной концентрации основной группы цитокинов. Преимуществом такого биоцида, как ProClin является блокада разрушения содержащихся в отделяемом десневом канале разнообразных форм микроорганизмов. Их наличие в получаемой для исследования десневой жидкости как
при интактном пародонте и особенно при пародонтитах приводит к быстрому разрушению практически всей определяемой в настоящее время с помощью иммуноферментного анализа группы цитокинов.
Таблица 1
Влияние состава разводящего раствора при взятии десневой жидкости на содержание основных про-и противоспалительных цитокинов
Показатели Десневая жидкость у лиц с адентией Десневая жидкость у больных с адентией
(пг/мл среды и без патологических изменений пародонта и пародонтитом легкой степени тяжести
разведения) 0,155М раствор хлорида 0,155М раствор 0,155М раствор хлорида 0,155М раствор
натрия и 0,2 % раствор хлорида натрия натрия и 0,2 % раствор хлорида натрия
ProClin 300 ProClin 300
IL-ip 4,2 (1,9; 7,2) 3,1 (1,2; 5,4) 21,1** (12,5; 27,8) 10,8* ** (6,3; 15,2)
IL- 6 4,9 (2,3; 5,7) 3,7 (1,8; 4,3) 116,6** (64,4; 166,2) 54,5* ** (32,4; 83,4)
IL-8 73,3 (65,6; 79,7) 48,9* (43,5; 52,5) 295,25** (167,9; 322,9)* 132,3* ** (65,7; 160,8)
МСР-1 28,9 (26,6; 32,1) 17,3* (17,9; 21,4) 110,4** (78,6; 120,5) 46 9* ** (39,3; 59,8)
TNFa 7,6 (6,4; 9,6) 3,3* (3,1; 5,2) 11,3 (5,2; 14,3) 3,8* (1,1; 4,7)
IL-1RA 4279,5 (3794,25; 4885,5) 2139,5* (1897,2; 2442,8) 3885 (1894; 4808)* 1928* (946; 2403)
Примечание: * - Р < 0,05 при сравнении результатов исследования десневой жидкости, перенесенных в пробирки с 0,155М раствором хлорида натрия и 0,2 % раствором ProClin 300 и без него; ** - Р < 0,05 при сравнении результатов исследования десневой жидкости у лиц с адентией и без патологических изменений пародонта и у больных с адентией и пародонтитом легкой степени.
Заключение. Таким образом, при определении концентрации цитокинов в зубодесневой жидкости важнейшее значение для получения достоверных и воспроизводимых результатов анализа имеет преаналитический этап. Введение в раствор для экстракции и последующего хранения десневой жидкости «ProClin 300» может быть использовано для повышения чувствительности и специфичности всей группы исследованных цитокинов в диагностике воспалительных заболеваний пародонта. Внедрение исследования биомаркеров десневой жидкости для оценки воспалительных заболеваний пародонта является перспективным направлением внедрения современных систем принятия решений в практической стоматологии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Fitzsimmons TR, Sanders AE, Bartold PM, Slade GD. Local and systemic biomarkers in gingival crevicular fluid increase odds of periodontitis. J Clin Periodontol. 2010;37(1):30-6. doi: 10.1111/j.1600-051X.2009.01506.x.
2 Цепов A.M., Орехова Л.Ю., Николаев А.И. и др. Некоторые аспекты этиологии и патогенеза хронических воспалительных генерализованных заболеваний пародонта (обзор литературы). Ч. 1 // Пародонтология. -2005. - № 2 (35). - С. 3-6.
3 Григорьян А.С., Грудянов, А.И., Рабухина Н.А., Фролова О.А. Морфогенез воспалительных заболеваний пародонта // Болезни пародонта. Патогенез, диагностика, лечение. - М.: МИА, 2004. - С. 28-62.
4 Dasanayake AP, Periodontal disease is related to local and systemic mediators of inflammation, J Evid Based Dent Pract, 2010, 10(4):246-247. doi: 10.1016 / j.jebdp.2010.09.006.
5 Shimizu, T., Kubota, T., Iwasaki, M., Morozumi, Yoshie, H. Changes in Biomarkers after Initial Periodontal Treatment in Gingival Crevicular Fluid from Patients with Chronic Periodontitis Presenting with Drug-Induced Gingi-valOvergrowth" Open Journal of Stomatology, , 2016;6(2):64-72 doi: 10.4236 / ojst.2016.62008.
6 Обоснование применения профессиональной гигиены полости рта при ортодонтическом лечении по результатам исследования биомаркеров десневой жидкости / Н.Б. Захарова, А.В. Лепилин, Д.В. Воробьев и др. // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2015. - Т. 11. - № 2. - С. 168-173.
7 Изменение баланса цитокинов в десневой жидкости при заболеваниях пародонта и его значение для прогнозирования регенераторных нарушений в тканях пародонта / Л.Ю. Островская, Н.Б. Захарова, А.П. Могила и др. // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2014. - Т. 10. - № 3. - С. 435-440.
8 www.synthesisgene.com: ProClin300 Protocol
Рукопись получена: 28 июняа 2019 г. Принята к публикации: 10 июля 2019 г.
