CC BY
29
/ребёнка
Kaíhíhhq пед1атр1я / Clinical Pediatrics
УДК 616.5-002.2
ВОЛОСОВЕЦЬ О.П., ДОСЕНКО B.C., КРИВОПУСТОВ С.П., ПАВЛИК О.В., еМЕЦЬ О.В., СТРОЙ д.о. Нацюнальний медичний унверситет¡мен/ О.О. Богомольца, м. Ки!в
ЗНАЧЕНИЯ ОДНОНУКЛЕОТИДНИХ nOAÍMOPOÍ3MÍB В ГЕНАХ MTOR (RS11121704) ТА ATG5 (RS510432) B РОЗВИТКУ АЛЕРПЧНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ У Д|ТЕЙ
Резюме. Мета цього до^дження — визначення зв'язку однонуклеотидних nолiморфiзмiв в генах mTOR (mammalian target of rapamycin; мшень рапамщину у ссавщв) i ATG5 (autophagy related gene 5; ген автофаги 5) та розвитку алергiчного фенотипу у дтей. Генотипування mTOR (rs11121704) та ATG5 (rs510432) проводили в грут хворих з атотчними захворюваннями i контрольнш груп за допомогою по-лiмеразноi ланцюгово1 реакци у реальному чаа. Выявлено, що у 50 (54,9%) пацieнтiв i 43 (49,4 %) здоровых дтей наявна мажорна алель (ТТ) полiморфiзму rs11121704; 36 (39,6 %) i 32 (36,8 %) вiдповiдно мали гетерозиготну алель (ТС); у 5 (5,5 %) i 12 (13,8 %) виявлено мторну алель (СС). Варiанти з генотипом СС rs11121704у гет mTOR визначалися у 2,5раза частше у контрольнш грут, тж серед хворих. Алельт варiанти в ген ATG5 розподыилися так: 51 (52 %) пащент та 43 (44,3 %) здорових дитини мали гетерозиготну алель (СТ), 29 (29,6 %) i 21 (21,6 %) вiдповiдно мав мнорну алель (ТТ), у 18 (18,4 %) та 33 (34 %) була мажорна алель (СС). ТТ-генотип асоцтеться з тдвищенимризикомранньог матфеста-цПбронхiальноiастми (до 3ротв життя). Вважаемо, що полiморфiзми в генах mTOR (rs11121704) та ATG5(rs510432) можуть служити корисними прогностичними маркерами для оцщкиризику виникнення бронхiальноi астми та Ышт алергiчноi патологи у дтей.
Ключовi слова: однонуклеотидний полiморфiзм, автофагiя, mTOR, ATG5, алергiчна патологiя, дти.
Вступ
Актуальшсть алерпчно! патологи у дггей, а саме бронхГально! астми, атошчного дерматиту (АД) та шших атотчних захворювань зростае щороку. КГль-юсть таких дггей в УкраШ становить 5—10 %, що можна порГвняти з лГтературними даними щодо по-ширення ще! патологи у свт. Так, у розвинених кра-1нах piвень поширеносп атотчних захворювань серед дитячого населення становить 15—30 % (Roider E. et al., 2013).
ЗрозумГло, що ендогенним базисом розвитку алерпчних захворювань е генетична схильшсть до порушення piвноваги в iмуннiй систем^ у взаемо-дГ! мж piзними типами лiмфоцитiв. ВГдомо, що ди-феpенцiацiя ефекторних Т-клггин запускаеться пГд впливом зовшшшх антигешв i потребуе одночасно! взаемодГ! цитоюшв, яю забезпечують стимуляцго Т-клiтинного рецептора (TCR) i, як наслщок, зна-чних морФологГчних i функцюнальних змГн на!вних Т-КЛГТИН [5, 17].
1снуе пpинаймнi шГсть рГзних ефекторних кло-нГв з 1х ушкальними особливостями: Th1, Th2, Th9, Th17, Th22 i CD4+CD25+ регуляторш Т-клГтини
(Treg). Treg-клiтини можуть походити з двох дже-рел. Природш Treg-клiтини (nTreg) утворюються в процесГ онтогенезу тимуса, в той час як шдуковаш Treg-клiтини (iTreg) диференцгоються з на!вних пе-риферичних Т-клггин при 1х активащ! за наявнос-тГ високо! концентраций трансформуючого фактора росту р (TGF-P) i штерлейкша-2 (IL-2). Баланс м1ж ефекторними Th- i Treg-клГтинами може критично вплинути на результати багатьох захворювань люди-ни. ПГдвищення рГвня IL-6 i TGF-р в мжросередо-вищГ можуть спровокувати утворення Th17-клiтин. АктивацГя Т-клГтин IFN-y i 1Л-12 призводить до до-зрГвання Th1-клiтин-ефектоpiв, присутнГсть IL-4, IL-25, IL-33 i тимГчного стромального лГмфопоетину
Адреса для листування з авторами:
Павлик Олена ВГкторГвна E-mail: [email protected]
© Волосовець О.П., Досенко В.6., Кривопустов С.П.,
Павлик О.В., бмець О.В., Строй Д.О., 2015 © «Здоров'я дитини», 2015 © Заславський О.Ю., 2015
(TSLP) призводить до диференцiацГi в 1Ъ2-клиини [1, 5, 17].
Функци р!зних типiв клiтин визначенi цитокша-ми, яю вони виробляють пщ час антигенно! стиму-ляци. У патогенезi алергiчного запалення секрец!я IL-4, IL-5, IL-31 i IL-13 Th2-клiтинами призводить до алерген-специфiчного синтезу iмуноглобулiну Е (IgE), активаци диференцiювання еозинофiлiв та в результата до дегрануляци тучних клiтин [1].
Поряд iз позаклгганними цитокiновими сигналами в iмуннiй стимуляци лiмфоцитiв важливе значен-ня мають внутрiшньоклiтиннi механiзми, зокрема автофапчного каскаду. Так, дослщниками (Delgofe et al.) була вивчена здатнiсть сигнального шляху mTOR (mammalian target of rapamycin; мшень рапа-мiцину у ссавщв) модулювати iмунну вщповщь та кль тинну пролiферацiю. Мiшень рапамщину у ссавцiв (mTOR, також вщомий як FRAP, RAFT, або RAPT) е еволюцiйно консервативною серин-треонiновою протешкшазою, що регулюе клiтинний метаболiзм, рют i пролiферацiю вiдповiдно до зовшшнк чинни-кiв — доступнiсть поживних речовин, вплив цито-кiнiв [17]. З огляду на значну роль функцш mTOR у процесi клиинно! диференщаци було висловле-но припущення, що mTOR у на!вних Т-клгганах може визначати результат розпiзнавання антигешв i Т-клiтинну диференцiацiю.
Delgofe et al. дослщжували роль у диференщаци ефекторних Т-клiтин i виявили, що mTOR-дефщитш CD4 + Т-клiтини не в змозi активувати специфiчнi транскрипцшш фактори, такi як GATA-3, Т-bet, i RORgt. Крiм того, автори показали, що нездатнють до диференщювання в ефекторнi клiтини була обу-мовлена ослабленням вщповщних STAT-сигналiв у вщповщь на поляризуючi цитокiни. Замють цього пiсля активаци mTOR-дефiцитнi CD4+ Т-клиини диференцiювалися в регуляторнi клггани Foxp3+ [5]. У наступнiй робот [6] показано, що Т-клiтини, по-збавленi mTORC1-активностi, ще були в змозi стати Th2-клiтинами. Автори дослщжували вплив сигналь заци mTORC2 на розвиток Th2. При видаленнi сиг-нал!заци mTORC2 в Т-клiтинах виявлено, що вони були не в змоз! стати Th2-клiтинами, але збериалася !х здатнiсть диференцiюватися в Th1- i Th17-клiтини. Щ данi визначають р!зш сигнальнi шляхи як мехашз-му, за допомогою якого mTOR регулюе диференщю-вання Т-хелпер!в.
Становить штерес те, що mTOR також бере участь у процес! росту, дозр!вання тучних клгган i секреци цитоюшв. Shin et al. у своему дослщженш встанови-ли, що туберозний склерозний комплекс 1 (TSC1) е критичним регулятором для сигнал!заци mTOR в тучних кл^инах, пщлеглих FceRI i С-Kit, i дифе-ренцшно контролюе дегранулящю тучних клгган i продукщю цитоюшв. TSC1-дефiцит призводить до порушення дегрануляци тучних клгган, але при цьому посилюеться продукц!я цитоюшв in vitro i в природних умовах тсля FceRI контакту. TSC1 мае виршальне значення для виживання тучних клгган через множинш шляхи апоптозу (в тому числ! шпбу-
ючо1 регуляци р53, т1Я-34а, активних форм кисню) i регулящю Вс1-2 [20]. Крiм того, сигналiзацiя тТОЯ може модулювати ангiогенез i лiмфангiогенез, що вiдiграють важливу роль у патогенезi астми. Ыпбу-вання тТОЯ блокуе синтез фактора росту ендотелго судин (VEGF), фактор ангюгенезу, що iндукуе фенотип астми у мишей [8].
Як було зазначено, стимулювання тТОЯС1 зни-жуе автофагiю — процес внутршньоклгтинно! дегра-даци лiзосомальних бiлкiв, цитоплазматичних ком-понентiв, органел, що забезпечуе мехашзм контролю якост1 бшка. Вщомо, що iнiцiацiя процесу автофаги вщбуваеться пщ впливом щонайменше двох кiназ — иЬК1 (вщома також як АГС-1) та VPS34 (вакуоль-ний протеш 34). Як наслщок ЗСх активаци вщповщш протеши добудовуються в мембрану фагосоми, що завершуе процес формування та дозрiвання автофа-госоми. тТОЯС1, при наявностi вщповщних умов, пригшчуе активацiю иЬК1 шляхом фосфорилюван-ня i таким чином стае негативним регулятором автофаги [7].
Автофапя вщграе важливу роль у функцюнуван-н1 1мунно! системи, а саме забезпечуе знешкоджен-ня внутр1шньокл1тинних бактерш та в1рус1в, анти-генпрезентацiю на р!зних р1внях, пролiферацiю Т- ! В-кл1тин, п1дтримку гх внутр1шньокл1тинного гоме-остазу.
Вщомо, що макроавтофагiя п1сля деградаци про-тетв iндукуе транспортування гх до МНС (головного комплексу пстосумюносп) II типу в тим1чних ештель альних клiтинах, що е необхщним для позитивно! i негативно! селекцц л1мфоцит1в у тимус1 [8, 20].
Аналопчно забезпечуеться презентац!я антигешв внутршньоклгтинних патогенiв у комплекс МНС II антигенпрезентуючих кл1тин СD4+-клiтинам. Автофапя вщповщае за процес антигенпрезентаци у В-клiтинах, макрофагах, дендритних клгтинах. Анти-гени, що утворюють сильний зв'язок з Т-кл1тинним рецептором СD4 нагвних Т-кл1тин, призводять до диференщювання у ТЫ- i ТЫ7-клгтини, тод1 як низькоафiннi комплекси «пептид-МНС/Т-кл1тинний рецептор» сприяють диференщаци в ТЪ2-клгтини [4]. Таким чином, активнють та функ-цiонування Т-кл1тинного рецептора на поверхш Т-л1мфоцит1в п1сля завершення процеав дозрiвання та селекци, як ! сам процес деградаци протегшв, мо-жуть сприяти формуванню ТЪ2-фенотипу. Важливо вщзначити, що i цитокши, притаманнi ТЫ- та ТЪ2-фенотипам, у свою чергу, регулюють активацго авто-фагп. Так, iнтерферон у iндукуе протеолiз, а 1Ь-4 та 1Ь-13 пригн1чують автофагiю [15].
Окр!м того, автофапя забезпечуе деградацiю мгто-хондр1й та окислених протетв. Оксидативний стрес пщ час дизрегуляци протеол!зу може призвести до ураження тканин оргашзму. Наприклад, в разi брон-хiальноi астми р1вн1 Н2О2 та N0 у повир^ що видиха-еться пацiентом, прямо взаемопов'язанi з тяжюстю перебiгу астми [11].
!снуе ч1ткий взаемозв'язок м1ж процесами ав-тофагй та активацiею рецепторiв розтзнавання
патершв (PRRs), у тому числi Toll-, Nod- та RIG-I-подiбних рецепторГв. Так, активацГя рецепторiв спричинюе формування iнфламасом, внаслщок чого завершуегься дозpiвання IL-1ß га IL-18 [14]. KpiM того автофапя забезпечуе дозpiвання i вихщ секре-горних гранул тучних клiгин, ремоделювання ди-хальних шляхiв через збГльшення видГлення колагену з фiбpобластiв [13].
Виходячи з наведених даних, ми припустили, що полiмоpфiзми в генах mTOR та ATG5 можуть бути пов'язанi з розвитком алерпчного фенотипу в дитя-чому вiцi. Для пepeвipки mei гшотези ми дослщжува-ли вiдмiнносгi в частой SNPs (rs11121704 та rs510432) у дiгeй без алepriчно'i патологи (контрольна група) та дiгeй з бpонхiальною астмою i/або iншою алерпчною пагологieю, а також взаемозв'язок мiж цими двома полiмоpфiзмами.
MaTepiaAM та методи
Полiмоpфiзм rs11121704 в ген mTOR досль джувався у 91 дитини, полiмоpфiзм rs510432 в геш ATG5 — у 98 дггей вжом вiд 5 до 18 роив iз бронхь альною астмою та/або шшим алepгiчним захворю-ванням, яю перебували на сгацiонаpному лГкуванн в алepгологiчному вщдГленнГ Кшвсько! мюько! ди-тячо! клшГчно! лiкаpнi № 2. Групу контролю стано-вили 97 дггей вiком вiд 5 до 18 роив без алepгiчноi патологп для rs510432 в геш ATG5 та 87 дГгей для rs11121704 в гeнi mTOR. Встановлення дiагнозу АД вщбувалося на пiдсгавi даних, внесених батьками в адаптовану затверджену анкету (ISAAC), i включало в себе скарги на висип, сухють шири, лущення, свepбiж упродовж дитинства. Наявнiсгь бронхГаль-но! астми встановлювалась на основГ даних зГ слГв багькiв щодо персистуючого свистячого дихання (> 2 етзодГв нападГв, не пов'язаних з шфекщею верхшх дихальних шляхГв), даних строметрп (зни-жений об'ем наприкшщ жршо! секунди форсова-ного видиху (FEV1) i сшввщношення FEV1/FVC (форсована життева емюсть легень), позитивний тест з ß-2-агошстами), шдвищення рГвня IgE, пози-тивн шюрт прик-тести з аероалергенами (табл. 1).
Шшрт прик-тести були проведет та штерпре-тованГ згщно з протоколом Global Allergy and Asthma European Network, з використанням загальноi пане-лГ шгаляцшних алергешв на пщставГ опублжованих
методичних рекомендацш (документ Свропей^^ академй алергологй та клшГчно! Гмунологп (EAACI) та протокол «Швшчш стандарти i мгжнародне досль дження астми та алерги серед дггей» (ISAAC) II фаза). Батьки пщписали шформовану згоду до включення в дослщження. ОкрГм симптомГв астми, АД на момент огляду або в анамнезГ, алерпчного ринпу, в усгх дГгей був принаймнГ один позитивний результат шорного прик-тесту з панелГ з 15 алергенами.
Ви&р SNP
(однонуклеотидного noAiMop0i3My)
ПолГморфГзми rs11121704 у геш mTOR та rs510432 у геш ATG5 були обраш для генотипування, тому що гшотетично вони можуть впливати на розвиток алерпчного фенотипу i, як повщомляеться, зустрГчаються в европейських популяцГях.
Вид'лення дезоксирибонукле'1ново'1 кислоти (ДНК)
ЗабГр букального ештелго проводився з використанням букальних щггок Гз подальшим заморожуван-ням зразк1в та !х зберианням при температурГ —20° С. ДНК для генотипування екстрагували зГ зразк1в, ви-користовуючи набори Diatom™ Prep 200 («Лаборатория Изоген», РФ) вщповщно до протоколу вироб-ника. Концентрацго ДНК визначали за допомогою спектрофотометра NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies Inc., США).
Пoлiмеpaзнa ланцюгова реакця
Реакцй амплГфжацй проводили з використанням Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems, США), в кшцевш реакцй об'емом 20 мкл, що мю-тив 2X TaqMan Ушверсальний Master Mix (Applied Biosystems, США), assay C_910351_10 для полГмор-фГзму rs510432 в ген ATG5 i матричну ДНК. Амп-лГфжацГя фрагменпв гешв складалася зГ стадй де-натурацп при 95° С протягом 20 с, а попм 40 циклГв амплГфжацп при 95° С протягом 3 с i 60° С протягом 30 с. АналГз даних проводився з 7500 Fast Real-Time PCR Software.
Статистичний aнaлiз
Отримаш даш обробляли статистично з використанням програми Excel 2000 та Origin 7.0. Вщмшнють
Таблиця 1. РозподЛ пац1ент1в за кл1н1чними ознаками
Кл^чш ознаки Кiлькiсть пацieнтiв з доступними даними (n) Значення
Середнш BiK (роки) 98 8,0 ± 2,1
Стввщношення CTaTi (вiдсоток хлопчикiв) 98 57
Середне значення SCORAD (CI) 18 20 (16-24)
Середнш загальний IgE, kU • l-1 (IQ) 24 821,4 (42-8000)
Наявнiсть АД (%) 98 100
FEV1 (%) 76 76,4 (28,64-117,80)
FEV1/FVC 76 106,74 (84,40-118,39)
Покращення FEV1 пiсля введення сальбу-тамолу (%) 76 12,5 (0,4-87,2)
в частот1 генотипу i алелеи м1ж групою пац1ент1в 1з бронх1альною астмою i контрольною групою визна-чалась за допомогою %2-тесту Пiрсона. Р-значення менше 0,05 (р < 0,05) вважалося статистично зна-чущим. Для визначення та пiдтвердження взаемо-дГ1 мiж SNP, визначення типу ще! взаемодп вико-ристовувався метод багатофакторного зменшення розмiрностi (MDR — Multifactorial Dimentionality Reduction), а також графiчне зображення епiстазу за допомогою побудови дендрограм взаемодп. Для перевiрки рiвноваги Хардi — ВаИнберга використо-вували SNPAnalyzer (веб-програмне забезпечення).
Резудьтати
У 72 (73,4 %) дiтеИ було загострення бронхГаль-но! астми, що проявлялось експiраторною задиш-кою, свистячими хрипами i кашлем. У 40 (55,5 %) пацiентiв дiагностовано легкий стутнь загострення, 31 (43,1 %) мали загострення середньо! тяжкостi, 1 (1,4 %) — тяжке загострення, 28 % дггей з дiагнозом бронхГально! астми в стади ремюи проходили плано-ве обстеження. Загалом у 60 (83,3 %) пащенпв вияв-лено зниження показника FEV1 (< 80 %), 34 (47,2 %) мали позитивний тест з р-2-агонютом. У амейному анамнезi всгх дiтеИ були випадки атопiчних захворю-вань. 98 (100 %) дггей мали АД в анамнезi, з них 35 (35,7 %) дггей упродовж останнього часу вiдмiчають прояви АД у виглядГ висипу, сухост шюри, лущен-ня, свербежу, лiхенiзацii. У 34 (34,7 %) дггей прояви АД вiдзначались ¡з дня народження до 1 року, у 16 (16,3 %) — до 3 роюв, у 8 (8,2 %) — до 7 роюв, у 7 (7,2 %) — до 10 роюв, у 5 (5,1 %) прояви з'явились тсля року.
1нша супутня алерголопчна патолопя визнача-лась у 46 (46,9 %) дггей. У 23 (23,5 %) дггей мав мюце алерпчний рингт: ¡з них 18 (18,4 %) мали цглорГчний алерпчний рингт, 5 (5,1 %) — сезонний. Серед алер-голопчних захворювань в анамнезГ вщзначалась го-стра алерпчна кропив'янка — 4 (4,1 %) дггей, харчова алерггя — 9 (9,2 %) дггей.
Генотипування показало такий розподгл алельних варГанпв у геш mTOR (рис. 1).
Розподгл генотишв rs11121704 у геш mTOR вщпо-вщае закону ХардГ — Вайнберга. Виявлено, що у 50
(54,9 %) пащенпв i 43 (49,4 %) здорових дггей була наявна мажорна алель (ТТ) (р > 0,05 за %2-тестом); 36 (39,6 %) i 32 (36,8 %) пащенпв та здорових дггей вщ-повщно мали гетерозиготну алель (ТС) (р > 0,05 за %2-тестом, вщношення шанав (OR) 0,97 (95% довГрчий штервал (Д1) 0,52-1,81) та 5 (5,5 %) i 12 (13,8 %) мали мшорну алель (СС) (р > 0,05 за %2-тестом, OR 0,36 (95% Д1 0,11-1,05) (табл. 2-4). ВарГанти з генотипом СС rs11121704 у геш mTOR виявилися в 2,5 раза час-тше у контрольнш груш, нгж серед хворих.
Розподгл алельних варГанпв у геш ATG5 наведено на рис. 2.
Розподгл генотишв rs510432 в геш ATG5 також вщповщае закону ХардГ — Вайнберга. Виявлено, що у 51 (52 %) пащенпв та 43 (44,3 %) здорових дггей була гетерозиготна алель (СТ) (р < 0,05 за %2-тестом, OR 2,53 (95% Д1 1,14-5,74) у 29 (29,6 %) пащенпв та у 21 (21,6 %) дггей ¡з контрольно! групи наявна мь норна алель (ТТ) (р < 0,05 за %2-тестом, OR 1,00) та 18 (18,4 %) пащенпв i 33 (34 %) здорових дггей мали ма-жорну алель (СС) (р < 0,05 за %2-тестом, OR 2,17 (95% Д1 1,09-4,46) (табл. 2-4). ТТ-генотип полГморфГзму rs510432 в геш ATG5 асоцгоеться з пщвищеним ри-
Рисунок 1. Граф1чне зображення частотноi характеристики розподлу генотишв пол'шорф'зму rsl1l21704 у ген mTOR у контрольн1й груш та rpyniхворих на атопiчнi захворювання
Таблиця 2. Вщношення шаныв для кодом'шантноi моделi успадкування пол'шорф'зму rs11121704 в ген mTOR та rs510432 в ген ATG5 уд'ией з алерпчною патологею. Вдношення шанЫв з 95%
дов'рчим iнтервалом
Генотип Генотип, n (%) Вщношення шанав та 95% Д1
Здоровi XBopi
rs11121704
ТТ 43 (49,4) 50 (54,9) 1,00
ТС 32 (36,8) 36 (39,6) 0,97 (0,52-1,81)
СС 12 (13,8) 5 (5,5) 0,36 (0,11-1,05)
rs510432
СС 33 (34) 18 (18,4) 1,00
СТ 43 (44,3) 51 (52) 2,17 (1,09-4,46)
ТТ 21 (21,6) 29 (29,6) 2,53 (1,14-5,74)
у дiтей i3 полiморфiзмом в rem ATG5 вщбувся таким чином: 29 (29,6 %) i 22 (22,5 %) хлопчикiв та дiвчат, вщповщно, мали гетерозиготну алель; 13 (13,3 %) i 13 (13,3 %) — MiHopHy алель (СС); у 14 (14,3 %) хлопчи-юв i 7 (7,1 %) дiвчат була мажорна алель (р > 0,05 за %2-тестом).
Чiтко видно (рис. 3), що м1ж полiморфiзмами ATG5 та mTOR не спостерпаеться ефекту взаемодИ i вони представляють незалежнi головнi ефекти.
Обговорення та висновки
Лiтерaтyрнi данi свщчать про значну роль mTOR у регуляцИ сигнaлiв цитокiнiв, диференцiювaннi й розвитку ефекторних Th-клiтин, дозрiвaннi й дегра-нуляцИ тучних клiтин, регуляцИ процесу презентаций антигену шляхом автофагИ, що згодом призводить до формування 1Ъ2-клгтинного фенотипу. Сигналь-ний шлях mTOR також е важливим у функцюнуван-нi нейтрофiлiв, моноцитiв, дендритних клгтин, В- та Т-клiтин. Попереднi дослщження визначили mTOR як критичний регулятор клгтинного метaболiзмy, даючи початок розвитку нових генетичних моделей, щоб показати важливу роль цього шляху в гомеостaзi та функцИ Т-лiмфоцитiв.
1дентифжац1я фaкторiв ризику, що можуть впли-нути на ризик розвитку атотчно! патологи, дуже важлива. Остaннiм часом ряд «випадок — контроль»
Таблиця 3. Вдношення шанс1в для домiнантноï модел! успадкування пол1морф1зму rs11121704 в ген mTOR та rs510432 в ген ATG5 уд 'пей ¡з бронх'альною астмою. Вдношення шансв з 95% дов'рчим
¡нтервалом
Генотип Генотип, n (%) Вщношення шанав та 95% Д1
Здоровi XBopi
rs11121704
TT 43 (49,4) 50 (54,9) 1,00
ТС/СС 44 (50,6) 41 (45,1) 0,8 (0,44-1,44)
rs510432
СС 33 (34) 18 (18,4) 1,00
CT/TT 64 (66) 80 (81,6) 2,29 (1,19-4,51)
Таблиця 4. Вдношення шанс1в для рецесивноï модел! успадкування полiморфiзму rs11121704 в ген mTOR та rs510432 в ген ATG5 удтей ¡з бронх'альною астмою. Вдношення шансв з 95% дов'рчим
iнтервалом
Генотип Генотип, n (%) Вщношення шанав та 95% Д1
Здоровi Хворi
rs11121704
TT/ТС 75 (86,2) 86 (94,5) 1,00
СС 12 (13,8) 5 (5,5) 0,36 (0,11-1,03)
rs510432
СС/СТ 54 (55,7) 47 (48) 1,00
TT 43 (44,3) 51 (52) 1,36 (0,78-2,4)
Таблиця 5. Розподл генотипiв полiморфiзму rs510432 в ген ATG5 залежно вд ранньоïманiфестацiï
бронх/ально/ астми (до 3 роюв життя)
Машфестащя Генотип (n) Вщношення шанав
Т/Т Т/С С/С
До 3 poKiB 3 12 16 Р = 0,005369
Пюля 3 poKiB 14 39 13
зиком ранньо! машфестацИ бронх1ально! астми (до 3 роюв життя) (р = 0,005369) (табл. 5).
Серед дгтей iз полiморфiзмом rs11121704 в геш mTOR було виявлено, що у 30 (32,9 %) хлопчиюв i 20 (21,9 %) дiвчaт була мажорна алель, 23 (25,3 %) i 13 (14,3 %) хлопчиюв та дiвчaт, вщповщно, мали гетерозиготну алель, 1 (1,1 %) i 4 (4,4 %) — мшорну алель (СС) (р > 0,05 за %2-тестом). Розподш за статтю
■н
CC
CT
TT
□ Контроль иПафенти
Рисунок 2. Анал'з частотно)'характеристики розподлу генотипв пол'морф'зму rs510432 в ген ATG5 у контрольнй груп та групiхворих на атопiчнi захворювання
mTOR 1
Г
27
10 ■ ■ 6 1
32
12 16 12 3 0
17 17 11 5 6 1
Рисунок 3. Розподл генотипт пол'торф 'зм 'т rs11121704 в ген mTOR та rs510432 в ген ATG5.
Темно-&рий кол'р — комбнаця генотитв, що асоцйована з пщвищеним ризиком виникнення атопiчного захворювання, свтло-с1рий кол'\р — комб'нац 'я генотитв, що асо^йована 3i зниженим ризиком виникнення захворювання
дослщжень показав зв'язок пол1морф1зм1в в геш mTOR з ризиком розвитку раку [2, 3, 9, 10, 12, 19], зокрема, пол1морф1зму rs11121704 (T > C), широко вивченого в популяц1ях бвропи, США та Китаю. Дослщниками був показаний зв'язок TT-генотипу rs11121704 з клтчними параметрами (OR = 1,53, 95% Д1 1,01-2,32, р = 0,044), такими, як ризик смертносп, метастаз1в i сттйшсть до х1мютерапп [13]. Також було показано, що полiморфiзм rs2295080 в промоторi зменшуе транскрипцшну активнiсть у до-слiдженнi in vitro, i пов'язаний з низькою експрешею мРНК mTOR у нирковш тканинi [12]. В описаному дослщженш функцiональне значення пол1морФ1з-му rs11121704 було визначене за допомогою SNPexp онлайн-iнструменту для оцiнки можливого бюло-гiчного впливу на експрессiю гена mTOR. Випадки з ТТ-генотипом мали вищi рiвнi експреси гена mTOR, нiж ТС- i СС-генотипи, хоча i не було досягнуто р1в-ня статистично! значущостi (р = 0,059).
Полiморфiзми rs11121704 в геш mTOR та rs510432 в геш ATG5 були широко вивчеш в европейськш популяци i, отже, були обраш нами для дослщжен-ня. Розподш варiантiв полiморфiзму rs 11121704 в геш mTOR в европейськш популяци: генотип ТТ — 52,7 %, генотип ТС — 41,1 %, генотип СС — 6,2 %, алель Т — 73 %, алель С — 27 %. Розподш варiантiв полiморфiзму гена ATG5 rs510432 в европейськiй популяци: генотип СС — 31,9 %, генотип СТ — 44,2 %, генотип ТТ — 23,9 %, алель С — 54 %, алель Т — 46 %.
Ми дослщжували взаемозв'язок дитячих атошч-них захворювань i mTOR регуляци та автофагл Було виявлено можливий зв'язок мiж SNP у геш mTOR та
ATG5 i алерпчним фенотипом у дiтей. Варiанти з генотипом СС rs11121704 в геш mTOR зус^чалися у 2,5 раза частше у контрольнiй груш, нiж серед хво-рих. Також було знайдено статистично значущi вщ-мiнностi у розподiлi генотипiв rs510432 в генi ATG5 у контрольнш групi та групi пацiентiв. У дггей з алер-гiчною патолопею варiанти з ТТ-генотипом зустрь чаються частiше, нiж у групi контролю.
Асощаци генотипiв iз клiнiчними параметрами алерпчних захворювань не було встановлено в попе-реднiх дослщженнях. У цьому дослщженш нами було виявлено, що ТТ-генотип полiморфiзму rs510432 в геш ATG5 асощюеться з пщвищеним ризиком ран-ньо! машфестаци бронхiальноi астми (до 3 рокiв жит-тя) (р = 0,005369) (табл. 5).
М1ж полiморфiзмами ATG5 та mTOR не спосте-рiгаеться ефекту взаемоди i вони представляють не-залежнi головн1 ефекти (рис. 3).
Зважаючи на ключову роль л!зосомного протео-л1зу в реалiзацii та регуляци ¡мунно! в1дпов1д1 про-цес автофагп в патогенезi алергiчних захворювань достатньо широко вивчений. Останш дослщження продемонстрували взаемозв'язок м1ж пол1морФ1з-мами гена ATG5 (rs 12201458 та rs 510432) та брон-х!альною астмою у дггей в американськш популяци. Мiнорна алель (Т) гена ATG5 rs 510432 пов'язана з пщвищеним ризиком бронх!ально! астми у дией. Окр!м того, як показано в експерименп, пол1мор-Ф1зм rs510432 п!двищуе активнiсть промотора гена: вар!ант алелi С призводив до пщвищення активнос-т1 промотора на 23 % пор!вняно з варiантом алел! Т. На наступнш стадх! дослщження було пщтверджено прогнозоване пгдвищення експреси гена ATG5 у па-щенпв ¡з бронхiальною астмою у стадп загострення [16]. Також було виявлено залежшсть показникiв спiрограми (FEV1) вщ пол1морФ1зму гена ATG5 (rs 12212740) у пащенпв ¡з бронхiальною астмою в американськш та канадськш популяц1ях [18].
Проте'][н ATG5, що е одним ¡з основних структур-них 6глк1в автофагосоми, часто обираеться як об'ект дослiдження рiзноманiтних захворювань. Так, пщ-вищений рiвень експреси гена ATG5 спостерпаеться при хворо61 Паркiнсона, виразковiй хворо61 шлунка. 1нпбування автофагй являе собою потенцiйно новий метод лжування нейродегенеративних, онколог1чних, метаболiчних, iнфекцiйних та атопiчних захворювань.
Таким чином, пол1морФ1зми генiв mTOR та ATG5 можуть розглядатися як перспективний генетичний маркер для ощнки ризику виникнення бронхiальноi астми та шшо1 алергiчноi патологii у дiтей.
Список лператури
1. Brand E.B., Sivaprasad U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis // J. Clin. Cell. Immunol. - 2011. — 2(3). — 110.
2. Cao Q., Ju X., Li P., MengX., Shao P. et al. Afunctional variant in the MTOR promoter modulates its expression and is associated with renal cell cancer risk// PLoS One. — 2012. — 7(11). — e50302. doi: 10.1371/journal.pone.0050302.
3. Chen J., Shao P., Cao Q., Li P., Li J. et al. Genetic variations in a PTEN/AKT/mTOR axis and prostate cancer risk in a Chinese population // PLoS One. — 2012. — 7(7). — e40817. doi: 10.1371/ journal.pone.0040817.
0
2
0
2
4. Datta S., Milner J.D. Rostrum. Altered T-cell receptor signaling in the pathogenesis of allergic disease // J. Allergy Clin. Immun. — 2011 — 127(2). — 351-354. Doi:10.1016/j.jaci.2010.11.0339.
5. Delgoffe G.M, Kole T.P, Zheng, Y, Zarek P.E, Matthews K.L., Xiao B, Worley P.F, Kozma S.C., Powell J.D. mTOR differentially regulates effector and regulatory T cell lineage commitment //Immunity. — 2009. — 30(6). — 832-844. doi: 10.1016/j.im-muni.2009.04.014.
6. Delgoffe G.M., Pollizzi K.M., Waickman A.D., Heikamp E, Meyers D.J., Horton M.R.., Bo Xiao, Worley P.F., Powell J.D. The mammalian Target of Rapamycin (mTOR) regulates Thelper cell differentiation through the selective activation ofmTORC1 and mTORC2 signaling//Nature immunology. — 2011. — 12(4). — 295-303.
7. Dunlop E.A., Tee A.R. mTOR and autophagy: A dynamic relationship governed by nutrients and energy//Semin. Cell. Dev. Biol. — 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.semcdb.2014.08.006
8. Fredriksson K, Fielhaber J.A., Lam J.K., Yao X., Meyer K.S. et al. Paradoxical Effects of Rapamycin on Experimental House Dust Mite-Induced Asthma // PLoSOne. — 2012. — e33984. doi:10.1371/ journal.pone.0033984.
9. He J, Wang M.Y., Qiu L.X., Zhu M.L., Shi T.Y. et al. Genetic variations of mTORC1 genes and risk of gastric cancer in an eastern chinese population // Mol. Carcinog. — 2013. — 52 Suppl. — 170179. doi: 10.1002/mc.22013.
10. HildebrandtM.A., YangH, HungM.C., Izzo J.G., HuangM. et al. Genetic variations in the PI3K/PTEN/AKT/mTORpathway are associated with clinical outcomes in esophageal cancer patients treated with chemoradiotherapy // J. Clin. Oncol. 2009. — 27. — 857-871. doi: 10.1200/jco.2008.17.6297.
11. Horvath I., Donnelly L.E., Kiss A. Combined use of exhaled hydrogen peroxide and nitric oxide in monitoring asthma // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 1998. — 158. — 1042-1046.
12. Huang L., Huang J., Wu P., Li Q., Rong L. et al. Association of genetic variations in mTOR with risk of childhood acute lymphoblastic leukemia in a Chinese population // Leuk. Lymphoma. — 2012. — 53. — 947-951. doi: 10.3109/10428194.2011.628062.
13. Jianbo Shao, Ying Li, Peiwei Zhao, Xin Yue, Xiaohui Liang Xuelian He. Association of mTOR Polymorphisms with Cancer Risk and Clinical Outcomes: A Meta-Analysis // PLoS One. — 2014 May 9. — 9(5). — e97085. DOI: 10.1371/journal.pone.0097085.
14. Jun A., HiromichiH, KazuyoshiK. Autophagy in the Pathogenesis of pulmonary disease//Intern. Med. — 2013. — 52. — 2295-2303.
15. Jyothula S.S., Eissa N.T. Autophagy and role in asthma // Curr. Opin. Pulm. Med. — 2013. — 19. — 30-35.
16. Martin L.J., Gupta J., Jyothula S.S. Functional variant in the autophagy-related gene 5 gene promoter is associated with childhood asthma // PLoSOne. — 2012. — 7. — e33454.
17. O'Brien T.F., Xiao-Ping Zhong. The Role and Regulation of mTOR in T Lymphocyte Function // Arch. Immunol. Ther. Exp (Warsz). — 2012 Jun. — 60(3). — 173-181.
18. Poon A.H., Chouiali F., Tse S.M. Genetic and histologic evidence for autophagy in asthma pathogenesis// J. Allergy Clin. Immun. — 2012. — 129. — 569-571.
19. Pu X., Hildebrandt M.A., Lu C, Lin J., Stewart D.J. et al. PI3K/PTEN/AKT/mTOR pathway genetic variation predicts toxicity and distant progression in lung cancer patients receiving platinum-based chemotherapy // Lung. Cancer. — 2011. — 71. — 82-88. doi: 10.1016/j.lungcan.2010.04.008.
20. Shin J., Pan H. Xiao-Ping Zhong Regulation of mast cell survival and function by tuberous sclerosis complex 1 // Blood. — 2012 Apr 5. — 119(14). — 3306-3314.
OTpuMaHO 10.01.15 ■
Волосовец А.П., Аосенко B.E., Кривопустов С.П., ПавликE.B., Емец О.В., Строй А.А. Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, г. Киев
ЗНАЧЕНИЕ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ГЕНАХ MTOR (RS11121704) И ATG5 (RS510432)
В РАЗВИТИИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ДЕТЕЙ
Резюме. Цель данного исследования — определение связи однонуклеотидных полиморфизмов в генах mTOR (mammalian target of rapamycin; мишень рапамицина у самцов) и ATG5 (autophagy related gene 5; ген аутофагии 5) с развитием аллергического фенотипа у детей. Генотипи-рование mTOR (rs11121704) и ATG5 (rs510432) проводили в группе больных с атопическими заболеваниями и контрольной группе с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Обнаружено, что у 50 (54,9 %) пациентов и 43 (49,4 %) здоровых детей присутствовала мажорная аллель (ТТ) полиморфизма rs11121704, 36 (39,6 %) и 32 (36,8 %) соответственно имели гетерозиготную аллель (ТС), 5 (5,5 %) и 12 (13,8 %) — минорную аллель (СС). Варианты с генотипом СС rs11121704 в гене mTOR оказались в 2,5 раза чаще в контрольной группе, чем среди больных. Аллельные варианты в гене ATG5 распределились следующим образом: у 51 (52 %) пациента и 43 (44,3 %) здоровых детей присутствовала гетерозиготная аллель (СТ), 29 (29,6 %) и 21 (21,6 %) соответственно имели минорную аллель (ТТ), 18 (18,4 %) и 33 (34 %) — мажорную аллель (СС). ТТ-генотип ассоциируется с повышенным риском ранней манифестации бронхиальной астмы (до 3 лет жизни). Считаем, что полиморфизмы в генах mTOR (rs11121704) и ATG5 (rs510432) могут служить полезными прогностическими маркерами для оценки риска возникновения бронхиальной астмы и другой аллергической патологии у детей.
Ключевые слова: однонуклеотидный полиморфизм, ау-тофагия, mTOR, ATG5, аллергическая патология, дети.
Volosovets O.P., Dosenko V.Ye., KryvopustovS.P., PavlykO.V., Yeemets O.V., StroiD.O.
National Medical University named after O.O. Bohomolets, Kyiv, Ukraine
SIGNIFICANCE OF SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN MTOR (RS11204981) AND ATG5 (RS510432) GENES IN ALLERGIC DISEASES IN CHILDREN
Summary. The objective of this study — to determine the association between single-nucleotide polymorphisms in mTOR (mammalian target of rapamycin) and ATG5 (autophagy related gene 5) genes and allergic phenotype in children. Ge-notyping for mTOR (rs11121704) and ATG5 (rs510432) was performed in group of patients with atopic diseases and in control group using real-time polymerase chain reaction. We have found that 50 (54.9 %) patients and 43 (49.4 %) healthy children had major allele (TT) of rs11121704 polymorphism; 36 (39.6 %) and 32 (36.8 %), respectively, had heterozygous allele (TC); 5 (5.5 %) and 12 (13.8 %) had minor allele (CC). Variants with CC genotype of rs11121704 in mTOR gene were revealed 2.5 times more frequently in the control group than among patients. Allelic variants in ATG5 gene were as follows: 51 (52 %) patients and 43 (44.3 %) healthy children had heterozygous allele (CT), 29 (29.6 %) and 21 (21.6 %), respectively, had minor allele (TT), and 18 (18.4 %) and 33 (34 %) had major allele (CC). TT genotype is associated with increased risk of early manifestation of bronchial asthma (until 3 years of life). We believe that polymorphisms in mTOR (rs11121704) and ATG5 (rs510432) genes may serve as important predictive markers in evaluating the risk of bronchial asthma and other allergic diseases in children.
Key words: single nucleotide polymorphism, autophagy, mTOR, ATG5, allergic diseases, children.
